JP6384685B2 - 組換えタンパク質の発現増進のための遺伝子断片を含むベクター及びその用途 - Google Patents
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Description
1)CHO−K1細胞株由来の遺伝子断片を獲得してベクターライブラリを構成するステップ;
2)前記ベクターライブラリをCHO−K1細胞株に形質導入して選択培地で培養した後、蛍光タンパク質発現率が遺伝子断片を挿入しないベクターを導入した対照群より高く表れた細胞等を分類するステップ;
3)前記ステップ2)で分類した細胞等を単一クローンで培養して導入された遺伝子断片を捜すステップ;及び
4)前記捜し出した遺伝子断片の配列を分析するステップ。
1)目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを製作するステップ;
2)前記目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを動物細胞に形質転換するステップ;及び
3)前記形質転換された動物細胞を培養して生産されたタンパク質を獲得するステップを含む目的遺伝子を生産する方法を提供する。
[発明を実施するための形態]
本発明の目的を達成するため、緑色蛍光タンパク質発現ベクターを構築し、これにCHO−K1細胞株(ATCC(登録商標) CCL−61(商標))の遺伝子断片を挿入してライブラリを獲得する方式を進めた。先ず、CHO−K1細胞株のゲノムをDNeasy blood & tissue kit(Qiagen)を利用してCHO−K1細胞から獲得した。抽出したゲノムDNAは、制限酵素Sau3AI(NEB)の処理濃度と温度、時間を異にして多様な条件で処理して断片に作った。DNA 1μg当たり2ユニットから2倍ずつ10回まで希釈したSau3AI制限酵素を反応させ、37℃、25℃、16℃及び4℃それぞれの温度で時間別に反応させ、反応が終了したDNAはアガロースゲルに電気泳動した。電気泳動を実施したアガロースゲルからgel extraction kit(Qiagen)を利用して大きさ別にDNAを抽出し、これをベクターに挿入する遺伝子断片として利用した。
前記実施例1で製作されたベクターライブラリをCHO−K1細胞株に形質導入し、選択培地での培養を介して緑色蛍光タンパク質を多様に発現する細胞群を獲得し、蛍光−活性化細胞分類器(FACS)を介して対照群より高い蛍光値を有する細胞等を分類した。
前記実施例2で分類した細胞等を単一細胞株に培養し、各細胞内に導入されたベクターが有する遺伝子断片を確認する作業を行った。
前記実施例3で獲得したE77(配列番号1)の効果を検証するため、遺伝子断片を挿入していない対照群ベクターGFP/pcDNAZeo(図2a)とE77を挿入したベクターGFP/pcDNAZeo−E77(図2b)とを利用し、CHO−K1細胞株に形質導入を行って緑色蛍光タンパク質の発現を確認した。
シス調節性因子のうち一部の因子は、ベクターに挿入される方向や目的遺伝子との位置的関係に従ってその効果が増加することもあり得ると知られている。これに基づき、E77の場合、ベクターに入る方向性と位置による影響性があるのかに対して確認した。細胞群を形成し、細胞群が表す蛍光度を比べる時、選択マーカーがCMVプロモーターと別のプロモーターによって発現される 場合、GFPを発現しない細胞等が多く発生するので、これによる誤差を減少させるため、選択マーカーであるゼオシン耐性遺伝子(ZeoR)を発現しようとする緑色蛍光タンパク質と一つの転写単位に発現できるよう、IRESを利用してGFP−IRES−ZeoRの形態に発現されるようにベクターを構成した。IRESはpIRES vector(clontech)から獲得し、GFP、IRES、ZeoRそれぞれの遺伝子のPCRを行った後、IRESとZeoR PCR産物を鋳型にして第二のPCRを行い、IRES−ZeoR PCR産物とGFP PCR産物を鋳型にして第三のPCRを行うことによりGFP−IRES−ZeoR遺伝子を獲得した。pcDNA3.1/Zeo ベクターにPvuII制限酵素を処理し自己接合してゼオシン耐性遺伝子が除去されたベクターを構成し、このマルチクローニングサイトにGFP−IRES−ZeoR遺伝子を挿入してベクターを構成した。このベクターはpGIZと名付けた。このような構成を有するベクターにE77(配列番号1)をCMVプロモーターの5’部位に挿入し、これを逆順に入れた77E挿入ベクターも構成した。さらに、GFP−IRES−ZeoR遺伝子の3’部分にE77を入れたベクターと、5’、3’両方の部位に入れたベクターとを構成した(図4a)。このような構成を有するベクターを形質導入した細胞は、選択培地培養を介して安定した細胞群を形成し、流細胞分析器(Guava、Millipore)を用いて各細胞群の蛍光度を比べた。5’部分にE77を逆順に入れたベクターの場合、対照群に比べて増加する効果がないことを見せるので、E77が方向性を有していることを観察した。3’部分にE77を挿入したベクターの場合、5’部分に挿入したベクターとほぼ同様に50%の発現率の増加を見せ、E77を前後に挿入したベクターの場合、30%程度の発現率の増加を見せた。
前記実施例3で言及したところのように、E77は、二つの遺伝子断片からなっている。これに伴い、それぞれの断片だけが存在する時、その効果がE77と同様に表れ得るのか否かと、前方の遺伝子断片が属した遺伝子部分を前後に拡張した配列も効果があるのかを分析した。
蛍光タンパク質以外のタンパク質発現率にE77(配列番号1)とEx77(配列番号4)が影響を及ぼし得るのかを確認するため、E77(配列番号1)とEx77(配列番号4)が挿入された抗体生産ベクターを構築し、動物細胞に導入して抗体の生産量を測定した。
Claims (5)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片がプロモーターの上流及び目的遺伝子の下流のうち少なくとも一つの位置に挿入された、動物細胞内目的遺伝子の発現増加用組換えベクター。
- 前記組換えベクターのプロモーターは、ウイルス由来または哺乳類由来のプロモーターであることを特徴とする請求項1に記載の目的遺伝子の発現増加用組換えベクター。
- 前記配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片は、下記方法で選抜することを特徴とする請求項1に記載の目的遺伝子の発現増加用組換えベクター:
1)CHO−K1遺伝子断片を獲得してベクターライブラリを構成するステップ;
2)前記ベクターライブラリをCHO−K1細胞株に形質導入して選択培地で培養した後、蛍光タンパク質発現率が遺伝子断片を挿入しないベクターを導入した対照群より高い細胞等を分類するステップ;
3)ステップ2)で分類した細胞等を単一クローンで培養して導入された遺伝子断片を捜すステップ;及び
4)捜し出した前記遺伝子断片の配列を分析するステップ。 - 請求項1に記載の組換えベクターによって形質転換された動物細胞。
- 1)請求項1に記載の発現増加用組換えベクターを製作するステップ;
2)前記発現増加用組換えベクターを動物細胞に形質転換するステップ;及び
3)前記形質転換された動物細胞を培養して生産されたタンパク質を獲得するステップを含む目的タンパク質を生産する方法。
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