JP6375254B2 - 蛍光観察用ユニットおよび蛍光観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光観察用ユニットおよび蛍光観察装置に関するものである。

従来、実験小動物等の試料を生きたまま観察するために、対物レンズを試料に対して種々の方向あるいは位置に配置して観察する観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この特許文献１に記載された観察装置は、極短パルスレーザ光を標本において集光することにより、集光位置において多光子励起効果により発生した蛍光を対物レンズの直後において極短パルスレーザ光の光路から分岐し、光ファイバによって外部の光検出器まで導いて検出することとしている。このような多光子励起型の観察装置を用いれば、試料のより深部に極短パルスレーザ光を集光させて蛍光を発生させることができ、試料のより深部の蛍光像を取得することができる。

特開２００５−３００６５５号公報

しかしながら、多光子励起型の観察装置の場合、対物レンズにより集光された蛍光がスキャナまで戻る前の対物レンズの直後において分岐されるため、スキャナによって極短パルスレーザ光が試料上で走査されると、それに伴って、蛍光の光束位置も変動する。したがって、スキャナによる走査範囲が広い場合には、分岐した蛍光を光ファイバに入射させることが困難となる。

また、試料が生体組織のように散乱体である場合、極短パルスレーザ光の集光位置において発生した蛍光は、対物レンズに戻る過程において試料によって散乱されるので、対物レンズによって試料の広い範囲から集めた蛍光を検出しなければ、明るい蛍光像を得ることができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、極短パルスレーザ光の走査範囲を拡大し、かつ、多光子励起効果によって発生した蛍光を試料のより広い範囲から集光して明るい蛍光像を取得することができる蛍光観察用ユニットおよび蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からの極短パルスレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査された極短パルスレーザ光を集光する瞳投影レンズと、該瞳投影レンズにより集光された極短パルスレーザ光を略平行光にして対物レンズに入射させる結像レンズと、前記対物レンズにより極短パルスレーザ光が試料に集光されることにより、集光位置において発生し、前記対物レンズにより集光された蛍光を極短パルスレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラーとを備え、前記結像レンズが、前記対物レンズに近接して配置され正の屈折力を有する第１光学系と、該第１光学系よりも前記瞳投影レンズ側に配置され負の屈折力を有する第２光学系とを備え、前記ダイクロイックミラーが、前記第１光学系と前記第２光学系との間に配置されている蛍光観察用ユニットを提供する。

本態様によれば、光源からの極短パルスレーザ光は、スキャナによって走査され、瞳投影レンズによって集光された後に、結像レンズによって略平行光に変換されて対物レンズに入射される。対物レンズに入射した極短パルスレーザ光は、対物レンズの焦点位置に配置されている試料に集光され、その集光位置において光子密度が高められることによって、試料内に存在している蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

対物レンズの焦点位置において発生した蛍光は、試料内を全方向に散乱していき、試料の表面から対物レンズにより入射する方向に射出した蛍光のみが対物レンズによって集光される。そして、この後に、結像レンズを構成している正の屈折力の第１光学系により収斂光となるとともに、第１光学系に軸外から入射した蛍光も光軸方向に近づくように屈折させられた状態でダイクロイックミラーによって極短パルスレーザ光の光路から分岐される。

すなわち、スキャナによって極短パルスレーザ光の試料における集光位置を移動させると、焦点位置から発せられ、対物レンズにより集光された蛍光光束は対物レンズの瞳位置を基準として揺動するが、正の屈折力を有する第１光学系を通過することにより、振れ幅を値狭くすることができる。
また、焦点位置の周囲の比較的広い範囲から対物レンズに入射した蛍光も、正の屈折力を有する第１光学系を通過することにより、より光束径の小さい収斂光となってダイクロイックミラーによって極短パルスレーザ光の光路から分岐される。

したがって、対物レンズから射出された平行光束のままでは分岐できなかった蛍光もダイクロイックミラーによって分岐し、効率よく検出することができる。これにより、試料のより深い位置に極短パルスレーザ光を集光させても、明るく鮮明な蛍光像を取得することができる。

上記態様においては、前記第１光学系と前記第２光学系との間に、非点収差補正板を備えていてもよい。
第１光学系と第２光学系との間においては、蛍光は正の屈折力を有する第１光学系により収斂光となっているので、光軸に対して一方向に傾斜させて配置されたダイクロイックミラーを極短パルスレーザ光が透過する際の屈折によってその傾斜方向のみに光束がずれる。非点収差補正板を配置することで、ダイクロイックミラーによるズレ方向とは逆方向にズレを発生させることにより、極短パルスレーザの集光点のズレをなくすことができる。

また、本発明の他の態様は、上記いずれかの蛍光観察用ユニットと、前記ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を検出する光検出器とを備える蛍光観察装置を提供する。
本態様によれば、狭い振れ幅で変動し、かつ、試料における極短パルスレーザ光の集光位置の周辺の広い範囲において散乱された蛍光を集めた収斂光を光検出器により検出して、試料のより深い位置における明るく鮮明な蛍光像を取得することができる。

上記態様においては、前記蛍光観察用ユニットと前記光検出器とを接続する光ファイバを備え、前記蛍光観察用ユニットが、前記ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を前記光ファイバの一端に集光させるカップリングレンズを備えていてもよい。
このようにすることで、光検出器を外部に固定しておき、光ファイバを湾曲させることにより、蛍光観察用ユニットを移動させることができ、試料を固定したままで蛍光観察用ユニットを移動させて、試料の種々の位置を種々の方向から観察することができる。

また、上記態様においては、前記蛍光観察用ユニットが、前記ダイクロイックミラーにより分岐された蛍光を前記対物レンズの光軸に沿う方向に偏向して前記カップリングレンズに入射させる光路偏向部材を備えていてもよい。
このようにすることで、カップリングレンズによって集光された蛍光の光路を光路偏向部材によって折り曲げて対物レンズの光軸に沿う方向に配置されている光ファイバに入射させることができる。すなわち、光ファイバを、蛍光観察用ユニットから対物レンズの光軸に沿う方向に延ばすことができる。これにより、蛍光観察用ユニットを対物レンズの焦点位置近傍の光軸に交差する軸線回りに揺動させても、光ファイバが動作の邪魔にならず、対物レンズの周辺空間をコンパクトに構成して、揺動角度を大きく確保することができる。

また、上記態様においては、前記光ファイバにより導光され、該光ファイバの他端から射出された蛍光を前記光検出器にリレーするリレーレンズを備えていてもよい。
このようにすることで、光ファイバの一端に入射され、光ファイバにより導光された蛍光は、光ファイバの他端から射出される際に所定の拡散角度で広がるが、リレーレンズによって略平行光に変換された後、再度集光させられて光検出器に入射される。リレーレンズは、光検出器に入射する蛍光の光束径を光検出器の受光面の有効面積以内にするとともに、光検出器への入射ＮＡが光検出器の許容範囲内となるように、光ファイバの他端から光検出器の受光面への投影倍率が設定されている。これにより、光検出器の角度依存性および入射位置依存性の影響を受けずに、蛍光を効率よく検出することができる。

また、上記態様においては、前記リレーレンズが、前記光ファイバの射出端から射出された蛍光を略平行光束に変換し、前記リレーレンズにより変換された前記略平行光束を波長毎に分岐する分光用ダイクロイックミラーを備え、前記光検出器が、前記分光用ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光をそれぞれ検出するように複数備えられていてもよい。

このようにすることで、リレーレンズによって形成された平行光束部分に配置した分光用ダイクロイックミラーによって蛍光が波長ごとに分岐され、それぞれ異なる光検出器により検出される。これにより、波長ごとの明るく鮮明な蛍光像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記蛍光観察用ユニットが、前記スキャナ、前記瞳投影レンズ、前記結像レンズおよび前記ダイクロイックミラーを取り付ける筐体を備え、前記光検出器が前記筐体に固定されていてもよい。
このようにすることで、光ファイバを用いることなく、ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を、直接、または少ない光学素子を経由して光検出器により検出することができる。光学素子を通過する毎に発生する蛍光のロスを低減し、さらに明るい蛍光像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記蛍光観察用ユニットが、前記対物レンズによって集光された前記試料からの光を前記ダイクロイックミラーとは異なる方向に偏向する観察光偏向部材と、該観察光偏向部材により偏向された光を撮影する撮像素子と、前記ダイクロイックミラーと前記観察光偏向部材とを択一的に前記極短パルスレーザ光の光路上に配置する挿脱機構とを備えていてもよい。

このようにすることで、挿脱機構の作動により、ダイクロイックミラーを第１光学系と第２光学系との間の極短パルスレーザ光の光路上に配置すると、対物レンズによって集光され第１光学系によってさらに集光された蛍光をダイクロイックミラーにより極短パルスレーザ光の光路から分岐して光検出器により検出することができる。一方、挿脱機構の作動により、観察光偏向部材を第１光学系と第２光学系との間の極短パルスレーザ光の光路上に配置すると、対物レンズによって集光され第１光学系によってさらに集光された試料からの光を観察光偏向部材によって他の方向に偏向し、撮像素子により撮影することができる。これにより、例えば、試料の表面の画像を取得して観察位置を確認し、その後、ダイクロイックミラーに切り替えて、蛍光像を観察することができる。

また、上記態様においては、前記蛍光観察用ユニットを前記対物レンズの焦点位置近傍において該対物レンズの光軸に交差する軸線回りに揺動させる揺動機構を備えていてもよい。
このようにすることで、揺動機構の作動により、試料に対物レンズの焦点位置をほぼ固定したまま、対物レンズの光軸方向を変化させることができ、試料を固定したまま種々の方向から観察することができる。

また、上記態様においては、前記光ファイバが、マルチモードファイバであってもよい。
また、上記態様においては、前記光ファイバが、リキッドファイバであってもよい。
このようにすることで、コアの大きなマルチモードファイバ、特に、リキッドファイバにより、狭い振れ幅で変動する蛍光の光ファイバへの入射時の損失を低減し、効率よく光検出器に入射させることができる。

また、上記態様においては、極短パルスレーザ光を発生する光源と前記蛍光観察用ユニットとを接続し、前記光源から発せられた極短パルスレーザ光を前記蛍光観察用ユニットに導光する光源用光ファイバを備えていてもよい。
このようにすることで、極短パルスレーザ光を発生する光源についても外部に固定し、光源用光ファイバを湾曲させることで蛍光観察用ユニットの移動を容易にして、試料を固定したまま種々の方向および種々の位置から観察することができる。

本発明によれば、極短パルスレーザ光の走査範囲を拡大し、かつ、多光子励起効果によって発生した蛍光を試料のより広い範囲から集光して明るい蛍光像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を模式的に示す全体構成図である。 図１の蛍光観察装置に備えられる蛍光観察用ユニットによる蛍光の検出を説明する部分的な拡大図である。 図１の蛍光観察装置の第１の変形例であって、多波長の蛍光を検出する蛍光観察装置を模式的に示す全体構成図である。 図１の蛍光観察装置の第２の変形例であって、非点収差補正板の作用を説明する図である。 図１の蛍光観察装置の第３の変形例であって、試料の表面を観察する機構を備える蛍光観察装置を模式的に示す全体構成図である。 図５の蛍光観察装置に備えられるダイクロイックミラーとミラーの挿脱動作を説明する斜視図である。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察用ユニット３および蛍光観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、多光子励起レーザ走査型顕微鏡であって、近赤外帯域の極短パルスレーザ光を発生する光源２と、該光源２から発せられた極短パルスレーザ光を試料Ｘに照射する一方試料Ｘにおいて発生した蛍光を集光する本実施形態に係る蛍光観察用ユニット３と、該蛍光観察用ユニット３により集光された蛍光を検出する光電子増倍管（光検出器）４と、光源２と蛍光観察用ユニット３とを接続する第１の光ファイバ５（光源用光ファイバ）と、蛍光観察用ユニット３からの蛍光を光電子増倍管４に導く第２の光ファイバ（光ファイバ）６と、リレー光学系（リレーレンズ）７と、蛍光観察用ユニット３を揺動可能な揺動機構２５と、光源２および蛍光観察用ユニット３に動作指示を入力するコントローラ２６と、モニタ２７とを備えている。

蛍光観察用ユニット３は、筐体８と、該筐体８内に配置されたスキャナ９、瞳投影レンズ１０、結像レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、ミラー（光路偏向部材）１３およびカップリングレンズ１４を備えている。
また、蛍光観察用ユニット３には、対物レンズ１５が交換可能に取り付けられるようになっている。

スキャナ９は、例えば、非平行な軸線回りにそれぞれ揺動させられる２枚のガルバノミラー１６を備えた、いわゆる近接ガルバノミラーである。スキャナ９は、光源２から発せられ、第１の光ファイバ５によって導光されてきた極短パルスレーザ光を２次元的に走査することができるようになっている。

瞳投影レンズ１０は、スキャナ９により走査された極短パルスレーザ光を集光して中間像を結像させるようになっている。
結像レンズ１１は、瞳投影レンズ１０により中間像を結像した極短パルスレーザ光を略平行光に変換して対物レンズ１５に入射させるようになっている。

本実施形態においては、結像レンズ１１は、正の屈折力を有する第１光学系１７と、負の屈折力を有する第２光学系１８とを備えている。第１光学系１７は、対物レンズ１５の基端側に近接して配置されている。第２光学系１８は、第１光学系１７に対して瞳投影レンズ１０側に、光軸Ｓ方向に間隔をあけて配置されている。

図中、第１光学系１７および第２光学系１８は、それぞれ単一のレンズによって表されているが、これに限定されるものではなく、それぞれ複数のレンズを組み合わせて全体として正の屈折力および負の屈折力を有するように構成されていてもよい。

すなわち、瞳投影レンズ１０から結像レンズ１１に入射された拡散する極短パルスレーザ光は、まず第２光学系１８を透過することによってさらに拡散させられた後に、第１光学系１７を透過させられることにより集光されて略平行光に変換され、対物レンズ１５に入射されるようになっている。

ダイクロイックミラー１２は、平行平板状に形成され、光軸Ｓに対して、例えば、４５°の角度をなして配置されている。ダイクロイックミラー１２は極短パルスレーザ光を透過させ、対物レンズ１５から入射してくる蛍光を略９０°偏向させて極短パルスレーザ光の光路から分岐させる透過率特性を有している。

ミラー１３は、ダイクロイックミラー１２により分岐された蛍光をさらに略９０°偏向させて、対物レンズ１５の光軸Ｓに沿って、対物レンズ１５とは反対側に向かわせるように蛍光の光路を屈曲させるようになっている。
カップリングレンズ１４は、ミラー１３によって偏向された蛍光をさらに集光して、第２の光ファイバ６の入射端に入射させるようになっている。

第１の光ファイバ５は、例えば、シングルモードファイバである。また、第２の光ファイバ６は、マルチモードファイバであり、特に、リキッドファイバであることが好ましい。また、第２の光ファイバ６の射出端のコア径は、光電子増倍管４の有効径以下の大きさである。

リレー光学系７は、第２の光ファイバ６により伝播され、射出端から射出された拡散する蛍光を一旦、略平行光に変換した後に再度集光して、光電子増倍管４の光電変換面１９に入射させるようになっている。リレー光学系７は、光電子増倍管４に入射する蛍光の光束径を光電子増倍管４の光電変換面１９の有効面積以内にするとともに、光電子増倍管４への入射ＮＡが光電子増倍管４の許容範囲内となるように、第２の光ファイバ６の射出端から光電子増倍管４の光電変換面１９への投影倍率が設定されている。リレー光学系７のリレー倍率は、例えば１倍であることが好ましい。

揺動機構２５は、蛍光観察用ユニット３の筐体８を固定するスライダ（図示略）と、円弧状に構成され、スライダを案内する円弧状のレール２８とを備えている。レール２８は、対物レンズ１５の焦点位置近傍を中心とした円弧形状を有しており、レール２８上にスライダを移動させることで、蛍光観察用ユニット３を、対物レンズ１５の焦点位置近傍の軸線回りに揺動させることができるようになっている。

コントローラ２６は、光源２および蛍光観察用ユニット３のスキャナ９に対して制御プログラムを実行するコンピュータ（図示略）と、該コンピュータが実行する制御プログラムを格納するメモリ（図示略）と、インターフェース部（図示略）とを備えている。コンピュータは、実行した制御プログラムのスキャナ９の走査位置情報と光電子倍増管４が検出した輝度信号とに基づいて２次元画像を生成するようになっている。メモリは、コンピュータが生成した２次元画像を記憶するようになっている。

インターフェース部は、コンピュータからの動作指令をスキャナ９に伝達するドライバと、光電子倍増管４からの検出信号をＡ／Ｄ変換してコンピュータに伝達する信号処理回路とを備えている。
モニタ２７は、コンピュータが生成した２次元画像を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察用ユニット３および蛍光観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いて試料Ｘの比較的深部の蛍光像を取得するには、コントローラ２６からの動作指令により光源２において極短パルスレーザ光を発生させる。光源２において発生した極短パルスレーザ光を、第１の光ファイバ５を介して蛍光観察用ユニット３に導光する。

蛍光観察用ユニット３に、第１の光ファイバ５を経由して入射された極短パルスレーザ光は、ドライバを介して伝達されたコントローラ２６からの動作指令に従って、スキャナ９によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ１０によって集光された後、結像レンズ１１によって略平行光に変換されて対物レンズ１５に入射される。極短パルスレーザ光は、対物レンズ１５の焦点位置に集光されることにより、焦点位置近傍のごく限られた範囲において光子密度を増大させてその範囲に存在している蛍光物質を励起し蛍光を発生させる。

発生した蛍光は、図２に示されるように、全方向に放射され、試料Ｘ内において散乱させられる。散乱させられた蛍光のうち、試料Ｘの表面から対物レンズ１５の方向に放射された蛍光が、対物レンズ１５によって集光される。

この場合において、本実施形態に係る蛍光観察用ユニット３によれば、正の屈折力を有する第１光学系１７と負の屈折力を有する第２光学系１８とを光軸Ｓ方向に間隔をあけて配置した結像レンズ１１を採用したので、通常の顕微鏡のように凸凹のタブレットレンズを結像レンズ１１として使用する場合と異なり後ろ側焦点距離を短縮し、結像レンズ１１自体をコンパクトに構成することができるという利点がある。

また、第１光学系１７と第２光学系１８との間に配置したダイクロイックミラー１２によって蛍光を分岐することとしたので、結像レンズ１１全体を通過した後の蛍光を分岐する場合と比較して、より強い屈折力によって蛍光を集光した状態で分岐することができる。
すなわち、極短パルスレーザ光の焦点位置において発生した蛍光は、周囲の試料Ｘ内部の散乱によって焦点位置の周囲にも広がるが、広がった蛍光も全て極短パルスレーザ光の焦点位置において発生したものであるため、可能な限り多くの蛍光を回収することが好ましい。

図２に示されるように、極短パルスレーザ光の走査範囲の各位置に極短パルスレーザ光が集光される場合には、走査範囲を含む、より広い範囲から散乱した蛍光が対物レンズ１５に入射する。このように広い範囲から対物レンズ１５に入射した光は、対物レンズ１５によって集光された後、結像レンズ１１に向けて広がるが、対物レンズ１５に近接して配置されている第１光学系１７が、通常の結像レンズよりも高い正の屈折力を有しているので、対物レンズ１５の光軸Ｓを中心とする収斂光の状態でダイクロイックミラー１２の狭い範囲に入射される。これにより、ダイクロイックミラー１２が小さくても、試料Ｘの広い範囲からの蛍光を極短パルスレーザ光の光路から分岐することができる。

すなわち、対物レンズ１５から結像レンズ１１に向かって、光軸Ｓに対して大きく斜めに射出されていく軸外からの蛍光も第１光学系１７によって光軸Ｓに沿う方向に偏向して集光し、光電子増倍管４に導くことができる。
その結果、本実施形態に係る蛍光観察用ユニット３および蛍光観察装置１によれば、極短パルスレーザ光の焦点位置において発生した蛍光を効率よく回収することができる。
ダイクロイックミラー１２によって分岐された蛍光はミラー１３によって偏向され、カップリングレンズ１４によってさらに集光されて第２の光ファイバ６に入射される。

第２の光ファイバ６はマルチモードファイバ、特にリキッドファイバにより構成されているので、コアが太く、カップリングレンズ１４によって集光された蛍光を効率よく入射させることができる。
すなわち、スキャナ９による走査範囲を超えたより広い範囲からの蛍光を第２の光ファイバ６に常に入射させる本実施形態に係る蛍光観察用ユニット３によれば、スキャナ９によって極短パルスレーザ光が走査されても、第２の光ファイバ６に入射される蛍光は変動せず、効率よく第２の光ファイバ６に入射させることができる。

そして、第２の光ファイバ６により導光された蛍光は、第２の光ファイバ６の射出端から射出されてリレー光学系７によってリレーされ、光電子増倍管４の光電変換面１９に入射され、輝度信号として検出される。検出された輝度信号は、信号処理回路を介してＡ／Ｄ変換されてコンピュータに伝達される。コンピュータが、伝達された輝度信号とスキャナ９の走査位置情報とに基づいて２次元画像を生成し、生成された２次元画像がメモリに記憶される。これにより、メモリに記憶されている２次元画像を必要に応じてモニタ２７に表示し、試料Ｘの蛍光を観察することができる。

また、リレー光学系７は、第２の光ファイバ６の射出端のコア径を光電変換面１９の有効面積内に投影するように、リレー倍率が設定される。この場合に、リレー光学系７の光電子増倍管４側からみたリレー倍率を略１倍またはそれ以下に設定しておくことにより、光電変換面１９に入射する蛍光の傾きを小さくして、検出感度の角度依存性による検出光量低下の防止に有利となる。

また、第２の光ファイバ６の射出端のコア径が光電子増倍管４の有効径以下の大きさであるため、第２の光ファイバ６により導光された蛍光が漏れることなく光電子増倍管４の光電変換面１９に入射し、入射位置依存性の影響を受けることなく、蛍光を効率よく検出することができる。

また、本実施形態においては、ダイクロイックミラー１２によって９０°偏向された蛍光をミラー１３によってさらに９０°偏向しているので、対物レンズ１５の光軸Ｓに略平行に延びる方向に筐体８に固定されている第２の光ファイバ６に、カップリングレンズ１４により集光された蛍光を容易に入射させることができる。

また、本実施形態においては、蛍光観察用ユニット３を対物レンズ１５の焦点位置近傍の軸線回りに揺動させる揺動機構２５によって蛍光観察用ユニット３を揺動させても第２の光ファイバ６が邪魔にならず、対物レンズ１５の周囲の空間をよりコンパクトに構成することができ、揺動角度を大きく確保することができる。

なお、本実施形態においては、単一波長の蛍光を取得する場合について説明したが、複数波長の蛍光を同時に取得する場合には、図３に示されるように、リレー光学系７による平行光束部分にダイクロイックミラー（分光用ダイクロイックミラー）２０を配置して、蛍光を波長ごとに分離し、分離された蛍光をそれぞれ別個の光電子増倍管４ａ，４ｂ，４ｃによって検出することにしてもよい。

また、本実施形態においては、第１光学系１７と第２光学系１８との間に平行平板からなるダイクロイックミラー１２を配置したため、該ダイクロイックミラー１２を透過する極短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１２を透過する際に屈折して、ダイクロイックミラー１２の傾斜方向に位置ズレ（非点収差）を生ずる。そこで、図４に示されるように、ダイクロイックミラー１２とは逆方向に同じ角度だけ傾斜する同じ厚さの平行平板ガラスからなる非点収差補正板２１を配置することにしてもよい。これにより、ダイクロイックミラー１２による極短パルスレーザ光の焦点位置ズレを防止することができる。

また、本実施形態においては、図６に示されるように、ダイクロイックミラー１２とは異なる方向に傾斜したミラー（観察光偏向部材）２２を備え、ダイクロイックミラー１２とミラー２２とを矢印Ｙのように移動させて、択一的に対物レンズ１５の光軸Ｓ上に配置する挿脱機構（図示略）を備えていてもよい。挿脱機構は、例えば、直動機構である。また、この場合には、図５に示されるように、蛍光観察用ユニット３がミラー２２によって反射された光を撮影する撮像素子２３を備えている。図中、符号２４はミラーである。
撮像素子２３は、コントローラ２６に接続されている。メモリは、撮像素子２３が取得したカメラ観察画像を記憶するようになっている。

このようにすることで、挿脱機構を作動させてダイクロイックミラー１２を対物レンズ１５の光軸Ｓ上に配置した状態では、上述したように極短パルスレーザ光を照射して蛍光を検出することができる。一方、挿脱機構を作動させてミラー２２を対物レンズ１５の光軸Ｓ上に配置した状態では、極短パルスレーザ光の照射を停止し、蛍光観察用ユニット３の外部から試料Ｘに白色光を照射することにより、対物レンズ１５により集光された試料Ｘからの反射光がミラー２２，２４によって反射され撮像素子２３により撮影される。これにより、試料Ｘの表面のカメラ観察画像を取得することができる。

試料Ｘの表面のカメラ観察画像を取得し、取得されたカメラ観察画像をモニタ２７に表示して観察位置を確認しながら、蛍光観察用ユニット３を試料Ｘに対して位置合わせし、その後、挿脱機構の作動によりダイクロイックミラー１２を挿入して、光源２からの極短パルスレーザ光を試料Ｘに照射することにより、明るい蛍光像を取得することができる。

また、本実施形態においては、ダイクロイックミラー１２によって分岐した蛍光を第２の光ファイバ６によって光電子増倍管４に導くこととしたが、これに代えて、筐体８に光電子増倍管４を固定し、光ファイバ６を経由することなく、光電子増倍管４によって検出することにしてもよい。
同様に、ミラー２２によって偏向した試料Ｘの表面からの反射光をミラー２４によって偏向することとしたが、これに代えて、ミラー２２によって偏向した後、直接、撮像素子２３によって撮影することにしてもよい。

１ 蛍光観察装置
２ 光源
３ 蛍光観察用ユニット
４，４ａ，４ｂ，４ｃ 光電子増倍管（光検出器）
５ 第１の光ファイバ（光源用光ファイバ）
６ 第２の光ファイバ（光ファイバ）
７ リレー光学系（リレーレンズ）
８ 筐体
９ スキャナ
１０ 瞳投影レンズ
１１ 結像レンズ
１２ ダイクロイックミラー
１３，２４ ミラー（光路偏向部材）
１４ カップリングレンズ
１５ 対物レンズ
１７ 第１光学系
１８ 第２光学系
２０ 分光用ダイクロイックミラー
２１ 非点収差補正板
２２ ミラー（観察光偏向部材）
２３ 撮像素子
Ｘ 試料
Ｓ 光軸

Claims (13)

1. 光源からの極短パルスレーザ光を走査するスキャナと、
   該スキャナにより走査された極短パルスレーザ光を集光する瞳投影レンズと、
   該瞳投影レンズにより集光された極短パルスレーザ光を略平行光にして対物レンズに入射させる結像レンズと、
   前記対物レンズにより極短パルスレーザ光が試料に集光されることにより、集光位置において発生し、前記対物レンズにより集光された蛍光を極短パルスレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラーとを備え、
   前記結像レンズが、前記対物レンズに近接して配置され正の屈折力を有する第１光学系と、該第１光学系よりも前記瞳投影レンズ側に配置され負の屈折力を有する第２光学系とを備え、
   前記ダイクロイックミラーが、前記第１光学系と前記第２光学系との間に配置されている蛍光観察用ユニット。
2. 前記第１光学系と前記第２光学系との間に、非点収差補正板を備える請求項１に記載の蛍光観察用ユニット。
3. 請求項１または請求項２に記載の蛍光観察用ユニットと、
   前記ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を検出する光検出器とを備える蛍光観察装置。
4. 前記蛍光観察用ユニットと前記光検出器とを接続する光ファイバを備え、
   前記蛍光観察用ユニットが、前記ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光を前記光ファイバの一端に集光させるカップリングレンズを備える請求項３に記載の蛍光観察装置。
5. 前記蛍光観察用ユニットが、前記ダイクロイックミラーにより分岐された蛍光を前記対物レンズの光軸に沿う方向に偏向して前記カップリングレンズに入射させる光路偏向部材を備える請求項４に記載の蛍光観察装置。
6. 前記光ファイバにより導光され、該光ファイバの他端から射出された蛍光を前記光検出器にリレーするリレーレンズを備える請求項４または請求項５に記載の蛍光観察装置。
7. 前記リレーレンズが、前記光ファイバの射出端から射出された蛍光を略平行光束に変換し、
   前記リレーレンズにより変換された前記略平行光束を波長毎に分岐する分光用ダイクロイックミラーを備え、
   前記光検出器が、前記分光用ダイクロイックミラーによって分岐された蛍光をそれぞれ検出するように複数備えられている請求項６に記載の蛍光観察装置。
8. 前記蛍光観察用ユニットが、前記スキャナ、前記瞳投影レンズ、前記結像レンズおよび前記ダイクロイックミラーを取り付ける筐体を備え、
   前記光検出器が前記筐体に固定されている請求項３に記載の蛍光観察装置。
9. 前記蛍光観察用ユニットが、前記対物レンズによって集光された前記試料からの光を前記ダイクロイックミラーとは異なる方向に偏向する観察光偏向部材と、該観察光偏向部材により偏向された光を撮影する撮像素子と、前記ダイクロイックミラーと前記観察光偏向部材とを択一的に前記極短パルスレーザ光の光路上に配置する挿脱機構とを備える請求項３から請求項８のいずれかに記載の蛍光観察装置。
10. 前記蛍光観察用ユニットを前記対物レンズの焦点位置近傍において該対物レンズの光軸に交差する軸線回りに揺動させる揺動機構を備える請求項３から請求項９のいずれかに記載の蛍光観察装置。
11. 前記光ファイバが、マルチモードファイバである請求項３から請求項１０のいずれかに記載の蛍光観察装置。
12. 前記光ファイバが、リキッドファイバである請求項１１に記載の蛍光観察装置。
13. 極短パルスレーザ光を発生する光源と前記蛍光観察用ユニットとを接続し、前記光源から発せられた極短パルスレーザ光を前記蛍光観察用ユニットに導光する光源用光ファイバを備える請求項３から請求項１２のいずれかに記載の蛍光観察装置。

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