JP5914242B2 - 観察装置 - Google Patents
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Description
本発明は、観察装置に関するものである。
対物レンズの光軸方向の任意位置の観察面において観察対象物を観察することを意図した観察装置の発明が特許文献１，２に開示されている。これらの文献に記載された観察装置は、観察対象物を載せるスライドガラスの表面または裏面からの反射光の強度が大きいことを利用して、スライドガラスの表面または裏面を基準観察面として検出し、観察対象物における所望の観察面と基準観察面との間の距離だけスライドガラスを光軸方向に移動させることで、所望の観察面において観察対象物を観察する。
また、例えば観察対象物が細胞である場合、観察対象物の生理学的情報を取得したいときもあり、観察対象物の形態的情報を取得したいときもある。観察対象物の生理学的情報を取得するには、観察対象物内の特定部位を蛍光色素で標識しておいて、その観察対象物に励起光を照射したときに発生する蛍光の像を撮像すればよい。一方、観察対象物の形態的情報を取得するには、低コヒーレンス光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物に照射したときに生じる第１反射光と、第２分岐光を参照ミラーに照射したときに生じる第２反射光とを干渉させ、その干渉像を撮像すればよい（非特許文献１，２を参照）。
H. Iwai, C. Fang-Yen, G. Popescu,A. Wax, K. Badizadegan, R. R. Dasari, and M. S. Feld, "Quantitative phaseimaging using actively stabilized phase-shifting low-coherenceinterferometry," Opt. Lett., Vol.29, No.20, pp.2399-2401 (2004).
T. Yamauchi, H. Iwai, M. Miwa,and Y. Yamashita, "Low-coherent quantitative phase microscope fornanometer-scale measurement of living cells morphology," Opt. Express, Vol.16,No.16, pp.12227-12238 (2008).
ところで、観察対象物の生理学的情報および形態的情報を実質的に同時に取得することができれば、その観察対象物について様々な有用な知見を獲得することができると期待される。しかし、蛍光像を撮像する観察装置と干渉像を撮像する観察装置とを単純に組み合わせるのみでは、観察対象物中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を取得することは困難である。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、観察対象物中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することが容易にできる観察装置を提供することを目的とする。
本発明の観察装置は、(1) 励起光を出力する励起光源と、(2) 励起光源から出力された励起光を観察対象物に照射するとともに、当該照射に応じて観察対象物で発生した蛍光を受ける対物レンズと、(3) 観察対象物で発生し対物レンズを通過した蛍光の像を撮像する蛍光撮像部と、(4) 観察対象物を搭載し、対物レンズの光軸方向に移動自在な搭載部と、(5) 干渉撮像用光を出力する干渉撮像用光源と、(6) 位置検出用光を出力する位置検出用光源と、(7) 干渉撮像用光源から出力された干渉撮像用光と、位置検出用光源から出力された位置検出用光とを、合波して出力する合波部と、(8) 合波部により合波されて出力された光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光として出力し、対物レンズを介して第１分岐光を観察対象物または搭載部に照射するとともに当該照射に応じて発生した第１反射光を入力し、第２分岐光を参照ミラーに照射するとともに当該照射に応じて発生した第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて出力する干渉光学系と、(9) 干渉光学系から出力された光を干渉撮像用光と位置検出用光とに分波して出力する分波部と、(10) 分波部から出力された干渉撮像用光の干渉像を撮像する干渉撮像部と、(11) 分波部から出力された位置検出用光の干渉強度を検出する光検出部と、(12) 光検出部による検出結果を取得し、搭載部の位置決め動作、蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作を制御する制御部と、を備えることを特徴とする。
さらに、本発明の観察装置では、制御部が、光検出部による干渉強度検出結果に基づいて、位置検出用光源から搭載部を経て光検出部に到るまでの位置検出用光の光路と、位置検出用光源から参照ミラーを経て光検出部に到るまでの位置検出用光の光路との光路長差を求め、その求めた光路長差に基づいてフィードバック制御をすることで搭載部の位置を目標位置とし、搭載部の目標位置において蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作の双方または何れか一方を行わせることを特徴とする。
本発明の観察装置では、位置検出用光源から出力された位置検出用光が、対物レンズを経て、観察対象物が存在しない搭載部上の位置に照射されるのが好適である。制御部が、搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて蛍光撮像部の撮像動作または干渉撮像部の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像または２次元の干渉像を取得し、これらに基づいて観察対象物の３次元の蛍光像または３次元の干渉像を取得するのが好適である。制御部が、干渉撮像部により撮像された干渉像に基づいて干渉強度像または干渉位相像を求めるのが好適である。また、本発明の観察装置は、蛍光撮像部により撮像された蛍光像と干渉撮像部により撮像された干渉像とを表示する表示部を更に備えるのが好適である。
本発明の観察装置では、制御部が、搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像および２次元の干渉像を同期して取得し、これらに基づいて観察対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得するのが好適である。
本発明の観察装置は、搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて、形状が既知である物体を標準対象物として、蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作を行わせて標準対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得し、これら３次元の蛍光像および３次元の干渉像の光軸方向の相対位置に差が生じている場合に、蛍光撮像部を光軸方向に動かすことによって３次元の蛍光像および３次元の干渉像の相対位置が重なるように光学系の微調整を行った上で種々の観察対象物の撮像を行うのが好適である。
本発明の観察装置は、搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて、形状が既知である物体を標準対象物として、蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作を行わせて標準対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得し、これら３次元の蛍光像および３次元の干渉像の光軸方向の相対位置に差が生じている場合に、蛍光像を結像させるレンズのうち干渉像の結像条件と独立に動かし得るものを光軸方向に動かすことによって３次元の蛍光像および３次元の干渉像の相対位置が重なるように光学系の微調整を行った上で種々の観察対象物の撮像を行うのが好適である。
本発明の観察装置は、励起光源および蛍光撮像部が共焦点顕微鏡の構成を有するのが好適である。本発明の観察装置は、励起光源がパルス幅１０００フェムト秒以下の短パルスレーザであり、励起光源および蛍光撮像部が二光子励起顕微鏡の構成を有するのも好適である。また、本発明の観察装置は、観察対象物内での蛍光共鳴エネルギー移動に起因する蛍光を蛍光撮像部が撮像するのも好適である。
本発明の観察装置は、観察対象物の内部の顆粒状の物体を蛍光染色し、観察対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を時系列で複数枚撮像し、蛍光染色された顆粒状の物体と観察対象物の表面または内部の膜状の構造との相対的な位置関係を可視化するのが好適である。
本発明の観察装置は、観察開始時において、観察の全時間幅に比して短い時間のみ、励起光源による励起光の照射を行うとともに、蛍光撮像部の撮像動作および干渉撮像部の撮像動作を行い、この動作により得られた画像から蛍光標識された物体と干渉撮像によって特徴抽出された物体との対応付けを行い、この観察開始時の撮像終了後は、励起光源による励起光の照射を行わずに、干渉撮像部の撮像動作のみを行うことによって、蛍光標識された物体の経時的観察を行うのが好適である。
本発明の観察装置は、観察対象物中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することが容易にできる。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
図１は、本実施形態の観察装置１の構成を示す図である。観察装置１は、スライドガラス４１上に搭載された観察対象物９０中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することができる装置であって、励起光源１１、フィルタ１２、ダイクロイックミラー１３、レンズ１４、ダイクロイックミラー１５、対物レンズ１６、フィルタ１７、蛍光撮像部１８、干渉撮像用光源２１、フィルタ２２、ダイクロイックミラー２３、レンズ２４、ハーフミラー２５、対物レンズ２６、レンズ２７、ダイクロイックミラー２８、干渉撮像部２９、位置検出用光源３１、光検出部３２、スライドガラス４１、アクチュエータ４２、参照ミラー４３、アクチュエータ４４、制御部５１および表示部５２を備える。
観察対象物９０は例えば細胞であり、観察対象物内９０の特定部位は蛍光色素により標識されている。励起光源１１は、その蛍光色素を励起し得る波長λＰの励起光を出力する。励起光源１１は、レーザ光源であってもよいし、その他の任意の光源であってもよい。フィルタ１２は、励起光源１１から出力される光のうち特定波長λＰの励起光を選択的に透過させる。ダイクロイックミラー１３は、フィルタ１２から到達する励起光λＰを反射させ、観察対象物９０で発生する蛍光λＦを透過させる。ダイクロイックミラー１５は、ダイクロイックミラー１３により反射されてレンズ１４を経て到達する励起光λＰを透過させ、観察対象物９０で発生する蛍光λＦを透過させ、干渉撮像用光源２１および位置検出用光源３１それぞれから出力される光を反射させる。
対物レンズ１６は、励起光源１１から出力されてフィルタ１２，ダイクロイックミラー１３，レンズ１４およびダイクロイックミラー１５を経た励起光λＰを、スライドガラス４１に載せられた観察対象物９０に照射する。対物レンズ１６は、観察対象物９０への励起光λＰの照射に応じて観察対象物９０で発生する蛍光λＦを受ける。対物レンズ１６は、干渉撮像用光源２１および位置検出用光源３１それぞれから出力されてダイクロイックミラー１５により反射された光をスライドガラス４１または観察対象物９０に照射する。また、対物レンズ１６は、これらの光の照射に応じてスライドガラス４１または観察対象物９０で発生する反射光を受ける。
フィルタ１７は、観察対象物９０で発生して対物レンズ１６，ダイクロイックミラー１５，レンズ１４およびダイクロイックミラー１３を経て到達した光のうち、蛍光λＦを選択的に透過させ、他の波長の光を遮断する。蛍光撮像部１８は、フィルタ１７を透過して到達した蛍光λＦを受光して、観察対象物９０で発生した蛍光λＦの像を撮像することができる。対物レンズ１６から蛍光撮像部１８の撮像面へ至る迄の蛍光λＦの結像光学系が固定であれば、蛍光撮像部１８は、対物レンズ１６から光軸方向に沿って一定距離の位置（および、その近傍）にある観察面における蛍光像を取得することができる。
励起光源１１および蛍光撮像部１８は共焦点顕微鏡の構成を有していてもよい。励起光源１１はパルス幅１０００フェムト秒以下の短パルスレーザであり、励起光源１１および蛍光撮像部１８は二光子励起顕微鏡の構成を有していてもよい。また、観察対象物９０内での蛍光共鳴エネルギー移動に起因する蛍光を蛍光撮像部１８が撮像してもよい。
干渉撮像用光源２１は、波長λＩの干渉撮像用光を出力する。干渉撮像用光λＩは低コヒーレント光であることが望ましい。干渉撮像用光源２１は例えばハロゲンランプや白色高輝度ＬＥＤであるのが好適である。フィルタ２２は、干渉撮像用光源２１から出力される光のうち特定波長λＩの干渉撮像用光を選択的に透過させる。
位置検出用光源３１は、波長λＺの位置検出用光を出力する。位置検出用光λＺは概ね高コヒーレント光であることが望ましい。位置検出用光源３１は、レーザ光源であるのが好適であり、数ｎｍの波長帯域幅を有する光を出力することができるＳＬＤ（Super Luminescent Diode）等であってもよい。
なお、励起光源１１から出力される励起光の波長λＰ、観察対象物９０で発生する蛍光の波長λＦ、干渉撮像用光源２１から出力される干渉撮像用光の波長λＩ、および、位置検出用光源３１から出力される位置検出用光の波長λＺは、図２にスペクトルの一例が示されるように、互いに重なることはない。
ダイクロイックミラー２３は、干渉撮像用光源２１から出力されてフィルタ２２を経て到達した干渉撮像用光λＩを反射させ、位置検出用光源３１から出力された位置検出用光λＺを透過させて、これら干渉撮像用光λＩと位置検出用光λＺとを合波して出力する合波部として作用する。
ハーフミラー２５は干渉光学系として作用する。すなわち、ハーフミラー２５は、ダイクロイックミラー２３により合波されて出力されレンズ２４を経て到達した光（干渉撮像用光λＩおよび位置検出用光λＺ）を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光をダイクロイックミラー１５へ出力し、第２分岐光を対物レンズ２６へ出力する。第１分岐光は、ダイクロイックミラー１５および対物レンズ１６を経て観察対象物９０またはスライドガラス４１に照射される。この第１分岐光の照射に応じて発生する第１反射光は、対物レンズ１６およびダイクロイックミラー１５を経てハーフミラー２５に到達する。第２分岐光は対物レンズ２６を経て参照ミラー４３に照射され、この第２分岐光の照射に応じて発生する第２反射光は対物レンズ２６を経てハーフミラー２５に到達する。そして、ハーフミラー２５は、観察対象物９０またはスライドガラス４１で発生した第１反射光を入力するとともに、参照ミラー４３で発生した第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させてレンズ２７へ出力する。
なお、以下では、ハーフミラー２５から対物レンズ１６を経て或る観察面に至る迄の第１分岐光の光路と、その観察面から対物レンズ１６を経てハーフミラー２５に至る迄の第１反射光の光路とを併せて、第１光路という。また、ハーフミラー２５から対物レンズ２６を経て参照ミラー４３の反射面に至る迄の第２分岐光の光路と、参照ミラー４３の反射面から対物レンズ２６を経てハーフミラー２５に至る迄の第２反射光の光路とを併せて、第２光路という。
また、ハーフミラー２５から対物レンズ１６を経て照射される第１分岐光に含まれる位置検出用光λＺは、対物レンズ１６の視野内において観察対象物９０が存在しないスライドガラス４１の表面に照射されるのが好適である。また、スライドガラス４１の表面は位置検出光λＺの波長に対して反射増強コーティングされているのが好適である。
ダイクロイックミラー２８は、ハーフミラー２５から出力されてレンズ２７を経て到達した光を受け、その光のうち干渉撮像用光λＩを干渉撮像部２９へ反射させ、位置検出用光λＺを光検出部３２へ透過させる。ダイクロイックミラー２８は、干渉撮像用光λＩと位置検出用光λＺとに分波して出力する分波部として作用する。
干渉撮像部２９は、ダイクロイックミラー２８により反射された干渉撮像用光λＩの干渉像を撮像する。或る観察面について第１光路および第２光路それぞれの光路長の差が干渉撮像用光λＩのコヒーレント長程度以下であるときに、その観察面からの反射光λＩと参照ミラー４３からの反射光λＩとが干渉するので、干渉撮像部２９は、その観察面の干渉像を撮像することができる。
光検出部３２は、ダイクロイックミラー２８を透過した位置検出用光λＺの干渉強度を検出する。観察対象物９０を搭載するスライドガラス４１は、アクチュエータ４２により対物レンズ１６の光軸方向に移動自在である。また、参照ミラー４３は、アクチュエータ４４により対物レンズ２６の光軸方向に移動自在である。スライドガラス４１および参照ミラー４３それぞれの位置が変化すると、光検出部３２により検出される干渉強度も変化する。
制御部５１は、光検出部３２による干渉強度検出結果に基づいて、位置検出用光源３１からスライドガラス４１を経て光検出部３２に到るまでの位置検出用光λＺの光路と、位置検出用光源３１から参照ミラー４３を経て光検出部３２に到るまでの位置検出用光λＺの光路との光路長差を求めることができる。そして、制御部５１は、その求めた光路長差に基づいてフィードバック制御をすることでスライドガラス４１の位置を目標位置とし、スライドガラス４１の目標位置において蛍光撮像部１８の撮像動作および干渉撮像部２９の撮像動作の双方または何れか一方を行わせる。
制御部５１は、蛍光撮像部１８による撮像で得られた蛍光像を取得するとともに、干渉撮像部２９による撮像で得られた干渉像を取得する。表示部５２は、その蛍光像および干渉像を表示する。表示部５２は、画面上で蛍光像および干渉像を左右に並べて表示してもよいし、蛍光像と干渉像とを互いに重ねて表示してもよい。
制御部５１は、スライドガラス４１の複数の目標位置（好ましくは一定間隔の複数の目標位置）それぞれにおいて蛍光撮像部１８の撮像動作または干渉撮像部２９の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像または２次元の干渉像を取得すれば、これらに基づいて観察対象物９０の３次元の蛍光像または３次元の干渉像を取得することもできる。この場合、表示部５２は、観察対象物９０中の任意の平面（例えば対物レンズ１６の光軸に平行な平面）における２次元の蛍光像または２次元の干渉像を表示することができる。
また、制御部５１は、スライドガラス４１の複数の目標位置それぞれにおいて蛍光撮像部１８の撮像動作および干渉撮像部２９の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像および２次元の干渉像を同期して取得し、これらに基づいて観察対象物９０の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得してもよい。
観察装置１は、対物レンズ１６と観察対象物９０との間の距離の変化によってのみ第１光路と第２光路との光路長差が変化するように構成されるのが好適である。その為には、ダイクロイックミラー１５、対物レンズ１６、ハーフミラー２５、対物レンズ２６、アクチュエータ４２およびアクチュエータ４３は、共通の剛性のある基盤上に固定されるのが好適である。
次に、位置検出用光源３１および光検出部３２によりスライドガラス４１の位置をモニタリングしてフィードバック制御する方法について説明する。図３は、対物レンズ１６の視野における観察対象物９０および位置検出用光λＺの照射位置ＰＺを示す図である。同図に示されるように、位置検出用光λＺは、観察対象物９０が細胞である場合に該観察対象物９０の動きによって検出結果が変化しないように、観察対象物９０に照射されるのではなく、観察対象物９０が存在しないスライドガラス４１上の照射位置ＰＺに対して垂直に照射されるのが好ましい。なお、位置検出用光λＺの照射位置ＰＺは、スライドガラス４１でなくてもよく、アクチュエータ４２によりスライドガラス４１とともに移動する部位であってもよい。
図４は、位置検出用光源３１からスライドガラス４１までの位置検出用光λＺの光学系を示す図である。同図では、位置検出用光λＺの光学系上にあるダイクロイックミラー２３，ハーフミラー２５およびダイクロイックミラー１５の図示が省略されている。レンズ２４の焦点距離をｆ２４とし、対物レンズ１６の焦点距離をｆ１６とする。例えば、レンズ２４の焦点距離ｆ２４は２００ｍｍ程度であり、対物レンズ１６の焦点距離ｆ１６は１０ｍｍ程度である。
位置検出用光λＺの光学系は、レンズ２４と対物レンズ１６との間の光路長が ｆ２４＋ｆ１６となるように設定される。また、位置検出用光源３１は、位置検出用光λＺの光学系の光軸Ａｘに対して垂直な方向にずれた位置に配置され、光軸Ａｘに平行な方向に位置検出用光λＺを出力する。
このように位置検出用光源３１からスライドガラス４１までの位置検出用光λＺの光学系が設定されることにより、位置検出用光源３１から出力される位置検出用光λＺは、レンズ２４により一旦集光された後に拡がって対物レンズ１６に入力され、この対物レンズ１６によりコリメートされて、観察対象物９０が存在しないスライドガラス４１上の照射位置ＰＺに対して垂直に照射され得る。これにより、対物レンズ１６の視野の中央領域に観察対象物９０を配置することができ、また、観察対象物９０が存在しないスライドガラス４１上の照射位置ＰＺに対して位置検出用光λＺを垂直に照射することができる。
スライドガラス４１に対して位置検出用光λＺが垂直入射しているか否かは以下のようにして確認することができる。ダイクロイックミラー２８に替えてミラーを配置し、このミラーにより位置検出用光λＺを反射させて干渉撮像部２９に入射させることで、対物レンズ１６の視野における位置検出用光λＺの照射位置ＰＺを干渉撮像部２９により観察することができる。そして、アクチュエータ４２によりスライドガラス４１を上下移動させたときに、干渉撮像部２９により観察される位置検出用光λＺの照射位置ＰＺが動かなければ、スライドガラス４１に対して位置検出用光λＺが垂直入射していることになる。仮に、干渉撮像部２９により観察される位置検出用光λＺの照射位置ＰＺが動く場合には、位置検出用光源３１の配置の方位を調整する。なお、干渉撮像部２９が波長λＺに対して充分な感度を有していない場合には、干渉撮像部２９の受光面の前に設けられた波長変換素子により、干渉撮像部２９が感度を有する波長の光に変換すればよい。
光検出部３２による位置検出用光λＺの干渉強度の検出結果に基づいてスライドガラス４１の位置をモニタすることができる。具体的には、光検出部３２による位置検出用光λＺの干渉強度のゼロクロス点を用いて、スライドガラス４１の位置をモニタリングしてフィードバック制御することができる。より好適には、非特許文献１に記載されているように、対物レンズ２６の光軸に沿ってアクチュエータ４４を小振幅（例えば振幅１０ｎｍ程度）かつ高周波数（例えば周波数３ｋＨｚ以上）で正弦波状に上下動させることで光検出部３２の出力信号を変調させ、この光検出部３２の出力信号を復調すれば、波長λＺの数百分の一の精度でスライドガラス４１の位置をモニタリングしてフィードバック制御することができる。
図５は、スライドガラス４１の位置の時間的変化の例を示す図である。位置検出用光源３１および光検出部３２によりスライドガラス４１の位置を高精度にモニタリングしてフィードバック制御することができるので、観察対象物９０について必要なアプリケーションに応じて、同図（ａ）に示されるように対物レンズ１６の光軸に沿ってスライドガラス４１の位置をシーケンシャルに設定してもよいし、同図（ｂ）に示されるように対物レンズ１６の光軸に沿ってスライドガラス４１の位置をランダムに設定してもよい。後者の場合、例えば、観察対象物９０のうち生理学的に興味深い信号が得られているフォーカス面を至適な順序でランダムにアクセスしてもよい。
次に、観察対象物９０中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得する方法について説明する。蛍光撮像部１８により得られる蛍光像は、観察対象物９０と蛍光撮像部１８との間にある結像光学系（対物レンズ１６およびレンズ１４）により蛍光撮像部１８の撮像面に結像される観察対象物９０中の平面（以下「蛍光観察面」という。）の近傍で発生した蛍光λＦの像である。一方、干渉撮像部２９により得られる干渉像は、第１光路および第２光路それぞれの光路長の差が０となる観察対象物９０中の平面（以下「干渉観察面」という。）の近傍で発生した位置検出用光λＺの反射光の像である。
図６は、対物レンズ１６とスライドガラス４１との配置関係を示す図である。蛍光観察面と干渉観察面とを共通の観察面Ｓとすることで、観察対象物９０中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することができる。同図（ａ）では、共通の観察面Ｓがスライドガラス４１の上面に設定されている。同図（ｂ）では、同図（ａ）に対してアクチュエータ４２によりスライドガラス４１が下方に移動しており、共通の観察面Ｓが観察対象物９０中に設定されている。位置検出用光源３１および光検出部３２によりスライドガラス４１の位置をモニタリングしてフィードバック制御しながら、アクチュエータ４２によりスライドガラス４１を移動させることで、観察対象物９０中の任意の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することができる。
蛍光観察面と干渉観察面とを共通の観察面Ｓとするには、スライドガラス４１の複数の目標位置それぞれにおいて、形状が既知である物体（例えば蛍光ビーズ）を標準対象物として、蛍光撮像部１８の撮像動作および干渉撮像部２９の撮像動作を行わせて標準対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得する。そして、これら３次元の蛍光像および３次元の干渉像の光軸方向の相対位置に差が生じている場合に、蛍光撮像部１８を光軸方向に動かすことによって、または、蛍光像を結像させるレンズのうち干渉像の結像条件と独立に動かし得るものを光軸方向に動かすことによって、３次元の蛍光像および３次元の干渉像の相対位置が重なるように光学系の微調整を行えばよい。
図７は、蛍光観察面と干渉観察面とを共通の観察面Ｓとする方法を説明する図である。同図（ａ）に示されるように既知の半径を有する蛍光ビーズ９１をスライドガラス４１上に載置して、アクチュエータ４２によりスライドガラス４１を上下に移動させながら、蛍光撮像部１８により蛍光像を取得するとともに、干渉撮像部２９により干渉像を取得することで、同図（ｂ）に示されるように蛍光像および干渉像それぞれのＺ方向強度分布を求める。このような蛍光ビーズは、半径の誤差が１％未満であるものが市販品として入手可能である。
このようにして求められた蛍光像のＺ方向強度分布は蛍光ビーズ９１の中心位置で最大となる。また、干渉像のＺ方向強度分布はスライドガラス４１の上面位置で最大となる。蛍光ビーズ９１の中心位置はスライドガラス４１の上面位置より蛍光ビーズ９１の半径と等しい距離だけ上方にある。したがって、最大蛍光強度位置が最大干渉強度位置より蛍光ビーズ９１の半径と等しい距離だけ上方にあれば、蛍光観察面と干渉観察面とが共通の観察面となっていることが判る。
蛍光観察面と干渉観察面とを共通の観察面とするには、最大蛍光強度位置が最大干渉強度位置より蛍光ビーズ９１の半径と等しい距離だけ上方になるように、蛍光撮像部１８または干渉撮像部２９の各光軸方向の位置を調整したり、参照ミラー４３の光軸方向の位置を調整したりすればよい。このような事前の光学系の調整を一度行うことで、以降は観察対象物９０中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することができる。
次に、干渉撮像部２９により得られる干渉像に基づいて干渉強度像および干渉位相像を求める方法について説明するとともに、観察対象物９０中の共通の観察面における蛍光像，干渉強度像および干渉位相像を実質的に同時に取得する方法について説明する。なお、干渉像は強度情報および位相情報を含み、干渉強度像は干渉像の強度情報を示す像であり、干渉位相像は干渉像の位相情報を示す像である。
干渉強度像および干渉位相像を求めるには位相シフト法が用いられる（非特許文献２参照）。すなわち、アクチュエータ４４により参照ミラー４３を干渉撮像用光の波長λＩの４分の１ずつ動かして４枚の干渉像の組ＰＭを取得し、これら４枚の干渉像の組ＰＭを演算処理することで干渉強度像および干渉位相像を求めることができる。或いは、アクチュエータ４２によりスライドガラス４１および観察対象物９０を波長λＩの４分の１ずつ動かしてもよい。
図８は、干渉撮像部２９により得られる干渉像，干渉強度像および干渉位相像それぞれの取得タイミングを説明する図である。同図（ａ）に示されるように、参照ミラー４３またはスライドガラス４１を波長λＩの４分の１ずつステップ的に上昇させていって各ステップにおいて干渉像を取得し、４枚ずつ組にして各組の４枚の干渉像を演算処理することで干渉強度像および干渉位相像を求めてもよい。或いは、同図（ｂ）に示されるように、参照ミラー４３またはスライドガラス４１を波長λＩの４分の１ずつステップ的に降下させていって各ステップにおいて干渉像を取得し、４枚ずつ組にして各組の４枚の干渉像を演算処理することで干渉強度像および干渉位相像を求めてもよい。求められる干渉強度像および干渉位相像は、実質的に、各組の４枚の干渉像のうち第２干渉像の干渉観察面と第３干渉像の干渉観察面との中間位置にある観察面のものである。
図９は、蛍光撮像部１８により得られる蛍光像の取得タイミングを説明する図である。理想的には、個々の干渉像の露光に同期させて蛍光像を取得し、４枚の干渉像から干渉強度像および干渉位相像を求めるのと同様に、４枚の蛍光像から平均蛍光像を作成することができれば、これら平均蛍光像，干渉強度像および干渉位相像は共通の観察面のものとすることができる。しかし、光量の差や撮像部の感度の差により、蛍光像および干渉像それぞれの最適露光時間は異なり、例えば、干渉像の露光時間が１００ｍ秒であって、蛍光像の露光時間が３５０ｍ秒であるような状況が起こり得る。このことから、個々の干渉像の露光に同期して蛍光像を取得することは困難である。
同図に示されるように、参照ミラー４３またはスライドガラス４１を波長λＩの４分の１ずつステップ的に上昇または降下させていって、４ステップ移動の度に蛍光撮像部１８による蛍光像ＦＭの撮像を開始することが考えられる。しかし、この場合、参照ミラー４３またはスライドガラス４１を波長λＩの４分の１ずつステップ的に上昇させる場合（同図（ａ））と降下させる場合（同図（ｂ））とで、蛍光像ＦＭの撮像タイミングに差が生じる。このような上昇時と降下時とで撮像タイミングの差がある場合、蛍光像の３次元像を作成しようとすると、上昇時と降下時とで作成した蛍光像の断層像に上下方向のズレが生じることとなり、例えば顆粒などを撮像した場合は偽の振動が観測されてしまう。
そこで、図１０に示されるような処理を行うのが好適である。図１０は、観察対象物９０中の共通の観察面の蛍光像，干渉強度像および干渉位相像を求める方法を説明する図である。同図に示されるように、画像の重率平均化の計算によって観察面の調整を行う。前述の問題により蛍光像および干渉強度像・干渉位相像それぞれの観察面がずれている場合に、干渉強度像・干渉位相像ＰＭの観察面が蛍光像ＦＭの観察面と蛍光像ＦＭ＋１の観察面とをａ:(１-ａ)に内分する面であるとする。このとき、(１-ａ)ＦＭ＋ａＦＭ＋１を真の蛍光像ＦＭとして用いることで、観察対象物９０中の共通の観察面の蛍光像，干渉強度像および干渉位相像を求めることができる。
以上のとおり、本実施形態の観察装置を用いれば、観察対象物の蛍光像および干渉像を取得する際に、撮像している観察面とスライドガラス表面等の基準面との間の距離が高精度に分かるので、所望位置の観察面で発生した蛍光像および干渉像を確実に取得することができる。また、所望位置の観察面で発生した蛍光像および干渉像を取得することが可能になったことにより、３次元の蛍光像および干渉像をも得ることができる。この効果は、更にはデコンボリューション等の数値解析手法により、蛍光色素の分布を高解像度で推定することにも役立つ。
また、本実施形態の観察装置を用いれば、観察対象物中の共通の観察面における蛍光像および干渉像を実質的に同時に取得することができる。これにより、観察対象物が細胞である場合等に、観察対象物の化学的・生理学的情報を蛍光像から得ることができ、これと同時に、観察対象物の形態情報を干渉像から得ることができるようになり、観察対象物の性質をより詳しく知ることができる。
観察対象物９０の内部の顆粒状の物体を蛍光染色し、観察対象物９０の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を時系列で複数枚撮像し、蛍光染色された顆粒状の物体と観察対象物９０の表面または内部の膜状の構造との相対的な位置関係を可視化することができる。
特に、干渉位相像を用いることで、観察対象物における膜状の構造物の形態が高精度に分かるようになる。応用としては、例えば細胞サンプルにおいて蛍光色素が細胞膜や核膜の中にあるのか外にあるのかを明らかにし、細胞内部での蛍光色素の動態を３次元的に追跡するといったことが考えられる。
また、観察開始時において、観察の全時間幅に比して短い時間のみ、励起光源１１による励起光の照射を行うとともに、蛍光撮像部１８の撮像動作および干渉撮像部２９の撮像動作を行い、この動作により得られた画像から蛍光標識された物体と干渉撮像によって特徴抽出された物体との対応付けを行う。そして、この観察開始時の撮像終了後は、励起光源１１による励起光の照射を行わずに、干渉撮像部２９の撮像動作のみを行うことによって、蛍光標識された物体の経時的観察を行うことができる。このようにすることで、フォトブリーチングの影響を受けることなく蛍光標識された物体の経時的観察を行うことができる。
以下、本実施形態の観察装置を用いた実施例１〜３について説明し、各実施例において取得された蛍光像，干渉強度像および干渉位相像を示す。
実施例１では、直径２０μｍの蛍光ビーズ９１（SPHERO TECH製、FP-20052-5）をスライドガラス４１上に載置して、干渉強度像，干渉位相像および蛍光像を取得した。また、実施例１では、各位置の観察面Ｓについて蛍光像および干渉像を取得してスタックし、これらに基づいて蛍光ビーズ９１の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得した。
図１１は、実施例１において各位置の観察面Ｓについて取得された干渉強度像，干渉位相像および蛍光像を示す図である。同図において、最上段は蛍光ビーズ９１中の観察面Ｓの位置を示し、第２段は干渉強度像を示し、第３段は干渉位相像を示し、最下段は蛍光像を示す。また、最左列は観察面Ｓがスライドガラス４１の上面に位置する場合を示し、中央列は観察面Ｓが蛍光ビーズ９１の中央部付近に位置する場合を示し、最右列は観察面Ｓが蛍光ビーズ９１の上部付近に位置する場合を示す。同図から、各位置の観察面Ｓに応じた画像が得られていることが分かる。また、これらの画像の取得を行う際に蛍光ビーズ９１の直径２０μｍを全てカバーするように上下に２９μｍのスキャンを行ったが、このスキャンを繰り返しても同じ位置の観察面Ｓにおいては干渉強度像，干渉位相像および蛍光像の何れについても同じ画像が得られた。
図１２は、実施例１において取得された垂直断面および水平断面それぞれの干渉強度像および蛍光像を示す図である。同図において、上段は垂直断面の像を示し、下段は水平断面の像を示す。また、左列は干渉強度像を示し、右列は蛍光像を示す。図中の直線は、垂直断面図においては水平断面図の切断位置を表し、水平断面図においては垂直断面図の切断位置を表す。
実施例２では、子宮頸がん由来の培養細胞HeLaを観察対象物９０として用い、この細胞の脂質膜を染める蛍光色素としてＤｉＯを用いた。この蛍光色素の吸光ピーク波長は４８４ｎｍであり、発光ピーク波長は５０１ｎｍである。
図１３は、実施例２において観察対象物９０として用いた細胞の構造を模式的に示す図である。観察面が所望の位置に設定されることで、その観察面上の様々な細胞内の構造物が観察され得る。
図１４は、実施例２において各位置の観察面Ｓについて取得された干渉強度像，干渉位相像および蛍光像を示す図である。同図において、最上段は観察対象物９０中の観察面Ｓの位置を示し、第２段は干渉強度像を示し、第３段は干渉位相像を示し、第４段は蛍光像を示し、最下段は蛍光像から輝点を抽出した像を示す。また、最左列は観察面Ｓがスライドガラス４１の上面に位置する場合を示し、中央列は観察面Ｓが観察対象物９０の中央部付近に位置する場合を示し、最右列は観察面Ｓが観察対象物９０の上部付近に位置する場合を示す。
図１５は、実施例２において取得された垂直断面および水平断面それぞれの干渉強度像および蛍光像を示す図である。同図において、上段は垂直断面の像を示し、下段は水平断面の像を示す。また、左列は干渉強度像を示し、右列は蛍光像を示す。
これらの図から、干渉像（干渉強度像・干渉位相像）から細胞の形態情報を得ることができ、これと同時に蛍光像から細胞内の生理学的な情報（脂質膜の分布）を得ることができることが分かる。
実施例３では、図１６に示されるように、化学薬品によりエッチングされて表面に数μｍの凹凸があるガラス基板を観察対象物９０として用い、この凹凸がある表面上に直径２.５μｍの蛍光ビーズ９１をまばらに配置したものをサンプルとした。ガラス基板の表面に凹凸があるので、蛍光ビーズ９１の高さにもバラツキが生じた。観察面を各位置に設定して干渉強度像，干渉位相像および蛍光像を取得し、各位置の干渉位相像に基づいて位相アンラッピングを行って、観察対象物９０の表面の凹凸形状を求めた。
図１７は、実施例３において取得された垂直断面および水平断面それぞれの干渉強度像および蛍光像を示す図である。同図において、上段は垂直断面の像を示し、下段は水平断面の像を示す。また、左列は干渉強度像を示し、右列は蛍光像を示す。
図１８は、実施例３において各位置の干渉位相像に基づいて位相アンラッピングを行った位相像を示す図である。観察対象物９０としてのガラス基板の表面が滑らかな凹凸を有するので、位相アンラッピングの結果、位相の等高線が明瞭に得られた。
図１９は、実施例３において位相アンラッピングにより得られた観察対象物９０の表面形状に蛍光ビーズ９１の蛍光強度の３次元データをボリュームレンダリングによってスーパーインポーズした図である。同図に示されるように、観察対象物９０の表面形状および蛍光ビーズ９１の蛍光情報の３次元分布の同時表示が可能となる。
また、実施例３では、図２０に示されるように、観察面を上下に９.５μｍ幅で繰り返し往復させて、干渉強度像，干渉位相像および蛍光像を取得した。１回の往復に要した時間は２４秒であり、往復回数は１６回であった。
図２１は、１往復目の観察面の上昇途中における高さ５μｍの位置（図２０中のＡ点）で取得された垂直断面および水平断面それぞれの干渉強度像および蛍光像を示す図である。図２２は、１６往復目の観察面の降下途中における高さ５μｍの位置（図２０中のＢ点）で取得された垂直断面および水平断面それぞれの干渉強度像および蛍光像を示す図である。図２１および図２２それぞれにおいて、上段は垂直断面の像を示し、下段は水平断面の像を示す。また、左列は干渉強度像を示し、右列は蛍光像を示す。
図２１と図２２とを対比して判るように、観察面の位置を繰り返し変化させた後であっても、観察面が同一の位置であれば、各々の場合に取得される干渉強度像および蛍光像の何れも、見分けが付かないほど同一のものであると言える。
１…観察装置、１１…励起光源、１２…フィルタ、１３…ダイクロイックミラー、１４…レンズ、１５…ダイクロイックミラー、１６…対物レンズ、１７…フィルタ、１８…蛍光撮像部、２１…干渉撮像用光源、２２…フィルタ、２３…ダイクロイックミラー、２４…レンズ、２５…ハーフミラー、２６…対物レンズ、２７…レンズ、２８…ダイクロイックミラー、２９…干渉撮像部、３１…位置検出用光源、３２…光検出部、４１…スライドガラス、４２…アクチュエータ、４３…参照ミラー、４４…アクチュエータ、５１…制御部、５２…表示部、９０…観察対象物。
Claims (13)
- 励起光を出力する励起光源と、
前記励起光源から出力された励起光を観察対象物に照射するとともに、当該照射に応じて前記観察対象物で発生した蛍光を受ける対物レンズと、
前記観察対象物で発生し前記対物レンズを通過した蛍光の像を撮像する蛍光撮像部と、
前記観察対象物を搭載し、前記対物レンズの光軸方向に移動自在な搭載部と、
干渉撮像用光を出力する干渉撮像用光源と、
位置検出用光を出力する位置検出用光源と、
前記干渉撮像用光源から出力された干渉撮像用光と、前記位置検出用光源から出力された位置検出用光とを、合波して出力する合波部と、
前記合波部により合波されて出力された光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光として出力し、前記対物レンズを介して前記第１分岐光を前記観察対象物または前記搭載部に照射するとともに当該照射に応じて発生した第１反射光を入力し、前記第２分岐光を参照ミラーに照射するとともに当該照射に応じて発生した第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて出力する干渉光学系と、
前記干渉光学系から出力された光を前記干渉撮像用光と前記位置検出用光とに分波して出力する分波部と、
前記分波部から出力された前記干渉撮像用光の干渉像を撮像する干渉撮像部と、
前記分波部から出力された前記位置検出用光の干渉強度を検出する光検出部と、
前記光検出部による検出結果を取得し、前記搭載部の位置決め動作、前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作を制御する制御部と、
を備え、
前記制御部が、
前記光検出部による干渉強度検出結果に基づいて、前記位置検出用光源から前記搭載部を経て前記光検出部に到るまでの前記位置検出用光の光路と、前記位置検出用光源から前記参照ミラーを経て前記光検出部に到るまでの前記位置検出用光の光路との光路長差を求め、
その求めた光路長差に基づいてフィードバック制御をすることで前記搭載部の位置を目標位置とし、
前記搭載部の目標位置において前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作の双方または何れか一方を行わせる、
ことを特徴とする観察装置。 - 前記位置検出用光源から出力された位置検出用光が、前記対物レンズを経て、前記観察対象物が存在しない前記搭載部上の位置に照射される、ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
- 前記制御部が、前記搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて前記蛍光撮像部の撮像動作または前記干渉撮像部の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像または２次元の干渉像を取得し、これらに基づいて前記観察対象物の３次元の蛍光像または３次元の干渉像を取得する、ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
- 前記制御部が、前記干渉撮像部により撮像された干渉像に基づいて干渉強度像または干渉位相像を求める、ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
- 前記蛍光撮像部により撮像された蛍光像と前記干渉撮像部により撮像された干渉像とを表示する表示部を更に備えることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
- 前記制御部が、前記搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作を行わせて２次元の蛍光像および２次元の干渉像を同期して取得し、これらに基づいて前記観察対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得する、ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
- 前記搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて、形状が既知である物体を標準対象物として、前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作を行わせて前記標準対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得し、これら３次元の蛍光像および３次元の干渉像の光軸方向の相対位置に差が生じている場合に、前記蛍光撮像部を光軸方向に動かすことによって３次元の蛍光像および３次元の干渉像の相対位置が重なるように光学系の微調整を行った上で種々の前記観察対象物の撮像を行う、ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
- 前記搭載部の複数の目標位置それぞれにおいて、形状が既知である物体を標準対象物として、前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作を行わせて前記標準対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を取得し、これら３次元の蛍光像および３次元の干渉像の光軸方向の相対位置に差が生じている場合に、蛍光像を結像させるレンズのうち干渉像の結像条件と独立に動かし得るものを光軸方向に動かすことによって３次元の蛍光像および３次元の干渉像の相対位置が重なるように光学系の微調整を行った上で種々の前記観察対象物の撮像を行う、ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
- 前記励起光源および前記蛍光撮像部が共焦点顕微鏡の構成を有することを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
- 前記励起光源がパルス幅１０００フェムト秒以下の短パルスレーザであり、
前記励起光源および前記蛍光撮像部が二光子励起顕微鏡の構成を有する、
ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。 - 前記観察対象物内での蛍光共鳴エネルギー移動に起因する蛍光を前記蛍光撮像部が撮像する、ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
- 前記観察対象物の内部の顆粒状の物体を蛍光染色し、前記観察対象物の３次元の蛍光像および３次元の干渉像を時系列で複数枚撮像し、前記蛍光染色された顆粒状の物体と前記観察対象物の表面または内部の膜状の構造との相対的な位置関係を可視化する、ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
- 観察開始時において、観察の全時間幅に比して短い時間のみ、前記励起光源による励起光の照射を行うとともに、前記蛍光撮像部の撮像動作および前記干渉撮像部の撮像動作を行い、この動作により得られた画像から蛍光標識された物体と干渉撮像によって特徴抽出された物体との対応付けを行い、
この観察開始時の撮像終了後は、前記励起光源による励起光の照射を行わずに、前記干渉撮像部の撮像動作のみを行うことによって、蛍光標識された物体の経時的観察を行う、
ことを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
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