CN108303402A - 一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及*** - Google Patents

Abstract

本发明公开一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及***，包括：通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；将两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；通过带有电子狭缝的探测器收集荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。本发明实现大视场、大景深成像，提升了样本图像成像质量。

Description

一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及***

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，更具体地，涉及一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及***。

背景技术

使用一光束薄片从样本侧面激发荧光，在垂直于光片的方向上通过显微物镜与CCD或sCMOS相机来获取照明层面的荧光图像的光片照明显微技术作为一项二十一世纪新兴的前沿成像方法，相比传统的落射荧光显微，具有光毒性小、高时空分辨率、高通量兼备的特点，进而使得对生物体的三维，动态全景观察成为可能。目前光片照明显微术已作为一种成像的新方法，在国际范围内获得了各类研究人员的广泛关注。

光片显微成像***以它高轴向分辨率、较高通量以及低光漂白等特点，在生物医学成像领域中得到了广泛的关注。与传统荧光显微成像相比，光片荧光显微***采用了额外的照明光路来产生一层极薄的激光光片。当样本放置于光片工作区域时，仅有薄光片穿过的平面会激发出荧光信号，被与照明光路正交的宽场采集光路收集，形成图像。通过在探测光路方向上即z方向上快速扫描样本或光片即可产生一系列的切面荧光图像序列，再经过堆叠重构出样本的三维结构，因此图像的轴向分辨率由照明光束的宽度即光片的厚度确定。

随着大量应用研究的开展，更多对光片的挑战和问题也被相继提出。首先分辨率和有效视场之间的耦合关系，是常规高斯光片所面临的巨大障碍。换言之，高分辨率和大视场之间的矛盾在高斯光片荧光成像中难以调和。而贝塞尔光束本身具有零衍射，保型性等特点，近年在光片成像中也成为一大热点。贝塞尔光束在获得数微米高轴向分辨率的同时，也可具有长达数毫米的传播长度从而使光片均匀覆盖数毫米的有效视场，可以有效解决高分辨率与大视场难以兼备的经典矛盾。但是，使用贝塞尔光片进行照明时，虽然贝塞尔光束本身具有中心强度高，自恢复效应以及抗散射等特点，但其本身截面呈环状，存在严重的旁瓣效应，在低数值孔径的探测下要想维持大视野并提高轴向分辨率，对贝塞尔光的旁瓣进行有效的抑制将成为不可避免的重点和难点。如能解决上述矛盾，则贝塞尔光束能应用于显微成像领域，特别是适用于各种大型深层厚组织的成像，解决生物医学上实际问题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于解决使用贝塞尔光片进行照明时，其本身截面呈环状，存在严重的旁瓣效应的技术问题。

为实现上述目的，一方面，本发明提供一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，包括以下步骤：

通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

可选地，该方法还包括以下步骤：移动样本，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。

可选地，两路贝塞尔光束投射到样本上为x轴方向，且双侧贝塞尔光束的投射方向相反，两束贝塞尔光束同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样本的荧光采集方向为z轴方向，通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

可选地，所述贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

可选地，两路贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴的正向边缘，并同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的样本图像扫描并折返。

另一方面，本发明提供一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，包括：照明单元、贝塞尔光束产生单元以及探测成像单元；

照明单元，用于产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；

贝塞尔光束产生单元，用于将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束，将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；

探测成像单元，通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

可选地，该***还包括：控制单元，用于控制探测器的电子狭缝与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，以及控制样本移动，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，控制两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。

可选地，两路贝塞尔光束投射到样本上为x轴方向，且双侧贝塞尔光束的投射方向相反，所述控制单元，用于控制两束贝塞尔光束同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样本的荧光采集方向为z轴方向，通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

可选地，所述贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

可选地，所述控制单元，用于控制两路贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴的正向边缘，并同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的样本图像扫描并折返。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明提供的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，使用贝塞尔光束进行光片照明解决了普通光片产生时极大的损失光功率的问题，在协调了普通光片照明显微镜高分辨率与大视场的矛盾的同时又兼顾了光片***所具有的高通量，低光漂白的特性。

本发明使用电子狭缝，控制其与贝塞尔光束宽度一致的条件下，使控制光源扫描***与探测器在时间与空间上完全同步单方向曝光且进行数据输出，大大提升了样本图像成像质量。

本发明将双侧贝塞尔光束应用于光片***进行双侧照明，在获得数毫米的大视野条件下，双侧光束的严格对齐也及其重要，而在低数值孔径的物镜作为探测的条件下，满足了大视场的需求而引入的大景深问题也对电子狭缝与贝塞尔光束的高度同步提出了更高的要求。

本发明提出的成像方法和***在解决上述问题的同时也实现了在生物医学领域的进一步应用。

附图说明

图1为本发明提供的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法示意图；

图2为本发明实施例提供的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像的光路结构示意图；

在附图1中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为照明单元，2为贝塞尔光束产生单元，3为控制单元，4为探测成像单元，5为样本；

图3为本发明实施例提供的电子狭缝扫描曝光示意图；

图4为本发明实施例提供的贝塞尔光束与传统光片所用的高斯光束在传播方向，即x轴方向上的光束截面对比图；

图5为本发明实施例提供的贝塞尔光片成像***与传统的光片***在成像面以及重构面上的样本成像结果的对比。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明的目的在于提供一种大视场以及高轴向分辨率的高通量显微扫描成像方法。普通的光片照明显微镜使用的是高斯光片存在轴向高分辨率与大视场的不可调和的问题，本发明提出了以双侧贝塞尔光路的同步照明方式来同时获取较高的轴向分辨率与极大视野。本发明不仅兼顾了传统光片技术所具有的高通量、低光漂白的特性，解决了视野与轴向分辨率这一经典矛盾，也同时避免了普通光片产生时极大损失光功率的问题。

图1为本发明提供的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法示意图，如图1所示，包括以下步骤：

S101，通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；

S102，通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；

S103，将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；

S104，通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

移动样本，重复上述过程直到扫描获取完整的样本图像。

其中，使用低数值孔径的物镜作为探测物镜，在拥有较大景深的前提下贝塞尔光束具有的旁瓣效应不可忽视，必须引入同步机制对旁瓣加以抑制，同步机制即为在样本移动的过程中，两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。

其中，双侧照明光束(贝塞尔光束)在与探测光路垂直的产生光路方向上完全对齐后，贝塞尔光束中心主极强直径与探测器的电子狭缝宽度匹配，双侧照明光束在空间中完全对齐后，与探测器的电子狭缝宽度匹配，实现空间与时间的完全同步单方向扫描。双侧光束投射方向为相对x轴方向；扫描方向为y轴方向；样本的荧光采集方向为z轴方向。双侧扫描激光完全重合且同步扫描，扫描速度严格一致。

双侧扫描激光光束扫描初始位置在扫描阵列y轴正方向，两束贝塞尔光束完全重合呈线状，从y轴正方向致y轴负方向单方向扫描，同时电子狭缝宽度一定同步曝光读出。

具体地，将一频率、功率稳定的激光光源产生的光信号分为功率近似相等的两路分别用于与探测光路垂直的产生光路的相对方向进行双侧照明；通过贝塞尔光生成元件结合光路结构设计的光片生成部分将输入的两束高斯光束近似无衰减的转换成高强度的贝塞尔光束，同时高速扫描形成虚拟光片。其中，高速扫描贝塞尔光束可近似为光片，因此也可称其为虚拟光片。虚拟光片用于激发样本荧光。两束贝塞尔光束通过光路设计结合电动控制下进行对齐后同步投射在样本上，激发样本光片处的荧光；探测收集样本由光片激发产生的荧光并在sCMOS阵列上进行曝光成像；在探测光路即z轴上以步进的方式移动样本，重复上述过程直到扫描获取完整的样本图像；

其中，将同一激光光源产生的激光分为两束分别用于双侧照明，并严格控制双侧的激光光束功率相同，以获得两路性质一致的照明光束保证照明均匀。

进一步地，通过扫描***结合光学元件在电动控制下使贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

进一步地，双侧产生的贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴即与光束传播方向垂直的正向边缘，同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的图像扫描并折返。

进一步地，在相对于高倍物镜大数值孔径的前提下，本发明为获得大视野以低倍物镜低数值孔径的物镜作为探测光路上的采集物镜，探测器特有的曝光模式下形成一电子狭缝，设置其行数与扫描光束宽度严格同步并同步进行单方向扫描。

进一步地，双侧投射在样本上的扫描激光完全重合在产生光路的传播方向上呈一均匀直线，使视野长度达到数毫米。

相应地，如图2所示，本发明提供一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，包括：照明单元1、贝塞尔光束产生单元2、探测成像单元3以及控制单元4。

照明单元1，用于产生两路准直且强度一致的高斯激光光束。具体地，照明单元包括：激光光源，用于产生一束准直的高斯激光。分光结构，用于将激光源产生的高斯激光分为光强相等的两束激光用于双侧照明。

贝塞尔光束产生单元2，用于将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束，将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本5产生荧光。具体地，将高斯光束转化为单光束轴向只有数微米，传播长度可达数毫米的贝塞尔光束，同时高速扫描形成虚拟光片。

探测成像单元4，通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本5的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。具体地，采用低数值孔径的探测物镜采集荧光产生的激发光，同时提供图像传感器进行曝光成像。

控制单元3，用于控制探测器的电子狭缝与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，以及控制样本移动，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，控制两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。具体地，在大景深的条件下，为了消除旁瓣效应，同时控制探测器的电子狭缝与扫描成像动作进行荧光探测和图像同步曝光，完成一次扫描阵列的成像后控制样本夹持在z轴方向步进。

可选地，两路贝塞尔光束投射到样本上为x轴方向，且双侧贝塞尔光束的投射方向相反。控制单元3用于控制两束贝塞尔光束同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样本的荧光采集方向为z轴方向，通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

可选地，贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

可选地，控制单元3用于控制两路贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴的正向边缘，并同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的样本图像扫描并折返。

进一步地，贝塞尔光片产生单元2包括：衰减片，用于严格控制双侧光束功率相等；光片产生结构，用于将高斯光束转化为轴向只有数微米，传播长度可达数毫米的贝塞尔光束，同时控制扫描***以形成虚拟光片。

进一步地，探测成像单元4包括：探测单元，采用低数值孔径的探测物镜采集荧光产生的激发光；图像传感器，用于对样本层层曝光成像并输出成像数据。

进一步地，控制单元3，在大景深的条件下，为消除旁瓣效应，控制探测器的电子狭缝行数的同时，与扫描成像动作同步进行荧光探测和图像曝光，完成一次扫描阵列的成像后，控制样本夹持在z轴负方向即远离探测器方向步进。

以下为本发明提供的两个具体实施例：

实施例1

本发明实施例提供的一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法是一种将一个激光光源严格分为两束扫描激光，通过贝塞尔光片生成机制生成大视野下的贝塞尔光片，执行严格同步扫描的方法。针对透明化样本：形成的极薄光片通过样本，激发荧光，通过图像传感器同步曝光并输出图像。

本实施例中，通过将一个稳定光源分成两路再分别与衰减片结合，严格保证两路激光属性相同，包括：频率、光强等。

本实施例中，通过光片产生结构，将输入的高斯激光在不损失信号功率的条件下转化为高强度的贝塞尔光束，且贝塞尔光束的长度足够长以覆盖数毫米的大视野。

本实施例中，双侧贝塞尔光束需在空间中高精度对齐，且在扫描数毫米的大视野下不发生畸变。

本实施例中，采用低数值孔径的探测物镜，在获得大景深的同时，需要采用电子狭缝与双侧贝塞尔光束进行严格同步。

本实施例中，通过扫描***将两路独立的贝塞尔光束在与探测阵列平行的方向上的电子狭缝进行完全同步扫描，同时激发样品荧光信号，并进行曝光重构图像。

鉴于贝塞尔光束本身具有的零衍射，保型性等特点，在使用其作为照明光束时，使用特殊的光片生成结构在达到轴向数微米的高分辨的同时在传播方向的数毫米的视野内不发生畸变。

同时鉴于方法本身的原理要求，使用低数值孔径的物镜作为探测，在大视野下拥有极大景深，足以覆盖贝塞尔光束的多级旁瓣，若不对旁瓣进行抑制，图像将有较多的焦外激发使对比度和动态范围进一步下降。两路扫描激光信号应位于同一时空坐标系下，与电子狭缝结合同时完成扫描共获取一张图像信息，避免交错重叠或干扰叠加。贝塞尔光束投射到样品上为x轴方向，且双侧光束投射方向相反，两束激光同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样品的荧光采集方向为z轴方向。通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

两束对齐的贝塞尔光束扫描初始位置位于扫描阵列的正向边缘，同步扫描且扫描方向相同。如图3所示，两路扫描信号投射在样品上，对样品进行线状激发，因此采集到的荧光也将获得线状曝光。两路贝塞尔光束完全叠加对齐，保证在数毫米大视野下的完全覆盖，且在贝塞尔光束本身具有的零衍射，保型性的基础上进一步对极具散射特性的深层组织，大样品，增加了透射深度。

鉴于样本经过透明化处理，具有一定的三维尺度，通过光片扫描信号能够完整获得图像信息；本实施例提供的方法为，设计精准的三维控制台，精确调节样本位置实现层析，获取多个切面的图像信息，最后重构形成三维立体图像。

参见图2，扫描信号通过物镜与物镜分别从两侧以线状相对投射在样品上，使激发荧光呈线状与电子狭缝同步。

参见图3，扫描曝光方式为线性曝光，最终于扫描同步的曝光图像也是线性输出的。

参见图4，贝塞尔光束与普通光片***使用的高斯光束相比，除具有零衍射、保型性的特点外，没有瑞丽范围的限制而极适用于大视野扫描成像。

实施例2

使用转基因GFP标记的小鼠作为观察对象，荧光信号在神经细胞中表达，如皮层的椎体神经元，星型异质细胞，已及较深层的海马细胞。神经细胞在488纳米的激发波长下发射绿色荧光。如使用普通的宽场照明倒置荧光显微镜观察，由于广泛的焦外光照射，图像对比度极低，光污染严重；若使用普通的光片显微成像装置，要覆盖整个鼠脑视野，必将使用极厚光片，轴向分辨率将大打折扣，若使用较薄光片以达到较高的轴向分辨率，可覆盖视野将大大缩小。而采用大视野无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，结合了贝塞尔光束无衍射、保型性的特点实现了大视场扫描成像；同时采用电子狭缝与贝塞尔光束严格同步又极大抑制了贝塞尔光束的旁瓣，使成像图像对比度更高，动态范围更大。

参见图5，左侧为采用大视野无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法产生的一层极薄光片拍摄的鼠脑皮层锥体神经元细胞，成像面几乎完全杜绝了焦外光的污染，得到的皮层图像清晰，对比度高。重构面的轴向分辨率也极高，可实现高质量的三维成像。而图5右侧展示的是传统的光片显微成像***对同一样本，同一区域的成像。通过对比可直观看到，本发明在成像面对焦外光的抑制更好；而传统的光片显微成像***轴向重构的分辨率以及郊外污染非常糟糕，结构完全无法解析。采用本发明方法获得的重构面图像的轴向分辨率与对比度均获得了显著的提升，可清晰分辨神经细胞结构，而对应的三维重构效果也获得极大提升，可以清晰展示三维神经细胞的空间结构信息。所以采用本大视野无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法可实现对鼠脑的真正意义上的三维成像和完美重构。

本发明属于显微成像技术领域，公开了一种大视场无衍射贝塞尔光片显微同步扫描成像方法，由于贝塞尔光束本身具有的无衍射，保型性等特点，在实际应用中可传播较长长度，于深层组织中透射更深，可覆盖大视野。采用低数值孔径的物镜作为探测，双侧贝塞尔光束通过对齐机制进行严格对齐后必须与探测器的电子狭缝在时间与空间上完全同步并做单方向扫描以在大景深中消除旁瓣效应。光束投射方向为x轴方向；扫描方向为y轴方向；样本的荧光采集方向为z轴方向，双侧贝塞尔光束同步从扫描阵列的y轴正向边缘直至负向边缘。本发明通过双侧贝塞尔光片照明进行扫描显微成像，以期在高通量，低漂白的成像特点下，实现数毫米大视野与数微米的高轴向分辨。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；

通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；

将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；

通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

2.根据权利要求1所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，其特征在于，还包括以下步骤：

移动样本，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。

3.根据权利要求1或2所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，其特征在于，两路贝塞尔光束投射到样本上为x轴方向，且双侧贝塞尔光束的投射方向相反，两束贝塞尔光束同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样本的荧光采集方向为z轴方向，通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

4.根据权利要求3所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，其特征在于，所述贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

5.根据权利要求3所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，其特征在于，两路贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴的正向边缘，并同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的样本图像扫描并折返。

6.一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，其特征在于，包括：照明单元、贝塞尔光束产生单元以及探测成像单元；

照明单元，用于产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；

贝塞尔光束产生单元，用于将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束，将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；

探测成像单元，通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

7.根据权利要求6所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，其特征在于，还包括：控制单元；

控制单元，用于控制探测器的电子狭缝与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，以及控制样本移动，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，控制两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。

8.根据权利要求6或7所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，其特征在于，两路贝塞尔光束投射到样本上为x轴方向，且双侧贝塞尔光束的投射方向相反，所述控制单元，用于控制两束贝塞尔光束同时同步进行扫描，且扫描速度一致，扫描方向为y轴方向，激发样本的荧光采集方向为z轴方向，通过光束对齐机制使两束贝塞尔光在三维空间中完全对齐且与扫描阵面的电子狭缝平行，控制探测器的电子狭缝宽度与贝塞尔光束的宽度一致，从而同步扫描以抑制焦平面外的杂散光，保证图像质量。

9.根据权利要求8所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，其特征在于，所述贝塞尔光束在空间中覆盖7至8毫米大视场，进行扫描的同时不发生畸变。

10.根据权利要求8所述的大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像***，其特征在于，所述控制单元，用于控制两路贝塞尔光束同时投射在扫描阵列的y轴的正向边缘，并同时扫描至y轴负向边缘，直至完成扫描阵面内的样本图像扫描并折返。