JP3917705B2 - 走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、スポット光で標本を走査することで標本からの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の走査型光学顕微鏡として、図８に示すようにレーザ光源１から出射されたレーザ光は、ビームエキスパンダ２で適宜なるビーム径に拡大され、レーザラインフィルタ３を通してレーザ光の持つ波長成分のうちの所要の波長成分が選択され、さらにダイクロイックミラー４で反射し、ガルバノミラー等による光偏向器５、６でＸ、Ｙ偏向され、結像レンズ７、目視観察用プリズム８、対物レンズ９を介して標本１０上を走査される。そして、標本１０を透過した光は、コンデンサーレンズ１１、ミラー１２、集光レンズ１３を介して光伝送ファイバ１４に入射され、さらに両面ミラー１５を介して光検出器１６に入射され、フレームメモリ１７で画像データを生成して、図示しないモニタに表示されるようにし、一方、標本１０上で反射した光は、対物レンズ９、目視観察用プリズム８、結像レンズ７、光偏向器５、６を介してダイクロイックミラー４に入射され、ここで、反射光のうち標本１０からの蛍光のみを透過させ、さらに結像レンズ１８より共焦点絞り１９を通過させた後、両面ミラー１５を介して光検出器２０に入射され、フレームメモリ２１で画像データを生成して、図示しないモニタに表示されるようにしている。
【０００３】
つまり、このようにした走査型光学顕微鏡では、最初に、レーザ光走査により標本１０の透過光を光伝送ファイバ１４を介して光検出器１６で検出することで、標本１０をなす生細胞などの全体像を検出し、目的とする細胞部分に蛍光を付した状態から、次のレーザ光走査により、今度は、標本１０の反射光から蛍光量のみを検出することで、例えば、生細胞の所望する断面（高さ方向）でのカルシウムイオン濃度の変化などを捕らえることができるようにしている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、このような従来の走査型光学顕微鏡では、光伝送ファイバ１４を介して検出される標本１０の透過光は、生細胞などの全体像を見るためのもので、標本１０からの蛍光は、対物レンズ９を含む反射光路でのみ検出するようにしているので、光検出器２０で検出される蛍光は、対物レンズ９の開口数（ＮＡ）で決まるが、対物レンズ９の開口数を上げるにも限界があり、油浸式のものでもＮＡ＝１．４程度で、それほどの効果は期待できないばかりか、特に、蛍光は、その性質上、３６０度の方向に放射することを合わせ考えると、対物レンズ９を介して取り込まれる蛍光量は、極めて小さいものとなる。このことは、蛍光量を検出する光検出系でのＳ／Ｎ比が十分でなくなり、この結果として、良質の画像が得られない。
【０００５】
そこで、レーザ光を強めるなどして蛍光に対する励起光量を増やすことで、蛍光量の増加を図り、Ｓ／Ｎ比の改善を可能にすることが考えられるが、励起光量を増やすことは、蛍光の褪色が速まり、安定した検出ができなくなるとともに、標本が生細胞の場合は、細胞に対するダメージが大きくなるという問題がある。
【０００６】
さらに、標本１０からの蛍光を対物レンズ９を含む反射光路のみにより検出するものでは、例えば、図９に示すように半球状に盛上がった標本１０中の高さ方向に異なる２つの断面Ｚ1 、Ｚ2 を観察するような場合、対物レンズ９に近い断面Ｚ1 の観察はあまり問題ないが、対物レンズ９に遠い断面Ｚ2 の観察では、断面Ｚ2 からの蛍光は、標本１０中を透過する間に吸収および散乱により失われてしまうため、対物レンズ９を介して取り込まれる蛍光量は、さらに小さいものになってしまう。そこで、標本１０の高さ方向（Ｚ方向）についてステップを変化させながら観察するセクショニング方法が考えられるが、こうすると、対物レンズ９に近い断面Ｚ1 と遠い断面Ｚ2 とで取り込まれる蛍光量が異なるため、得られる画像の明るさが異なり、観察しずらいものとなるという問題がある。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、標本からの蛍光を効率よく検出できるとともに、良質の観察画像が得られる走査型光学顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、スポット光で標本を走査することにより、該標本からの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡において、２光子励起用のスポット光を発生する光源手段と、前記スポット光が照射される標本上で２光子励起される蛍光を前記光源手段側から取り込む第１の光路と、前記スポット光が照射される標本上で２光子励起される蛍光を該標本面の透過光路側から取り込む第２の光路と、これら第１および第２の光路中に配置され前記標本面からの反射光および前記標本を透過した励起光を除去するバリアフィルタと、前記第１の光路の蛍光および第２の光路の蛍光を検出する同一の蛍光検出器とを具備し、前記第 1 の光路の蛍光及び第 2 の光路の蛍光の両方が前記同一の蛍光検出器に導かれて同時に検出される。
【０００９】
請求項２記載の発明は、請求項１記載において、前記第２の光路は、その一部を光ファイバで構成している。請求項３記載の発明は、請求項１記載において、さらに、前記標本の高さ方向に異なる複数の断面をスポット光走査するセクショニングを可能にしている。
請求項４記載の発明は、請求項１記載において、前記第１の光路および前記第２の光路は、その一部がそれぞれ光ファイバで構成される。
請求項５記載の発明は、スポット光で標本を走査することにより、該標本からの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡において、蛍光励起用のスポット光を発生する光源手段と、前記スポット光が照射される標本上で励起される蛍光を前記光源手段側から取り込む第１の光路と、前記スポット光が照射される標本上で励起される蛍光を該標本面の透過光路側から取り込む第２の光路と、これら第１および第２の光路により取り込まれた前記蛍光を検出する同一の蛍光検出器とを具備し、前記第 1 の光路の蛍光及び第 2 の光路の蛍光の両方が前記同一の蛍光検出器に導かれて同時に検出されることを特徴とする。
【００１０】
この結果、請求項１記載の発明によれば、２光子励起が生じる領域でのみの蛍光を第１および第２の光路を介して検出できるので、標本からの蛍光を効率よく検出することができ、蛍光量を検出する光検出系でのＳ／Ｎ比を改善できる。
【００１１】
請求項２記載の発明によれば、第２の光路の一部を光ファイバとすることで、構成を簡単にできる。
請求項３記載の発明によれば、スポット光走査される標本の断面の高さが異なっても、第１または第２の光路のいずれかより十分な蛍光量を検出できるので、これら断面から得られる画像は、明るさに変化の少ない安定したものになる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される２光子励起法を採用した走査型光学顕微鏡の概略構成を示している。
【００１３】
図において、３１はレーザ光源で、このレーザ光源３１は、２光子励起用のパルスレーザ（例えば、波長９００ｎｍのチタンサファイアレーザ）を使用している。
【００１４】
このレーザ光源３１より出射されたレーザ光は、ビームエキスパンダ３２で適宜なるビーム径に拡大され、レーザラインフィルタ３３を通してレーザ光の持つ波長成分のうちの所要の波長成分が選択され、ダイクロイックミラー３４に入射される。この場合、ダイクロイックミラー３４は、図２に示す特性を有するもので、上述したレーザ光（波長９００ｎｍ）を反射するとともに、後述する標本４１の蛍光（波長４７０〜７００ｎｍ）を透過するようにしている。
【００１５】
ダイクロイックミラー３４で反射されたレーザ光は、ガルバノミラー等による光偏向器３５、３６でＸ、Ｙ偏向され、さらに、これら光偏向器３５、３６を後述する対物レンズ４０の瞳位置に投影させる瞳投影レンズ３７、目視観察用プリズム３８、結像レンズ３９、対物レンズ４０を介してスポット光として標本４１に照射され、この標本４１上で走査されるようにしている。なお、光偏向器３５、３６の間には、リレーレンズ４２１を配置し、瞳像を光偏向器３５と光偏向器３６に投影するようになっている。
【００１６】
この場合、標本１０上のレーザ光が照射される領域では、２光子励起が発生している。この場合の２光子励起は、標本４１面に２つの光子を同時に当てることにより生じる現象で、同じ蛍光色素に対して１光子励起を使用するのと比べ、２倍の波長の励起光で励起するのと同じ効果が得られ、励起光の散乱が生じにくく、２光子励起が生じる領域でのみ蛍光を発生させることができる。
【００１７】
そして、標本４１上で２光子励起された蛍光と標本４１面での反射光は、上述のレーザ光照射光路中を逆方向（反射光路）に進んでダイクロイックミラー３４まで戻り、ダイクロイックミラー３４を透過したものは、さらに集光レンズ４２、バリアフィルタ４３を通して光検出器４４に入射される。この場合、バリアフィルタ４３は、標本４１面からの反射光を完全にカットし２光子励起された蛍光のみを通過させるもので、標本４１からの蛍光のみを光検出器４４に入射させるようにしている。
【００１８】
なお、集光レンズ４２は、光検出器４４の受光素子がレーザ光のビーム径に対して大きい場合は、特に用いなくともよい。一方、標本４１の蛍光は、標本４１を透過する励起光とともに、コンデンサレンズ４５で集光され、バンドルファイバや液体ファイバなどの光ファイバ４６に導入される。この場合、光ファイバ４６の入射端面は、コンデンサレンズ４５の焦点位置に配置している。この位置は、上述の光偏向器３５、３６、対物レンズ４０の後側焦点位置とも共役である。勿論、光ファイバ４６への標本４１の蛍光と標本４１を透過する励起光の入射は、適当なビーム投影倍率をかけるようにしてもよい。
【００１９】
また、光ファイバ４６からの出射される光は、集光レンズ４７、バリアフィルタ４８を通して光検出器４４に入射される。この場合、バリアフィルタ４８は、標本４１を透過する励起光を完全にカットして２光子励起された蛍光のみを通過させるもので、標本４１からの蛍光のみを光検出器４４に入射させるようにしている。
【００２０】
しかして、このような構成によると、レーザ光源３１から出射された２光子励起用のレーザ光は、ビームエキスパンダ３２、レーザラインフィルタ３３を通してダイクロイックミラー３４に入射され、ここで反射して光偏向器３５、３６でＸ、Ｙ偏向され、瞳投影レンズ３７、目視観察用プリズム３８、結像レンズ３９、対物レンズ４０を介して標本４１上に照射され、このレーザ光が照射される標本４１上の領域では、２光子励起が発生する。
【００２１】
この状態から、標本４１上で２光子励起された蛍光と標本４１面での反射光は、上述のレーザ光照射光路を逆に進んでダイクロイックミラー３４まで戻り、ダイクロイックミラー３４を透過して、さらに集光レンズ４２よりバリアフィルタ４３に入射され、ここで、標本４１面からの反射光が完全にカットされ、２光子励起された蛍光のみが通過され、光検出器４４により検出される。
【００２２】
一方、標本４１の蛍光は、標本４１を透過する励起光とともに、コンデンサレンズ４５で集光され、光ファイバ４６を通し、さらに集光レンズ４７よりバリアフィルタ４８に入射され、ここで、標本４１を透過した励起光が完全にカットされ、２光子励起された蛍光のみが通過され、光検出器４４により検出される。
【００２３】
この場合、標本４１面での反射光とともに対物レンズ４０に入射される標本４１上の２光子励起された蛍光は、この２光子励起が生じる領域でのみの蛍光で、対物レンズ４０の開口数（ＮＡ）に相当する蛍光量が取り込まれ、また、標本４１を透過する励起光とともに、コンデンサレンズ４５に入射される標本４１上の２光子励起された蛍光は、この２光子励起が生じる領域でのみの蛍光で、コンデンサレンズ４５の開口数（ＮＡ）に相当する蛍光量が取り込まれるようになるので、これらにより標本４１からの蛍光を光検出器４４にて効率よく検出することができ、蛍光量を検出する光検出系でのＳ／Ｎ比が大幅に改善され、良質の画像を得られる。
【００２４】
また、例えば、図３に示すように半球状に盛上がった標本４１中の高さ方向の異なる２つの断面Ｚ11、Ｚ12を観察するようなセクショニングの場合、いま、対物レンズ４０に近い断面Ｚ11を光走査すると、対物レンズ４０側の反射光路では、断面Ｚ11からの標本４１内部を透過する距離が小さいので、この間に吸収および散乱により失われる蛍光量は極めて少なく、安定した蛍光量を対物レンズ４０を通して取り込むことができる。一方、対物レンズ４０より遠い断面Ｚ12を光走査すると、コンデンサレンズ４５側の透過光路では、断面Ｚ12からの標本４１内部を透過する距離が小さいので、この間に吸収および散乱により失われる蛍光量は極めて少なく、安定した蛍光量をコンデンサレンズ４５を通して取り込むことができる。
【００２５】
これにより、対物レンズ４０に近い断面Ｚ11と遠い断面Ｚ12とで取り込まれる蛍光量をほぼ等しいものにできるので、これら断面Ｚ11、Ｚ12から得られる画像の明るさが変化することがなくなり、観察し易い安定したものにできる。
（第２の実施の形態）
図４は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００２６】
この場合、標本４１を透過する励起光と蛍光は、コンデンサレンズ４５で集光され、バリアフィルタ４９を通って光ファイバ５０に入射されるようになっている。この場合、バリアフィルタ４９は、標本４１を透過する励起光を完全にカットして２光子励起された蛍光のみを通過させるもので、標本４１からの蛍光のみを光ファイバ５０に入射させるようにしている。また、光ファイバ５０は、バンドルファイバからなるもので、その出射端部を筒状部材５１の外周面に沿って配置している。
【００２７】
そして、このような筒状部材５１端を光検出器４４の受光面に当接して、光ファイバ５０を通った透過光路の標本４１からの蛍光を光検出器４４で検出するとともに、集光レンズ４２、バリアフィルタ４３を通った反射光路の標本４１からの蛍光を筒状部材５１の中空部を通して光検出器４４で検出するようになる。
【００２８】
従って、このようにすれば、さらに透過光路での集光レンズを省略できるので、価格的に安価にできる。
（第３の実施の形態）
図５は、第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００２９】
この場合、標本４１を透過する励起光と蛍光は、コンデンサレンズ４５で集光されて光ファイバ４６に入射され、光ファイバ４６を通ってコリメートレンズ５２に入射される。このコリメートレンズ５２は、光ファイバ４６からの出射光を平行光にするもので、この平行光をピンホール部材５３に照射している。
【００３０】
ピンホール部材５３は、コリメートレンズ５２からの平行光が照射される面をミラーコートが施され、また、中心部のピンホール５３１を反射光路の集光レンズ４２の焦点位置に配置していて、このピンホール部材５３を反射光路の集光レンズ４２の光軸に対し所定角度傾けることで、ピンホール部材５３面で反射される透過光路と集光レンズ４２を通る反射光路を同軸に合成している。
【００３１】
そして、これらピンホール部材５３のピンホール５３１を通過される反射光路の光とピンホール部材５３の反射面で反射された透過光路の光は、それぞれダイクロイックミラー５４に入射される。
【００３２】
この場合、ダイクロイックミラー５４は、図６に示すように６００ｎｍを境に分光するような特性を有するもので、この特性に合わせて反射光路および透過光路の光は分光され、バリアフィルタ５５、５６に入射され、これらバリアフィルタ５５、５６により、標本４１面からの反射光および標本４１を透過する励起光が完全にカットされ、２光子励起された蛍光のみが光検出器５７、５８でそれぞれ検出されるようになる。
【００３３】
従って、このようにすれば、６００ｎｍを境に２光路に分光した状態で、蛍光検出を行うことができる。例えば、ＳＮＡＲＦ−１のような蛍光色素を用いて生細胞のＰＨの変化を測定できる。
（第４の実施の形態）
図７は、第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３４】
この場合、標本４１を透過する励起光と蛍光は、コンデンサレンズ４５で集光され光ファイバ５９に入射される。この光ファイバ５９は、バンドルファイバからなるもので、このバンドルファイバのうち１本のファイバ５９１を反射光路の集光レンズ４２の焦点位置に配置し、透過光路の光と集光レンズ４２を通る反射光路の光を合成している。ここでのバンドルファイバ径は、集光レンズ４２で集光される光スポット径より大きいものとする。
【００３５】
光ファイバ５９からの出射光は、コリメートレンズ６０に入射され、平行光になってダイクロイックミラー６１に入射される。このダイクロイックミラー６１も図５で述べたと同様にして、光ファイバ５９の出射光を２光路に分光するものである。そして、ダイクロイックミラー６１で２光路に分けられた光は、バリアフィルタ６２、６３を通して反射光および励起光がカットされ、２光子励起された蛍光のみが光検出器６４、６５でそれぞれ検出されるようになる。
【００３６】
従って、このようにしても、２光路に分光して蛍光検出でき、さらに構成を簡単にでき、価格的にも安価にできる。
なお、上述した第１乃至第４の実施の形態では、２光子励起を採用した走査型光学顕微鏡について述べたが、１光子励起レーザ顕微鏡にも適用することができる。この場合、透過光路から得られる蛍光に対して共焦点効果を期待できないが、蛍光の利用効率を高めるという点では有用である。
【００３７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、２光子励起が生じる領域でのみの蛍光を第１および第２の光路を介して検出できるので、標本からの蛍光を効率よく検出でき、蛍光量を検出する光検出系でのＳ／Ｎ比を改善でき、良質の画像を得られる。
【００３８】
また、第２の光路の一部を光ファイバとすることで、構成を簡単にできる。
さらに、スポット光走査される標本の断面の高さが異なっても、第１または第２の光路のいずれかよりより十分な蛍光量を検出できるので、これら断面から得られる画像は、明るさに変化の少ない安定したものが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】 第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示す図。
【図３】 第１の実施の形態を説明するための図。
【図４】 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図５】 本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】 第３の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示す図。
【図７】 本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】 従来の走査型光学顕微鏡の一例の概略構成を示す図。
【図９】 従来の走査型光学顕微鏡を説明するための図。
【符号の説明】
３１…レーザ光源、
３２…ビームエキスパンダ、
３３…レーザラインフィルタ、
３４…ダイクロイックミラー、
３５、３６…光偏向器、
３７…瞳投影レンズ、
３８…目視観察用プリズム、
３９…結像レンズ、
４０…対物レンズ、
４１…標本、
４２…集光レンズ、
４３…バリアフィルタ、
４４…光検出器、
４５…コンデンサレンズ、
４６…光ファイバ、
４７…集光レンズ、
４８…バリアフィルタ、
４９…バリアフィルタ、
５０…光ファイバ、
５１…筒状部材、
５２…コリメートレンズ、
５３…ピンホール部材、
５３２…ピンホール、
５４…ダイクロイックミラー、
５５、５６…バリアフィルタ、
５７、５８…光検出器、
５９…光ファイバ、
６０…コリメートレンズ、
６１…ダイクロイックミラー、
６２、６３…バリアフィルタ、
６４、６５…光検出器。

Claims (5)

1. スポット光で標本を走査することにより、該標本からの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡において、
   ２光子励起用のスポット光を発生する光源手段と、
   前記スポット光が照射される標本上で２光子励起される蛍光を前記標本面の反射光路側から取り込む第１の光路と、
   前記スポット光が照射される標本上で２光子励起される蛍光を該標本面の透過光路側から取り込む第２の光路と、
   これら第１および第２の光路中に配置され前記標本面からの反射光および前記標本を透過した励起光を除去するバリアフィルタと、
   前記第１の光路の蛍光及び第２の光路の蛍光を検出する同一の蛍光検出器とを具備し、前記第 1 の光路の蛍光及び第 2 の光路の蛍光の両方が前記同一の蛍光検出器に導かれて同時に検出されることを特徴とする走査型光学顕微鏡。
2. 前記第２の光路は、その一部を光ファイバで構成されることを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。
3. さらに、前記標本の高さ方向に異なる複数の断面をスポット光走査するセクショニングを可能にしたことを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。
4. 前記第１の光路および前記第２の光路は、その一部がそれぞれ光ファイバで構成されることを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。
5. スポット光で標本を走査することにより、該標本からの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡において、
   蛍光励起用のスポット光を発生する光源手段と、
   前記スポット光が照射される標本上で励起される蛍光を前記標本面の反射光路側から取り込む第１の光路と、
   前記スポット光が照射される標本上で励起される蛍光を該標本面の透過光路側から取り込む第２の光路と、
   これら第１および第２の光路により取り込まれた前記蛍光を検出する同一の蛍光検出器とを具備し、前記第 1 の光路の蛍光及び第 2 の光路の蛍光の両方が前記同一の蛍光検出器に導かれて同時に検出されることを特徴とする走査型光学顕微鏡。

Images