JP6437458B2 - 第Ｘａ因子の阻害を中和するための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、その内容が参照することによって全体として本明細書に組み込まれる、２０１３年１月３１日に出願された米国仮出願第６１／７５９，３３２号の利益を主張する。

配列表への参照
３７ ＣＦＲ §１．８２１の下で、ＰＣ０７２００６＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータで読み取り可能な形態（ＣＲＦ）で本明細書と同時に提出される配列表は、参照することによって本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０１３年１２月１８日に作成され、ファイルサイズは７キロバイトであった。

薬理学的な抗凝固は、血栓形成促進性状態を有する患者のための治療の中心である。５０年以上にわたり、利用可能な唯一の経口抗凝固剤は、酸化ビタミンＫを再利用するビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）の阻害剤であるワルファリンであった。ワルファリンは、頻繁な凝固パラメータのモニタリングおよび用量調整を余儀なくさせる予測不可能な薬物動態を含む、多くの欠点を有する。しかし、突発的な出血の事象または緊急の外科手術が必要な事象では、迅速かつ完全な逆転を可能にする解毒剤が存在する。

経口的な直接ＦＸａ阻害剤は、ワルファリンなどの標準的な治療と比較した場合に、血栓形成促進性疾患を有する患者における投薬スキームおよび止血のモニタリングを単純にする潜在能力を有する、新たな抗凝固剤である。これらの薬物は、ワルファリンに勝る多くの利点を有するが、これらの新規な抗凝固剤に利用可能な、完全に有効な逆転剤は存在しない。

しかし、それらの影響に対する具体的な対策の欠如は、管理不可能な出血の恐れに起因してこれらの作用物質の広範囲での採用を制限し得る、重要な未だ対処されていない臨床的要求である。

出願人は、直接活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）阻害剤の影響を中和するための組成物および方法を提供することによって、この重要な未だ対処されていない臨床的要求に取り組んだ。

一部の実施形態によると、本開示は、１６位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｙでの置換、または１７位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＬｅｕ、Ａｌａ、もしくはＧｌｙでの置換を含む少なくとも１つの修飾を含有する第Ｘａ因子変異体を含む組成物を投与することによる、直接第Ｘａ因子（ＦＸａ）阻害剤で治療されている対象における出血を低減または予防するための方法を提供する。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体を含む組成物での治療の結果、出血が少なくとも５０％低減する。特定の実施形態によると、直接第Ｘａ因子阻害剤には、リバーロキサバンまたはアピキサバンが含まれる。一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度は、典型的な治療量または治療量を超える量である。例えば、一部の実施形態において、リバーロキサバンの血漿濃度は約５００ｎＭ以上であり得、アピキサバンの血漿濃度は約２５０ｎＭ以上であり得る。特定の実施形態によると、ＦＸａ変異体は、置換Ｉ１６Ｌを含有する。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体は、第Ｘａ因子阻害剤の血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度で、直接第Ｘａ因子阻害剤の影響を無効にし得る。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体を含む組成物は、計画的な外科手術の前、損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の意図的なもしくは偶発的な過剰投薬の後に投与される。一部の実施形態において、対象における止血は、ＦＸａ変異体の最初の用量の後に止血アッセイを用いてモニタリングされ、適切な止血が所定時間までになされない場合には、ＦＸａ変異体の少なくとも１回の第２の用量が、十分な止血を達成するために投与される。一部の実施形態によると、所定時間は、最初の用量のＦＸａ変異体が投与された約１５分、３０分、４５分、または６０分後である。他の時間もまた可能である。一部の他の実施形態において、例えば、異なるＦＸａ変異体、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡ、またはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を含む、少なくとも第２の凝固促進剤が、ＦＸａ変異体に加えて投与される。

一部の実施形態によると、本開示は、１６位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｙでの置換、または１７位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＬｅｕ、Ａｌａ、もしくはＧｌｙでの置換を含む少なくとも１つの修飾を含有する第Ｘａ因子変異体を含む組成物を投与することによる、直接第Ｘａ因子（ＦＸａ）阻害剤で治療されている対象における外因性または内因性の凝血経路の活性化に応じて生産されるトロンビンの量を増大させるための方法を提供する。特定の実施形態によると、直接第Ｘａ因子阻害剤には、リバーロキサバンまたはアピキサバンが含まれる。一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度は、典型的な治療量または治療量を超える量である。例えば、一部の実施形態において、リバーロキサバンの血漿濃度は約５００ｎＭ以上であり得、アピキサバンの血漿濃度は約２５０ｎＭ以上であり得る。特定の実施形態によると、ＦＸａ変異体は、置換Ｉ１６Ｌを含有する。特定の実施形態によると、生産されるトロンビンの量は、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上増大する。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体は、第Ｘａ因子阻害剤の血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度で、直接第Ｘａ因子阻害剤の影響を無効にし得る。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体を含む組成物は、計画的な外科手術の前、損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の意図的なもしくは偶発的な過剰投薬の後に投与される。一部の実施形態において、対象における止血は、ＦＸａ変異体の最初の用量の後に止血アッセイを用いてモニタリングされ、適切な止血が所定時間までになされない場合には、ＦＸａ変異体の少なくとも１回の第２の用量が、十分な止血を達成するために投与される。一部の実施形態によると、所定時間は、最初の用量のＦＸａ変異体が投与された約１５分、３０分、４５分、または６０分後である。他の時間もまた可能である。一部の他の実施形態において、例えば、異なるＦＸａ変異体、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡ、またはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を含む、少なくとも第２の凝固促進剤が、ＦＸａ変異体に加えて投与される。

一部の実施形態によると、本開示は、１６位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｙでの置換、または１７位（キモトリプシン番号付けシステムを用いる）の野生型アミノ酸のＬｅｕ、Ａｌａ、もしくはＧｌｙでの置換を含む少なくとも１つの修飾を含有する第Ｘａ因子変異体を含む組成物を投与することによる、直接第Ｘａ因子（ＦＸａ）阻害剤で治療されている対象における凝血時間（例えば、ＰＴまたはＩＮＲまたは一部の他のアッセイを用いて測定される）を減少させるための方法を提供する。特定の実施形態によると、直接第Ｘａ因子阻害剤には、リバーロキサバンまたはアピキサバンが含まれる。一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度は、典型的な治療量または治療量を超える量である。例えば、一部の実施形態において、リバーロキサバンの血漿濃度は約５００ｎＭ以上であり得、アピキサバンの血漿濃度は約２５０ｎＭ以上であり得る。特定の実施形態によると、ＦＸａ変異体は、置換Ｉ１６Ｌを含有する。特定の実施形態によると、凝血時間は、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低減する。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体は、第Ｘａ因子阻害剤の血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度で、直接第Ｘａ因子阻害剤の影響を無効にし得る。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体を含む組成物は、計画的な外科手術の前、損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の意図的なもしくは偶発的な過剰投薬の後に投与される。一部の実施形態において、対象における止血は、ＦＸａ変異体の最初の用量の後に止血アッセイを用いてモニタリングされ、適切な止血が所定時間までになされない場合には、ＦＸａ変異体の少なくとも１回の第２の用量が、十分な止血を達成するために投与される。一部の実施形態によると、所定時間は、最初の用量のＦＸａ変異体が投与された約１５分、３０分、４５分、または６０分後である。他の時間もまた可能である。一部の他の実施形態において、例えば、異なるＦＸａ変異体、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡ、またはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を含む、少なくとも第２の凝固促進剤が、ＦＸａ変異体に加えて投与される。

図１Ａ：リバーロキサバンによる遊離ｗｔ−ＦＸａの阻害を示す図である。ｗｔ−ＦＸａ（２ｎＭ）によるペプチジル基質（ＳｐｅｃＸａ、２００ｕＭ）加水分解の初期速度を、リバーロキサバンの増大濃度で決定した。Ｋｉ値をグラフに示す。 図１Ｂ：リバーロキサバンによるＦＸａ^Ｉ１６Ｌの阻害を示す図である。ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ（６ｎＭ）によるペプチジル基質（ＳｐｅｃＸａ、２００ｕＭ）加水分解の初期速度を、リバーロキサバンの増大濃度で決定した。Ｋｉ値をグラフに示す。 図２Ａ：プロトロンビナーゼを形成しているｗｔ−ＦＸａのリバーロキサバン阻害を示す図である。ＰＣＰＳ（２０ｕＭ）およびＦＶａ（４０ｎＭ）の存在下での、ｗｔ−ＦＸａ（２ｎＭ）によるペプチジル基質（ＳｐｅｃＸａ、２００ｕＭ）加水分解の初期速度を、リバーロキサバンの増大濃度で決定した。 図２Ｂ：プロトロンビナーゼを形成しているＦＸａ^Ｉ１６Ｌのリバーロキサバン阻害を示す図である。ＰＣＰＳ（２０ｕＭ）およびＦＶａ（４０ｎＭ）の存在下での、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ（６ｎＭ）によるペプチジル基質（ＳｐｅｃＸａ、２００ｕＭ）加水分解の初期速度を、リバーロキサバンの増大濃度で決定した。 リバーロキサバンのトロンビン生成に対する影響の逆転に対する、異なる濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を示す図である。 図４Ａ：リバーロキサバンの影響の逆転に対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を示す図である。正常なヒト血漿を、５００ｎＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、ピークトロンビンをプロットした。 図４Ｂ：リバーロキサバンの影響の逆転に対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を示す図である。正常なヒト血漿を、５００ｎＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、生成された総トロンビン（ＥＴＰ）をプロットした。 図４Ｃ：リバーロキサバンの影響の逆転に対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を示す図である。正常なヒト血漿を、５００ｎＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、ピークトロンビンをプロットした。 図４Ｄ：リバーロキサバンの影響の逆転に対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を示す図である。正常なヒト血漿を、５００ｎＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、生成された総トロンビン（ＥＴＰ）をプロットした。 図５Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが高用量のリバーロキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、７．５ｕＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、ピークトロンビンをプロットした。 図５Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが高用量のリバーロキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、７．５ｕＭのリバーロキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、生成された総トロンビン（ＥＴＰ）をプロットした。 図６Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔが２５０ｎＭのアピキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、２５０ｎＭのアピキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、ピークトロンビンをプロットした。 図６Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔが２５０ｎＭのアピキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、２５０ｎＭのアピキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、生成された総トロンビン（ＥＴＰ）をプロットした。 図７Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔが高用量のアピキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、２．０ｕＭのアピキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、ピークトロンビンをプロットした。 図７Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔが高用量のアピキサバンの影響を逆転させることを示す図である。正常なヒト血漿を、２．０ｕＭのアピキサバンと共に、かつ増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６ＬまたはＦＸａ^Ｉ１６Ｔの不存在下または存在下で、インキュベートした。データ分析の後、生成された総トロンビン（ＥＴＰ）をプロットした。 図８Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが、リバーロキサバンの存在下で、全血凝血を修正することを示す図である。全血トロンボエラストグラフィーを用いて、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、典型的な用量のリバーロキサバンの影響を逆転する能力を評価した。 図８Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが、リバーロキサバンの存在下で、全血凝血を修正することを示す図である。全血トロンボエラストグラフィーを用いて、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、高用量のリバーロキサバンの影響を逆転させる能力を評価した。 図９Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが、アピキサバンの存在下で、全血凝血を修正することを示す図である。全血トロンボエラストグラフィーを用いて、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、典型的な用量のアピキサバンの影響を逆転させる能力を評価した。 図９Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが、アピキサバンの存在下で、全血凝血を修正することを示す図である。全血トロンボエラストグラフィーを用いて、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、高用量のアピキサバンの影響を逆転させる能力を評価した。 図１０Ａ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌがトロンビン生成アッセイにおいてリバーロキサバンを中和することを示す図である。リバーロキサバンの用量応答を示す。 図１０Ｂ：ＦＸａ^Ｉ１６Ｌがトロンビン生成アッセイにおいてリバーロキサバンを中和することを示す図である。リバーロキサバンの存在下でのＦＸａ^Ｉ１６Ｌの用量応答を示す。 ＦＸａ^Ｉ１６Ｌがマウス尾部クリップ出血モデルにおいてリバーロキサバンを中和することを示す図である。 マウスに投与されたリバーロキサバンが、ＲＯＴＥＭを用いて測定される全血の凝血時間を遅延させること、およびＦＸａ^Ｉ１６Ｌとの投与がリバーロキサバンの影響を用量応答的に中和することを実証する図である。 図１３Ａ：マウスに投与されたリバーロキサバンが、レーザーにより生じる精巣挙筋における血管損傷の部位で凝血塊の形成を予防すること、およびＦＸａ^Ｉ１６Ｌとの投与がリバーロキサバンの影響を中和することを示す図である。凝血塊の形成は、生体顕微鏡法、ならびにフィブリンおよび血小板に対する蛍光標識抗体を用いて視覚化した。未処理マウスにおける凝血塊の形成を示す。 図１３Ｂ：マウスに投与されたリバーロキサバンが、レーザーにより生じる精巣挙筋における血管損傷の部位で凝血塊の形成を予防すること、およびＦＸａ^Ｉ１６Ｌとの投与がリバーロキサバンの影響を中和することを示す図である。凝血塊の形成は、生体顕微鏡法、ならびにフィブリンおよび血小板に対する蛍光標識抗体を用いて視覚化した。リバーロキサバンが血小板の蓄積を遅延および低減させ、かつフィブリンの堆積を予防したことを示す。 図１３Ｃ：マウスに投与されたリバーロキサバンが、レーザーにより生じる精巣挙筋における血管損傷の部位で凝血塊の形成を予防すること、およびＦＸａ^Ｉ１６Ｌとの投与がリバーロキサバンの影響を中和することを示す図である。凝血塊の形成は、生体顕微鏡法、ならびにフィブリンおよび血小板に対する蛍光標識抗体を用いて視覚化した。リバーロキサバンおよびＦＸａ^Ｉ１６Ｌを投与されたマウスにおいて、凝血塊の形成が損傷の部位で生じたことを示す。 野生型ヒト第Ｘ因子プレタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。シグナルペプチドは、アミノ酸１〜２３に対応する。プロペプチドは、アミノ酸２４〜４０に対応する。活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）の成熟軽鎖は、アミノ酸４１〜１７９に対応する。活性型ＦＸａの成熟重鎖（活性化ペプチドを除去した後）は、アミノ酸２３５〜４８８に対応する。活性化ペプチド（ＡＰ）は、アミノ酸１８３〜２３４に対応する。 野生型ヒト第Ｘ因子プレタンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。コード配列は、ヌクレオチド５８から１５２４に対応する。 野生型ヒト第Ｘ因子プレタンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。コード配列は、ヌクレオチド５８から１５２４に対応する。図１５−１の続きである。

本開示は、それを必要とする対象において直接ＦＸａ阻害剤の抗凝固性の影響を中和するための組成物および方法を提供する。出願人は、特定のＦＸａ変異体が、用量依存的に、直接ＦＸａ阻害剤の影響を迅速かつ完全に中和することを発見した。さらに詳細には、出願人は、比較的少量のＦＸａ変異体が、治療濃度の、さらには治療濃度を超える濃度のＦＸａ阻害剤の存在下で、インビボでの正常な凝固活性を回復させることを発見した。直接ＦＸａ阻害剤の抗凝固性の影響のための速く有効な解毒剤を提供することによって、出願人の開示は、したがって、これらの有利な抗凝固剤についての展望を満たすことに寄与する。

凝固第Ｘ因子（ＦＸ）は、内因性第ＩＸ因子／第ＶＩＩＩ因子または外因性経路（組織因子／第ＶＩＩａ因子）によって活性化されるとプロトロンビナーゼのプロテアーゼ部分であるＦＸａになる酵素原である。Ａｒｇ−Ｉｌｅ切断可能結合のタンパク質分解性の切断の後、酵素原における一連の良く定義された構造的変化である活性化ペプチド（ＡＰ）の放出によって、成熟活性セリンプロテアーゼへの活性化プロセスが動き出す（参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｏｓｏら、（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３、１８６２７〜１８６３５；Ｂｕｎｃｅら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７、２９０〜２９８；およびＩｖａｎｃｉｕら、（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９、１０２８〜１０３３を参照されたい）。成熟ＦＸａは、触媒性ドメインを含有する軽鎖および重鎖を有する。成熟ＦＸａは、活性型補因子である第Ｖａ因子（ＦＶａ）の結合を含む、プロトロンビナーゼ複合体の形成がなされると、活性セリンプロテアーゼになる。

活性化されると切断によって酵素原様ＦＸａ変異体が生じるＦＸの変異体形態が開発された。すなわち、切断が生じると、その結果生じたＦＸａ変異体は、活性部位機能が弱く、循環阻害剤（すなわち、抗トロンビンＩＩＩおよびＴＦＰＩ）による不活化に対してより耐性である。ＦＸａ変異体は、したがって、野生型ＦＸａよりも、血漿における半減期が長い。ＦＸａ変異体は、ＦＶａ、脂質膜、およびカルシウムを結合して、プロトロンビンを効率的に活性化させる完全に活性なプロトロンビナーゼ複合体を形成する。

ＦＸａの酵素原様変異体は、酵素原様立体構造で循環し、血栓形成性ではないと思われる（参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｏｓｏら、（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３、１８６２７〜１８６３５、およびＩｖａｎｃｉｕら、（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９、１０２８〜１０３３を参照されたい）。このようなＦＸａ変異体の例は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２００７／０５９５１３において記載されている。

凝固の酵素は、キモトリプシン様の折り畳みを有するプロテアーゼのＳ１ペプチダーゼファミリーに属する、トリプシン様酵素である。凝固プロテアーゼは、互いに非常に相同な、かつ消化性の先祖セリンプロテアーゼに非常に相同な、触媒性ドメインを含有する。構造的相同性／同一性は大きく（＞７０％）、それは、凝固酵素（第Ｘａ因子を含む）の触媒性ドメインにおける残基が、キモトリプシノゲンにおける対応する残基に従って番号付けされるほどである。（キモトリプシン番号付けシステム；共に参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、ＢａｊａｊおよびＢｉｒｋｔｏｆｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３、２２２：９６〜１２８、Ｔａｂｌｅ ２；ならびにＢｏｄｅ Ｗ、Ｍａｙｒ Ｉ、Ｂａｕｍａｎ Ｙら、Ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｄ １．９Å ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｇｍｅｎｔ．ＥＭＢＯ Ｊ １９８９、８（１１）：３４６７〜３４７５を参照されたい）。したがって、アミノ酸は、本明細書において、当業者に周知のキモトリプシン番号付けシステムに従って言及され得る。

本開示によると、ＦＸａ変異体は、インビボまたはインビトロで野生型ＦＸａタンパク質と比較して変異体をより酵素原様にするアミノ酸置換を含むＦＸａタンパク質であり得る。本開示のＦＸａ変異体は、プロトロンビナーゼが形成されると、野生型ＦＸａの活性を実質的に取り戻す。本開示の方法において有用なＦＸａ変異体の例は、キモトリプシン番号付けシステムに従った、ａ）１６位のＩｌｅがＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、またはＧｌｙである修飾、およびｂ）１７位のＶａｌがＬｅｕ、Ａｌａ、またはＧｌｙである修飾からなる群から選択される修飾を含む変異体である。キモトリプシン番号付けシステムにおけるアミノ酸１６および１７は、配列番号１（ヒト第Ｘ因子プレプロタンパク質）のアミノ酸２３５および２３６でそれぞれ生じる。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体は、ＦＸａ^Ｉ１６ＬおよびＦＸａ^Ｉ１６Ｔである（ＦＸａ変異体について本明細書において用いられる命名は、キモトリプシン番号付けシステムに従って番号付けされた位置の元のアミノ酸と、その後に、置換されたアミノ酸とを列挙する）。ＦＸａ変異体は、あらゆる哺乳動物ＦＸａの変異体であり得る。しかし、特に興味深いものは、ヒトＦＸａのＦＸａ変異体である。

特定の実施形態において、本開示の変異体ＦＸａに活性化されるＦＸ変異体は、非天然の細胞内タンパク質分解性切断部位を挿入することによってさらに修飾され得る。非限定的な例において、哺乳動物細胞において「活性型」酵素原様ＦＸａ変異体を発現させるために、非天然の細胞内タンパク質分解性切断部位を、変異体ＦＸ酵素原において、配列番号１の２３４位（キモトリプシン番号付けシステムにおける１５位）のＡｒｇと、配列番号１の２３５位に対応する位置（キモトリプシン番号付けシステムにおける１６位）のアミノ酸との間に挿入することができる。特定の実施形態において、非天然の細胞内プロテアーゼ切断部位は、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号３）である。これらの切断部位は、細胞内のプロテアーゼ（ＰＡＣＥ／フリン様酵素）によって効率的に認識され、除去される。この切断の結果、分子の成熟重鎖が配列番号１の２３５位に対応する位置（キモトリプシン番号付けシステムにおける１６位）のアミノ酸で始まるようになった、プロセシングされた変異体ＦＸａが生じ得る。前記位置でのこの切断部位の導入によって、ＦＸからＦＸａへの細胞内変換が可能になる。

特定の実施形態において、ＦＸ変異体の活性化ペプチド（ＡＰ）の全アミノ酸配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸１８３〜２３４）は、非天然の細胞内プロテアーゼ切断部位で置き換えられる。特定の実施形態によると、非天然の細胞内プロテアーゼ切断部位は、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号３）である。上記で説明したように、この修飾によって、細胞によって発現されるＦＸ変異体の細胞内切断が可能になる。細胞内切断は、ＦＸ変異体を活性型酵素原様ＦＸａ変異体に変換し、これは次いで、その後の精製のために細胞によって分泌される。このアプローチは、例えば、タンパク質を単離した後、または凝血の直前に、変異体凝血因子を活性化させるためにこの修飾がなければ必要となるであろう細胞外切断の必要性をなくすものである。

特定の実施形態において、本開示のＦＸａ変異体は、天然の野生型ヒトシグナル配列および／またはプロペプチド配列を含むＦＸ変異体プレタンパク質に由来する。他の実施形態において、非ヒト種に由来するＦＸシグナル配列および／またはプロペプチドを、対応する天然のアミノ酸配列の代わりに用いることができる。また、さらに他の実施形態において、他のヒトまたは非ヒトから分泌されたタンパク質に由来するシグナル配列および／またはプロペプチド配列を、対応する天然のアミノ酸配列の代わりに用いることができる。

例示的な実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３５位のアミノ酸（野生型配列ではイソロイシン）は、スレオニン（Ｔｈｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、またはグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択される異なるアミノ酸で置換されている。これらの置換は、それぞれ、１文字目がイソロイシンの一文字コードであり、最後の文字が野生型配列内に置換されているアミノ酸の一文字コードである、命名Ｉ２３５Ｔ、Ｉ２３５Ｌ、Ｉ２３５Ｆ、Ｉ２３５Ｄ、およびＩ２３５Ｇを用いて表記され得る。配列番号１の２３５位は、キモトリプシン番号付けシステムにおける１６位に等しいため、同一の置換は、Ｉ１６Ｔ、Ｉ１６Ｌ、Ｉ１６Ｆ、Ｉ１６Ｄ、およびＩ１６Ｇと表記され得る。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３５位のアミノ酸は、Ｔｈｒで置換されている（すなわち、Ｉ２３５ＴまたはＩ１６Ｔ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３５位のアミノ酸は、Ｌｅｕで置換されている（すなわち、Ｉ２３５ＬまたはＩ１６Ｌ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３５位のアミノ酸は、Ｐｈｅで置換されている（すなわち、Ｉ２３５ＦまたはＩ１６Ｆ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３５位のアミノ酸は、Ａｓｐで置換されている（すなわち、Ｉ２３５ＤまたはＩ１６Ｄ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、２３５位のアミノ酸は、Ｇｌｙで置換されている（すなわち、Ｉ２３５ＧまたはＩ１６Ｇ）。

別の例示的な実施形態によると、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３６位のアミノ酸（野生型配列におけるバリン）は、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、またはグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択される異なるアミノ酸で置換されている。これらの置換は、それぞれ、１文字目がバリンの一文字コードであり、最後の文字が野生型配列に置換されているアミノ酸の一文字コードである、命名Ｖ２３６Ｌ、Ｖ２３６Ａ、およびＶ２３６Ｇを用いて表記され得る。配列番号１の２３６位は、キモトリプシン番号付けシステムにおける１７位に等しいため、同一の置換は、Ｖ１７Ｌ、Ｖ１７Ａ、およびＶ１７Ｇと表記され得る。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３６位のアミノ酸は、Ｌｅｕで置換されている（すなわち、Ｖ２３６ＬまたはＶ１７Ｌ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３６位のアミノ酸は、Ａｌａで置換されている（すなわち、Ｖ２３６ＡまたはＶ１７Ａ）。１つの実施形態において、ＦＸａ変異体は、配列番号１のアミノ酸４１〜１７９およびアミノ酸２３５〜４８８を含み、ここで、２３６位のアミノ酸は、Ｇｌｙで置換されている（すなわち、Ｖ２３６ＧまたはＶ１７Ｇ）。

他の実施形態において、先の段落において記載した具体的な変異体を含む、本開示のＦＸａ変異体には、タンパク質の軽鎖および／または成熟重鎖の様々なアイソフォームが含まれ得る。ＦＸａ変異体の成熟重鎖の非限定的な例示的なアイソフォームには、成熟重鎖のアルファ型およびベータ型が含まれる。参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｊｅｓｔｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７５年６月２５日、２５０（１２）：４４９７〜５０４。本開示の組成物には、アルファおよびベータ成熟重鎖アイソフォームの一方もしくは他方または両方が見られるＦＸａ変異体タンパク質が含まれ得る。

さらに他の実施形態によると、先の段落において記載した具体的な変異体を含む、ＦＸａ変異体タンパク質のアイソフォームには、様々な数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のアミノ酸）がタンパク質の軽鎖および／または成熟重鎖のカルボキシ末端から無くなっているかまたは前記末端に付加されているアイソフォームが含まれ得る。

特定の実施形態によると、本開示のＦＸａ変異体には、配列番号１の野生型ＦＸａのアミノ酸配列と比較して、ある最小程度の相同性または配列同一性を有するタンパク質が含まれる。したがって、例えば、ＦＸａ変異体には、配列番号１の野生型ＦＸａの軽鎖および成熟重鎖と配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同または同一な軽鎖および成熟重鎖を含有するタンパク質が含まれ、ここで、このようなＦＸａ変異体にはまた、配列番号１の２３５位に対応するアミノ酸位置の、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｙでの置換、または配列番号１の２３６位に対応するアミノ酸位置の、Ｌｅｕ、Ａｌａ、もしくはＧｌｙでの置換が含まれ、さらに、このようなＦＸａ変異体は、プロトロンビナーゼ複合体に組み込まれるまで、酵素原性である。配列番号１のアミノ酸配列において、野生型ＦＸａの軽鎖配列は、アミノ酸４１から１７９に対応し、野生型ＦＸａの成熟重鎖配列は、アミノ酸２３５から４８８に対応する。アミノ酸配列の相同性または同一性のパーセンテージは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴなどのソフトウェアを用いて容易に決定することができる。

他の非限定的な実施形態によると、本開示のＦＸａ変異体にはまた、限定はしないが１つまたは複数のＯ結合型もしくはＮ結合型糖質基または様々な数のガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を含む１つまたは複数の翻訳後修飾を含有する、ＦＸａ変異体が含まれ得る。本開示のＦＸａ変異体にはさらに、化学的に修飾されたＦＸａ変異体タンパク質が含まれ得る。本開示の方法において有用な他のＦＸａ変異体もまた可能である。

本明細書において用いられる場合、用語ＦＸａ^Ｉ１６ｘは、配列番号１における２３５位（キモトリプシン番号付けシステムにおける１６位に対応する）に対応するアミノ酸が野生型配列におけるアミノ酸（イソロイシン）から「ｘ」と示される異なるアミノ酸に変化している、活性型第Ｘ因子の変異体を指す。一部の非限定的な例示的な実施形態において、アミノ酸「ｘ」は、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、またはグリシン（ＧｌｙまたはＧ）であり得る。

本明細書において用いられる場合、用語ＦＸａ^Ｖ１７ｙは、配列番号１における２３６位（キモトリプシン番号付けシステムにおける１７位に対応する）に対応するアミノ酸が野生型配列におけるアミノ酸（バリン）から「ｙ」と示される異なるアミノ酸に変化している、活性型第Ｘ因子の変異体を指す。一部の非限定的な例示的な実施形態において、アミノ酸「ｙ」は、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、またはグリシン（ＧｌｙまたはＧ）であり得る。

用語ＦＸａ^Ｉ１６ｘおよびＦＸａ^Ｖ１７ｙは、配列番号１で示されるタンパク質配列によって限定されない。それどころか、これらの用語にはさらに、プロトロンビナーゼ複合体に組み込まれるまで酵素原として振る舞う、キモトリプシン番号付けシステムにおける１６位または１７位での特定の置換突然変異を有する、本明細書において記載される様々なアイソフォームおよび相同タンパク質が含まれる。

本開示のＦＸａ変異体は、タンパク質を発現させるためのあらゆる技術によって生産され得る。

「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された変異体」は、その由来元または由来源のおかげで（１）その天然の状態でタンパク質、ポリペプチド、または変異体に付随する天然で関連する成分と結び付いていない、（２）同一種に由来する他のタンパク質を有さない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）天然に生じない、タンパク質、ポリペプチド、または変異体である。したがって、化学的に合成された、またはそれが天然に由来する元である細胞と異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然で関連する成分から「単離される」ことになる。タンパク質はまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、天然で関連する成分を実質的に有さないようにされ得る。

タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０から７５％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋である」、「実質的に均質である」、または「実質的に精製されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％Ｗ／Ｗを典型的に含み、より通常は約９５％であり、また９９％を超える純度であり得る。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その後、当技術分野において周知の染料でゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化するなどの、当技術分野において周知の多くの手段によって示され得る。特定の目的では、より高い分解能が、ＨＰＬＣまたは当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによってもたらされ得る。

本開示の方法は、直接ＦＸａ阻害剤を中和するために有用である。直接ＦＸａ阻害剤は、ＦＸａに直接的に結合し、他のプロテアーゼよりもＦＸａを選択的に結合する阻害剤である。直接ＦＸａ阻害剤は、プロトロンビンに関してＦＸａの非競合阻害剤である。それらは、裂隙を結合する基質を結合し、この領域を同様に結合する小さなペプチド基質に関して競合的にＦＸａを阻害する。それらは、高ピコモル濃度の親和性でＦＸａを阻害し、血漿中で高度にタンパク質に結合している。直接ＦＸａ阻害剤の例は、リバーロキサバン、アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、およびオタミキサバンである。特定の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤は、リバーロキサバンおよびアピキサバンから選択される。

本開示によると、ＦＸａ変異体は、ＦＸａを結合する、またはプロトロンビナーゼを形成したＦＸａを結合する直接ＦＸａ阻害剤を中和するために用いられ得る。直接ＦＸａ阻害剤は、阻害のために、ＦＸａの補因子を要することもあり、または要しないこともある。本開示の方法によると、ＦＸａ^Ｉ１６ＬおよびＦＸａ^Ｉ１６ＴなどのＦＸａ変異体は、直接ＦＸａ阻害剤を含有する血液を有する対象に投与される。

本開示は、限定はしないが、合成阻害剤、低分子阻害剤、経口利用可能な阻害剤、または可逆阻害剤を含む直接ＦＸａ阻害剤を中和するためのＦＸａ変異体の使用を包含する。ＦＸａ阻害剤は、これらの特徴のあらゆる組み合わせ、例えば、経口利用可能な、合成の、可逆の、低分子阻害剤であり得る。特定の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤は、リバーロキサバン、アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、およびオタミキサバンから選択され得る（それぞれが参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｐｅｒｚｂｏｒｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１１年１月、１０（１）：６１〜７５；Ｔｕｒｐｉｅ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００７年６月、２７（６）：１２３８〜４７；Ｐｉｎｔｏら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ ２２：６４５〜６６１（２０１２）；Ｐｉｎｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５０：５３３９〜５３５６（２００７）を参照されたい）。特定の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤は、リバーロキサバンまたはアピキサバンから選択される。

一部の実施形態において、本開示のＦＸａ変異体は、直接ＦＸａ阻害剤が治療濃度で生じる場合に、このような阻害剤の影響を逆転させるために対象に投与され得る。他の実施形態において、本開示のＦＸａ変異体は、直接ＦＸａ阻害剤が治療濃度を超える濃度で生じる場合に、このような阻害剤の影響を逆転させるために対象に投与され得る。治療濃度を超える濃度は、特定の対象または対象クラスにおいて安全に抗凝固を達成するために必要であると通常考えられる濃度よりも高い濃度である。直接ＦＸａ阻害剤の治療濃度を超える濃度は、偶発的なまたは意図的な過剰投薬の結果生じ得る。直接ＦＸａ阻害剤の治療濃度を超える濃度はまた、例えば薬剤の相互作用または他の要因に起因する、これらの薬剤に対する予想外に高い感受性、または予想外に遅いクリアランス速度などの、特定の対象における予想外の影響の結果生じ得る。特定の対象または対象クラスにおいて何が直接ＦＸａ阻害剤の治療濃度または治療濃度を超える濃度となるかの決定は、当業者の知識の範囲内である。

本開示によると、ＦＸａ変異体は、他のトリプシン様プロテアーゼよりもＦＸａを少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１００００倍選択的に結合する直接ＦＸａ阻害剤を中和するために用いられる。

直接ＦＸａ阻害剤は、約２×１０^−７Ｍ以下のＫ_ｉでＦＸａ変異体を結合し得る。「Ｋ_ｉ」は、最大阻害の半分をもたらすために必要な濃度である、特定の阻害剤−標的相互作用の、阻害剤定数を指す。Ｋ_ｉは、当技術分野において知られている方法を用いて決定され得る。本開示は、したがって、プロトロンビナーゼ複合体を有さないＦＸａ変異体を約２×１０^−８Ｍ以下、約１×１０^−８Ｍ以下、約９×１０^−９Ｍ以下、約８×１０^−９Ｍ以下、約７×１０^−９Ｍ以下、約６×１０^−９Ｍ以下、約５×１０^−９Ｍ以下、約４×１０^−９Ｍ以下、約３×１０^−９Ｍ以下、約２×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−９Ｍ以下、約９×１０^−１０Ｍ以下、約８×１０^−１０Ｍ以下、約７×１０^−１０Ｍ以下、約６×１０^−１０Ｍ以下、約５×１０^−１０Ｍ以下、約４×１０^−１０Ｍ以下、約３×１０^−１０Ｍ以下、約２×１０^−１０Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下、約９×１０^−１１Ｍ以下、約８×１０^−１１Ｍ以下、約７×１０^−１１Ｍ以下、約６×１０^−１１Ｍ以下、約５×１０^−１１Ｍ以下、約４×１０^−１１Ｍ以下、約３×１０^−１１Ｍ以下、約２×１０^−１１Ｍ以下、約１×１０^−１１Ｍ以下、約９×１０^−１２Ｍ以下、約８×１０^−１２Ｍ以下、約７×１０^−１２Ｍ以下、約６×１０^−１２Ｍ以下、約５×１０^−１２Ｍ以下、約４×１０^−１２Ｍ以下、約３×１０^−１２Ｍ以下、約２×１０^−１２Ｍ以下、または約１×１０^−１２Ｍ以下、またはそれ以下のＫ_ｉで結合する直接ＦＸａ阻害剤を中和することを企図する。本開示の方法に従ってＦＸａ変異体によって中和される直接ＦＸａ阻害剤は、野生型ＦＸａを、それがＦＸａ変異体を結合するＫ_ｉの少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも１５分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、または少なくとも５０分の１のＫ_ｉで結合し得る。直接ＦＸａ阻害剤は、野生型ＦＸａを、プロトロンビナーゼ複合体を有さないＦＸａ変異体でのＫ_ｉよりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低いＫ_ｉで結合し得る。直接ＦＸａ阻害剤は、野生型ＦＸａを含むプロトロンビナーゼ複合体を、それがＦＸａ変異体を含むプロトロンビナーゼ複合体を結合する場合とほぼ同一のＫ_ｉで結合し得る。

１つの態様において、本開示は、ＦＸａ変異体を投与することによる、出血している（内部でまたは外部で）または出血するリスクがある（例えば、計画的な外科手術の過程で）対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を中和するための方法を提供する。一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤は、治療濃度またはより高い濃度（すなわち、治療濃度を超える濃度）で対象内に存在し得る。一部の実施形態において、治療濃度は、感受性の個体においては過剰投薬であり得る。本開示の方法は、したがって、直接ＦＸａ阻害剤の過剰投薬に対する解毒剤を提供するために有用である。様々な実施形態において、治療の対象は、ヒトまたは獣医学的対象であり得る。

直接阻害剤の過剰投薬は、過剰に低減した凝血能力の症状または徴候の存在に基づいて検出され得る。非限定的な例には、黒っぽいタール状便、血便、および吐血を含む、胃腸の出血の形跡が含まれる。他の例には、鼻血、ならびに紫斑または小さな切り傷およびかすり傷からの出血の傾向または重症度の増大が含まれる。

臨床的状況において、直接阻害剤の過剰投薬は、直接的に、または対象の血液の凝血能力を測定し、予想された抗凝固程度からの偏差を検出することによって、検出され得る。凝血の潜在能力は、当業者によく知られた方法で測定され得る。例えば、過剰投薬は、対象のプロトロンビン時間が過剰に延びる場合に疑われ得る。特定の実施形態において、過剰投薬は、国際標準化比（ＩＮＲ）で表されるプロトロンビン時間が、約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、またはそれ以上よりも大きいと測定される場合に、裏付けられる。

ＦＸａ変異体は、限定はしないが、計画的な外科手術の前、外出血もしくは内出血をもたらす損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の過剰投薬の後を含む、直接ＦＸａ阻害剤の影響を中和することが望ましい場合にいつでも投与され得る。本開示によると、ＦＸａ変異体は、計画的な外科手術の前、外出血もしくは内出血をもたらす損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の過剰投薬の後などの、望ましい中和影響が必要な時点から、少なくとも約１２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約３時間、少なくとも約２時間、少なくとも約１時間、少なくとも約３０分、少なくとも約１０分、または少なくとも約５分で、投与され得る。

別の実施形態によると、本開示は、急性大量出血を有する対象におけるＦＸａ阻害療法に起因する後天的な凝固障害の緊急の逆転を生じさせるためにＦＸａ変異体を投与する方法を提供する。一部の実施形態において、対象は成人したヒト患者である。他の実施形態において、対象は小児のヒト患者である。

一部の実施形態において、急性大量出血は、外傷によって生じる。他の実施形態において、急性大量出血は、外科手術または他のタイプの介入手順の間に生じる。例示的な非限定的な介入手順には、切開、ドレナージ、血管手術、虫垂切除術、ヘルニア切開術またはヘルニア修復術、腹部手術、胆嚢摘出術、穿孔術（穿頭孔）、腰椎穿刺、心臓ペースメーカーの挿入、股関節骨折手術などが含まれる。さらに他の実施形態において、急性大量出血は、明らかな原因のない、自然発生的な出血であり得る。

限定はしないが、急性大量出血の部位には、胃腸の出血、皮下または筋肉内の出血、膀胱の出血、関節血症、硬膜下血腫、鼻出血、腹膜の出血、子宮の出血、および他の部位の出血が含まれる。

本開示のＦＸａ変異体での有効な治療は、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させ得る。ＦＸａ変異体によるこのような影響の逆転の成功は、様々な手段で決定され得、異なるアッセイ、方法、またはエンドポイントを用いて測定またはモニタリングされ得る。

一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させるためのＦＸａ変異体での治療は、ＦＸａ変異体で治療される対象から得られた血液または血漿に対して行われる試験またはアッセイを用いてモニタリングされる。血液試料は、ＦＸａ変異体での治療の所定時間後に対象から採取され得る。血液、または血液から調製される血漿は、次いで、１つまたは複数の試験にかけられて、直接ＦＸａ阻害剤の存在にも関わらず特定の止血性薬力学的パラメータが正規化されているかが決定される。正規化が見られたら、対象は、ＦＸａ変異体でさらに治療される必要はない。しかし、正規化が見られない場合は、本開示の方法に従うＦＸａ変異体でのさらなる治療が、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させるために必要であり得る。ＦＸａ変異体での治療の有効性をモニタリングするための試験には、凝血する能力を直接的にもしくは間接的に測定する、または直接ＦＸａ阻害剤の活性を測定する試験が含まれる。非限定的な例示的な試験には、プロトロンビン時間または関連する国際標準化比、プロトロンビナーゼ誘発性の凝血時間アッセイ、トロンボエラストメトリー、トロンボエラストグラフィー、色素生成性抗ＦＸａアッセイ、トロンビン生成アッセイ、プロトロンビン断片１＋２のレベル、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体のレベル、活性型部分トロンボプラスチン時間、および部分トロンボプラスチン時間が含まれる。他の試験もまた、当業者の知識内にあり得る。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における出血を低減させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における出血を、ＦＸａ変異体での治療が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における出血を、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における直接ＦＸａ阻害剤の活性を低減させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における直接ＦＸａ阻害剤の活性を、ＦＸａ変異体での治療が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における直接ＦＸａ阻害剤の活性を、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

直接ＦＸａ阻害剤の活性は、それぞれが参照することによって本明細書に組み込まれる、Ａｓｍｉｓら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、１２９：４９２〜４９８（２０１２）、またはＢａｒｒｅｔｔら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１０４：１２６３〜７１（２０１０）において記載されているもののような、色素生成性抗ＦＸａアッセイを用いてモニタリングされ得る。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象の血液または血漿において生産されるトロンビンの量を増大させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるトロンビンの生産を、ＦＸａ変異体が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上、増大させる。対象の血液または血漿におけるトロンビンの生産は、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）または当業者に良く知られた他の技術を用いて決定され得る。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における凝血を増大させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における凝血を、ＦＸａ変異体が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上、増大させる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における凝血時間を低減させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における凝血時間を、ＦＸａ変異体での治療が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における凝血時間を、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

一部の実施形態によると、凝血時間は、止血が回復するにつれて減少する、対象のプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定することによって決定される。ＰＴは、組織因子の添加後に血清が凝血するためにかかる時間量である。ＰＴは、したがって、外因性の凝血系が凝血をサポートする能力を測定する。ＰＴは、試験を実施するために実験室で用いられる特定の試薬に応じて変化し得るが、正常なＰＴは、約１１から１３秒である。凝血時間はまた、凝血時間の測定における実験室ごとのばらつきを排除する、国際標準化比（ＩＮＲ）を用いて表され得る。ＩＮＲを用いて、０．８から１．１という比は、正常な凝血を示す。ＰＴまたはＩＮＲは、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることが必要な対象にＦＸａ変異体が投与されてから所定時間後に決定され得る。

一部の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させるためのＦＸａ変異体での治療は、対象のＰＴを、約２５秒、２４秒、２３秒、２２秒、２１秒、２０秒、１９秒、１８秒、１７秒、１６秒、１５秒、１４秒、１３秒、１２秒、１１秒、１０秒、またはそれ以下まで低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象のＩＮＲを、約４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、またはそれ以下まで低減させる。他の実施形態によると、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるＰＴまたはＩＮＲを、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

プロトロンビン時間は、ＦＸａ変異体の投与の所定時間後に測定され得る。したがって、一部の非限定的な実施形態において、ＰＴは、ＦＸａの投与の１５分、２０分、３０分、４０分、４５分、５０分、６０分、またはそれ以上後に測定される。当業者の知識に従って、他の時間もまた可能である。

凝血時間はまた、それぞれが参照することによって組み込まれる、Ｇｒａｆｆら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ＦＸａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｔｉｍｅ（ＰｉＣＴ）ａｓｓａｙ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｒｉｎ，ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ，ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ ａｎｄ ＤＸ ９０６５ａ、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．、４５：２３７〜４３（２００７）、およびＨａｒｄｅｒら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ＦＸａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ ｂｙ Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ＰｉＣＴ）：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ＦＸａ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｓｓａｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、１２３：３９６〜４０３（２００８）において記載されているような一段階のプロトロンビナーゼ誘発性凝血時間（ＰｉＣＴ）アッセイを用いて測定され得る。

さらに他の実施形態において、トロンボエラストメトリーまたはトロンボエラストグラフィーの方法を用いて、凝血塊の形成または凝血時間を分析することができる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象の血液または血漿におけるプロトロンビン断片１＋２（ＰＦ１＋２）のレベルを増大させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるＰＦ１＋２を、ＦＸａ変異体が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上、増大させる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象の血液または血漿におけるトロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）のレベルを増大させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるＴＡＴを、ＦＸａ変異体が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上、増大させる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における活性型部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を低減させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における活性型部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を、ＦＸａ変異体での治療が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるａＰＴＴを、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

一部の実施形態によると、ＦＸａ変異体を投与することによって対象における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させることは、対象における部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を低減させる。一部の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象における部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を、ＦＸａ変異体での治療が不存在の場合と比較して、直接ＦＸａ阻害剤の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。他の実施形態において、ＦＸａ変異体での治療は、対象におけるＰＴＴを、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減させる。

他の実施形態において、臨床的エンドポイントは、ＦＸａ変異体で治療される対象において、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させるために止血が適切に回復しているかの決定に依存し得る。例えば、対象が急性の出血を示している場合、臨床的な止血有効性は、既存の出血の即座の停止がＦＸａ変異体での治療の後に生じる場合は「非常に良い」とスコア付けされ得、出血の停止が１〜２時間遅れる場合は「普通」とスコア付けされ得、出血の停止が２時間超遅れる場合は「問題あり」とスコア付けされ得、そして出血に対する影響がない場合は「なし」とスコア付けされ得る。ＦＸａ変異体での治療が普通未満であると決定されると、さらなる用量のＦＸａ変異体が、適切な止血を生じさせるために投与され得る。さらなる実施例において、対象が介入手順を受けている場合、臨床的な止血有効性は、正常な止血が手順中に実現される場合は「非常に良い」とスコア付けされ得、手順内の止血が失血の量または質によって少し異常であると判断される場合（例えば、わずかな毛細血管性出血）は「普通」とスコア付けされ得、手順内の止血が失血の量または質によってそれなりに異常であると判断される場合（例えば、管理可能な出血）は「問題あり」とスコア付けされ得、そして、手順内の止血が失血の量または質によって非常に異常であると判断される場合（例えば、重篤な難治性の大出血）は「なし」とスコア付けされ得る。

直接ＦＸａ阻害剤の治療有効用量は、当技術分野における技術を有する医師に周知の多くの要因に依存する。リバーロキサバンの典型的な治療用血漿濃度は、約５００ｎＭである。しかし、本開示によると、ＦＸａ変異体は、より低いまたはより高い濃度の阻害剤を中和するために投与され得る。ＦＸａ変異体で治療される対象におけるリバーロキサバンの血漿濃度は、典型的な治療濃度より低いかまたは高くてよく、例えば、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、または約１０００ｎＭであり得る。

アピキサバンの典型的な治療用血漿濃度は、約２５０ｎＭである。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体は、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、または約１０００ｎＭの血漿濃度のアピキサバンと共に対象に投与される。

同様に、本開示によると、ＦＸａ変異体は、阻害剤の血漿濃度が典型的な治療用血漿濃度よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍高い場合などの、過剰投薬のケースで、直接ＦＸａ阻害剤を中和するために用いられ得る。

ＦＸａ変異体は、驚くべきことに、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度よりも低い血漿濃度で直接ＦＸａ阻害剤を中和することにおいて有効である。本開示によると、ＦＸａ変異体は、約１から１０、約１から２５、約１から５０、約１から１００、約１から２５０、約１から５００、約１から１，０００、約１から２，５００、約１から５，０００、または約１から１０，０００の、阻害剤に対する変異体の血漿濃度比で、直接ＦＸａ阻害剤の影響を無効にする。特定の実施形態において、ＦＸａ変異体は、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度の少なくとも１０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２５０分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも１，０００分の１、少なくとも２，５００分の１、少なくとも５，０００分の１、または少なくとも１０，０００分の１の血漿濃度で、直接ＦＸａ阻害剤の影響を無効にする。

他の実施形態において、直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させるために十分なＦＸａ変異体の血漿濃度は、直接阻害剤の血漿濃度に、約０．１×１０^−４から約１０００×１０^−４、約４×１０^−４から約４０×１０^−４、約２０×１０^−４から約２００×１０^−４、または他の範囲にわたる変換係数をかけることによって計算される。さらに他の実施形態において、変換係数は、約０．１×１０^−４、０．５×１０^−４、１×１０^−４、２×１０^−４、３×１０^−４、４×１０^−４、５×１０^−４、６×１０^−４、７×１０^−４、８×１０^−４、９×１０^−４、１０×１０^−４、１１×１０^−４、１２×１０^−４、１３×１０^−４、１４×１０^−４、１５×１０^−４、１６×１０^−４、１７×１０^−４、１８×１０^−４、１９×１０^−４、２０×１０^−４、２１×１０^−４、２２×１０^−４、２３×１０^−４、２４×１０^−４、２５×１０^−４、２６×１０^−４、２７×１０^−４、２８×１０^−４、２９×１０^−４、３０×１０^−４、３１×１０^−４、３２×１０^−４、３３×１０^−４、３４×１０^−４、３５×１０^−４、３６×１０^−４、３７×１０^−４、３８×１０^−４、３９×１０^−４、４０×１０^−４、４５×１０^−４、５０×１０^−４、５５×１０^−４、６０×１０^−４、６５×１０^−４、７０×１０^−４、７５×１０^−４、８０×１０^−４、８５×１０^−４、９０×１０^−４、９５×１０^−４、１００×１０^−４、１１０×１０^−４、１２０×１０^−４、１３０×１０^−４、１４０×１０^−４、１５０×１０^−４、１６０×１０^−４、１７０×１０^−４、１８０×１０^−４、１９０×１０^−４、２００×１０^−４、２５０×１０^−４、３００×１０^−４、３５０×１０^−４、４００×１０^−４、４５０×１０^−４、５００×１０^−４、５５０×１０^−４、６００×１０^−４、６５０×１０^−４、７００×１０^−４、７５０×１０^−４、８００×１０^−４、８５０×１０^−４、９００×１０^−４、９５０×１０^−４、または１０００×１０^−４であり得、かつこれらの数値の間にわたる。ＦＸａ直接阻害剤の血漿濃度は、当業者の知識に従って、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または他の方法によって、測定され得る。

直接ＦＸａ阻害剤の過剰投薬を逆転させるために十分なＦＸａ変異体の標的血漿濃度を達成することは、当業者の知識の範囲内である。非限定的な例において、対象の血漿容積または他のパラメータなどの、関連する薬物動態学的パラメータの推定は、対象の性別、身長、および体重、または他の因子に基づいて行われ得、標的濃度を達成するためにどの程度ＦＸａ変異体が投与される必要があるかを計算するために用いられる。ＦＸａ変異体を投与した後、血漿濃度は、当業者の知識に従ってモニタリングされ得、この情報は、濃度をあらゆる望ましい範囲に維持するために用いられる。

本開示の組成物および方法には、「治療有効量」または「予防有効量」のＦＸａ変異体が含まれる。「治療有効量」は、必要な投与量および期間で、望ましい治療結果を達成するために有効な量を指す。ＦＸａ変異体の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびにＦＸａ変異体の、個体において望ましい応答を引き出す能力などの因子に従って変化し得る。治療有効量はまた、ＦＸａ変異体のいかなる毒性のまたは有害な影響も治療的に有利な影響を上回らない量である。「予防有効量」は、必要な投与量および期間で、望ましい予防結果を達成するために有効な量を指す。例えば、用量は、計画的な外科手術の前に得ることができる。

投与量レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、治療的または予防的応答）をもたらすように調整され得る。例えば、単回ボーラスを投与することができるか、複数回の分割用量を経時的に投与することができるか、または用量を治療的状況の緊急の要求によって指示されるように比例的に低減もしくは増大させることができる。投与を簡単にするため、および投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤することが特に有利である。本明細書において用いられる投与単位形態は、治療される哺乳動物対象のための単位投与量として適している物理的に個別の単位を指し、各単位は、望ましい治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を、所要の薬学的担体と組み合わせて含有する。本開示の投与単位形態についての仕様は、（ａ）ＦＸａ変異体の特有の特徴、および達成されるべき特定の治療的または予防的影響、ならびに（ｂ）個体の治療のためのこのようなＦＸａ変異体を化合する分野に固有の制限によって決定され、かつそれらに直接依存する。

特定の実施形態において、投与されるＦＸａ変異体の治療または予防有効量は、約０．０００１から５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１から５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１から５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１から０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１から０．５ｍｇ／ｋｇである。

特定の実施形態において、本開示のＦＸａ変異体の治療または予防有効血清濃度は、約０．０００３から３００ｎＭ、約０．００３から３００ｎＭ、約０．０３から３００ｎＭ、約０．００３から３０ｎＭ、約０．０３から３０ｎＭ、または約０．３から３ｎＭである。例えば血液または血漿における、ＦＸａ変異体の濃度は、当技術分野において公知のあらゆる方法によって測定され得る。

投与量値はＦＸａ阻害剤の濃度で変化し得ることに留意されたい。いかなる特定の対象、具体的な投与量レジメンも、個体の要求、および投与する人物または組成物の投与を監督する人物の専門的な判断に従って、経時的に調整されること、ならびに本明細書において示される投与量の範囲は例示的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を限定することを意図したものではないこともさらに理解されたい。

本開示の別の態様は、ＦＸａ変異体またはこのようなＦＸａ変異体を含む組成物を含むキットを提供する。キットには、ＦＸａ変異体または組成物に加えて、診断物質またはさらなる治療物質が含まれ得る。キットにはまた、治療方法において用いるための指示、ならびに、限定はしないが、氷、ドライアイス、発泡スチロール、発泡体、プラスチック、セロファン、シュリンクラップ、気泡ラップ、段ボール、およびスターチピーナッツなどの、包装材料が含まれ得る。１つの実施形態において、キットには、ＦＸａ変異体またはそれを含む組成物と、本明細書において記載される方法において用いられ得る１つまたは複数の治療物質とが含まれる。

ＦＸａ変異体は、例えば、それを含む組成物の形で、適切な止血が回復するまで、または直接ＦＸａ阻害剤がもはや有効でなくなるまで、１回または複数回、対象に投与され得る。複数回の投与が用いられる場合、それらは、１時間に１回、１日に１回、または、例えば１日に複数回の用量を含む、あらゆる他の適切な間隔で、投与され得る。複数回用量は、１０分ごと、１５分ごと、２０分ごと、３０分ごと、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日に１回、３日に１回、および１週間に１回などのスケジュールで投与され得る。ＦＸａ変異体はまた、例えばミニポンプを介して、連続的に投与され得る。ＦＸａ変異体は、例えば非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）を介して投与され得る。ＦＸａ変異体は、通常、以下に記載される医薬組成物の一部として投与される。

別の実施形態において、ＦＸａ変異体は、別のＦＸａ変異体、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡ、およびプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を含む、別の凝固促進剤と共に同時投与され得る。

本開示のＦＸａ変異体とさらなる治療物質との同時投与（組み合わせ療法）は、ＦＸａ変異体とさらなる治療物質とを含む医薬組成物を投与すること、ならびに、２つ以上の分離した医薬組成物、すなわち、ＦＸａ変異体を含む一方の医薬組成物およびさらなる治療物質を含む他方の医薬組成物を投与することを包含する。同時投与または組み合わせ療法にはさらに、ＦＸａ変異体とさらなる治療物質とを同時にまたは連続的にまたはその両方で投与することが含まれる。例えば、ＦＸａ変異体は、３日に１回投与され得、一方、さらなる治療物質は、ＦＸａ変異体と同時に、または異なる時点で、１日に１回投与される。ＦＸａ変異体は、さらなる治療物質での治療の前または後に投与され得る。同様に、本開示のＦＸａ変異体の投与は、外科手術を含む他の治療法を含む治療レジメンの一部であり得る。組み合わせ療法は、疾患の再発を予防するために投与され得る。組み合わせ療法は、１時間から１週間に複数回、投与され得る。投与は、１０分ごと、１５分ごと、２０分ごと、３０分ごと、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回などのスケジュールであり得るか、または、例えばミニポンプを介して連続的に投与され得る。組み合わせ療法は、例えば非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）を介して投与され得る。

さらなる態様において、本開示は、対象における直接ＦＸａ阻害剤の中和において用いるためのＦＸａ変異体を含む組成物を提供する。組成物は、薬学的に許容できる担体、媒体、または生理学的に適合する他の成分を含み得る。このような担体、媒体、および他の成分の非限定的な例には、溶媒（例えば、水、エタノール、生理食塩水、リン酸緩衝溶液）、洗剤、界面活性剤、分散媒質、被覆剤、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、糖（例えば、ショ糖、デキストロース、ラクトース）、ポリアルコール（例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム）、湿潤剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、およびＦＸａ変異体の安定性または有効性を増強させ得る作用物質が含まれる。

本開示に従った使用のため組成物は、溶液（例えば、注射可能溶液および注入可能溶液）などの、対象に投与するためのあらゆる適切な形態であり得る。組成物は、例えばバイアルまたは充填済みシリンジ内の、対象に投与できる状態の予混合されたフォーマットで提供され得る。このようなフォーマットは、投与前の希釈剤での再構成を要しない。あるいは、組成物は、投与前の希釈剤（例えば、滅菌水または生理食塩水）での再構成が必要な凍結乾燥形態で提供され得る。後者の場合、希釈剤は、分離した容器内の凍結乾燥物と共に提供され得る。当業者の知識によると、組成物は、冷凍下でまたは室温で保存するために製剤され得る。組成物の形態は、少なくとも部分的に、意図された投与態様に依存する。特定の実施形態において、投与態様は、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与を含む、非経口投与である。

治療用組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物として、リポソーム内、または高い薬剤濃度に適した他の注文された構造で製剤され得る。無菌注射可能溶液は、所要量のＦＸａ変異体を、上記に列挙された１つの成分または成分の組み合わせと共に、適切な溶媒内に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって、調製され得る。通常、分散物は、活性化合物を、基本的な分散媒質と上記に列挙されたもののうちの所要の他の成分とを含有する無菌媒体内に組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、活性成分と、先に滅菌濾過されたその溶液に由来するあらゆるさらなる望ましい成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散物のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持され得る。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物内に、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。

本開示によって、本明細書における組成物のいずれも、直接ＦＸａ阻害剤で治療されている対象に投与され得ることがさらに企図される。

本明細書において記載される実施例および実施形態は例示的な目的のためのものにすぎないこと、ならびにそれに照らした様々な修正または変更が当業者に明らかであり、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

（実施例１）
リバーロキサバンに対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの感受性
リバーロキサバンに対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの感受性を試験するために、阻害アッセイを確立させた。リバーロキサバンは、０．５８２ｎＭの阻害定数（Ｋ_ｉ）を示す、野生型ＦＸａの効率的な阻害剤であった（図１Ａ）。ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの酵素原様の性質に起因して、リバーロキサバンは、約１５分の１に低減した親和性でこの変異体に結合した（Ｋ_ｉ＝９．３ｎＭ）（図１Ｂ）。逆に、変異体がプロトロンビナーゼ複合体を形成していた場合（すなわち、ＦＶａおよびリン脂質小胞の添加の際）、リバーロキサバンについてのＫ_ｉは、野生型酵素に匹敵する値までほぼ回復した（ｗｔ ＦＸａ、Ｋ_ｉ＝２．６７ｎＭ（図２Ａ）；ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ、Ｋ_ｉ＝３．４ｎＭ（図２Ｂ）。

（実施例２）
ＦＸａ変異体はリバーロキサバンおよびアピキサバンを中和する
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を用いて、酵素原様ＦＸａ変異体が、より生理学的な環境において直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させ得るかを評価した。ＴＧＡは、凝固開始後に経時的に血漿におけるトロンビン生産を測定するものであり、以前に記載されているように行った（参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｎｃｅら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７、２９０〜２９８を参照されたい）。正常なヒト血漿におけるトロンビン生成を、９０分、３７℃で、５００ｎＭのリバーロキサバンの存在下または不存在下で測定した。ＦＸａ^Ｉ１６Ｌがリバーロキサバンの影響を逆転させ得るかどうかを評価するために、増大量のＦＸａ^Ｉ１６Ｌを、５００ｎＭのリバーロキサバンを含有する血漿に添加した。トロンビン生成を、２．０ｐＭの組織因子／４ｕＭのリン脂質、ならびにＣａＣｌ_２およびトロンビン蛍光発生基質で開始させた。

データは、５００ｎＭのリバーロキサバンの存在下の血漿のトロンビン生成プロファイルが、リバーロキサバンの不存在下の血漿と比較して実質的に低減することを実証した。逆に、０．０３から１ｎＭの増大濃度のＦＸａ^Ｉ１６Ｌは、トロンビン生成を回復させた（図３）。これらのデータは、ナノモル濃度およびナノモル濃度を下回る濃度の範囲のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの予想外に低い濃度が阻害剤の影響を逆転させ得ることを示す。５００ｎＭのリバーロキサバン（典型的な治療用血漿濃度）の存在下のＦＸａ^Ｉ１６Ｌの用量応答分析は、トロンビン生成のピーク高さ（図４ＡおよびＣ）および生産された総トロンビン（ＥＴＰ）（図４ＢおよびＤ）が、本質的に最大に達し、これらの条件下でＦＸａ^Ｉ１６Ｌの１〜３ｎＭの間の正常レベルまで完全に回復したことを示す。さらなる実験は、高濃度のリバーロキサバン（７．５μＭ、治療濃度を超える濃度）の存在下でさえも、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌは比較的低い用量（≦３．０ｎＭ）でピークトロンビン（図５Ａ）および生成された総トロンビン（図５Ｂ）の回復において依然として非常に有効であることを示した。

類似の実験もまた、ＦＸａ酵素原様変異体が別の直接ＦＸａ阻害剤であるアピキサバンの影響を逆転させ得るかどうかを評価するために行った。これらの実験において、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌと、別の酵素原様ＦＸａ変異体であるＦＸａ^Ｉ１６Ｔとの有効性も比較した。ＦＸａ^Ｉ１６ＴはＦＸａ^Ｉ１６Ｌに類似しているが、ＦＸａ^Ｉ１６Ｔは、プロトロンビナーゼ複合体を形成している場合に、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌと比較して、本質的に活性が低く、血漿半減期が長く、活性が約３分の１〜５分の１に低減している。リバーロキサバンのデータと一致して、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌは、用量依存的に、２５０ｎＭのアピキサバン（典型的な治療用血漿濃度）の存在下で、ピークトロンビン（図６Ａ）および生成される総トロンビン（図６Ｂ）を回復させ得、１〜３ｎＭのＦＸａ^Ｉ１６Ｌの間で最大に達するようである。ＦＸａ^Ｉ１６Ｔもまた、アピキサバンの影響を逆転させるのに有効であったが、トロンビン生成を完全に回復させるためには、より高い濃度のこの変異体が必要であると考えられる（図６）。両変異体は、より高い濃度のアピキサバン（２μＭ）の存在下でさえも依然として有効であった。しかし、これらの条件下で、トロンビン生成を完全に回復させるためには、より高い濃度の両変異体が必要であると考えられる（図７ＡおよびＢ）。

（実施例３）
ＦＸａ^Ｉ１６Ｌは全血においてリバーロキサバンおよびアピキサバンを中和する
全血トロンボエラストメトリーを用いて、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ変異体の、全血における直接ＦＸａ阻害剤の影響を逆転させる能力を評価した。この系において、血液は健康なボランティアから採取した。最初の２ｍＬの血液を廃棄し、次の５ｍＬの血液を採血器（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）内に回収した。血液試料の回収の前に、トウモロコシトリプシン阻害剤およびクエン酸ナトリウムが回収管の中に入っており、血液内で０．１０５Ｍのシトレートおよび２５μｇ／ｍＬのトウモロコシトリプシン阻害剤の最終濃度が達成された（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バーリントン、バーモント州）。２セットの反応を各ドナーについて分析した。第１の反応は、血液回収の５分後に開始した。第２の反応は、第１の反応の開始の１時間後（回収の１時間５分後）に開始した。

血液を、トロンボエラストメトリーＲＯＴＥＭ（登録商標）デルタ（Ｔｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて分析した。反応のために、（１）６μＬの媒体、タンパク質、および／または阻害剤を空のカップに添加し、（２）２０μｌの０．２ＭのＣａＣｌ_２（最終濃度１１．６ｍＭ）、および（３）２０μｌのＩｎｎｏｖｉｎ（反応物における最終濃度１：１０，０００、組織因子源）をカップに添加した。上記のように回収された全血を反応物（３００μＬ）に添加し、記録を、およそ３０〜６０分にわたり継続するようにした。回収されたデータを、製造者のソフトウェア（Ｒｏｔｅｍ Ｇａｍｍａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．１）を用いて分析した。

ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、リバーロキサバンまたはアピキサバンの存在下で全血凝血塊の形成を加速させる能力を、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）を用いて調べた。両直接ＦＸａ阻害剤は、単独で、２つの異なる濃度で、全血凝血塊の形成に対する実質的な影響を有しており、低用量（治療濃度）では、全血凝血塊の形成は部分的に解消された（図８Ａおよび図９Ａ）が、高用量（治療濃度を超える濃度）では、全血凝血塊の形成はほとんど完全に解消された（図８Ｂおよび図９Ｂ）。全血凝血塊の形成に対するリバーロキサバンまたはアピキサバンの影響は、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌによって逆転することができた。５００ｎＭのリバーロキサバンまたは２５０ｎＭのアピキサバンの存在下で、０．３ｎＭのＦＸａ^Ｉ１６Ｌは、全血凝固を完全にまたはほぼ完全に回復させることができた（図８Ａおよび図９Ａ）。より高い濃度の直接ＦＸａ阻害剤を用いた場合（約２ｕＭ）、０．３ｎＭのＦＸａ^Ｉ１６Ｌは、全血凝固を部分的に回復させ、３ｎＭのＦＸａ^Ｉ１６Ｌは、全血凝固を完全に回復させた（図８Ｂおよび図９Ｂ）。これらのデータは、ＦＸａ酵素原様変異体が、阻害剤の治療濃度と治療濃度を超える濃度との両方で、血漿ベースのおよび全血の凝固アッセイにおいて、リバーロキサバンまたはアピキサバンの抗凝固性の影響を効果的に逆転させ得ることを実証した。

これらの研究の結果は、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌが、リバーロキサバンの抗凝固性の影響を、両作用物質がインビボで投与された場合に中和し得るかを試験することによって、確認され、示された。これらの実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、リバーロキサバン（１ｍｇ／ｋｇ）または緩衝液を、尾静脈を介して注入した。次いでマウスを、頚静脈および大静脈を露出するように準備した。およそ１０分後、ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ（１または２ｍｇ／ｋｇ）を直接的な注射によって頚静脈内に注入した。注射の５分後、血液を、大静脈を介して、シトレートおよびトウモロコシトリプシン阻害剤内に回収した。回収された血液を、次いで、希釈された組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、１：４２，０００希釈）を用いてＲＯＴＥＭによって分析した。緩衝液のみを投与されたマウスから得られた全血は、約２分までに凝血した（図１２）。１ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンの投与によって、凝血時間は実質的に約１０分まで延びた（図１２）。ＦＸａ^Ｉ１６Ｌのさらなる投与によって、凝血時間は、リバーロキサバンの存在下で、用量依存的に短縮した（図１２）。

（実施例４）
ＦＸａ^Ｉ１６Ｌはトロンビン生成アッセイにおいてリバーロキサバンを中和する
血漿におけるリバーロキサバンの逆転に対するＦＸａ^Ｉ１６Ｌの影響を、較正自動化トロンボグラフィー（ＣＡＴ）系（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）を用いて、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）において調べた。正常なヒト血漿を、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（オーバーランドパーク、カンザス州）から入手した。反応において、４μＭのリン脂質および１ｐＭの組織因子を含有する２０μＬのＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ ＬＯＷを、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ丸底９６ウェルプレート内の７０μＬのプールされた正常なヒトクエン酸血漿（治療用血漿濃度範囲内の２５０ｎＭのリバーロキサバンで処理された）に添加し、反応は２連（デュプリケート）で行った。先行する反応が開始するとすぐに、１０μＬの媒体またはＦＸａ^Ｉ１６Ｌを、０．０３１２５ｎＭから０．５ｎＭの範囲のＦＸａ^Ｉ１６Ｌ最終濃度で血漿に添加し、１２０μＬの全反応容積とした。反応を、塩化カルシウムおよび蛍光発生基質を含有する２０μＬのＦｌｕＣａ緩衝液を添加することによって開始させた。血漿反応物の蛍光を、３７℃で、２０秒間隔で、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計で読み取り、参照トロンビン較正器の反応の蛍光と比較して、トロンビン濃度を決定した。蛍光シグナルの強度（ＦＵ）を、３７℃で、ＣＡＴを用いて、連続的にモニタリングした。Ｔｈｒｏｍｂｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶバージョン）を用いて、トロンビン生成曲線（ｎＭトロンビン対時間）を分析して、遅滞時間、ピーク高さ、ピークまでの時間、および内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）を表す曲線下面積を抽出した。

正常なヒト血漿におけるトロンビン生成の用量依存性の阻害を、インビトロでのリバーロキサバン処理（５〜２００ｎＭ）で観察した（図１０Ａ）。リバーロキサバンは、遅滞時間の増大と、ピークトロンビンの減少およびＥＴＰの減少とをもたらした。リバーロキサバン（２５０ｎＭ）へのＦＸａ^Ｉ１６Ｌの添加は、ヒト血漿を阻害し、その結果、トロンビン阻害の用量依存性の逆転をもたらし（図１０Ｂ）、すなわち、ピークトロンビン生成は回復し、遅滞期は短縮され、そしてＥＴＰは増大した。低用量の０．０３１２５ｎＭのＦＸａ^Ｉ１６Ｌで、トロンビン生成は、媒体で処理された正常なヒト血漿に匹敵するレベルまで回復した。

（実施例５）
ＦＸａ^Ｉ１６Ｌはマウス尾部クリップ出血モデルにおいてリバーロキサバンを中和する
ＦＸａ^Ｉ１６Ｌの、インビボでのリバーロキサバンの影響を克服する能力を、正常なマウスにおける急性出血モデルにおいて評価した。結果は、酵素原様ＦＸａ変異体が直接ＦＸａ阻害剤の抗凝固性の影響を逆転させ得ることを実証した。

出血を延ばすリバーロキサバンの用量を確立するために、オスＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）に、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇの用量のリバーロキサバンを単回、静脈内注射した。３０分後、マウスをイソフルランで麻酔し、加熱したプラットフォームに置き、そしてマウスの体温を３７℃で維持し、その後、尾部を切断した。尾部を、５０ｍＬの事前に温めた３７℃のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）内に２分浸した。３ｍｍの尾部切断部を作製し、血液を１０分間、ＰＢＳ内に回収した。出血量の定量的評価を、ＰＢＳ内に回収された血液のヘモグロビン含有量によって決定した。試験管を遠心分離して赤血球を回収し、５ｍＬの溶解緩衝液（８．３ｇ／ＬのＮＨ_４Ｃｌ、１．０ｇ／ＬのＫＨＣＯ_３、および０．０３７ｇ／ＬのＥＤＴＡ）内に再懸濁し、そして試料の吸光度を５７５ｎｍで測定した。吸光値を、標準曲線を用いて、総失血（μＬ）に変換した。リバーロキサバンの投与の結果、尾部切断後の失血が用量依存的に増大した（図１１）。

このモデルにおいて、５０ｍｇ／ｋｇ用量のリバーロキサバンは、尾部離断後の失血を増大させた。マウスに５０ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンを投薬し、３０分後、５０または２００ｕｇ／ｋｇのＦＸａ^Ｉ１６Ｌを３７℃で静脈内に投薬し、その後、尾部を切断した。マウスを次いでイソフルランで麻酔し、加熱したプラットフォームに置き、そしてマウスの体温を３７℃で維持し、その後、尾部を切断した。尾部を、５０ｍＬの事前に温めた３７℃のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）内に２分浸した。３ｍｍの尾部切断部を作製し、血液を１０分間、ＰＢＳ内に回収し、出血量の評価を、記載したように、ヘモグロビン含有量によって決定した。このモデルにおいて、止血性ＦＸａ^Ｉ１６Ｌ変異体の投与により、リバーロキサバンで誘発される過剰な失血が減少した（図１１）。

（実施例６）
ＦＸａ^Ｉ１６Ｌは生体顕微鏡法を用いて実証されるようにマウス出血モデルにおいてリバーロキサバンを中和する
生体顕微鏡法を用いて視覚化されるように、リバーロキサバンは、レーザー誘発性の損傷後のマウス精巣挙筋の微小循環において血栓の形成を阻害することが実証された。ＦＸａ^Ｉ１６Ｌのさらなる投与によって、この系におけるリバーロキサバンの抗凝固性の影響は中和され得た。

標準的な技術を用いて、マウスの精巣挙筋を露出させ、生体顕微鏡法を用いて視覚化した。筋肉における血管の損傷を、次いで、レーザーを用いて誘発した。損傷後、凝血塊の形成を、フィブリンおよび血小板を特異的に認識する異なる蛍光標識された抗体を用いて視覚化した。凝血は、両タイプの抗体から生じる蛍光シグナルの存在によって示される。

レーザーでの損傷の後、未処理マウスは、損傷部位で凝血塊を迅速に形成し、それは数分にわたり安定であった（図１３Ａ）。ビデオフレームにおいて、凝血塊は、フィブリンおよび血小板に対する抗体と関連する蛍光シグナルの同時発生として可視的である（より暗い灰色の領域と重なる、明るい灰色の中央領域）。１ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンの、マウスへの投与は、しかし、損傷部位での血小板の蓄積を遅らせ、フィブリンのあらゆる兆候を解消した（図１３Ｂ）。ビデオフレームにおいて、抗血小板抗体に関連する蛍光シグナルの存在を反映する暗い灰色の領域によって示されるように、程度が低減した血小板のみが見られた。逆に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンと、その後、０．５ｍｇ／ｋｇのＦＸａ^Ｉ１６Ｌとを投与した場合、凝血塊は、損傷部位で迅速に形成された（図１３Ｃ）。ビデオフレームにおいて、凝血塊は、血小板およびフィブリンに対する抗体と関連する蛍光シグナルの特徴的なパターンによって示される。

本明細書において別段の定義がない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。通常、本明細書において記載される、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名と、それらの技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられるものである。

本開示の方法および技術は、通常、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、本明細書の全体を通して引用され論じられる様々な一般的な参考文献およびさらに具体的な参考文献において記載されているように行われる。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造者の説明に従って、当技術分野において一般に達成されるように、または本明細書において記載されるように行われる。本明細書において記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医科学および薬化学に関連して用いられる命名と、それらの実験手順および実験技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられるものである。

本明細書において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、または他の文献は、各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文献が全ての目的で参照することによって組み込まれることが個別に示されたのと同程度に、全ての目的で、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めることを意図するが、いかなる他の整数または整数群の排除も意図するものではないことが理解される。

Claims (22)

1. 直接第Ｘａ因子阻害剤（直接ＦＸａ阻害剤）であるリバーロキサバンまたはアピキサバンで治療されている対象における出血を低減させるかまたは予防するための医薬組成物であって、配列番号１における２３５位に対応する位置のアミノ酸がＬｅｕまたはＴｈｒで置換されている第Ｘａ因子変異体を含み、かつ第Ｘａ因子変異体が、リバーロキサバンまたはアピキサバンの血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度でリバーロキサバンまたはアピキサバンの影響を無効にする、医薬組成物。
2. 出血が少なくとも約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減する、請求項１
   に記載の組成物。
3. それを必要とする対象における直接ＦＸａ阻害剤であるリバーロキサバンまたはアピキサバンの存在下で生産されるトロンビンの量を増大させるための医薬組成物であって、配列番号１における２３５位に対応する位置のアミノ酸が、ＴｈｒまたはＬｅｕで置換されている第Ｘａ因子変異体を含み、かつ第Ｘａ因子変異体が、リバーロキサバンまたはアピキサバンの血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度でリバーロキサバンまたはアピキサバンの影響を無効にする、医薬組成物。
4. 生産されるトロンビンの量が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、または５０倍増大する、請求項３に記載の組成物。
5. それを必要とする対象においてリバーロキサバンまたはアピキサバンの存在下で凝血時間を減少させるための医薬組成物であって、配列番号１における２３５位に対応する位置のアミノ酸がＬｅｕまたはＴｈｒで置換されている第Ｘａ因子変異体を含み、かつ第Ｘａ因子変異体が、リバーロキサバンまたはアピキサバンの血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度でリバーロキサバンまたはアピキサバンの影響を無効にする、医薬組成物。
6. 凝血時間が少なくとも約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％低減する、請求項５に記載の組成物。
7. 凝血時間の低減がプロトロンビン時間（ＰＴ）を用いて測定される、請求項５に記載の組成物。
8. 前記対象における前記ＰＴが、約２５秒、２４秒、２３秒、２２秒、２１秒、２０秒、１９秒、１８秒、１７秒、１６秒、１５秒、１４秒、１３秒、１２秒、１１秒、または１０秒である、請求項７に記載の組成物。
9. 前記対象における国際標準化比（ＩＮＲ）が、約４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、または０．７である、請求項７に記載の組成物。
10. ＰＴが、ＦＸａ変異体の投与の１５分、２０分、３０分、４０分、４５分、５０分、６０分、７５分、または９０分後に決定される、請求項７から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 急性大量出血を有する対象におけるＦＸａ阻害療法に起因する後天的な凝固障害の緊急の逆転を生じさせるための医薬組成物であって、ここで該ＦＸａ阻害療法が、直接ＦＸａ阻害剤であるリバーロキサバンまたはアピキサバンによるものであり、該医薬組成物が配列番号１における２３５位に対応する位置のアミノ酸がＬｅｕまたはＴｈｒで置換されている第Ｘａ因子変異体を含み、かつ第Ｘａ因子変異体が、リバーロキサバンまたはアピキサバンの血漿濃度の少なくとも１００分の１の血漿濃度でリバーロキサバンまたはアピキサバンの影響を無効にする、医薬組成物。
12. 第Ｘａ因子変異体が、０．０００１から５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１から５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１から５ｍｇ／ｋｇ、０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇ、０．００１から０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１から０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 第Ｘａ因子変異体が、０．０００３から３００ｎＭ、０．００３から３００ｎＭ、０．０３から３００ｎＭ、０．００３から３０ｎＭ、０．０３から３０ｎＭ、または０．３から３ｎＭの血清濃度に達するように投与される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 第Ｘａ因子変異体が、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度の少なくとも２５０分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも１，０００分の１、少なくとも２，５００分の１、少なくとも５，０００分の１、または少なくとも１０，０００分の１の血漿濃度で、直接ＦＸａ阻害剤の影響を無効にする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 第Ｘａ因子変異体が、直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度に０．１ｘ１０^−４から１００ｘ１０^−４の範囲にわたる変換係数をかけることによって計算される血漿濃度で、直接ＦＸａ阻害剤の効果を無効にするものである、請求項１から１４のいずれか一項に記載
    の医薬組成物。
16. 第Ｘａ因子変異体が、計画的な外科手術の前、損傷の後、または直接ＦＸａ阻害剤の過剰投薬の後に投与される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 第Ｘａ因子変異体が２回以上投与される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 少なくとも１つのさらなる凝固促進剤が投与される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 凝固促進剤が、異なる第Ｘａ因子変異体、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡ、およびプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
20. 直接ＦＸａ阻害剤の血漿濃度が治療量を超える量である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 直接ＦＸａ阻害剤がリバーロキサバンであり、リバーロキサバンの血漿濃度が、少なくとも約１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、または８００ｎＭである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 直接ＦＸａ阻害剤がアピキサバンであり、アピキサバンの血漿濃度が、少なくとも約５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、または４００ｎＭである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。

Images