JP6904953B2 - 細胞クローン性を決定する方法 - Google Patents
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Description
本発明の一側面において、この方法は、
A) クローン性が決定されることになるMCBから増殖された参照サブクローン細胞(RSC)のゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は
i) 前記RSCゲノムのペアエンド(両端読み込み)配列決定により1つ以上のRSCゲノム配列を得ること、および
ii) 前記1つ以上のRSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を産生する、工程、
B) 最も高い配列包括度を有する、工程(A)で特定された1つ以上のTIRを決定する工程であって、
前記配列包括度は、所与のTIRを含む所与の核酸配列が配列決定プロセス中に部分的に重複する読み取りによって読み取られる回数を指し、
最も高い配列包括度を有する前記1つ以上のTIRは参照TIR(RTIR)として指定される、工程、
C) クローン性が決定されることになるMCBから増殖されているが前記RSCからは独立している1つ以上のサブクローン細胞(SC)のそれぞれのゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は、
i) それぞれのSCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のSCゲノム配列を得ること、および
ii) それぞれの1つ以上のSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の比較導入遺伝子挿入領域(CTIR)を産生する、工程、
D) 工程(B)で決定された前記1つ以上のRTIRを工程(C)で決定されたそれぞれのCTIRと比較する工程、
E) それぞれのSCに存在する前記1つ以上のCTIRの各々と、前記RSCに存在する対応するRTIRとの対応関係を評価する工程、ならびに、
F) 工程(E)で評価された前記対応関係に基づいて前記MCBのクローン性を決定する工程、を含む。
本発明の別の側面において、この方法は、
G) クローン性が決定されることになるMCBから増殖された参照サブクローン細胞(RSC)のゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は
iii) 前記RSCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のRSCゲノム配列を得ること、および
iv) 前記1つ以上のRSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を産生する、工程、
H) 最も高い配列包括度を有する、工程(A)で特定された1つ以上のTIRを決定する工程であって、
前記配列包括度は、所与のTIRを含む所与の核酸配列が配列決定プロセス中に部分的に重複する読み取りによって読み取られる回数を指し、
最も高い配列包括度を有する前記1つ以上のTIRは参照TIR(RTIR)として指定される、工程、
I) クローン性が決定されることになるMCBから増殖されているが前記RSCからは独立している1つ以上のサブクローン細胞(SC)のそれぞれのゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は、
iii) それぞれのSCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のSCゲノム配列を得ること、および
iv) それぞれの1つ以上のSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の比較導入遺伝子挿入領域(CTIR)を産生する、工程、
J) 工程(B)で決定された前記1つ以上のRTIRを工程(C)で決定されたそれぞれのCTIRと比較する工程、
K) それぞれのSCに存在する前記1つ以上のCTIRの各々と、前記RSCに存在する対応するRTIRとの対応関係を評価する工程、ならびに、
l) 工程(E)で評価された前記対応関係に基づいて前記MCBのクローン性を決定する工程、
を含み、前記MCBは、前記RSCおよび前記1つ以上のSCが同じ集団に分類される場合、モノクローナルと見なされる。
クラス1は、前記導入遺伝子にマッピングする「読み取り1」配列を含み、クラス2は、前記HPCゲノムにマッピングする「読み取り1」配列を含み、クラス3は、前記導入遺伝子にマッピングする「読み取り2」配列を含み、クラス4は、前記HPCゲノムにマッピングする「読み取り2」配列を含み、
前記「読み取り1」および前記「読み取り2」は、前記RSCまたは前記1つ以上のSCの核酸ライブラリの配列決定で生成した核酸集団内の所与の核酸分子の5’末端および3’末端に対応する、それぞれの順方向(forward)および逆方向(reverse)読み取りを示す。
クラス1は、前記導入遺伝子に排他的にマッピングする「読み取り1」配列を含み、クラス2は、前記HPCゲノムに排他的にマッピングする「読み取り1」配列を含み、クラス3は、前記導入遺伝子に排他的にマッピングする「読み取り2」配列を含み、クラス4は、前記HPCゲノムに排他的にマッピングする「読み取り2」配列を含み、
前記「読み取り1」および前記「読み取り2」は、前記RSCまたは前記1つ以上のSCの核酸ライブラリの配列決定で生成した核酸集団内の所与の核酸分子の5’末端および3’末端に対応する、それぞれの順方向および逆方向読み取りを示す。
前記配列識別子は、フローセルのレーン、フローセル内のタイル番号、タイル内の核酸集団の「x」座標、およびタイル内の核酸集団の「y」座標に関する情報を含み、これによって「読み取り1」および「読み取り2」配列に対応する各配列対をフローセル内の固有の位置に割り当てる。
Dd(RSC,SCm)=1-(2*N(total)/[N(CTIR)+N(RTIR)])
式中、Dd(RSC,SCm)は、前記RSCゲノムとそれぞれのSCmゲノムとの間の距離関数を示し、N(total)は、前記RSCゲノムおよび前記SCmゲノムの両方に存在する挿入領域の数であり、N(CTIR)は、前記SCmゲノムに存在する挿入領域の総数であり、N(RTIR)は、前記RSCゲノムに存在する挿入領域の総数であり、Dd(RSC,SCm)は、距離を0〜1の尺度で示し、0の距離は、前記RSCとそれぞれのSCmとの間でのクローン同一性を示し、1は、クローン相違性を示す。
万能細胞バンク(MCB)
宿主前駆細胞
安定な遺伝子組み込み
レトロウイルス形質移入
組換え核酸配列
目的遺伝子
組換えタンパク質および組換えタンパク質発現
プロモーター
ビリオン
配列整列(マッピング)
サブクローン
参照サブクローン(RSC)
参照導入遺伝子挿入領域(RTIR)
比較導入遺伝子挿入領域(CTIR)
DNA配列決定ライブラリ
単一細胞配列決定
次世代配列決定
フローセル
合成時解読
塩基決定は、ヌクレオチドを、読み取られた特異的蛍光体に割り当てるプロセスである。
ペアエンド配列決定
FastQファイルおよび配列識別子
読み取り数
配列包括度
「高い」または「より高い」配列包括度
PHRED品質スコア
位相化および前位相化
コンティグ
足場
集団
対応関係
境界
A) 単離された単一細胞(SgC)のゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は、前記SgCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のSgCゲノム配列を得ること、および前記1つ以上のSgCゲノム配列を、前記既知のRSgcゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させることにより達成され、これによって1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を産生する、工程、
B) 最も高い配列包括度を有する、工程(A)で特定された1つ以上のTIRを決定する工程であって、前記配列包括度は、所与のTIRを含む所与の核酸配列が配列決定プロセス中に部分的に重複する読み取りによって読み取られる回数を指し、最も高い配列包括度を有する前記1つ以上のTIRは参照TIR(RTIR)として指定される、工程、
を含む方法も開示する。
クラス1は、前記導入遺伝子にマッピングする読み取り1配列を含み、
クラス2は、前記RSgcゲノムにマッピングする読み取り1配列を含み、
クラス3は、前記導入遺伝子にマッピングする読み取り2配列を含み、
クラス4は、前記RSgcゲノムにマッピングする読み取り2配列を含み、
前記読み取り1および前記読み取り2は、前記RSgCまたは前記1つ以上のSgCの核酸ライブラリの配列決定で生成した核酸集団内の所与の核酸分子の5’末端および3’末端に対応する、それぞれの順方向および逆方向読み取りを示す。好ましくは、読み取り1配列は、フローセル配列識別子を用いて、対応する読み取り2配列と組み合わせられ、前記配列識別子は、フローセルのレーン、フローセル内のタイル番号、タイル内の核酸集団の「x」座標、およびタイル内の核酸集団の「y」座標に関する情報を含み、これによって読み取り1および読み取り2配列に対応する各配列対をフローセル内の固有の位置に割り当てる。また、好ましくは、それぞれの読み取りデータ対のそれぞれの読み取り1および読み取り2配列は、導入遺伝子およびRSgCゲノムの既知の配列に対して別々に整列される。一層好ましくは、クラス1および4配列を含む読み取りデータ対ならびにクラス2およびクラス3配列を含む読み取りデータ対のみが、さらなる分析のために選択される。より一層好ましくは、TIRは、クラス2およびクラス4に対応するペアエンド読み取り配列をRSgCゲノムに対して整列させ、これによって前記TIRの各々につき2kbの領域をRSgCゲノム中に規定することによって特定される。要約すると、本発明者らは、MCBのクローン性を確認する新規の方法を提供し、これにより、MCBを医薬品としての応用が意図されたタンパク質の製造における産生細胞株として承認するために保健医療当局が求める、従来の時間および労力集約的なMCBの試験が回避される。本発明の方法は、MCBの堅牢なクローン性評価を可能にする厳密な再現性から利益を受ける。本発明者らは、この有益な効果を、ペアエンド配列決定とそれに続く、得られた配列決定データの生物情報学的データ処理とを組み合わせた新規の手法によって達成する。特に、ペアエンド配列決定データを処理する新規の手法により、従来のシングル読み取り配列決定または従来のペアエンド配列決定データの処理では不可能な、HPCゲノムの既知の配列中の導入遺伝子挿入部位の特定が新たに可能になる。従って、本発明は、医薬品としての応用が意図されたタンパク質生成物の産生において使用するMCBの品質を堅牢に評価するための強力な手段を提供する。
クローン選択および配列決定
〔実施例2〕
DNA抽出
〔実施例3〕
Illuminaライブラリ調製および配列決定
〔実施例4〕
生物情報学的分析
〔実施例5〕
挿入領域の比較
〔実施例6〕
類似性分析
〔実施例7〕
確率分析
〔実施例8〕
方法の実現性の確認
〔実施例9〕
単一細胞分析
Claims (19)
- 既知の配列の導入遺伝子の、既知の配列の宿主前駆細胞(HPC)ゲノムへの、予測可能または予測不能な挿入から生じる万能細胞バンク(MCB)のクローン性を決定する方法であって、
A) クローン性が決定されることになるMCBから単離された参照サブクローン細胞(RSC)のゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は
i) 前記RSCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のRSCゲノム配列を得ること、および
ii) 前記1つ以上のRSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を産生する、工程、
B) 最も高い配列包括度を有する、工程(A)で特定された1つ以上のTIRを決定する工程であって、
前記配列包括度は、所与のTIRを含む所与の核酸配列が配列決定プロセス中に部分的に重複する読み取りによって読み取られる回数を指し、
最も高い配列包括度を有する前記1つ以上のTIRは参照TIR(RTIR)として指定される、工程、
C) クローン性が決定されることになるMCBから単離されているが前記RSCからは独立している1つ以上のサブクローン(SC)のそれぞれのゲノム中の1つ以上の導入遺伝子挿入領域(TIR)を特定する工程であって、この特定は、
i) それぞれのSCゲノムのペアエンド配列決定により1つ以上のSCゲノム配列を得ること、および
ii) それぞれの1つ以上のSCゲノム配列を、前記既知のHPCゲノム配列および前記既知の導入遺伝子配列に対して整列させること
により達成され、これによって1つ以上の比較導入遺伝子挿入領域(CTIR)を産生する、工程、
D) 工程(B)で決定された前記1つ以上のRTIRを工程(C)で決定されたそれぞれのCTIRと比較する工程、
E) それぞれのSCに存在する前記1つ以上のCTIRの各々と、前記RSCに存在する対応するRTIRとの対応関係を評価する工程、ならびに、
F) 工程(E)で評価された前記対応関係に基づいて前記MCBのクローン性を決定する工程、を含み、
前記MCBは、前記RSCおよび前記1つ以上のSCが同じ集団に分類される場合、モノクローナルと見なされる、方法。 - ペアエンド配列決定が、所与の核酸分子をその両末端から配列決定することによって、配列決定されることになるゲノムの断片を示す所与の核酸分子の読み取りデータ対を生成することに関わる、請求項1に記載の方法。
- 前記RSCが、前記1つ以上のSCと比較してより高い配列包括度で配列決定される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記MCBが、前記導入遺伝子を複数の位置で前記HPCゲノムへ挿入することから生じ、複数の位置における前記導入遺伝子の挿入は、レトロウイルスベクターを用いて行われる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- TIRの決定が、ペアエンドライブラリに由来するペアエンド読み取り1配列およびペアエンド読み取り2配列を4つのクラスに分類することを含み、
クラス1は、前記導入遺伝子にマッピングする読み取り1配列を含み、
クラス2は、前記HPCゲノムにマッピングする読み取り1配列を含み、
クラス3は、前記導入遺伝子にマッピングする読み取り2配列を含み、
クラス4は、前記HPCゲノムにマッピングする読み取り2配列を含み、
前記読み取り1および前記読み取り2は、前記RSCまたは前記1つ以上のSCの核酸ライブラリの配列決定で生成した核酸集団内の所与の核酸分子の5’末端および3’末端に対応する、それぞれの順方向および逆方向読み取りを示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 読み取り1配列が、フローセル配列識別子を用いて、対応する読み取り2配列と組み合わせられ、前記配列識別子は、フローセルのレーン、フローセル内のタイル番号、タイル内の核酸集団の「x」座標、およびタイル内の核酸集団の「y」座標に関する情報を含み、これによって読み取り1および読み取り2配列に対応する各配列対をフローセル内の固有の位置に割り当てる、請求項5に記載の方法。
- それぞれの読み取りデータ対のそれぞれの読み取り1および読み取り2配列が、導入遺伝子およびHPCゲノムの既知の配列に対して別々に整列される、請求項5または6に記載の方法。
- クラス1および4配列を含む読み取りデータ対ならびにクラス2およびクラス3配列を含む読み取りデータ対のみが、さらなる分析のために選択される、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TIRが、クラス2およびクラス4に対応するペアエンド読み取り配列をHPCゲノムに対して整列させ、これによって前記TIRの各々につき2kbの領域をHPCゲノム中に規定することによって特定される、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。
- ペアエンドNGSライブラリ中の最も高い配列包括度を有するn個のRTIRを決定する工程を含み、nは5〜50の整数である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 最も高い配列包括度を有するn個の第1RTIRが、
(A) HPCゲノムにマッピングするクラス2およびクラス4に対応するそれぞれのペアエンド読み取り配列の読み取り数で、より多いとRTIRとして含まれることを示す、読み取り数、ならびに
(B) クラス2およびクラス4に対応するそれぞれのペアエンド読み取り配列の読み取り数の部分的な重複で、より少ないとRTIRとして含まれることを示す、読み取り数の部分的な重複
に基づいて決定される、請求項10に記載の方法。 - 前記RSCゲノム中のn個の第1RTIRの各々が、前記1つ以上のSCゲノムの各々における前記CTIRの対応するゲノム位置と比較される、請求項10または11に記載の方法。
- 前記RSC中の前記RTIRと前記1つ以上のSC中の前記CTIRとの比較が、挿入領域の存在/不在マトリックスを生成することによって達成され、マトリックスの1つの次元は、前記RSCゲノム中の前記導入遺伝子の前記n個のRTIRを示し、マトリックスのもう一つの次元は、前記RSCおよび前記1つ以上のSCの各々を示す、請求項12に記載の方法。
- 前記1つ以上のSC中のそれぞれのCTIRの、前記RSC中のそれぞれのRTIRに対する存在または不在は、マトリックス中に二色コードとして示され、第1の色は、前記RSC中のそれぞれのRTIRのそれぞれの存在または不在、前記1つ以上のSC中のそれぞれのCTIRのそれぞれの存在または不在を示し、第2の色は、前記RSC中のそれぞれのRTIRのそれぞれの不在または存在、前記1つ以上のSC中のそれぞれのCTIRのそれぞれの不在または存在を示す、請求項13に記載の方法。
- 前記RSCと前記1つ以上のSCの各々との関係が、距離行列を計算することによって評価される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 距離行列が次式(I)
Dd(RSC,SCm)=1-(2*N(total)/[N(CTIR)+N(RTIR)])
[式中、Dd(RSC,SCm)は、前記RSCゲノムとそれぞれのSCmゲノムとの間の距離関数を示し、N(total)は、前記RSCゲノムおよび前記SCmゲノムの両方に存在する挿入領域の数であり、N(CTIR)は、前記SCmゲノムに存在する挿入領域の総数であり、N(RTIR)は、前記RSCゲノムに存在する挿入領域の総数であり、Dd(RSC,SCm)は、距離を0〜1の尺度で示し、0の距離は、前記RSCとそれぞれのSCmとの間でのクローン同一性を示し、1は、クローン相違性を示す]に基づいて計算される、請求項15に記載の方法。 - パラメータN(total)、N(CTIR)および/またはN(RTIR)が、請求項14または15のいずれかに従って生成された挿入領域の存在/不在マトリックスに基づいて計算される、請求項16に記載の方法。
- 共通の距離行列で前記1つ以上のSCをRSCに対して示す工程を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 2つのそれぞれのゲノムが、式(I)に従って計算された互いの距離が0の場合、共通の集団に属していると見なされる、請求項18に記載の方法。
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