CN117947069A - 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117947069A
CN117947069A CN202211348560.7A CN202211348560A CN117947069A CN 117947069 A CN117947069 A CN 117947069A CN 202211348560 A CN202211348560 A CN 202211348560A CN 117947069 A CN117947069 A CN 117947069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid fragment
sequence
gene
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211348560.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈亮
杨小丽
邓新宇
李文峥
陈伟海
梁国龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Taili Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Taili Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Taili Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Taili Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211348560.7A priority Critical patent/CN117947069A/zh
Priority to PCT/CN2023/126825 priority patent/WO2024093790A1/zh
Publication of CN117947069A publication Critical patent/CN117947069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用。相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：本申请经过大量的筛选，发现在宿主细胞的Mtf1基因的合适位置***外源目标基因，对应得到的靶向整合细胞均具有稳定且高产目标产物的特点。并且，所得靶向整合细胞对培养工艺要求不苛刻，自身构建工艺简单，耗时缩短，成本降低，重复性好，可控性强。

Description

稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用。
背景技术
现阶段生物学进入了飞速发展的阶段。随着基因工程、蛋白工程和细胞工程等多个学科的发展，生物技术产业得到了大力的发展，生物制药业也蓬勃兴起。生物医药产业是战略性新兴产业，其在不断的发展中伴随着对产物表达量及表达稳定性的要求的增高，而细胞系构建则是决定产物表达产量及表达稳定性的关键因素。
目前药物生产多数采取随机整合方式来构建细胞株，常规耗时至少6个月才有机会得到稳定细胞株。该方法工作量极大，成本极高，拷贝数不稳定，位点不稳定，位点对于细胞生理影响的也具有不确定性等，从而导致细胞状态不稳定，无法有效评估稳定产量与建立稳定生产工艺。这些缺点会导致生产的细胞株传代稳定性不佳，导致生长过程丢失目的基因而失去生产价值。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括提供一种核酸，包含该核酸的宿主细胞能够稳定、高产地表达整合入SEQ ID No.1的外源核酸片段。
在本申请的第一方面，提供一种核酸，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3440-3624个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3451-3615个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3460-3597个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3470-3580个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3480-3570个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3490-3559个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3505-3546个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3525-3557个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3530-3545个碱基区间内的任意位点；
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3531-3540个碱基区间内的任意位点。
在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
在本申请的一些实施方式中，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶。
在本申请的一些实施方式中，所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在本申请的一些实施方式中，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
在本申请的第二方面，提供一种重组载体，其特征在于，所述载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、***瘤病毒载体、***多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
在本申请的第三方面，提供一种靶向整合细胞，所述靶向整合细胞包含第一方面中所述的核酸。
在本申请的一些实施方式中，所述靶向整合细胞为真核细胞；
在本申请的一些实施方式中，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
在本申请的一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
在本申请的第四方面，提供第三方面所述的靶向整合细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将第一方面中所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段，制备靶向整合细胞。
在本申请的第五方面，提供一种生产目标基因表达产物的方法，所述方法包括如下步骤：培养第三方面中所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
本申请经过大量的筛选，发现在宿主细胞的Mtf1基因的合适位置***外源目标基因，对应得到的靶向整合细胞均具有稳定且高产目标产物(无论是融合蛋白，双抗还是单抗)的特点。并且，所得靶向整合细胞对培养工艺要求不苛刻，自身构建工艺简单，耗时缩短，成本降低，重复性好，可控性强。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例中的工艺流程图；
图2为本申请实施例整合位点筛选质粒图谱；
图3为本申请实施例产品转染质粒图谱；
图4为本申请实施例整合细胞融合蛋白表达量统计图；
图5为本申请实施例整合细胞融合蛋白稳定及高产验证图；
图6为本申请实施例产融合蛋白的整合细胞的电泳图；
图7为本申请实施例产品转染质粒图谱；
图8为本申请实施例整合细胞单抗表达量统计图；
图9为本申请实施例产单抗的整合细胞的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
本发明中，“约”或“大约”意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，即测量***的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在3个或超过3个标准差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、以及又更优选至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物***或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，并且更优选在2倍内。
本发明中，“选择标记基因”可以是如下基因，所述基因允许在存在相应的选择剂的情况下，携带所述基因的靶向整合细胞可对于或针对所述基因而被特异性地选择。例如但非限制性地，选择标记可以允许在存在所述基因的情况下，用选择标记基因转化的靶向整合细胞被阳性选择；非转化的靶向整合细胞将不能在选择条件下生长或存活。选择标记可以是阳性、阴性或双功能的。阳性选择标记可以允许选择携带标记的细胞，而阴性选择标记可以允许携带标记的细胞被选择性地消除。选择标记可以赋予对药物的抗性或补偿靶向整合细胞中的代谢或分解代谢缺陷。
本发明中，“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、半抗体和抗体片段，只要所述片段展现出所需的抗原结合活性。如本文所用，术语“抗体片段”是指除了完整抗体以外的包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分的分子。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。有关某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
本发明中，术语“靶向整合细胞”是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。靶向整合细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与针对初始转化细胞中所筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变体后代。
本发明中，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的靶向整合细胞的基因组中的载体。在某些实施方案中，载体引导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
本发明中，术语“同源片段”是指如通过序列比对所确定共有显著序列相似性的序列片段。例如，两个序列片段可以是约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或99.9％同源的。比对是通过算法和计算机程序(包括但不限于BLAST、FASTA和HMME)进行的，所述比对比较序列片段并基于因素(如序列长度、序列身份和相似性、以及序列错配和空位的存在和长度)来计算匹配的统计显著性；例如可以是相似序列片段长度与对齐区域长度的比值。同源序列片段可以指DNA和蛋白质序列二者。
当前公开的主题提供了适合于外源核苷酸序列的靶向整合细胞。在某些实施方案中，靶向整合细胞包含在宿主细胞的基因组上的整合位点处整合的外源核苷酸序列。“整合位点”包含靶向整合细胞基因组内的核酸序列，在所述核酸序列中***外源核苷酸序列。在某些实施方案中，整合位点是在靶向整合细胞基因组上的两个相邻核苷酸之间。在某些实施方案中，整合位点包括核苷酸延伸段，可以在任何所述核苷酸之间***外源核苷酸序列。
本申请的第一方面
本申请提供一种核酸，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
SEQ ID No.1:
gtaagtaaagcagcagatgagggcccagtgtggctgtggggcagctccttatgcagcgtgctggcagttttttactgtgattaaaggagatcctgggcttagagcctgtggtggtagtcttgcctctcaacaacacatctgtgtcctgttctgttgtgactgctttctagaactgttggattgtatggccacattgtaactgaggaatactacattgtaatatctcagattttcctctctaaatcataaataaagtagaaatttcaccaaagtgaattcatgtttatactacaaaagtaacagcatggctactctgataacagagtgactagatttgtatgtaataactagaactggctataaatgatttgttttggagatgcctgtgagaatgtgctttattaatttagtgaatagttaatagataatagcgggtagttcttatcattcaggccagagaacacaaatgagaccagattagctggaagttgtcacattcatattcagatactatggatgaagtaatgcctttcagggtatcttggaactgtaaagcatttttaaaattgtagtagtgaatttgaatgaaaggcctaaaggtagtgagtggtaaacattattcgggaactagtgcaagttaatttgaaaaaaacaggtcactgcagttcctgtgctgaggactccatgtcaggtactaccaagcagaaataggcttaatttctggaggaaatattttccttttttgttgtagtggaggtttgaaattacatacaacttgtatagatgacttattcatgacatttggcttttcctttataactcaagggcggaatgcctacctagcctacatgagagtttgaactctagtattgcaaataaatgaatgacttataaataagtatcttagagctatgaatatcttagagaaaccatcattcctcacgtcacagtggacacggtaatgtttgaagcatctccaacatctgtttggtctgtacttgaatacttccagaatggtaagagcacaggctttcatagctcagtccagtacatttgttggcctgctctgattgctaggaagcttttgcttgtatgagacgcaagcctgtccttgtgtgatgctgctcccagcctccagttctgtctccccgagagcctgcttccgtgggacaacctgcacatctttaaaggtcctgtcatgctcttcggtacaagctagccacctacactcaaatacttttctgatggcacctccccacccccaccccagtctctcatcagtctggttgcctttaattgaaggaattccagtttttcaaagtccttttaaaatccagagttgagcataatctcacaagagtgagtcagcagtgccagttgtgtggtgcttatctatgtcttcatctggacactgtactataatggccgtgccatctgtgctttattatcaacatctcaccgtttgcttgtacttggaaacctctagaatagtggttctcaaccaggcacagttttgccccccaggagacatttggttgtcacactggggaagtgctaactggaatcttgtaggtaggggtaatgatgctgttagatactttataatgtacaggacagcctccgacaacaaatcattaacccccgatgtctccagggcttggatggaggaaccctgttctgcattatcatgaatgcagctgtcaagttttgttctggtgaaggtagccaggcttgtaagcctttggagtgtctccatactggaattttcttgatggtttcaacccagtatgtgagcttgtattaggggttcatctgtcttcaacagaatattatttgttgttgctgctgttgtttttgagatgttcccatgtaacccaagctggcctccaacttgctatgtgaagttaaagttgaccttgaactccagctctcctgccttcccctttccagtgctaggatgacaagcatgcacctggcctcacaaacatttgccaagcaaggtgctgtgattgcagatggtgatttgcaaaatagaggtagaaatacctgatggcagtaatgtgagcattggggataaagtgtaagtgtgaagggtaccagtgctgtgtttgggagcacaaggagctcacttgtgtgcttaggcgagccttcaaggtagtcttaaaaagtgtattcagtttatgagaaaagcagggcaggagaatttctgagacatgggcacaaagtgaacaaagagagggaggtagaaagcagaggccccttcccctctttagggagtggccagccatccttctaaaattagtgtgttttgttttctcttttgaaacagacttgtgcagcccaagctttcctcaaagtggtgatcctcctgcctctctagtgctaggattacaggcatataccacacgtgaccagtacattttctgtatagggctaaatagtaaatgttcttttccttacagactatgtagtctctgttaacagtcagttgtagaccatgcacatatgggctgggggtagagcttagactggatcacatgccacaaggccctgggttctattcccagaaccacagcacaggaaaaaggatagcatgtaaatgagcatgctggccagaattgacttaggggctgtagtgagcgtctcggtccttggactaaaatcccgggagtagcaggagatggggatagaaagatagcaaagatccagatctagaacatagtgatagctccacgagtgtttgtgatgtttacgaagagtaggagacttgcagatctgggagccaggagtaatgtggctagaggagcgtatagatgtggcgcacgcctttgatcccagcactcgggaggcaggggggtgggtctctgtgagtttgaggccagcctggtctacagagttccaggacagtcagaactatatagtgagaccctgtctcaaaacaaacaaacaaaaacaaaacaaaagaggagcattttagaagggatattctggcagcagcaggtagccaggaaacaaaggaaagaagggacgctatggcctgctagaagacacttgagtttcatttaacagttgaaggggagaatctaagacccaaggagctttgtctgctgttggaatttgcataatgagccctgagttgaatgtgagtcaaaggttttgaatcacattcattgaaaagatttgtttaggctaggtggtggtggtgcacacctttaatcccatcacctgggaggcagaggcaggtggatctctgagttcaaggccagcctggtttacagatggagttccaggacatccagggctacacagagaaaccctgtctcgaaatccccccccaccaccaccaccaaaaaaagggaaaaacaaaacaaaacagaaaaaagcttcgtctaggtctgggcatggtggttgcacacctttcatgccagcactctggaggcagagtcaagtggatctgagttcaaggcccactagggctatccagtaagatccttcctcaaaacaaaagataggtttttctcaatgccttgagttgctgctggttgatgaatggtaaatatttagtagttgagagtctatcacgatgtgtcattcagtcgtgttcagactgcatgttgaagacaaagtggctagctctgccttctacccactacctccccactctaaatggtgagtctgttaacaagaattggcacaagagcaaagttggtggggaagtgagtacatttggttggtgcgtactgaatgtagtccttgggcgtaaggagcataagttgaaacccactggaaatgtgggtctgaggtcaagcaaatgacacagatcctagatgccttcagggtggccacacaaacaaggaagaagatagggactggagagagaaagggagccagagaaaaagacagtagtcaggagaggtgggtcaggaaggctgacttcctgtatggcctggaagagggagtagggaggagctggagaaaacactagttcttgtctcttgtactcaacattttgaaaatgttttcagttgagccctgggcacagagtgtgtgaggtagaagtaagctgggatgagagagcaggaagcagaagtgtggagttttgttttgtttttaaagtttgatacttggaagaaaaaccattgaggcagtagtagtagctcaggggcattgaaactttgaagtttagaaagttagagctgggcatggtgattcatgcctttcagtcccagcgctggggaaggagaggcagatggagttctaggccagctagggctacgtagtaagaacccatttctaaattaatttcattaaagcctcaaaagttttggcatagtttaggccctagctttaggccagcctcagttaatgattactgtatgagtgttcatgagcaaatgtttgagaaatgttaagtaaaatcaaactgtttcagaacttatcaggcgggaccttttggcttgctaataactaagagaagtattttctaaattctgtaagcttatgttataaaccattttccagacattagctgagcatggtttgggaaatgctgatctaagcagaagagaagataggagggtggatgggattatgcaatctgatattagctgtcactttcttgctttgtactccttaccaattagttgcttctgtttgcaagcctggcttgccccattcgtttcttggggccatttaatcgtgaacagggtcaaggatgtacgagctcttcatccagtgtactatgggtttatctcataggctcttccttctctcttcagtttttctatcctatatgtaacatctgtgtagaagagtctatatgctagacttatttattttctgaattggattttaacagcagccgatgctggcctcagactcacagcagtctgttgaagtctgagattagaaacgggggccactgccctggtcttaaactggtattaggctcagtaggtttggggcctcgatggggatcaggaagaagtagccacagccctgtcttcggaggccagacagacattcaggaggcttgccttacctcagtcagtgattgacagtggttctattttggcttacaaatccacttagttggcctgaggaggccagtgtttacagatgataacagctgcatgatctttaaccatccttgtcccgggagcctgttttaagcatggctgtttttgctgcatggcattcacaggtactgctcttgagaaatgcaatcctttgataactaagtcttcttggcttcctaagcagcttagtttctgagtcagatgttagcctgattttcctgtttaccccgggttgtacctttgtttcctttagtgtgcagttggcttactgatcactttcttcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcttcttcttcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcctattattttcatcatgcttatcttacgcaaaaacaagccaaccaggaccttgccacacacactgtctcaccctaccacagacttctgggcatcctggctcttagttcacatttcaggttctcatcctaactttactgctttttccctgtggattggtagctttgagagcttctgtcaaaacactgtcattctgcatcccatatactcaaaggcctcctaaatagtcggcagatatgaagaaaccaagggtccaaggatattgttcatggtaccctaaatatcccagagcattgattgggaaagaatggctttccttgcaagaagcaggtgcagtggtctttgaattttgctcttggagtattggattactgtcagtggccttctgaaaggaggggatgggttctttctctttcctattcctctttttttattttatatttaattttttttaaaattttttgagacagggtttctgtgtagtcctggccgacctggagctcactgtgttgaccaggttggcctcaaacctctttgcctctgcctcccaagtaccaaaggcatatgccatcacaactagctgaatttatttagcctgacagattttaagtaagaataaaggggttagaatggggtggcttgtgcctataatgccagcatcttggaaggctaaagcagaagcttgccgtgagtttcaggcattctgggctacatggtactttgcaggccagcctgggttacaatgagaaatctgtctcaggaaaacaaaagggagcaaacagaagtaagggggatttgactccagtgttcagagccttttttcagttttcctttattttaggaagactgatcgaagcctggtggtggtggcacactcctttagtcccagcactctggaggtagaggcaggcagatctctgtgagttctagaccagcctggtctacaagagctagttctaggacagcctccaaagccacaaagaaaccctgtctcaaaaaaacaaaacaaaacaaaacaaaaagactgattgcagtcctgttcctcagtgggaatcctcggggagtggagctatgcgctcagacacaccagggtgtttaactgtgctggagtggatccacccaccttccactctgcacgccacgattacatttcttcacagatccctgttcagctcccacgggattgccattcagaactaggaccgatgagcctgtcactgcttgaaagtgtagtgttgagcatctgctcatttccctccaaggtctgacgtaactttggtcagatgctctgttagttctcagaaccctctggtgcttggcgagcagtagggaaatgctggtggctctgtatggctctgttggaggctagagtagggtgtgctttccctgtgccaccacgtgaagccgatttatcaacgtgtctcctccatgagggcatatgtgatacttgtccctgtctcatcactgaggccctctggcctggcagaggaacctggctggttttaggcacacactgtgttttaaagttgttaccgtgggagctctgggtcttcagttgatgttttctgtggactgtaataggttctcctgacattttgttcttgtaagagtgggagaatatacttgaattttagttctctccccttatttaaatccagcttattccaaaaactgtttcttcttcgaaagatgatttcagccttggtctcttcttttttgttgtagtgtatacttgctatgtggcccaggcaagctgctctctgtcctcttttgtaatatggaaataaaaatatcctgctgcattctgtgatgatgcagtgagatttatgtaatataaaagtgtacctcagtgtgcctcagatgctgggcacagcagccgttcagtcacatgttctcttgcttttttttcccctcacagacccctgttcctaaaggttcagaggtcatgtctagttttagaaaggttaaaactgtcaaggcttttatgttagggactgatttgggaagcatgttctccttgagacaggctgtaaattgtggttggaagcggaagtgctagtgcacactggggaggccgaggcagggggatctgtacatttcaaggctgtctagtctacatagttcaaggctagtctgagattctgtctttaaaagttggggaaatgtgattggattccaggagagcccgcagaaatcttagtcccagcctacttagctgaactttcctgtgaacatcattgtaactgggaggggttgttgtgtattgtttgttttgtttggggggagctagggaattgagcccagggccaccagatgatgctaggccagggctctgccactaagctacatcttcagtcatctttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgtttttttgagacagggtttctctggctttggaggctgtcctggtattagctcttgtagaccagattggtctcgaactcacagagatctgcctgcctttgcctcctgagtgctgggattaaagtcgtgtgccaccaacgcccggtttatttttgtttttttaatttatttatttatatgtatgagtattttgcctgcatttatgtctgtggcccatttgtgtgccgggcatctgtggaggcagaaaacacctgatcccctgtaactagaggtgcagcctgttgaaaaccactgtataggtgctaagaattgaatctgggtcctctggaagagcagccagtcctcctaatcacttaacattctctctagctcctcttaaaaacaaaaacaaagacaaaaaacaccctttttgttttgaaataggttctccctaagttgttcagggtggctttgaactcaatctgtggtatggggatcattgtactgggattacttttctatatcttcctgggtaactgagaccatcaacctgagtcattagaccacagttttaaccatgttataaaatgagggcatttgtggttcccaaacaaaggttggtgaacactagtccttgccacaggtaatcttttgtttgtttgtttgtttgtttgtttttgagacatggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactaactcttgtagaccaggctggtttggaactcacagagatcctcctgcctctgcctcctgaatgctgggactaaaggcatgcaccaccatcttttgccctcattggtgtcttgtaattcccttggtaccaggccactgaaagttactttcatggtggacatatggggcaccaatatcctccagctaaaagtgaaggctttaatataattttatatttcatctttttaacaatcataaaacaaacagttagtccccattttacagagataaaaaaatgaaagcatagaaacatctagctgtcggtcccagtgcctggaggtagagacaggtgaatcctaagggttctctggctgtagagtctgagagctccagattcagtgagagaccctgtctcagaaaataacatggaggcctggtgtggtggcccacacctttagtctcagcacttaggaagcagaagcaggtaaatctctgtgagtttgaggacagcctgagctacatagtgagaccctgtttatgaagaaattagaagacaatcctgatgtcaaccggtcttgtgcatgctcacacacaagtgcacacaccctcatacacatacgccatgagcatacacacctgcaaataggaacatccagttctcaggtggtgaaattgagacttgaactggggattgtctggatgccaaagtcaatgctttttatgacaacctaccagtttacaaaggtcgtagtcaagacacaggcctgttggctgctgacaggactgagaaatgaaaggccaactgggtgtccttagtttgaatgggtagagggatgaggtgtgcgcacagctctggagagtgatggctgtgtgacttcagttctgctgggcattggagaaattggaccaattcagagcacttagatttgtgattcaagagttttgattgtccatttggaatagaagaaaccagtgctagtatggagcagttttggtatggggaaaagggacaggaagtcactagtgatgggaagaaagggcagagttcagtttttttctccctggggttttttgtttgtctttttgcttttctttttttttgagacagaatcttgctatgtatagccatagctagcctggaacttactatcttgatcagtctaccttcaaagttggggcaatgctcctgcttccgcccctgccttctgagtgctgggatcaaaggtttgcaccagcatactcagtagctgtaaccaccagcctatcatttattgatgagggtttgtctgctctgggctcagaaccagggactccctttctttatcgaaatgtgtagaactgagttctctccatctccttttttcttctagcagaaactcaggtttttctttctttttctaatttttaacaatgtctcctgaagccgggcggtggtggcgcatgccttcaatcccagcacttgggaggcagaggcaggcggatctctgtgagttcgaggccagcctggtctacaagagctagtttccaggacagcctccaaggccacagataaaccctgtctcgaaaaaaacaaaaaacaacaacaacaacaaaaaagaatgtctcctaaagttctgccgcttccttttcttctgctgctcctgttttctctgcttctgccgcctgagtgctgtgaacgtctctgctaaacatttctgtttagaaccattcacaacactgtcaacctctgagccctcatcccctctggacattcacagcgttaccctccatgctgagggtgctcacctgggcatgcttagtatctcctgggagtctctgggctctttagcagggccctccacagctgtctgagtccacatgagaaaaattaaagccaggtttagatgtcttaaggtctttttcttcatgtccaatggtgtctccagtgccagtatggtcctattacagatactgtcattcgttttgacaagcaggctacctgcgtgtgactcttccctgaagtttctgggttcagctctgtctttctgctctgtagataagcttgccttagtccaagttttaagtcccatttttgtatattgccctcatgtgctcactatccatcatcagtgtggcttctcagaccgtgttcttgcctgtcctgcctaactcttctttttgtttgaacttcttgagagcaagggccattattgctgttgttgttgttggcactaagcacagtataattctagaacacaattcttgaagtccataaatgctaagttttagtctcttttaaaggtacatgatgttgcaatatctcttctttgtggaatgacactctgcatttttttttcagcttcctgttctgatcctgtttgagatggtttaggtttccctttttgtgaaatttgttgctattttaaaataattctgaaggatactcaacaatgatgtctacttattgtctccagatgaaatgagaagttgatcatttattcagtttatcattgggagaaaaggcatctaatactcagcaccacttttattttactgttttttttgtttgtttgttttttgtttttgttttttttttcttgagatggggtttctctgtttaacagccctggctgtcctggaactctctttgtagatcaggctggtctcaaactcatagagatccacctacttctgctttcctaatgctgggactaaagacgtgcaccaccactggctaggataggatctttactatgggtatgtagcccagcctggccttgaccttgtgttagccttcctgcctcagtcatcctgctgagtgccaccataaccaacttctgtcctacctttcagtaccattcctggtctgagtgctttcctacctttttgtcctcagtttcgctctggttctaatctgccaagttttcctgaatgcatggttggcttactgctgatgctctggtcactgccacacagttccagtgctggtgctggggcagcgagacggaagtcttagcagtcggtggtctttgctacacttgacctggctgacaccccactcaaaacttcctttcccacatggcagcgttggggtttgctgctgtttgtgtgtatgtgtgggtatgcggtacaggtatattcacatgtgtaaaagcacctgtgtatacatggaagctgagctgatagtgtcttccttgctcactctgcactttatttactgaggcaggatctctcgctgaacccggaactcaccaattccagctgtcttcccctggcaggcctgtctctgtcgccagagtctggagagaatggtgaccctcatggccaagagcctttgtgtgggttctaatcattaagtattgctgggcgtgtttcattaattcaaaatctaaatggaatgagtgctactttccacaagtctagtctctcaagttgttagtgagcaaggtagctatagggcctgctctcatgcagtttacagtttagatgagaagcatccattcattaatttaattcagtaaatatttacttagtgcctgattttccaagtcctgcttgcctagcaactgaaggtaataatggaaattgtttaattatgtaactgtttaatcttaattgtatcttgaactttaaagaagagatggtgtctctccattggggattagtcccagaaacactactttttcctccagcatacatggatcctcaggttccatatataaagggatccgagtgtttgcatgtaggctcctgtaaaatttaaatatttaaaacatgtatttgtgtgtaggagcatgtggatgtcagagaacaactttgtggagtttgttgtctgtgtgtcccaaggattgatcttgacagcaggcatctttattcactgatgatctagctcctgaccaccttctcctgtatactttaaagtagctggccttacttatgacacgtttaatacagtgtagatgctctagaaattgttgtttaaggaataaaaagtggttctgtacatgttcagcacaggcaactgttcttgttgtttgtttgttttttttttattctgaacattttcactctgtaattgactgaatccatgaatgcagatcccccaggttctgagggctggtggcccaggaagccgtgagagcctagagtaagcctgcctgtcacactcagaactgaggctaaggaccagtctgagagaggcccttgagaaagaaacatcaatagtggagtggctggcctagtacaagaattcagatggagtggggcagggagtgactgcattgcctactgcagccacttacaaagtagtcatctgccatggaaactcaaggatgaaattctgtcctatctcacctctgtgatggaccttacgatggagacagggtcccctttcttacccttcagggatagtgttgaaatttccatttgtaaagttagcacatgtacatgagagactaattaccaatgcaaattaagtgtcgaatgagtggttaacttgcataacactgacatttagaggaggacactgctggatagacatggaggattatggaggaccttggtaggagtgagacttgaattaaagggagaggctctggaaagcaaagaaaggaactagacatttccagtaaagggagaaaagagcacaggaaaggggcgggaactgagagtcaccgaggatgagtgtgctgtgcctctaggcctaggctgaccctcctgctcgcctggttcctgagtcatacagcagaaagtgttgaaaggccctgggaatacccttgatcctacctagacactgggacttttttggtgagaggccttggcgagcaccaagacatatgactgagtgagtcagttgagggaatacagagcacaacctgtgtggcagtgggagggcgatccatgggtaggtgatcaagagcttgtgaaaggtcctattagaagttaaaaagaagaaggggtggggtgggaggaggaaggagtcagtgcccctcccctgtctagcaaactagctgacaggctaaatcccttttaagcctagttgtttgttttgtatagctctagagtactgtttctctacatgtgggtctcgacccctaggggtcaaccagccctttcaaaggggttgccgacgaccattggaaaccacagatacttacattatgattataaaagtggcaaaattacagttatgaagtctcaataaaaacaatcttatggtgggaggtcaccccaacacgaggaactgtattaaaaggatcacacacagcattaggcggttgagaatcactgatctagaactgtttttttttttttttttttttttaacgtgtctgtgaagggcagaggcttcagagtccaggagtgttgggaatgagctctggtcctgcaagagcatcttttcagcccctgtttgtgaggattgaacccagagcctcaggcatgctagacaaacactaactaagccacaactctggcctcagttgttatttgtttaattattttattttggttttttgagacagggttttctgttcaacagacctggctgtcctgtaactcactctgtagaccaggctagcctctgcctccccagttttagaactaaaggcatgaaccatcaccacccagcttattgtattttatttaagtaaagctctcaggtagcctagactggcctagattatctgtatagctaaggatgactgaatgaccttgaatttattgttttatttttgtggcagaatctcactgtatagctctgactggcctggaactctctatgtgagccaaactgacaccaaacttacagaaatggatctgcctctaagcttccaagctctataatcaaggccaccacacctgtccaaccttgaacttttgatactgagtgctgagattcctgacacacccagtttatgtcctgttgggaacagaacccagggcttcatgcatgctgggaaagcactctaccagtgagctgcactccgtcccagttgcaaaaaagatttattgatctttttcagatcaaaataatagttcataatgtgtgaaaattgtatgaaattcaggcttcagtgtccatgaatgtttttggaacatggtagtgttcggttacttgcctgtgacttcttgtaacatgcagggcaagggctgtatagtgacagagaccataaagtccaaaatatcttctctttgacacgacagaaacctgtccaccttgagttatacccacccatccttggctcaaccaccctttctgaaacagaatggtcactgtctcctccctgaggctctgcccttccacccccagccctgattttgtcatctctgtgccaagggccacaccatgttttgttttttattttttgtttctttttttttgtttgtttttttgagacagggtttctctgtgtaacagttttgactgttgtggaactcactctgtagaccaggctggcctctgcctcttttttttttttttttttttttttttttctttttcgagatggggtttctctgtggctttggaggcagtcctggaactagcccttgtagaccaggctggcctcaaactcacagagatcctctgcctctgcctcccaattactgggattaaaggcatgtgtcaccatcacccggctttgttgttttgagacagggtttcactatgtagttctggcaaccttgcatcttactctgtagaccaggctggcctctgcctcttttttttttttttttttttttttttgatttttgggttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaaccagcctggtctcaaacttacagagatcctctgcctctgcctcctgagtgctgggactaaaggcttgtgccaccaccgccctgctggcctctgccttttaagcactagcattaaaggtgtgtaccaccactgccaactgcttcccccctccccctttttttaaccaggtcaatttctctgtgtagtcctagctgtccctgaacttgcttggtagaccaggctggcctcaaactcagatccacctatgtctgcctctcaaatgcagggattaaaagtgtgtgccaccatatatatctcccaccgtatttttttttctccccgagacagggtttctctgtggctttggaggctgacctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaaatcactgagatccacctgcctctgcctccccagtgctggattaaaggcgtgcgccaccaccgcccggcccttccaccgtattttaagctgcacccaccccactgggctttgtgtgttcttttgaggccttcattcactttcctccaggaattttccctttgttgcggggcagaggtgtgtagtagctcagacattaagacagagtcttgtaattcagccttggctggcctcaaactcagaattcctcttgcttccgcctcccaggcaggcgctaggattacaggtatgcaccaccaccccagctcttggacttttccctctagaaattaagccctcagctcagcccagaagtactggtcctggctctgctctacttctttcatttcaccgctatccggactcccgccccagccttgcagggtctctctgagtcattagggaatccttgtgtgggaatgtatatgtggggggatggggaggtctggttgttttccctgccccgccctttgcttactctgccgtttgtcgttttgatccttttgtttcccatgagacccctcttttagctgctgtgacattccttgctctagctctttctctcacttccttaccaagttctttactagttagtgtgttagatgctgcgtgctccccctgttataattaaacttgtgggggaatttgcgtgggggaccttggcggattccatggcaggcgagggtgacccaggcggagggacaaacatgctaggcagacagcataagtgggaagttttttagaaaggggagggaggaaagagaaaagagctaccttttctaaaagacacagaggacagaagagaagagggagataggaaaatcttgtctgccctaggggaaccctggcaaagaggagctggagagacgggagcagacagagagctggaaaacagaggatccggaaagtgggcggaagtctttgttttaaaggggtcctttgcacctgggctgaccagggtactgcctgagtgcattctgccaggtgacgggcaggccagcttaatgcctgaatccttacacacacacacacacacacacacacgcacacacgcacgcatacacgcatgcacgcgcgcgcgcgcacacacacacatacacacacacactcatcctttgtcctgtggtgtgagctattttataggatactatatgtgtcagttactgtattaaaataccttacataaattattcttaatccattttttgttgttttgtttgtgtttgtttttagtcagggtttcctctagaccaggctggcctcaaacttagagatcagtctgcctctgcctcctgatttctggaattaaaggcatgtgccaccactgctcagcaaatttttcttaatccttgagcagcttttattttattttaacgtttatcccagactgtggtaaggcattcctttcatcccagtattgggaggcagaggtaggcagatctctgtgagttgaaggacagccaaggctattcacagagaaaccctgtcttgaaaagcatatgtatatatacaatttttagttacacataggtttatgactgtatatgggtattttcagggcaagtgcaggtgcccatggagacccagtagctggagtgataggcggttgtgaactgctgggtgtggattcagagaactcaggccctctgtaaagcagtgagtgctcttaactgctgagctgtctctccagctgcctacaacagcttttggaaagatagacttagggcttgggatgtagctcagttggtcaagtgcatgccgtcatacccaaagctggggtcactccctggtactgtatgcaaatctagtgtgctgatacacacgtgtgagctcccagaaggcagaatcaggaggatcggatgtttgaagcctcaagtttgctgtcaacttgtatttcatgagtccctccctgtctcagggtggagaagtgagatctgggcagctgttttcccctactgataaggtatcccatgtcccctgtcag
在本申请的一个示例中，所述外源核酸片段被整合入的序列片段与所述SEQ IDNo.1所示的核酸片段保持不低于90％的一致性，例如90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的一致性。
本申请中，所述外源核酸片段的整合位点可以对应所述核酸片段的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、……17870、17871、17872、17873、17874、17875、17876、17877、17878位。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3440-3624个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3451-3615个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3460-3597个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3470-3580个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3480-3570个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3490-3559个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3505-3546个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3525-3557个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3530-3545个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3331-3540(例如3531、3532、3533、3534、3535、3536、3537、3538、3539、3540)个碱基区间内的任意位点。
在本申请的一个示例中，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
在本申请的一个示例中，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶。
在本申请的一个示例中，所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在本申请的一个示例中，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
在本申请的一个示例中，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
在本申请的一个示例中，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
本申请的第二方面
本申请提供一种重组载体，所述载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
在本申请的一个示例中，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、***瘤病毒载体、***多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
本申请的第三方面
本申请提供一种靶向整合细胞，所述靶向整合细胞包含第一方面所述的核酸。
在本申请的一个示例中，所述靶向整合细胞为真核细胞；
可选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
可选地，所述CHO细胞包括CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或者CHO K1M宿主细胞。
本申请的第四方面
本申请提供第三方面中所述的靶向整合细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将第一方面中所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段，制备靶向整合细胞。
可选地，整合的方式包括但不限于同源重组技术衍生的位点特异性重组技术，依靠针对特异识别位点的整合酶，在基因组和外源DNA间实现基因置换、基因敲出及敲入等基因工程操作，例如可以是重组酶介导的盒式交换，例如可以是CRISPR/Cas9介导的基因靶向整合。
本申请的第五方面
本申请提供一种生产目标基因表达产物的方法，所述方法包括如下步骤：培养第三方面中所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
本申请中的靶向整合细胞具备稳定、高产的特点。
本申请中，可以通过实验来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列：在本发明的一些实施方式中，可以通过全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列以分离宿主细胞；在本发明的一些实施方式中，可以在基于转座酶的盒整合事件之后通过全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过强力(brute force)随机整合筛选来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过常规测序方法(如靶基因座扩增)，之后进行下一代测序和全基因组来确定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过常规细胞生物学方法(如荧光原位杂交分析)来确定染色体上整合位点的位置。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
下述的具体实施例中的耗材涉及：细胞电转仪专用重悬缓冲液NeonResuspension Buffer R(ThermoFisher)，电击液E(ThermoFisher)，恢复培养基EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium(Sigma-Aldrich)，扩增培养基为EX-CELLAdvancedCHO Fed-batch Medium加200μg/ml hygromycin(ThermoFisher)和1％GlutaMAX(ThermoFisher)，摇瓶培养基为EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium加1％GlutaMAX，流加培养基中基础培养基使用100％ EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium加1％GlutaMAX，补料培养基为4％ Cell Boost 7a/7b(HyClone)。
实施例1
本实施例的操作流程参见图1，主要包括如下步骤：
(1)将绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选的标记基因，利用attp序列作为同源臂，构建一个包含RMCE的重组质粒，见图2；
(2)将构建好的质粒扩增、线性化后，用于转染；
(3)取3×10E6个CHO细胞到50mL离心管，1000rpm室温离心5min，弃上清；
(4)用5mL Ex-Cell Advanced CHO Fed-batch培养基清洗细胞，1000rpm室温离心5min，弃上清；
(5)用细胞电转仪专用重悬缓冲液100μL重悬细胞；
(6)取线性化后质粒15μg到步骤(5)重悬细胞中，轻柔混匀，吹打50次，避免产生气泡；
(7)打开细胞电转仪，调节参数，电机槽装入电转仪，槽中加入3mL电击液E；
(8)将步骤(6)细胞质粒混悬液吸入电转枪头，装入电击槽中，进行电击；
(9)将电转后的细胞立即转入加有2mL恢复培养基的6孔板转入37℃5％ CO2培养箱过夜培养；
(10)电转48h后进行加压筛选，细胞每2-3天传代一次，细胞活率先降低后上升，当细胞活率大于90％时，该细胞为稳定的细胞池；
(11)将稳定细胞池细胞利用流式细胞分选筛选高荧光细胞，获取最高荧光的1％细胞；
(12)富集后细胞利用精准挑选***荧光排序后进行精准挑选，完成单克隆化；
(13)单克隆的荧光细胞，进行扩增培养，形成细胞株，并在摇瓶阶段进行荧光检测，保留高荧光细胞株，记作GBBc001细胞；
(14)上述高荧光细胞株进行90天左右的传代稳定性研究，确认荧光值变化较小并且细胞株生长稳定的细胞为稳定高荧光细胞；
(15)参照步骤(1)，将目标基因1(Fc融合蛋白)片段克隆入质粒中，构建一个包含RMCE的重组质粒，见图3；目标基因2(单抗)重组质粒构建的示意图见图7。
目标基因片段1具有SEQ ID No.2所示的序列，SEQ ID No.2：
gctcctcccagactgatctgcgactcccgcgtgctggaacggtacctgctggaagccaaagaggctgaaaacatcacaacaggctgcgccgagcactgcagcctgaacgagaatattaccgtgcctgacaccaaggtgaacttctacgcctggaagcggatggaagtgggtcagcaggccgtcgaagtgtggcagggcctggccctgctgtctgaagctgtcctccggggccaagctctgctcgtgaactcctctcagccttgggaacccctgcaactgcacgtggataaggccgtgtctggcctgagatctctgaccacactgctgcgggctttgggcgcccagaaagaggctatcagcccccctgatgctgcttccgccgcccctctgagaacaatcaccgccgataccttccggaagctttttagggtttacagcaatttcctgcggggcaagctgaagctgtataccggcgaggcctgcagaaccggcgacagaggctccgagagaaaatgttgcgtggagtgtcctccttgccccgccccacctgtggctggaccttccgtgtttctgttccctcctaagcccaaggacaccctgatgatctccagaacccccgaagtgacctgtgtggtcgtggacgtgtcacacgaggaccctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtcgaggtgcacaacgccaagaccaagcctagagaagagcagttcaactccaccttcagagtggtgtctgtcctcacagtggtgcaccaggactggctgaatggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcctgctccaatcgagaagaccatctccaagaccaagggccagccacgggagcctcaggtgtacaccctgcctccctctcgggaggagatgaccaagaaccaggtctccctgacctgcctggtgaagggcttttacccttctgacatcgccgtggaatgggagtccaacggccaacccgagaacaactacaaaaccacccctcctatgctggactccgacggctctttcttcctgtactccaagctgactgtggacaagtctagatggcagcagggaaacgtgttctcttgctccgtgatgcatgaggccctgcataaccactacacccagaagtctctgtccctgagccctggaaagtgactcgag
(16)选取步骤(14)稳定高荧光细胞GBBc001进行转染、整合验证，将上述步骤(15)重组质粒扩增、线性化后，与Bxb-1整合酶共转染入稳定高荧光细胞GBBc001，转染步骤如前述；
(17)转染2天后细胞池进行加压筛选，2周左右形成稳定细胞池；
(18)对细胞池中无荧光细胞比例进行统计，并在细胞活率恢复至90％以上后FACS富集，扩大培养，待活率恢复90％后进行有限稀释法铺板，将细胞池单克隆化；
(19)单克隆细胞中无荧光细胞置于恒温培养箱(37℃，80％湿度)培养，进行继续扩增(Advanced+1％Glutamax)，扩大到摇瓶阶段培养(Advanced+1％Glutamax)，大约1个月后细胞株可进入补料，通过流加培养(前三天Advanced+1％Glutamax，第3、5天补加3％7a和0.3％7b(cytiva)、7、9、11、13天每天补加5％7a和0.5％7b(cytiva)，在第3、5、7、9、11、13天根据细胞耗糖量补足糖并进行表达量评估，定点整合的产品单拷贝细胞株与同条件下培养的随机整合的细胞株[1]表达量比较结果见图4(融合蛋白)、图8(单抗)；
为考察靶向整合融合蛋白(Fc融合蛋白)产品对应细胞产品克隆的稳定性，产品克隆连续传代90天左右进行稳定性评估，在连续传代的过程中，取第1天、第42天、第91天的靶向整合融合蛋白的细胞分别进行7天的批次培养(Advanced+1％GlutaMAX)，并于第3、5、7天根据细胞耗糖量补足糖，结果显示融合蛋白产品克隆细胞从表达量(图5)显示出稳定和高产；
对荧光、目标基因1均高表达细胞株GBBc001-14进行二代全基因组测序，获取整合位点在CHO上的注释信息如下：NC_048595:28250698位于Mtf1的intron 3of11。
整合目标基因1后的序列片段如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3：gtggttgcacacctttcatgccagcactctggaggcagagtcaagtggatctgagttcaaggcccactagggctatccagtaagatccttcctcaaaacaaaagataggtttttctcaatgccttgagttgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtaggtttgtctggtcaaccaccgcggtctccgtcgtcaggatcatgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcccctatgacgtcaatgacggtaaatggcccgctggcattatgcccagtacatgacctttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgggatccgccaccatggaacta ggtctacgatgggtgtttctagtggccatcctggaaggcgtgcagtgtgctcctcccagactgatctgcgactccc gcgtgctggaacggtacctgctggaagccaaagaggctgaaaacatcacaacaggctgcgccgagcactgcagcct gaacgagaatattaccgtgcctgacaccaaggtgaacttctacgcctggaagcggatggaagtgggtcagcaggcc gtcgaagtgtggcagggcctggccctgctgtctgaagctgtcctccggggccaagctctgctcgtgaactcctctc agccttgggaacccctgcaactgcacgtggataaggccgtgtctggcctgagatctctgaccacactgctgcgggc tttgggcgcccagaaagaggctatcagcccccctgatgctgcttccgccgcccctctgagaacaatcaccgccgat accttccggaagctttttagggtttacagcaatttcctgcggggcaagctgaagctgtataccggcgaggcctgca gaaccggcgacagaggctccgagagaaaatgttgcgtggagtgtcctc
用上述断点上游引物F1(SEQ ID No.4:gtctgggcatggtggttgca，距离断点在基因组上游131bp)与产品质粒上目标基因1下游引物R1(SEQ ID No.5：gaggacactccacgcaaca，在目标基因1翻译起始位点下游600bp左右)扩增该产品质粒对应细胞株基因组，得到符合理论大小(2113bp)的片段(基因组131bp，整合到基因组的原载体696bp，位点替换后的产品序列1286bp)，如图6(GBBc001-14泳道对应条带)所示。
将扩增出来的条带切胶回收，纯化，并设计多对引物进行DNA测序，测序结果拼接后序列如上所示，和理论序列一致(序列SEQ ID No.3)，从而证实目标基因正确整合入目标位点。
同样，对荧光、目标基因2均高表达细胞株GBBc001-3整合目标基因后的序列片段如SEQ ID No.6所示，SEQ ID No.6：
gagtcagtggatctgagttcaaggcccactagggctatccagtaagatccttcctcaaaacaaaagataggtttttctcaatgccttgagttgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacccggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtaggtttgtctggtcaaccaccgcggtctccgtcgtcaggatcatgcggccgccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgctatactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgccaatacactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcatttattatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttattaaacataacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttctacatccgagccctgctcccatgcctccagcgactcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacgatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggggagcgggcttgcaccgctgacgcatttggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtgttctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtccttgacacgaagcttgccgccaccatggacatgagagtgcctgctcagctgctgggcctgctcctgctgtggctgagaggcgctagatgtgatatcgtgatgacacagtccccactttctctgcctgtcacccctggcgaacctgcttctatctcttgccggtcctcccagagcctcctgtattccatcggctacaactacctggattggtacctgcagaagagcggccaatcccctcagctgctgatctacctgggctccaaccgggccagcggagtgcccgatagattctccggctccggatctggcaccgacttcacactgaagatcagcagagtggaagctgaggacgtgggcttttactactgcatgcaggctctgcagaccccctacaccttcggccagggaaccaagctggaaatcaagcggaccgtggccgctccttctgtgttcatctttcctccttccgacgagcagctgaaatctggcaccgcctccgttgtgtgcctgctgaacaacttctaccctagagaggccaaggtgcagtggaaggtcgacaacgccctgcagtctggcaactctcaagagtccgtgacagaacaggactctaaggactccacctactccctgtcctctaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaggtgacccac
用上述断点上游引物F3(SEQ ID No.4):gtctgggcatggtggttgca与产品所用质粒上产品基因下游引物R3(SEQ ID No.7)：actcgcctctattgaagct扩增该产品细胞株基因组，得到符合理论大小(3198bp)的片段，如图9(GBBc001-3泳道对应条带)所示。
将扩增出来的条带切胶回收，纯化，并设计多对引物进行DNA测序，测序结果拼接后序列如上所示，和理论序列一致(序列SEQ ID No.6)，从而证实目标基因正确整合入目标位点。
参考文献：
[1]Takeshi Omasa et al,.Cell engineering and cultivation of chinesehamster ovary(CHO)cells.Curr Pharm Biotechnol.2010Apr；11(3):233-40.
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (13)

1.核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3440-3624个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3451-3615个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3460-3597个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3470-3580个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3480-3570个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3490-3559个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3505-3546个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3525-3557个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3530-3545个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3531-3540个碱基区间内的任意位点。
3.根据权利要求1或者2所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶；或/和，
所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
5.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
6.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
7.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
8.重组载体，其特征在于，所述载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、***瘤病毒载体、***多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
10.靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞包含权利要求1至7任一项所述的核酸。
11.根据权利要求10所述的靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞为真核细胞；
可选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
12.权利要求10或者11所述的靶向整合细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将权利要求1至7任一项所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段，制备靶向整合细胞。
13.生产目标基因表达产物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求10或者11所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
CN202211348560.7A 2022-10-31 2022-10-31 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用 Pending CN117947069A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211348560.7A CN117947069A (zh) 2022-10-31 2022-10-31 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用
PCT/CN2023/126825 WO2024093790A1 (zh) 2022-10-31 2023-10-26 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211348560.7A CN117947069A (zh) 2022-10-31 2022-10-31 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117947069A true CN117947069A (zh) 2024-04-30

Family

ID=90798654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211348560.7A Pending CN117947069A (zh) 2022-10-31 2022-10-31 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117947069A (zh)
WO (1) WO2024093790A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018150271A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Lonza Ltd. Mammalian cells for producing adeno-associated viruses
EP3728309A2 (en) * 2017-12-22 2020-10-28 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
CN111019873B (zh) * 2018-10-09 2022-08-19 安徽吐露港生物科技有限公司 在食气梭菌基因组上快速整合大片段dna的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024093790A1 (zh) 2024-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2150617B1 (en) Enhanced expression and stability regions
Balasubramanian et al. Rapid recombinant protein production from piggyBac transposon-mediated stable CHO cell pools
US12018285B2 (en) Integration sites in CHO cells
EP2711428A1 (en) Site-specific integration
Ley et al. MAR elements and transposons for improved transgene integration and expression
JP4817514B2 (ja) 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
CN107893073B (zh) 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法
Ng et al. Development of a targeted integration Chinese hamster ovary host directly targeting either one or two vectors simultaneously to a single locus using the Cre/Lox recombinase‐mediated cassette exchange system
Wang et al. Accumulative scFv-Fc antibody gene integration into the hprt chromosomal locus of Chinese hamster ovary cells
WO2023093008A1 (zh) 一种cho细胞基因nw_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用
US20230151392A1 (en) Safe harbor loci
WO2023093007A1 (zh) 一种cho细胞基因nw_003614889.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用
TW202115252A (zh) 核酸之隨機化組態靶向整合
US20230340542A1 (en) Platform for developing stable mammalian cell lines
US20110136236A1 (en) Genetically modified eukaryotic cells
CN117947069A (zh) 稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用
US8530233B2 (en) Expression vector with enhanced gene expression capacity and method for using the same
WO2023246626A1 (zh) 靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法
JP6384685B2 (ja) 組換えタンパク質の発現増進のための遺伝子断片を含むベクター及びその用途
CN110982790B (zh) 一种用于蛋白展示和表达的细胞株及其制备方法和应用
JP2023520947A (ja) 標的組込み方法
JP2006507847A (ja) 真核細胞内における配列特異的ｄｎａ組換え
Reese et al. Development of recombinase-based targeted integration systems for production of exogenous proteins using transposon-mediated landing pads
WO2023050169A1 (zh) 一种在基因组上高通量实现tag到taa转换的方法
WO2023050158A1 (zh) 一种实现多碱基编辑的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination