JP6655536B2 - 補因子の非存在下で凝固活性を有する、及び/又は、第ix因子凝固活性が増加した第ix因子変異体、並びに、出血性疾患を処置するためのその使用 - Google Patents
補因子の非存在下で凝固活性を有する、及び/又は、第ix因子凝固活性が増加した第ix因子変異体、並びに、出血性疾患を処置するためのその使用 Download PDFInfo
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Description
凝固第IX因子
血液凝固第IX因子(F.IX)は、凝固カスケードにおいて中心的な役割を果たしている。F.IXは、一本鎖の不活性なチモーゲンとして血漿中を循環するトリプシン様のビタミンK依存性セリンプロテアーゼである(DiScipio et al., 1977; Davie et al., 1991)。第IX因子は、第XIa因子又は第VIIa因子−組織因子のいずれかによってCa2+依存的に活性化される。活性化には、活性化第VII因子(F.VIIa)−組織因子複合体又は活性化第XI因子(F.XIa)のいずれかによる2つのペプチド結合の開裂により(Fujikawa et al., 1974; Lindquist et al., 1978)、35残基の活性化ペプチドを除去することが必要である。
最もよく知られている凝固因子疾患は血友病である。血友病は、生体が血液凝固又は凝血を制御する能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患のファミリー名である。最もよく見られる形態である血友病Aは、第VIII因子(F.VIII)遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これにより、F.VIIIの欠損症が起こる。遺伝は、X連鎖劣性であり;したがって、男性は発症するが、女性はキャリアであるか又は非常に稀に軽度の表現型を示す。5,000人中1人の男性が発症する。血友病Bは、第IX因子(F.IX)欠損症としても知られ、これは2番目に最もよく見られるタイプの血友病であるが、血友病Bは血友病Aよりもはるかに頻度が少ない。
血友病は、遺伝子療法アプローチに理想的である。なぜなら、必要とされる凝血は血流中を循環しており、それ故、生体中の基本的にどこにでも発現され得るからである。さらに、重度な形態の疾病を患う患者の予防処置を用いての研究は、循環中の凝血因子の1%超の最小限の上昇が、すでに臨床結果を改善し得、そして疾病によって引き起こされる大半の病変、すなわち関節破壊を回避し得ることを実証した。いくつかの遺伝子療法アプローチが開発されたが、試験は依然として初期の臨床段階である。最も有望なアプローチは現在、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いての血友病Bの処置のためのものである。
本発明によると、この目的は、第IX因子(F.IX)又は活性化第IX因子(F.IXa)の変異体を提供することによって解決され、F.IX変異体は、それが補因子の非存在下で凝固活性を有することを特徴とし、該補因子は第VIII因子(F.VIII)又は活性化第VIII因子(F.VIIIa)である。
−非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシン;
−塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン;
−酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸;並びに
−非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステインを含む。
mRNA/cDNAについてはRefseq NM_000133(配列番号1)、及び
タンパク質配列についてはRefseq NP_000124(配列番号2)。
配列番号2のアミノ酸配列は、F.IXのシグナルペプチド及びプロペプチドを含有する。実際の番号付けは、−46(Met)から始まり;+1はTyrである。
さらに、6、11、25、44、54、72、75、78、86、89、102、105、113、119、122、125、135、139、154、159、185、195、196、211、219、222、224、236、243、251、260、262、263、268、289、299、302、304、310、319、330、334、336、338、366、368、376、383、386、391、392、394、399、及び/又は99−ループの改変、
好ましくは255〜269、383、6、44、72、75、102、105、122、185、224、263、338、及び/又は99−ループの改変、
より好ましくは6、102及び/又は185
の群から選択された位置にアミノ酸置換を含む。
好ましくは、L6F、Q44H、W72R、F75V、S102N、S102K、S102P、S102R、S102Q、S102W、N105S、K122R、E185D、E185S、E185F、E185K、E185P、E185Q、E185R、E224G、E243D、I263S、R338E、T376A、及び/又は99−ループの改変、
より好ましくはL6F、S102N及び/又はE185D
の群から選択される。
グループA
−補因子F.VIIIの非存在下における凝固活性
(F.VIII非依存性活性)
野生型と比較して増加
グループB
−補因子F.VIIIの非存在下における凝固活性
F.VIII非依存性凝固活性は、基本変異体のそれぞれの凝固活性と比較して増加している
好ましくは、L6F、S102N、S102K、S102P、S102R、S102Q、S102W、E185D、E185S、E185F、E185K、E185P、E185Q、E185Rから選択され、
1つの実施態様では、265位のアミノ酸置換は、K265T又はK265Aである。
V181I/K265T/I383V/L6F変異体、
V181I/K265T/I383V/S102N変異体、
V181I/K265T/I383V/E185D変異体、
V181I/K265T/I383V/E185S変異体、
V181I/K265T/I383V/L6F/S102N変異体、
V181I/K265T/I383V/L6F/S102K変異体、
V181I/K265T/I383V/S102N/E185D変異体、及び
V181I/K265T/I383V/S102N/E185S変異体
から選択される。
V181I/K265A/I383V/L6F変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N変異体、
V181I/K265A/I383V/E185D変異体、
V181I/K265A/I383V/E185S変異体、
V181I/K265A/I383V/L6F/S102N変異体、
V181I/K265A/I383V/L6F/S102K変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N/E185D変異体、及び
V181I/K265A/I383V/S102N/E185S変異体
から選択される。
V181I/K265A/I383V/L6F変異体、及び
V181I/K265A/I383V/E185D変異体
から選択される。
本発明によると、この目的は、第IX因子(F.IX)又は活性化第IX因子(F.IXa)の変異体を提供することによって解決され、ここで、F.IX変異体は、それが野生型と比較してその補因子の存在下で増加した凝固活性を有することを特徴とし、ここで、該補因子は、第VIII因子(F.VIII)又は活性化第VIII因子(F.VIIIa)である。
好ましくは、K5A、K5F、L6F、V10K、V10F、V10R、Q11R、Q11H、Q11K、Q44H、W72R、F75V、E78D、S102N、N105S、K122R、V135A、T159S、E185D、D186E、V211I、E224G、E243D、A262D、I263S、H268R、R327S、N367D、P368I、T376A、I383A、K394R、
より好ましくはK5A、L6F、Q11R、Q44H、W72R、F75V、E78D、S102N、N105S、K122R、E185D、D186E、V211I、E224G、E243D、I263S、T376A、K394R
の少なくとも1つと組み合わせて、アミノ酸置換R338L又はR338Eを含む。
グループD
−補因子F.VIIIの存在下で増加した凝固活性
(F.VIII依存性活性)
野生型と比較して増加
該補因子は第VIII因子(F.VIII)又は活性化第VIII因子(F.VIIIa)であり、
該変異第IX因子又は活性化第IX因子は、4、5、6、10、11、44、72、75、78、102、105、122、135、159、185、186、211、224、243、262、263、265、268、327、367、368、376、377、383、394、
好ましくは4、5、6、10、11、44、72、75、102、105、122、185、224、243、263、265、376、377、
より好ましくは377、10、4、5及び/又は265
の群から選択された位置のアミノ酸置換と組み合わせて、338位にアミノ酸置換を含む。
好ましくはK5A、L6F、Q11R、Q44H、W72R、F75V、E78D、S102N、N105S、K122R、E185D、D186E、V211I、E224G、E243D、I263S、K265T、T376A、S377W、K394R、
より好ましくはS377W、V10K、G4Y、K5A及び/又はK265T
の群から選択される。
5位のアミノ酸置換、
10位のアミノ酸置換、及び/又は
377位のアミノ酸置換
と組み合わせて、338位にアミノ酸置換を含む。
5位のアミノ酸置換はK5Aであり、
10位のアミノ酸置換はV10Kであり、
及び/又は377位のアミノ酸置換はS377Wである。
V10K/R338L変異体、
R338L/S377W変異体、
V10K/R338L/S377W変異体、
V10K/R338L/S377W/L6F変異体、
V10K/R338L/S377W/E243D変異体、
V10K/R338L/S377W/E224G変異体、
V10K/R338L/S377W/L6F/E224G変異体、
V10K/R338L/S377W/E243D/E224G変異体、
V10K/R338L/S377W/K265T変異体、
K5A/R338L変異体、
K5A/R338L/S377W変異体、
K5A/V10K/R338L/S377W変異体、
G4Y/V86A/R338L/S377W変異体、及び
G4Y/V86A/R338L/S377W/K265T変異体
から選択される。
本発明は、本発明者らの国際公開公報第2010/012451号のこれより以前の出願にすでに開示されている変異第IX因子を包含しない。特に、本発明は、以下を包含しない:
−単一変異体:R338A、S377W、G4Y、V86A、K265T、K265A、
−G4Y/V10K変異体、
−S340T/R338A/Y345T変異体、
−R338A/S377W変異体、
−S360A/R338A/S377W変異体、
−V86A/R338A/S377W変異体、
−G4Y/R338A/S377W変異体、
−R338A/K265T変異体、
−K265T/R338A/I383V変異体、
−Y259F/K265T/R338A/T340S/Y345T変異体、
−V181I、K265T/I383V変異体、
−V181I/K265T/R338A/S377W/I383V変異体。
−単一変異体:K5A、V10K、V86A、E277A、R338A、R338L、
−単一変異体:S102A、E113A、K122A、N105A、
−K5A/V10K変異体、
−V86A/E277A変異体、
−E277A/R338A変異体、
−V86A/E277A/R338A変異体、
−V86A/E277A/R338L変異体、
−Y259F/K265T/Y345T変異体。
好ましい実施態様では、本発明による第IX因子変異体は、該変異体に好ましくは共有結合的に付着した、さらなる化合物又は部分を含む(コンジュゲート)。
−タンパク質、例えばアルブミン、
−ラベル、例えば発色団、フルオロフォア、アイソトープ、
及び/又は
−バイオポリマー/ポリマー、例えばキトサン、PEG
から選択される。
本発明によると、上記の目的はさらに、本発明による変異第IX因子をコードする核酸を提供することによって解決される。
本発明によると、前記目的は、疾病の診断、予防及び/又は治療のために、本発明において開示したような、第IX因子変異体、又はそれらをコードする核酸、又は本発明の医薬組成物を提供することによってさらに解決される。
−F.VIIIの非存在下でトロンビンの生成を用量依存的に向上させ、F.VIIIの存在下においても野生型F.IXと比較してあまり変わらない効果を示し、
−F.VIIIの存在下及び非存在下においてF.Xの活性化を向上させ、
−F.VIIIに対する阻害抗体の存在下で凝固時間を修正し(F.VIIIインヒビターの存在下でも試験したF.IX変異体の機能を確認)、
−事前に活性化されないが、チモーゲン様であり、
−インビボで凝固を修正し、出血を止める(F.IX変異体が、インビボにおいて止血活性のある治療薬として働くことができる最初の証拠である)
ことを実証した。さらなる詳細については、実施例6〜8及び図1〜7を参照されたい。
本発明によると、前記目的はさらに、抗凝固化合物(抗凝固剤)、好ましくはF.IXaを直接阻害する物質のスクリーニング法を提供することによって解決される。
−試験しようとする化合物/物質を提供し、
−本発明の少なくとも1つの変異第IX因子を提供し、
−試験しようとする化合物/物質を、本発明の少なくとも1つの変異第IX因子と接触させ、
−該化合物/物質が、少なくとも1つの変異第IX因子に結合するかどうかを決定し、
−場合により、該化合物/物質が、少なくとも1つの変異第IX因子の活性をモデュレーションするかどうかを決定する。
実施例1
材料及び方法
非ウイルス性ベクター
プラスミドpcDNA(商標)3.1(インビトロジェン社、カールスバッド、CA、米国)は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター/エンハンサーの制御下にある1.4kbのイントロンAのフラグメントとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むヒトFIXミニ遺伝子を含有していた(Schuettrumpf et al., 2005)。インビボでの発現のために、ヒトFIX発現カセットをミニサークル産生プラスミドpMC.BESPX−MCS2(System Biosciences)に導入し、強力な肝臓特異的エンハンサー/プロモーターHCR/hAAT(肝遺伝子座制御領域1/ヒトα−1−抗トリプシン)によって制御された。ヌクレオチド置換を、クイックチェンジII XL−部位特異的突然変異誘発キット(Agilent technologies)を使用してhFIX cDNAに導入し、配列決定によって確認した。
ランダムな突然変異を、製造業者によって記載されているようにGeneMorph II EZClone Domain Mutagenesisキット(Agilent technologies)によってV181I、K265T及びI383Vの置換(FIX−ITVと命名;Milanov et al., 2012)をすでに有しているpcDNA(商標)3.1のhFIX発現カセットに導入した。メガプライマー合成は、1.2kbのフラグメントを増幅するhFIX cDNAのエキソン2〜8にかけての
正方向5’ TCTGAATCGGCCAAAGAGG ‘3[配列番号3]プライマー、及び
逆方向5’ CAGTTGACATACCGGGATACC ’3[配列番号4]プライマー
を使用して行なわれた。標的DNAの初期量を750ngに設定して、1kbあたり2.7の突然変異頻度を得た。プラスミドDNAを、QIAprep 96 Turbo Miniprepキット(キアゲン社)を使用して各々の個々の形質転換された大腸菌コロニー(総数:1600)から抽出した。HEK293T細胞を、96ウェルプレートでリポフェクション(リポフェクタミン;インビトロジェン社)によって、FIX−WT、FIX−ITV、又は個々の変異体をコードするプラスミドDNA 2.5μgを用いてトランスフェクトし、最初の細胞密度は5×104個の細胞/ウェルであった。10μg/mlのビタミンKの補充されたOptiMem培地中におけるタンパク質の発現は48時間かけて行なわれた。各々の変異体の回収された上清を、それぞれFVIIIの存在下及び非存在下において、市販の発色アッセイ(Biophen Faktor IX; Hyphen BioMed)を僅かに改変したものを使用してFIXバイパス活性及びFVIIIバイパス活性についてアッセイした。正常なヒト血漿(対照血漿N;シーメンス社)を標準曲線のために使用し、工学操作された変異体FIX−ITVを、活性レベルの比較のための参照基準として使用した。有望な変異体/クローンを配列決定して、活性の増加に関与する具体的なアミノ酸の置換を同定した。
HEK293T細胞を、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン及び1%L−グルタミンの補充されたDMEM中で培養し、トランスフェクションの24時間前に、1×106個の細胞/ウェルの初期細胞密度で6ウェルプレートに播種した。一過性の発現のために、細胞に、リン酸カルシウムにより媒介される沈降法を使用して、CMV−hFIX pcDNA(商標)3.1プラスミド 15μgを用いてトランスフェクトした。タンパク質の発現は、10μg/mlのビタミンKを含むが、血清及び抗生物質不含Opti−MEM中で行なわれた。トランスフェクションから24時間後に上清を回収し、FIX活性、ELISA、動的パラメーター、及びトロンビン生成についてアッセイした。
凝血活性を、以前に記載されているように(Milanov et al., 2012)、FIX欠損血漿又はFVIII欠損血漿における改変された1段階の活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)及び非活性化aPTT(naPTT)アッセイによって決定した。FIX比活性は、凝血活性を抗原レベルによって割ることによって算出され、野生型タンパク質(100%と設定)に対して標準化された。FIX抗原レベルは、記載のように(Schuettrumpf et al., 2005)、ELISAによって決定された。
トロンビン生成は、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ(Technothrombin TGA; Technoclone)を用いて測定した。TGA RD緩衝液を、それぞれFVIII欠損血漿又はFIX欠損血漿中で1:20又は1:100の最終希釈率で使用した。FIXタンパク質の最終濃度は、TGA緩衝液(Technoclone)中で希釈された正常な血漿レベルの0.05%〜5%であった。rhFIX(ベネフィクス;ファイザー社)又はrhFVIII(コージネイト;バイエル社)の製剤を対照として使用した。トロンビン生成分析を、提供されたTechnothrombinTGA評価ソフトウェアによって評価した。
FIXタンパク質試料を、5mMのCaCl2の存在下、1:100の酵素/基質のモル比で室温で5時間かけて、活性化FXI(Haematologic Technologies)によってFIXaへと活性化した。次いで、FXIaを、プロテインGでコーティングされた磁気ビーズ(DynabeadsプロテインG;インビトロジェン社)に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗FIX IgG(Haemachromdiagnostica)によって除去した。FX活性化を、10nMのrhFVIII(コージネイト(登録商標);バイエル社)及び1nMのFIXの存在下、又は、FVIIIの非存在下で4nMのFIXと共に、記載の通りに行なった(7)。反応を、37℃でマイクロタイタープレートリーダーで1分間隔で10分間405nmで測定した。吸光値を、pNAについての9600M−1cm−1のモル吸光係数、及び総容量100μlに対して0.5cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス−メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン12.0によって計算した。
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局(Regierungsprasidium Darmstadt)によって認可された。C57Bl/6マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。FVIII遺伝子のエキソン16の破壊を含有しているFXIII欠損マウスは、Charles River Laboratoriesから入手した。マウスは、実験開始時には9〜12週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、FIX−WT又は変異体をコードしている非ウイルス性ベクターMC.HCR/hAAT.FIXを、以前に記載(Milanov et al., 2012)されているように、マウス1匹あたり25μgのベクター用量で尾静脈に水力学的に投与した。注射から3日後に、血液試料を後眼窩神経叢から採取した。テールクリップ出血アッセイを、以前に記載(Milanov et al., 2012)されているように行ない、575nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。TAT複合体を、製造業者の説明書に従ってELISA(Enzygnost TAT; Siemens)によって測定した。
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン12.0(Systat software Inc.、サンノゼ、米国)を使用して分散分析(ANOVA)によって行なった。
ITV変異体及びIAV変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らはさらなる突然変異を導入して、異なる特性を有するF.IX分子を作製した。
FIX突然変異体が、インビボでの凝血活性を改善し、かつHAマウスの出血表現型を修正する能力を調べるために、本発明者らは、FIX−WT又は変異体FIX−FIAV(IAV+L6F)又はFIX−IDAV(IAV+E185D)をコードしている肝臓に指向されるミニサークルを、25μgのベクター用量で、FVIIIノックアウトマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から3日後、突然変異体FIXの発現レベルは、全ての処置群において類似しており、正常の約300%の血漿中活性レベルに達した(図9A)。FIX−IDAVで処置されたマウスのみが、有意により短い凝血時間を示し、1段階のaPTTアッセイによってFVIII欠損血漿中で測定したところ、FVIII非依存性活性は10%であった(図9B)。それにも関わらず、FIX−FIAV及びFIX−IDAVの両方の突然変異体が、テールクリップ出血アッセイ後に血友病表現型を部分的に修正し(図9C)、このことは、少量のFVIIIバイパス活性で、凝固カスケードを開始しかつ回復させるのに十分であることを示唆する。本発明者らはまた、凝固系の一般的な活性化マーカーを代表する、TAT複合体レベルに対するFIX突然変異体の効果も調べた。TATレベルは、全ての群において依然として同じであったが、個体間のばらつきは大きかった(図9D)。
材料及び方法
組換えタンパク質の産生、及び凝固活性の測定
上記の実施例1を参照されたい。
トロンビン生成を、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ(TechnothrombinTGA; Technoclone)を用いて測定した。TGA RD緩衝液を、それぞれFVIII欠損血漿又はFIX欠損血漿中で最終希釈率1:20又は1:100で使用した。FIXタンパク質の最終濃度は、TGA緩衝液(Technoclone)で希釈された正常な血漿レベルの0.05%〜5%であった。rhFIX(ベネフィクス;ファイザー社)又はrhFVIII(コージネイト;ファイザー社)の製剤を対照として使用した。トロンビン生成の分析を、提供されたTechnothrombinTGA評価ソフトウェアによって評価した。
FIXタンパク質試料を、5mMのCaCl2の存在下で、酵素/基質のモル比1:100で、室温で5時間かけて、活性化FXI(Haematologic Technologies)によってFIXaへと活性化した。次いで、FXIaを、プロテインGでコーティングされた磁気ビーズ(DynabeadsプロテインG;インビトロジェン社)に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗FXI IgG(Haemachrom diagnostica)によって除去した。FX活性化を、10nMのrhFVIII(コージネイト(登録商標)、バイエル社)及び1nMのFIXの存在下で、記載されているように(Hartmann et al., 2009)行なった。反応を、37℃でマイクロタイタープレートリーダーで1分間隔で10分間405nmで測定した。吸光値を、pNAについての9600M−1cm−1のモル吸光係数、及び総容量100μlに対して0.5cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス−メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン12.0によって計算した。
ナノ粒子を、記載のように(Mao et al., 2001)複合体のコアセルベーションによって調製した。脱アセチル化度が75%超である高分子量のキトサン(シグマ−アルドリッチ社)を、50mMのNaOAc緩衝液に溶解して、pH5.5の0.02%〜0.08%溶液とした。キトサン及び50mM Na2SO4緩衝液中50μg/ml又は100μg/mlのプラスミドDNA溶液を、別々に55℃まで加熱した。等容量(500μl)の両方の溶液を共に、高速ボルテックス下で30秒間混合した。ナノ粒子を経口投与まで室温で保存した。
キトサン/DNAナノ粒子(20μl、1μgに等しい)又は複合体を形成していないDNA(1μg)を、1、100、又は300mUのDNaseI(サーモフィッシャー社)のいずれかと共に37℃で1時間インキュベートした。反応を、EDTAの存在下で65℃で10分間の熱失活によって停止させた。37℃で4時間かけて0.8Uのキトサナーゼ(シグマ−アルドリッチ社)と共にさらにインキュベートすることにより、ナノ粒子からDNAが放出された。ベクターDNAの完全性を、0.8%アガロースゲル上でのその後の電気泳動によって調べた。
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局(Regierungsprasidium Darmstadt)によって認可された。C57Bl/6マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。C57Bl/6バックグラウンドのFIX欠損マウス(HBマウス)は、Katherine High(フィラデルフィア小児病院)によって親切にも提供された。マウスは、実験開始時には9〜12週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、FIX−WT又は変異体をコードしている非ウイルス性遺伝子導入ベクターMC.HCR/hAATを、以前に記載(Milanov et al., 2012)されているように、マウス1匹あたり10μgのベクター用量で、尾静脈に水力学的に投与した。経口でのFIX遺伝子の送達のために、マウスに、キトサンナノ粒子として製剤化され、ベビーシリアルと混合された、CMVプロモーターにより駆動されるベクター(pcDNA3.1又はMC)を与えた。FIX欠損マウスの免疫化を、2IUのrhFIXタンパク質(ベネフィクス;ファイザー社)の2回の皮下注射によって不完全フロイントアジュバントの存在下で2週間の間隔で行なった。血液を、イソフルラン麻酔下で後眼窩神経叢から1/10容量の3.8%クエン酸ナトリウム緩衝液中に採取した。テールクリップアッセイを以前に記載(Milanov et al., 2012)されているように行ない、575nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。
連続凍結切片(8〜10μm)を、肝臓、脾臓、小腸、及び大腸から免疫蛍光染色のために得た。使用される抗体を表S1に列挙する。画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM, Zeiss)を使用して撮影し、Zeiss software LSM Image Browserを用いて分析した。
全RNAを、脾臓、肝臓、十二指腸/空腸、回腸、及び大腸から、High pure RNA isolationキット(Roche Diagnostics Deutschland GmbH)を使用して単離した。High capacity cDNA reverse transcriptaseキット(Applied Biosystems)を、mRNAからcDNAへの翻訳のために使用した。定量リアルタイムPCRを、Power SYBR Green(Applied Biosystems)を用いて行なった。プライマー配列を表S2に列挙する。
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン12.0(Systat software Inc.、サンノゼ、CA)を使用して分散分析(ANOVA)によって行なった。
野生型タンパク質、ITV変異体及びIAV変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らは、さらなる突然変異を単一で又は組み合わせて導入して、異なる特性を有するF.IX分子を作製した。
インビボでFIX突然変異体の発現及び凝血活性を調べるために、本発明者らは、FIX−KLW、FIX−AKLW、FIX−YALW、又はFIX−WTのいずれかをコードしている肝臓に指向されたミニサークルを、10μgのベクター用量で、HBマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から3日後に、FIX発現レベルは、全ての処置群において正常な血漿レベルの約100%に達した(データは示されていない)。予想された通り、高機能なFIX突然変異体が選択されれば、3つ全ての突然変異体の凝血活性は、FIX−WTよりも最大10倍まで有意により高かった(図8C)。活性の比と抗原により、FIX比活性の10〜17倍の増加が判明した(p<0.05)。さらに、尾切断出血アッセイにより、止血的に正常なマウスと同等である、出血性表現型の完全な正常化が判明した(図8D)。
キトサン−DNAナノ粒子の経口投与により、HBマウスの小腸においてFIXタンパク質が産生される。
まず、ナノ粒子の安定性及びトランスフェクション効率の特徴付けを、一連のインビトロでの実験で行なった(データは示されていない)。次に、ナノ粒子を経口投与した(図10A)。インビボでは、キトサンで製剤化されたeGFPの1回量をHBマウスに経口投与した後に、小腸でのGFPの発現が成功裡に染色された(図10B)。予想された通り、肝臓、脾臓又は大腸において(データは示されていない)、及び製剤化されていないベクターの投与後に、シグナルは全く検出されなかった。キトサンで製剤化されたFIX−WTの経口送達により、FIXの提示は、主に、内皮細胞周辺の微絨毛に位置し、部分的に細胞外マトリックス(ECM)に位置していることが判明した(図10C、1列目)。しかし、また、FIXタンパク質と、FIXの天然リガンドであるコラーゲンIVとの共局在も認められ、よって、本発明者らは、コラーゲンIVが、循環中へのFIXタンパク質の放出を妨害する可能性があると仮定した(図10C、3列目)。この障害を克服するために、どちらもコラーゲンIVへの低い親和性を伴う、FIX変異体のKLW又はAKLWを、HBマウスに投与した。全体的に同じような発現パターンが観察されたが、腸におけるFIX変異体の細胞外コラーゲンIVとの結合は僅かに減少したようにみえた(図10C、4〜5列目)。FIXmRNA発現は、全小腸において専ら検出され、このことは、免疫組織化学的染色によって得られた結果を確認し、この領域におけるナノ粒子の取り込みの選択性を示す。裸DNAと、偽プラスミドを含有しているナノ粒子の適用により、検出不可能な発現レベルが得られた(図10D)。
HBマウスは、実験設計計画(図11A)に示されているように、キトサンで製剤化されたプラスミド又はMCベクターによって媒介される高機能FIX変異体の1日量を7回連続して受けた。FIX抗原発現は、1%という検出限界より低いままであった(データは示されていない)。しかし、コラーゲンIVに対する結合が損なわれた突然変異体(FIX−KLW及びFIX−AKLW対FIX−YALW)のFIX活性は、3日目から8日目の間に蓄積するようであり、8日目には(最も長い処置の時点)プラスミドで処置された群(図11B)では3%までの範囲の、MCで処置された群(図11C)では14%までの範囲のレベルに達した。経口による遺伝子療法を中止した後、FIX突然変異体の凝血活性は少なくとも3週間持続したが、有意なばらつきがあり、これは抗体の形成には関連しなかった(データは示されていない)。これに対し、キトサンで製剤化されたFIX−WT又は偽の経口送達後、凝血活性は検出限界(1%)未満のままであった(図11B+C)。本発明者らは、テールクリップ出血アッセイにおいてインビボでの効力をさらに調べた(図12A)。マウスは、FIX突然変異体の経口投与後に、1段階のaPTTによって測定された、有意により短いインビトロでの凝血時間を有していた(図12B)。観察と一致して、FIX−KLW及びFIX−AKLWの発現は、HBマウスの出血表現型を部分的に修正した(図12C)。凝血系の一般的な活性化マーカーを代表し、血友病の置換療法の脈絡で高機能な又は自然発生的な凝血の指標となるであろう、TAT複合体レベルは、全ての群において同じままであった(図12D)。
Claims (16)
- 補因子の非存在下で凝固活性を有することを特徴とする、第IX因子(F.IX)又は活性化第IX因子(F.IXa)の変異体であって、
該補因子は、第VIII因子(F.VIII)又は活性化第VIII因子(F.IIIa)であり、下記:
V181I/K265A/I383V/L6F変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N変異体、
V181I/K265A/I383V/E185D変異体、
V181I/K265A/I383V/E185F変異体、
V181I/K265A/I383V/E185K変異体、
V181I/K265A/I383V/E185Q変異体、
V181I/K265A/I383V/E185S変異体、
V181I/K265A/I383V/L6F/S102N変異体、
V181I/K265A/I383V/L6F/S102K変異体、
V181I/K265A/I383V/L6F/S102P変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N/E185D変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N/E185F変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N/E185K変異体、
V181I/K265A/I383V/S102N/E185S変異体、
V181I/K265T/I383V/L6F変異体、
V181I/K265T/I383V/S102N変異体、及び
V181I/K265T/I383V/E185D変異体、
から選択される、変異第IX因子。 - タンパク質、ラベル及び/又はポリマーを含む、請求項1の変異第IX因子。
- 前記タンパク質、ラベル及び/又はポリマーが、前記変異体に共有結合で付着している、請求項2の変異第IX因子。
- 請求項1〜3のいずれかの変異第IX因子をコードしている核酸。
- プロモーター及び/又は転写終結配列に作動可能に連結されている、請求項4の核酸。
- 発現プラスミド、遺伝子療法構築物、ウイルス性又は非ウイルス性のベクター又は遺伝子修復のための鋳型である、請求項4又は5の核酸。
- 請求項1の第IX因子(F.IX)の少なくとも1つの変異体又は請求項4〜6のいずれかの少なくとも1つの核酸を含む、医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含む、請求項7の医薬組成物。
- 疾病の診断、予防及び/又は治療に使用する医薬の製造のための、請求項1の第IX因子(F.IX)変異体、請求項4〜6のいずれかの核酸、又は請求項7又は8の医薬組成物の使用。
- 前記疾病が、出血性疾患又は出血である、請求項9の使用。
- 前記出血が、ハイリスクな手術技法、骨髄移植、大きな損傷、脳出血及び血小板機能異常症に関連した失血に関連する、請求項10の使用。
- 前記出血性疾患が、血友病A、第F.VIII因子若しくは第F.VIIIa因子に対する阻害性抗体によって引き起こされたか若しくは合併した血友病、血友病Bであり
及び/又は、出血性疾患は、重度の肝疾病;外傷性失血;血小板減少症及び血小板機能異常症;経口抗凝固療法の迅速な逆転;第V因子、第VII因子、第X因子及び第XI因子の先天性欠乏症;並びにフォンヴィルブランド因子に対するインヒビターによるフォンヴィルブランド病、大きな損傷に関連した失血、脳出血、血小板機能異常症を含む、バイパス剤が使用される出血性疾患である、請求項10の使用。 - 前記バイパス剤が使用される出血性疾患は、新生児凝固障害である、請求項12の使用。
- 細胞療法、遺伝子療法又はタンパク質輸液療法のための医薬の製造のための、請求項9〜13のいずれかの使用。
- 請求項1〜3のいずれかの変異第IX因子の使用を含む、抗凝固剤をスクリーニングするための方法。
- 前記抗凝固剤が、F.IXaを直接阻害する物質である、請求項15の方法。
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