WO2017090209A1 - 顕微鏡、観察方法、及び制御プログラム - Google Patents

顕微鏡、観察方法、及び制御プログラム Download PDF

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WO2017090209A1
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objective lens
sample
incident angle
stage
observation
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千枝子 中田
久美子 松爲
亘 友杉
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株式会社ニコン
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    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof

Definitions

  • the present invention relates to a microscope, an observation method, and a control program.
  • Patent Document 1 A microscope that illuminates a sample obliquely is known (for example, Patent Document 1).
  • At least one of the illumination optical system that irradiates the sample with illumination light obliquely and the observation optical system that includes the objective lens, the stage that holds the sample, and the objective lens is used as the objective.
  • a microscope is provided.
  • a stage on which a sample is placed, an illumination optical system that irradiates illumination light obliquely to the sample, an observation optical system having an objective lens, and a sample are held.
  • a control unit that moves at least one of the stage and the objective lens in the same direction as the optical axis of the objective lens, an imaging device that images the sample via the objective lens, and imaging for each observation position in the optical axis direction of the objective lens
  • a storage unit that stores conditions, and the imaging condition includes information on an incident angle of illumination light to the sample, and the control unit is configured to move at least one of the stage and the objective lens based on the imaging condition.
  • a microscope is provided that changes the incident angle of illumination light to a sample.
  • an illumination optical system that irradiates illumination light obliquely with respect to the sample and an observation optical system having an objective lens, and at least a stage that holds the sample and an objective lens
  • One of the observation methods uses a microscope that can move in the same direction as the optical axis of the objective lens, and includes changing the incident angle of the illumination light with respect to the sample when moving at least one of the stage and the objective lens.
  • an illumination optical system that irradiates illumination light obliquely on the sample and an observation optical system having an objective lens, and at least a stage that holds the sample and an objective lens
  • a control program that causes a computer to execute control of a microscope that can move in the same direction as the optical axis of the objective lens, and the control is performed on the sample of illumination light when moving at least one of the stage and the objective lens.
  • a control program is provided that includes changing the incident angle.
  • FIG. 1 is a diagram showing a microscope 1 according to the present embodiment.
  • the microscope 1 is a microscope that can obliquely illuminate a sample S to be observed and observe an image of the sample S.
  • the microscope 1 is configured to be able to change the irradiation angle of the illumination light with respect to the sample S, for example.
  • the microscope 1 is described as being a fluorescence microscope, but the microscope 1 may be a microscope other than the fluorescence microscope.
  • the microscope 1 can observe the inside of the sample S, and can generate, for example, an image (eg, Z-stack) in which cross sections in the thickness direction of the sample S are stacked.
  • the microscope 1 may be capable of observing only one cross section in the thickness direction of the sample S.
  • the microscope 1 includes a stage 2, a light source device 3, an illumination optical system 4, a first observation optical system 5, an imaging unit 6, an angle adjustment unit 7, and a control device 8.
  • the control device 8 includes a control unit 9 that comprehensively controls each unit of the microscope 1.
  • Stage 2 holds the sample S to be observed.
  • the stage 2 can place the sample S on the upper surface thereof, for example.
  • the X direction and the Y direction are directions parallel to the upper surface of the stage 2
  • the Z direction is a direction perpendicular to the upper surface of the stage 2.
  • the stage 2 may have a mechanism that can move in the X direction, the Y direction, and the Z direction, for example.
  • the light source device 3 includes a light source 11, a shutter 12, an acoustooptic device 13, and a lens 14.
  • the light source 11 includes, for example, a light emitting element such as a laser diode (LD) or a light emitting diode (LED).
  • LD laser diode
  • LED light emitting diode
  • the microscope 1 is used for fluorescence observation, the light source 11 emits illumination light L including excitation light that excites a fluorescent substance contained in the sample S.
  • the shutter 12 is controlled by the control unit 9 and can switch between a state in which the illumination light L from the light source 11 passes and a state in which the illumination light L is blocked.
  • the acoustooptic device 13 is provided on the light exit side of the shutter 12.
  • the acoustooptic device 13 is, for example, an acoustooptic filter.
  • the acoustooptic device 13 is controlled by the control unit 9 and can adjust the light intensity of the illumination light L.
  • the acoustooptic element 13 is controlled by the control unit 9, and a state where the illumination light L passes through the acoustooptic element 13 (hereinafter referred to as a light passing state) and a state or intensity blocked by the acoustooptic element 13 are reduced.
  • the state hereinafter referred to as a light shielding state
  • the lens 14 is a coupler, for example, and condenses the illumination light L from the acoustooptic device 13 on the light guide member 16.
  • the microscope 1 may not include at least a part of the light source device 3.
  • the light source device 3 is unitized, and may be provided in the microscope 1 so as to be replaceable (attachable and removable).
  • the light source device 3 may be attached to the microscope 1 when observing with the microscope 1.
  • the illumination optical system 4 can irradiate the sample S with the illumination light L from the light source device 3 obliquely.
  • the illumination optical system 4 includes a light guide member 16, a lens 17, a lens 18, a filter 19, a dichroic mirror 20, and an objective lens 21.
  • the optical axis of the illumination optical system 4 is denoted by reference numeral 4a.
  • the light guide member 16 is an optical fiber, for example, and guides the illumination light L to the lens 17.
  • the lens 17 is a collimator, for example, and converts the illumination light L into parallel light.
  • the lens 18 condenses the illumination light L on the pupil plane (rear focal plane) of the objective lens 21 or a position in the vicinity thereof.
  • the vicinity of the pupil plane (rear focal plane) is within a range of ⁇ 10 mm from the pupil plane (rear focal plane), for example.
  • the filter 19 has a characteristic that light in a wavelength band including a wavelength of excitation light that excites a fluorescent substance contained in the sample S (hereinafter referred to as excitation wavelength) is transmitted, for example.
  • the wavelength characteristic of the filter 19 is set so that at least a part of light having a wavelength other than the excitation wavelength is blocked.
  • the dichroic mirror 20 has a characteristic that the illumination light L is reflected and light (for example, fluorescence) in a predetermined wavelength band among the light from the sample S is transmitted.
  • the light from the filter 19 is reflected by the dichroic mirror 20 and enters the objective lens 21. At the time of observation, a part of the sample S is disposed on the front focal plane of the objective lens 21.
  • the illumination optical system 4 mentioned above is an example, and can be changed suitably.
  • a part of the illumination optical system 4 described above may be omitted or included in the light source device 3.
  • the illumination optical system 4 may include at least a part of the light source device 3.
  • the illumination optical system 4 may include an aperture stop, a field stop, and the like.
  • the optical element closest to the sample S in the illumination optical system 4 is the objective lens 21 in FIG. 1, but may be a prism, a mirror, or the like.
  • the first observation optical system 5 forms an image with light from the sample S.
  • the first observation optical system 5 forms an image of fluorescence from the fluorescent material included in the sample S.
  • the first observation optical system 5 includes an objective lens 21, a dichroic mirror 20, a filter 24, a lens 25, an optical path switching member 26, a lens 27, and a lens 28.
  • the first observation optical system 5 shares the objective lens 21 and the dichroic mirror 20 with the illumination optical system 4.
  • the optical axis 21 a of the objective lens 21 is coaxial with the optical axis 4 a of the illumination optical system 4 and coaxial with the optical axis 5 a of the first observation optical system 5.
  • the optical axis 21a of the objective lens 21 is in the Z direction.
  • Fluorescence from the sample S enters the filter 24 through the objective lens 21 and the dichroic mirror 20.
  • the filter 24 has a characteristic that light in a predetermined wavelength band out of the light from the sample S is selectively transmitted. This predetermined wavelength band is set so as to include the wavelength of fluorescence from the sample S (hereinafter referred to as fluorescence wavelength).
  • the filter 24 blocks illumination light, external light, stray light, and the like reflected from the sample S.
  • the filter 24 is unitized with, for example, the filter 19 and the dichroic mirror 20, and the filter unit 29 is provided in a replaceable manner.
  • the filter unit 29 may be exchanged according to, for example, the wavelength of the illumination light L emitted from the light source device 3, the wavelength of the fluorescence emitted from the sample S, or a single unit corresponding to a plurality of excitation wavelengths and fluorescence wavelengths.
  • the one using one filter unit may be used.
  • the light that has passed through the filter 24 enters the optical path switching member 26 through the lens 25.
  • the light emitted from the lens 25 enters the optical path switching member 26.
  • the optical path switching member 26 is a prism, for example, and is provided so as to be insertable into and removable from the optical path of the first observation optical system 5.
  • the optical path switching member 26 is inserted into and removed from the optical path of the first observation optical system 5 by, for example, a drive unit (not shown) controlled by the control unit 9.
  • the optical path switching member 26 guides the fluorescence from the sample S to the optical path toward the imaging unit 6 by internal reflection when inserted in the optical path of the first observation optical system 5.
  • Fluorescence from the sample S passes through the optical path switching member 26 and then enters the imaging unit 6 through the lens 27 and the lens 28.
  • the objective lens 21 and the lens 25 form a primary image (eg, intermediate image) of the sample S, for example.
  • the lens 27 and the lens 28 form a secondary image (eg, final image) of the sample S.
  • the first observation optical system 5 described above is an example and can be changed as appropriate. For example, a part of the first observation optical system 5 described above may be omitted. Further, the first observation optical system 5 may include an aperture stop, a field stop, and the like. The first observation optical system 5 may be provided independently of the illumination optical system 4, and may be provided on the opposite side of the objective lens 21 with respect to the sample S, for example.
  • the microscope 1 includes a second observation optical system 30 used for setting an observation range.
  • the second observation optical system 30 includes an objective lens 21, a dichroic mirror 20, a filter 24, a lens 25, a mirror 31, a lens 32, a mirror 33, a lens 34, a lens 35, in order from the sample S toward the observer's viewpoint Vp.
  • a mirror 36 and a lens 37 are provided.
  • the second observation optical system 30 shares the configuration from the objective lens 21 to the lens 25 with the first observation optical system 5. After passing through the lens 25, the light from the sample S enters the mirror 31 in a state where the optical path switching member 26 is retracted from the optical path of the first observation optical system 5.
  • the light reflected by the mirror 31 is incident on the mirror 33 via the lens 32, is reflected by the mirror 33, and then enters the mirror 36 via the lens 34 and the lens 35.
  • the light reflected by the mirror 36 enters the viewpoint Vp through the lens 37.
  • the second observation optical system 30 forms an intermediate image of the sample S in the optical path between the lens 35 and the lens 37.
  • the lens 37 is an eyepiece, for example, and the observer can set an observation range by observing the intermediate image.
  • the imaging unit 6 captures an image formed by the first observation optical system 5.
  • the imaging unit 6 includes an imaging element 40 and a control unit 41.
  • the image sensor 40 is, for example, a CMOS image sensor, but may be a CCD image sensor or the like.
  • the image sensor 40 has, for example, a structure in which a plurality of pixels arranged two-dimensionally and a photoelectric conversion element such as a photodiode is arranged in each pixel.
  • the imaging element 40 reads out the electric charge accumulated in the photoelectric conversion element by a readout circuit.
  • the image sensor 40 converts the read charges into digital data, and outputs data in a digital format (eg, image data) in which pixel positions and gradation values are associated with each other.
  • the control unit 41 operates the image sensor 40 based on a control signal input from the control unit 9 of the control device 8, and outputs captured image data to the control device 8. Further, the control unit 41 outputs a charge accumulation period and a charge read period to the control
  • the microscope 1 includes an input / output device 42 and a storage device 43.
  • the input / output device 42 is communicably connected to the control device 8 by wire or wireless.
  • the input / output device 42 includes a display device 44 (display unit, output unit) and an input device 45 (input unit).
  • the display device 44 is, for example, a liquid crystal display.
  • the display device 44 displays various images such as an image indicating various settings of the microscope 1, an image captured by the imaging unit 6, and an image generated from the captured image.
  • the control unit 9 controls the display device 44 to display various images on the display device 44. For example, the control unit 9 supplies the image data generated by the image processing unit 56 to the display device 44 and causes the display device 44 to display the image.
  • the input device 45 is an input unit that can be operated by the user, such as a keyboard, a mouse, or a trackball.
  • the input device 45 receives, for example, input of various information such as observation conditions and operation commands for each part of the microscope 1 from the user.
  • the input device 45 supplies information input to the own device to the control device 8.
  • the input / output device 42 is not limited to the above configuration, and may be a touch panel in which a display unit and an input unit are integrated, for example, or may include another output unit (eg, a printer) instead of the display device 44. Good.
  • the microscope 1 can change the observation position on the sample S in the direction of the optical axis 4 a of the illumination optical system 4.
  • the observation position on the sample S is set at or near the position of the front focal plane of the objective lens 21.
  • the observation position on the sample S can be changed, for example, by relatively moving the sample S and the objective lens 21 in the direction of the optical axis 21a of the objective lens 21 (the optical axis 4a of the illumination optical system 4).
  • the observation position on the sample S can be changed by moving the stage 2 on which the sample S is placed in the direction of the optical axis 21 a of the objective lens 21.
  • the observation position in the sample S may be changed by moving the objective lens 21 in the direction of the optical axis. That is, to change the observation position in the sample S, the stage 2 may be moved, the objective lens 21 may be moved, or both of them may be moved.
  • the angle adjusting unit 7 adjusts the angle of the illumination light L emitted from the illumination optical system 4 according to the observation position of the sample S in the direction of the optical axis 4a of the illumination optical system 4.
  • the angle adjustment unit 7 includes, for example, a holding member 51 and a drive unit 52.
  • the holding member 51 holds the end portion of the light guide member 16 on the light emission side.
  • the drive unit 52 can move the holding member 51 in a direction perpendicular to the optical axis 4 a of the illumination optical system 4.
  • the holding member 51 is provided on the pupil conjugate plane of the objective lens 21 or in the vicinity thereof.
  • the control device 8 collectively controls each part of the microscope 1.
  • the control device 8 includes a control unit 9, a calculation unit 55, and an image processing unit 56.
  • the control unit 9 controls the drive unit 52 and moves the holding member 51 by the drive unit 52. Thereby, the incident angle (for example, angle of the illumination light L and the optical axis 4a) of the illumination light L with respect to the sample S is adjusted.
  • the holding member 51 may be moved manually.
  • control unit 9 sends the light source device to the acoustooptic device 13 based on a signal (imaging timing information) indicating the charge accumulation period and the charge read period supplied from the control unit 41 of the imaging unit 6, for example.
  • 3 is supplied with a control signal for switching between a light-transmitting state through which light from 3 passes and a light-blocking state in which light from the light source device 3 is blocked.
  • the acoustooptic device 13 switches between a light transmission state and a light shielding state based on this control signal.
  • control unit 41 controls the acoustooptic device 13 to switch between the light shielding state and the light passing state based on a signal indicating the charge accumulation period and the charge readout period (information on imaging timing).
  • a signal may be supplied to control the acousto-optic element 13.
  • control unit 9 controls the imaging unit 6 to cause the imaging device 40 to perform imaging.
  • the control unit 9 acquires the imaging result (data of the captured image) from the imaging unit 6.
  • the image processing unit 56 performs image processing using the imaging result of the imaging unit 6. For example, the control unit 9 changes the observation position on the sample S by changing the position of the stage 2 in the direction of the optical axis 21 a of the objective lens 21. Further, the control unit 9 causes the imaging device 40 to perform imaging for each observation position, and obtains captured images at a plurality of observation positions in the direction of the optical axis 21 a of the objective lens 21.
  • the image processing unit 56 can generate a three-dimensional image of the sample S using, for example, a plurality of acquired captured images.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating adjustment of the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S by the angle adjustment unit 7.
  • the angle adjustment unit 7 adjusts the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S.
  • the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S is an angle formed by the optical axis 21a of the objective lens 21 (the optical axis 4a of the illumination optical system 4) and the direction in which the illumination light L is incident on the sample S. ( ⁇ 1, ⁇ 2, etc. in FIG. 2).
  • the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S ⁇ 1, ⁇ 2, etc. in FIG.
  • a light source image that can be generally regarded as a point light source is formed on the light emitting side end 16 a of the light guide member 16.
  • the end 16a of the light guide member 16 is disposed by the holding member 51 at the position of the pupil conjugate plane PU2 optically conjugate with the pupil plane PU1 of the objective lens 21 or in the vicinity of the pupil conjugate plane PU2.
  • the holding member 51 is disposed at the position Q1 on the pupil conjugate plane PU2.
  • the illumination light L emitted from the light guide member 16 enters the incident position P1 on the pupil plane PU1 of the objective lens 21, and then enters the sample S at an angle ⁇ 1.
  • the sample S is placed on a transparent member 2 a such as a cover glass, and the transparent member 2 a is supported by the stage 2.
  • the space between the lower surface of the transparent member 2a and the end surface of the objective lens 21 is filled with the immersion liquid LQ.
  • the refractive index of the immersion liquid LQ is substantially the same as the refractive index of the transparent member 2a, for example.
  • the angle between the illumination light L incident on the sample S at an angle ⁇ 1 and refracted at the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a and the optical axis 21a of the objective lens 21 (the optical axis 4a of the illumination optical system 4) is defined. It is represented by ⁇ 1.
  • the driving unit 52 moves the holding member 51 holding the end 16a of the light guide member 16 to a position Q2 closer to the optical axis 4a than the position Q1 when the angle of the illumination light L is reduced.
  • the incident position of the illumination light L on the pupil plane PU1 of the objective lens 21 changes to the incident position P2 closer to the optical axis 4a than the incident position P1, and the angle of the illumination light changes to ⁇ 2 smaller than ⁇ 1.
  • the angle between the illumination light L incident on the sample S at the angle ⁇ 2 and refracted at the interface Sa and the optical axis 4a is represented by ⁇ 2. Since ⁇ 2 is smaller than ⁇ 1, ⁇ 2 is smaller than ⁇ 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the illumination field of the illumination optical system and the field of view of the observation optical system.
  • the observation position on the sample S is assumed to be the same position as the front focal plane of the objective lens 21.
  • the illumination light L is collected on the pupil plane PU1 of the objective lens 21 is illustrated, but the illumination light L does not necessarily need to be collected on the pupil plane PU1 of the objective lens 21.
  • the illumination light L may be condensed near the pupil plane PU1.
  • the front focal plane FP1 of the objective lens 21 is set at the same position as the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a.
  • the illumination light L collected at the incident position P1 on the pupil plane PU1 of the objective lens 21 becomes parallel light, illuminates the sample S, and forms an illumination field LF1 at the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a.
  • the illumination field LF1 is formed around the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21, for example.
  • the visual field VF eg, the observation range on the sample S of the first observation optical system 5 (see FIG. 1) is formed around the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21, for example.
  • the illumination field LF is formed, for example, in a region where the entire visual field VF is accommodated.
  • FIG. 3B shows a state in which, for example, the stage 2 is brought close to the objective lens 21 from the state of FIG. 3B, the front focal plane FP2 of the objective lens 21 is located away from the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a in the direction of the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21 (of the sample S).
  • the illumination light L condensed on the pupil plane PU1 of the objective lens 21 becomes parallel light and forms an illumination field LF2 on the front focal plane FP2.
  • the illumination light L incident on the sample S has a ⁇ 1 angle with the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21 due to refraction at the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a.
  • the illumination field LF2 moves by a movement amount ⁇ X in the + X direction compared to the illumination field LF1.
  • the movement amount ⁇ X is an amount that depends on the distance ⁇ Z between the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a and the front focal plane FP2, the angle ⁇ 1, and the like. As the distance ⁇ Z increases or the angle ⁇ 1 increases, the movement amount ⁇ X increases. As the movement amount ⁇ X increases, the overlapping area between the illumination field LF2 and the visual field VF decreases, and it becomes difficult to obtain an image of the sample S satisfactorily. Therefore, the angle adjustment unit 7 illustrated in FIG.
  • the 2 is configured to change the illumination light L according to the observation position of the sample S in the direction of the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21 (the front focal plane of the objective lens 21). The incident angle with respect to the sample S is adjusted.
  • the front focal plane FP2 of the objective lens 21 is set at the same position as in FIG.
  • the angle adjusting unit 7 (see FIG. 2), for example, makes the incident position (condensing position) of the illumination light L on the pupil plane PU1 of the objective lens 21 incident according to the position of the front focal plane FP2 of the objective lens 21. Adjust to position P3.
  • the incident position P3 is set to a position closer to the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21 than the incident position P1 in FIG.
  • the illumination light L collected at the incident position P3 becomes parallel light and travels toward the sample S.
  • the angle ⁇ 3 of the illumination light L toward the sample S is smaller than the angle ⁇ 1 in FIG. 3B, and the illumination light refracted at the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a.
  • the angle L (the angle between the illumination light L refracted at the interface Sa and the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21) ⁇ 3 is smaller than the angle ⁇ 1 in FIG. Therefore, the illumination field LF3 moves in the ⁇ X direction as compared with the illumination field LF2 in FIG. Thereby, the overlapping area of the illumination field LF3 and the visual field VF is increased as compared with FIG. 3B, and an image of the sample S can be obtained satisfactorily.
  • the angle adjustment unit 7 illustrated in FIG. 2 is, for example, an observation position (front focal plane FP2 of the objective lens 21) from the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a in the direction of the optical axis 21a (optical axis 4a) of the objective lens 21.
  • the incident position P is adjusted according to the distance ⁇ Z.
  • the angle adjusting unit 7 sets the incident position P of the illumination light L to the objective lens 21 as the front focal plane FP2 of the objective lens 21 is farther from the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a (as ⁇ Z is larger). Is moved in a direction approaching the optical axis 21a (optical axis 4a).
  • the stage 2 when the stage 2 is moved in the direction approaching the objective lens 21 along the optical axis 21a of the objective lens 21, the deep part of the sample S (here, away from the interface Sa in a direction in which the distance increases) is the observation position. It becomes.
  • the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S if the incident angle of the illumination light L with respect to the sample S remains constant, the overlapping area between the illumination field and the field of view decreases, so that the stage 2 is moved along the optical axis and controlled.
  • the unit 9 controls the driving unit 52 of the angle adjusting unit 7, and moves the holding member 51 by the driving unit 52 so that the incident position P approaches the optical axis 21 a (optical axis 4 a) of the objective lens 21.
  • the control unit 9 controls the drive unit 52 of the angle adjustment unit 7, and the incident position P of the objective lens 21 is controlled by the drive unit 52.
  • the holding member 51 is moved so as to approach the optical axis 21a (optical axis 4a).
  • the calculation unit 55 shown in FIG. 1 calculates the target value of the incident position (for example, the incident position P3 in FIG. 3) with respect to the position of the front focal plane FP of the objective lens 21 on the sample S.
  • the control unit 9 controls the angle adjustment unit 7 based on the calculation result of the calculation unit 55.
  • the calculation unit 55 calculates a target value of the incident position of the illumination light L on the pupil plane PU1 based on information input via the input device 45.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating a relationship between an observation position and an incident angle calculated by the calculation unit 55 according to the present embodiment.
  • the calculation unit 55 uses, for example, two or more sets of the observation position specified by the user (the position of the front focal plane FP in the sample S of the objective lens 21) and the incident position P of the illumination light L as another observation position.
  • the target value of the incident position P of the corresponding illumination light L is calculated.
  • the horizontal axis is an observation position (unit: ⁇ m) in which the inside of the sample S is positive with the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a as a reference (0 ⁇ m).
  • the vertical axis is a value indicating the incident position P of the illumination light L on the pupil plane PU1, and its unit is an arbitrary unit (au).
  • a symbol U1 indicates a target value (about 0.897) of the incident position P corresponding to the first observation position (for example, about 0 ⁇ m) designated by the user.
  • Symbol U2 indicates a target value of the incident position P (eg, about 0.841) corresponding to the second observation position (eg, about 4.5 ⁇ m) designated by the user.
  • the calculation unit 55 calculates a target value of the incident position P with respect to the third observation position between the first observation position and the second observation position by interpolating between the plot U1 and the plot U2, for example. Specifically, in FIG. 4, the calculation unit 55 linearly interpolates U3 to U12 using linear interpolation.
  • the user specifies U1 and U2 and interpolates between U1 and U2. However, for example, the user specifies U5 and U10 to specify U1 to U4, U6 to U9, and U11. ⁇ U12 may be calculated. Note that the number of observation positions is appropriately set according to observation conditions and the like.
  • FIG. 4B is a diagram illustrating another example of the operation of the calculation unit 55 according to the present embodiment.
  • the calculation unit 55 calculates the incident position P of the illumination light L on the pupil plane PU1 by a non-linear interpolation method.
  • the calculation unit 55 interpolates a section between the plots U1 and U2 so that the plots U1 and U2 are end points and the plurality of plots U1 to U12 are arranged on a downwardly convex curve.
  • the calculation unit 55 calculates a plurality of plots U3 to U12 using an interpolation method (for example, ⁇ interpolation) in which the target value of the incident position is expressed in a function form including the index of the observation position.
  • an interpolation method for example, ⁇ interpolation
  • the interpolation method used by the calculation unit 55 is not limited to the above-described example, and may be an interpolation method having a polygonal distribution.
  • the control unit 9 may output to the input / output device 42 a plurality of methods for calculating information related to the incident angle according to the position of the objective lens 21 in a selectable manner. For example, the control unit 9 displays a plurality of interpolation method candidates (eg, linear interpolation, ⁇ interpolation, etc.) on the display device 44, and the user operates the input device 45 to select the interpolation method to be used. May be selectable.
  • interpolation method candidates eg, linear interpolation, ⁇ interpolation, etc.
  • the calculation unit 55 calculates information on the incident angle according to the position of the objective lens 21 based on the calculation method input from the input / output device 42, and the control unit 9 uses the information calculated by the calculation unit 55. Based on this, the incident angle may be changed.
  • the control unit 9 outputs a plurality of methods for calculating information related to the incident angle according to the position of the stage 2 to the input / output device 42 so that the information can be selected. Based on the above, information regarding the incident angle according to the position of the stage 2 may be calculated, and the control unit 9 may change the incident angle based on the information calculated by the calculation unit 55.
  • the horizontal axis is the observation position where the inside of the sample S is positive with the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a as a reference (0 ⁇ m), but the position of the stage 2 or the objective lens 21 It is good also as a position.
  • the user designates the first observation position and the target value of the incident position P, and the second observation position and the target value of the incident position P.
  • the calculation unit 55 determines the stage 2 corresponding to the first observation position.
  • the position (first stage position) and the position of the stage 2 (second stage position) corresponding to the second observation position are acquired, the first stage position and the target value of the incident position P, the second stage position and the incident thereof.
  • the target value of the position P may be associated.
  • the calculation unit 55 calculates a target value of the incident position P corresponding to the position of the stage 2.
  • the horizontal axis may be the absolute coordinate position of the stage 2 or may be based on the first stage position.
  • the user designates the first observation position and the target value of the incident position P, and the second observation position and the target value of the incident position P.
  • the calculation unit 55 corresponds to the first observation position.
  • the position of the objective lens 21 (first objective lens position) and the position of the objective lens 21 corresponding to the second observation position (second objective lens position) are acquired, and the target value of the first objective lens position and its incident position P is obtained.
  • the second objective lens position and the target value of the incident position P may be associated with each other.
  • the calculation unit 55 calculates a target value of the incident position P corresponding to the position of the objective lens 21.
  • the horizontal axis may be the absolute coordinate position of the objective lens 21 or may be based on the first objective lens position.
  • the control unit 9 controls the angle adjustment unit 7 based on the calculation result of the calculation unit 55. In this case, the control unit 9 controls the angle adjustment unit 7 using the position of the holding member 51 corresponding to the incident position P stored in the storage device 43 in advance.
  • the vertical axis is the incident position P of the illumination light L on the pupil plane PU1, but it may be the position of the holding member 51.
  • the user designates the first observation position and the position of the holding member 51, the second observation position and the position of the holding member 51, and the calculating unit 55 determines the position of the holding member 51 according to the observation position. Is calculated. In this case, it is not necessary to store the position of the holding member 51 corresponding to the incident position P in advance in the storage device 43.
  • the control unit 9 may change the incident angle based on information on the incident angle corresponding to the position of the objective lens 21 (hereinafter referred to as first reference information).
  • the first reference information may be information related to the incident angle associated with the absolute position information of the objective lens 21, for example.
  • the absolute position information is, for example, information on the position of the objective lens 21 with respect to a predetermined reference position, such as coordinates in the direction (Z direction) of the optical axis 21a of the objective lens 21.
  • the reference position is determined by the control unit 9 when the microscope 1 is turned on.
  • a function e.g., a formula, a numerical value table
  • the first reference information may be information regarding the incident angle associated with the movement amount of the objective lens 21.
  • a function e.g., a formula, a numerical table
  • the first reference information may be information regarding the incident angle associated with the relative position information of the objective lens 21 with respect to the stage 2.
  • the relative position information is, for example, information on the difference between the coordinates of the stage 2 and the coordinates of the objective lens 21 in the direction of the optical axis 21a of the objective lens 21 (Z direction).
  • a function e.g., a mathematical expression or a numerical table
  • the control unit 9 may change the incident angle based on information on the incident angle according to the position of the stage 2 (hereinafter referred to as second reference information).
  • the second reference information may be information related to the incident angle associated with the absolute position information of the stage 2, for example.
  • the absolute position information is, for example, information on the position of the stage 2 with respect to a predetermined reference position, and is the coordinates of the stage 2 in the direction of the optical axis 21a of the objective lens 21 (Z direction).
  • the reference position is determined by the control unit 9 when the microscope 1 is turned on.
  • a function e.g., a formula, a numerical table
  • the second reference information may be information regarding the incident angle associated with the moving amount of the stage 2.
  • a function e.g., a formula, a numerical table
  • the second reference information may be information related to the incident angle associated with the relative position information of the stage 2 with respect to the objective lens 21.
  • the relative position information is, for example, information on the difference between the coordinates of the stage 2 and the coordinates of the objective lens 21 in the direction of the optical axis 21a of the objective lens 21 (Z direction).
  • a function e.g., a mathematical expression or a numerical table
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating an example of the observation method according to the embodiment.
  • the user sets observation conditions using the input device 45.
  • the observation conditions are, for example, the first observation position (lower limit of the observation position) and the incident position at that time, the second observation position (upper limit of the observation position) and the incident position at that time, and observation in the optical axis direction of the objective lens 21. Such as the number of positions.
  • the user moves the holding member 51 to change the incident position to determine the optimum incident position at the first observation position and the second observation position based on the contrast, light intensity, and the like of a plurality of images captured. decide.
  • the above observation conditions may be stored in the storage unit 43 in advance, for example.
  • step S2 the calculation unit 55 calculates the relationship between the observation position and the incident position.
  • the calculation unit 55 uses the first observation position, the second observation position, and the number of observation positions in the optical axis direction of the objective lens 21 defined in the observation condition, and the first observation position, the second observation position, and the like.
  • the observation position between is calculated.
  • the calculation unit 55 uses the incident position in the case of the first observation position and the incident position in the case of the second observation position, and calculates the incident position at each observation position therebetween. To do.
  • step S3 the microscope 1 starts an operation related to observation, for example, according to a user instruction.
  • step S4 the control unit 41 controls the stage 2 and moves the stage 2 to a position corresponding to the first observation position.
  • step S5 the control unit 41 moves the holding member 51 using the relationship between the observation position and the incident angle.
  • step S ⁇ b> 6 the control unit 41 causes the imaging unit 6 to capture an image formed by the first observation optical system 5 in a state where the illumination light is irradiated from the illumination optical system 4 to the sample S, and acquires an image.
  • step S ⁇ b> 7 the control unit 41 determines whether image acquisition has been completed for all observation positions.
  • step S7 When it is determined that a part of the observation position set as the observation condition in step S1 is not completed (step S7; No), the control unit 41 positions the stage 2 in accordance with the next observation position in step S8. The process from step S5 to step S7 is repeated. In addition, when the control unit 41 determines that acquisition of images for all observation positions is completed (step S7; Yes), the series of processing ends.
  • step S2 the calculation unit 55 calculates the relationship between the observation position and the incident position, but the relationship between the observation position and the incident position may be stored in the storage device 43 in advance. In this case, step S2 is omitted.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a relationship between an observation position and an incident angle calculated by the calculation unit 55 according to the second embodiment.
  • the user does not need to specify a set of the observation position (the position of the front focal plane FP in the sample S of the objective lens 21) and the incident position P of the illumination light L.
  • the calculation unit 55 calculates the relationship between the observation position and the target value of the incident position P as indicated by reference numeral D1 in FIG. 6 based on a predetermined observation condition.
  • the above observation conditions include, for example, the refractive index between the sample S and the objective lens 21 (eg, the refractive index of the transparent member, the refractive index of the immersion liquid), the refractive index of the sample S, the type of the objective lens, and the environmental temperature. And the thickness of the cover glass 2a.
  • the observation position the position of the front focal plane FP in the sample S of the objective lens 21
  • the incident position P of the illumination light L the incident angle P is changed at the observation position, and a plurality of images are acquired.
  • the trouble can be saved.
  • calculation unit 55 calculates, for example, an area close to the interface Sa between the sample S and the transparent member 2a as indicated by reference numeral D2 in FIG. 6 in consideration of the influence of the aberration, the evanescent field, and the like. May be.
  • the user designates a set (symbol U1, U2, etc.) of the observation position (the position of the front focal plane FP in the sample S of the objective lens 21) and the incident position P of the illumination light L.
  • the calculation unit 55 calculates the relationship between the observation position and the incident position P by designating the observation position (the position of the front focal plane FP in the sample S of the objective lens 21).
  • the control unit 9 controls the driving unit 52 to move the holding member 51, and the sample S illuminated at a different incident position P at the designated observation position.
  • the imaging unit 6 is caused to capture a plurality of images.
  • the calculation unit 55 determines the target value of the incident position P corresponding to the first observation position input by the user, based on the information regarding the light from the sample S detected each time the incident position P is changed. For example, the calculation unit 55 sets the incident position P having the highest light intensity or contrast from the sample S as the target value of the incident position P at the first observation position. Similarly, the calculation unit 55 calculates the target value of the incident position P at the second observation position. Further, the calculation unit 55 similarly relates to light from the sample S that is detected every time the incident position P is changed for observation positions other than the first observation position and the second observation position (eg, U3 to U12). Based on the information, a target value of the incident position P may be calculated.
  • the relationship between the observation position and the incident position P can be calculated with higher accuracy than when linear interpolation is performed on U3 to U12 from U1 and U2.
  • the user needs to specify the target value of the incident position P corresponding to the observation position.
  • the calculation unit 55 performs the incident corresponding to the observation position specified by the user. Since the position P is calculated, the user's trouble can be saved.
  • FIG. 7 is a diagram showing the microscope 1 according to the present embodiment.
  • the microscope according to the present embodiment is a microscope using a single-molecule localization microscopy method such as STORM or PALM.
  • the microscope according to the embodiment can be used for both fluorescence observation of a sample labeled with one type of fluorescent substance and fluorescence observation of a sample labeled with two or more types of fluorescent substances.
  • the microscope according to the embodiment has, for example, a mode for generating a two-dimensional super-resolution image and a mode for generating a three-dimensional super-resolution image, and can switch between the two modes. It may have only one of the two modes.
  • a mode in which there are two types of fluorescent dyes (eg, reporter dyes) used for labeling, but the number of fluorescent dyes (eg, reporter dyes) may be one or more than three. .
  • the sample may include living cells (live cells), may include cells fixed using a tissue fixing solution such as a formaldehyde solution, or may be tissue.
  • the fluorescent substance may be a fluorescent dye such as a cyanine dye or a fluorescent protein.
  • the fluorescent dye includes a reporter dye that emits fluorescence when receiving excitation light in an activated state (hereinafter referred to as an activated state).
  • the fluorescent dye may include an activator dye that receives activation light and activates the reporter dye. If the fluorescent dye does not contain an activator dye, the reporter dye receives an activation light and becomes activated.
  • Fluorescent dyes include, for example, a dye pair in which two kinds of cyanine dyes are combined (eg, Cy3-Cy5 dye pair (Cy3, Cy5 is a registered trademark), Cy2-Cy5 dye pair (Cy2, Cy5 is a registered trademark) , Cy3-Alexa® Fluor647 dye pair (Cy3, Alexa® Fluor is a registered trademark)) and one type of dye (eg, Alexa® Fluor647 (Alexa® Fluor is a registered trademark)).
  • the fluorescent protein include PA-GFP and Dronpa.
  • the illumination optical system 4 irradiates the sample S with excitation light having two types of wavelengths according to the fluorescent material (eg, reporter dye).
  • the light source device 3 includes an activation light source 11a, an excitation light source 11b, an excitation light source 11c, a shutter 12a, a shutter 12b, a shutter 12c, a mirror 61, a dichroic mirror 62, and a dichroic mirror 63.
  • the activation light source 11a emits activation light L0 that activates a part of the fluorescent substance contained in the sample S as illumination light.
  • the fluorescent material contains a reporter dye and does not contain an activator dye.
  • the reporter dye of the fluorescent substance is in an activated state capable of emitting fluorescence when irradiated with the activation light L0.
  • the wavelength of the activation light L0 is, for example, 405 nm.
  • the fluorescent material may include a reporter dye and an activator dye. In this case, the activator dye activates the reporter dye when it receives the activation light L0.
  • the fluorescent substance may be a fluorescent protein such as PA-GFP or Dronpa.
  • the shutter 12a is disposed on the light emission side of the activation light source 11a. The shutter 12a is controlled by the control unit 9, and can switch between a state in which the activation light L0 from the activation light source 11a passes and a state in which the activation light L0 is blocked.
  • the excitation light source 11b emits first excitation light L1 having a first wavelength as illumination light.
  • the shutter 12b is disposed on the light emission side of the excitation light source 11b.
  • the shutter 12b is controlled by the control unit 9, and can switch between a state in which the first excitation light L1 from the excitation light source 11b passes and a state in which the first excitation light L1 is blocked.
  • the excitation light source 11c generates second excitation light L2 having a second wavelength different from the first wavelength as illumination light.
  • the second wavelength is shorter than the first wavelength.
  • the first wavelength is 647 nm and the second wavelength is 561 nm.
  • the shutter 12c is disposed on the light emission side of the excitation light source 11c.
  • the shutter 12c is controlled by the control unit 9, and can switch between a state in which the second excitation light L2 from the excitation light source 11c is allowed to pass and a state in which the second excitation light L2 is blocked.
  • the mirror 61 is disposed on the light emission side of the shutter 12c.
  • the second excitation light L2 that has passed through the shutter 12c is reflected by the mirror 61 and enters the dichroic mirror 62.
  • the dichroic mirror 62 is disposed on the light emission side of the shutter 12b.
  • the dichroic mirror 62 has a characteristic of transmitting the second excitation light L2 and reflecting the first excitation light L1.
  • the first excitation light L1 reflected by the dichroic mirror 62 and the second excitation light L2 transmitted through the dichroic mirror 62 enter the dichroic mirror 63 through the same optical path.
  • the dichroic mirror 63 is disposed on the light emission side of the shutter 12a.
  • the dichroic mirror 63 has a characteristic of reflecting the first excitation light L1 and the second excitation light L2, and has a characteristic of transmitting the activation light L0.
  • the first excitation light L1 and the second excitation light L2 are irradiated to the sample S through the same optical path as the activation light L0.
  • the angle adjusting unit 7 may adjust the incident angle of the illumination light according to the wavelength of the illumination light, for example.
  • the incident angle may be an optimum incident angle for the activation light L0, the optimum incident angle for the first excitation light L1, the optimum incident angle for the second excitation light L2, or the minimum of these.
  • An angle between the angle and the maximum angle may be the incident angle.
  • the angle of incidence is set to be optimal for the wavelength of the first excitation light L1
  • the second excitation light L2 is irradiated
  • the activation light L0 does not necessarily need to be obliquely illuminated.
  • the image processing unit 56 performs image processing such as obtaining the position of the center of gravity of each image using the imaging result of the imaging unit 6.
  • the control unit 9 causes the imaging unit 6 to capture images in a plurality of frame periods, and the image processing unit 56 generates one image using at least a part of the imaging results obtained in the plurality of frame periods.
  • the image processing unit 56 calculates, for each of the plurality of captured images, the barycentric position of the fluorescence image (point image) included in each image.
  • the image processing unit 56 calculates the position of the center of gravity by performing Gaussian fitting on the distribution of pixel values in the region corresponding to the point image in the captured image.
  • the image processing unit 56 represents the barycentric position of the fluorescent image as a bright spot, and uses (merges) at least a part of the plurality of bright spots corresponding to the plurality of fluorescent images included in the plurality of captured images. ) Generate one image (eg, super-resolution image).
  • the first observation optical system 5 includes an astigmatism optical system (for example, a cylindrical lens 65).
  • the cylindrical lens 65 acts on at least part of the fluorescence from the sample S and generates astigmatism with respect to at least part of the fluorescence. That is, an astigmatism optical system such as the cylindrical lens 65 generates astigmatism by generating astigmatism with respect to at least a part of the fluorescence.
  • the cylindrical lens 65 is detachably provided in the optical path between the sample S and the imaging unit 6 (for example, the imaging device 40).
  • the image processing unit 56 uses astigmatism to determine the position of the fluorescent material in the depth direction of the sample S (the optical axis 21a of the objective lens 21, that is, the optical axis 5a direction of the first observation optical system 5). calculate.
  • the image processing unit 56 can calculate the position of the fluorescent material in the sample S, for example, by performing elliptical Gaussian fitting.
  • the cylindrical lens 65 is detachably provided.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating an example of an illumination and imaging sequence according to the present embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram conceptually illustrating an example of an image generated by the image processing unit 56.
  • the control unit 9 moves the stage 2 along the optical axis 21a of the objective lens 21 and sets it to a predetermined observation position (Z 0 in FIG. 8).
  • the control unit 9 controls the drive unit 52 of the angle adjustment unit 7 using the relationship between the observation position and the incident position P shown in FIGS. 4 and 6 and the like, and the incident position in the first image generation period T1.
  • the holding member 51 is moved so that becomes P 0-1 , and the holding member 51 is moved so that the incident position becomes P 0-2 in the second image generation period T2.
  • the control unit 9 executes an imaging sequence as follows at a predetermined observation position (Z 0 in FIG. 9).
  • the controller 9 irradiates the first excitation light (first excitation light L1) and does not irradiate the second excitation light (second excitation light L2) in the image generation period T1.
  • the control unit 9 also emits the activation light L0 during the image generation period T1.
  • the control unit 9 causes the imaging unit 6 to capture an image in each of the plurality of frame periods Tf of the image generation period T1 (first imaging process in the drawing; ON).
  • the control unit 9 irradiates the second excitation light and does not irradiate the first excitation light in the image generation period T2 next to the image generation period T1.
  • the control unit 9 also emits the activation light L0 during the image generation period T2.
  • control unit 9 causes the imaging unit 6 to capture an image in each of the plurality of frame periods Tf of the image generation period T2 (second imaging process in the drawing; ON).
  • the intensity of the activation light L0 is adjusted according to the fluorescent material, for example.
  • the intensity of the activation light L0 is set to be stronger when irradiating the second excitation light than when irradiating the first excitation light.
  • the control unit 9 controls the acoustooptic device 13 to adjust the intensity of the activation light.
  • the image processing unit 56 generates the first image Pa 0 using at least a part of the imaging results (eg, captured images) obtained by the plurality of first imaging processes in the image generation period T1. Further, the image processing unit 56 generates the second image Pb 0 by using at least a part of the imaging results (eg, captured images) obtained by the plurality of second imaging processes in the image generation period T2. Two types of fluorescent substances (eg, reporter dyes) are labeled on different organs and the like in the sample S, and images of organs and the like that are different between the first image Pa 0 and the second image Pb 0 are obtained. .
  • the image processing unit 56 may be, for example, by combining the first image Pa 0 and the second image Pb 0, to generate an image Pt 0 of one as shown in FIG. 9 (C).
  • the image processing unit 56 may generate one image Pt 0 without using the first image Pa 0 and the second image Pb 0 .
  • the image processing unit 56 at least a portion of the imaging result obtained by the plurality of first imaging process, using at least a portion of the imaging result obtained by the second imaging processing, the image Pt 0 of one It may be generated.
  • the image processing unit 56 may not generate an image Pt 0.
  • the control unit 9 moves the stage 2 along the optical axis 21a of the objective lens 21 and sets it to the next observation position (Z 1 in FIG. 8).
  • the control unit 9 controls the drive unit 52 of the angle adjustment unit 7 using the relationship between the observation position and the incident position P shown in FIGS. 4 and 6 and the like, and the incident position in the first image generation period T1.
  • the holding member 51 is moved so that becomes P 1-1
  • the holding member 51 is moved so that the incident position becomes P 1-2 in the second image generation period T2.
  • the control unit 9 executes the above-described imaging sequence to obtain the first image Pa 1 , the second image Pb 1 , and the image Pt 1 .
  • the first images Pa 0 to Pa n and the second images Pb 0 to Pb n images Pt 0 to Pt n are obtained at the observation positions Z 0 to Z n, respectively.
  • the image processing unit 56 using the first image Pa 0 ⁇ Pa n, it is possible to generate a three-dimensional picture Pa. Further, as shown in FIG. 9B, the image processing unit 56 can generate a three-dimensional image image Pb using the second images Pb 0 to Pb n . The image processing unit 56 can generate a three-dimensional image (eg, the three-dimensional image Pt in FIG. 9C) by, for example, synthesizing the three-dimensional image image Pa and the three-dimensional image image Pb. Further, as shown in FIG.
  • the image processing unit 56 can generate the image Pt 0 using the first image Pa 0 and the second image Pb 0 , and similarly, the image Pt 1 ⁇ Pt n can be generated.
  • the image processing unit 56 can also generate a three-dimensional image image Pt using the images Pt 0 to Pt n . Note that each of the first images Pa 0 to P n and the second images Pb 0 to Pb n is a three-dimensional image. However, when the cylindrical lens 65 is retracted from the optical path in FIG. Become.
  • the incident angle of the excitation light (first excitation light and second excitation light) to the sample is optimally set at each of the observation positions Z 0 to Z n , a highly accurate image can be obtained. it can.
  • single-molecule Localization Microscopy such as STORM and PALM that can generate high-resolution images
  • the incident angle of the illumination light to the sample is changed. Changing is particularly useful. If the incident angle of the illumination light with respect to the sample is not changed, the resolution may be reduced.
  • Single-molecule Localization In microscopy for example, it is possible to suppress the distortion of the light intensity distribution corresponding to the fluorescence image. Therefore, for example, the position of the center of gravity of the fluorescence image can be obtained with high accuracy, and a cross-sectional image of a thick sample can be obtained with high resolution.
  • the same components as those in the above-described embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted or simplified.
  • the configuration of the microscope 1 is the same as that in FIG. 1, but the operation of the control unit 9 is different from that in the first embodiment.
  • the control unit 9 causes the imaging unit 6 to capture a plurality of images at a plurality of different incident angles when moving at least one of the stage 2 and the objective lens 21.
  • the control unit 9 causes the imaging unit 6 to capture one or more images with respect to one incident angle in a state where the stage 2 and the objective lens 21 are arranged at the first relative position.
  • the imaging unit 6 is caused to capture one or more images for each incident angle.
  • the control unit 9 may determine the incident angle corresponding to the first relative position based on a plurality of images having different incident angles. For example, the control unit 9 may adopt an incident angle corresponding to an image having the highest luminance value among a plurality of images having different incident angles as the incident angle at the first relative position.
  • the image processing unit 56 may select an image used for image processing from a plurality of images having different incident angles. For example, the image processing unit 56 selects an image whose luminance value falls within a predetermined range from a plurality of images having different incident angles, and performs image processing (for example, the first image shown in FIG. 8 using only the selected image). 1 process of generating the image Pa 0) may be performed.
  • the control unit 9 captures one or more images with respect to one incident angle in a state where the stage 2 and the objective lens 21 are arranged at a second relative position different from the first relative position. 6, and one or more images may be captured by the imaging unit 6 for each of a plurality of incident angles.
  • the image processing unit 56 selects an image whose luminance value falls within a predetermined range from a plurality of images having different incident angles, and performs image processing (for example, the first image shown in FIG. 8 using only the selected image).
  • image generation processing Pa 1) may be performed.
  • the control part 9 may determine the incident angle corresponding to a 2nd relative position similarly to a 1st relative position also regarding a 2nd relative position.
  • the calculation unit 55 uses the incident angle for the first relative position and the incident angle for the second relative position to calculate the third relative position between the first relative position and the second relative position. The incident angle for the relative position may be calculated.
  • the control unit 9 includes, for example, a computer system.
  • the control unit 9 reads a program stored in the storage device 43 and executes various processes according to the program.
  • This program includes, for example, an illumination optical system that irradiates illumination light obliquely on a sample, and an observation optical system having an objective lens, and at least one of a stage that holds the sample and an objective lens is used as the objective lens.
  • This is a control program that causes a computer to control a microscope that can move in the same direction as the optical axis of the lens. The control changes the incident angle of the illumination light with respect to the sample when moving at least one of the stage and the objective lens. including.
  • This program may be provided by being recorded on a computer-readable storage medium.

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Abstract

【課題】試料に対して斜方から照明する顕微鏡において、厚みのある試料の断面画像を良好に取得することが可能な顕微鏡を提供する。 【解決手段】顕微鏡（１）は、試料（Ｓ）に対して斜方から照明光（Ｌ）を照射する照明光学系（４）と、対物レンズ（２１）を有する観察光学系（５、３０）と、試料を保持するステージ（２）および対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸（２１ａ）と同じ方向に移動させる制御部（９）と、を備える顕微鏡であって、制御部は、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させる。

Description

顕微鏡、観察方法、及び制御プログラム
　本発明は、顕微鏡、観察方法、及び制御プログラムに関する。
　試料に対して斜方から照明する顕微鏡が知られている（例えば特許文献１）。
特開平９－１５９９２２号公報
　試料に対して斜方から照明する顕微鏡において、厚みのある試料の断面画像を良好に取得することが望まれている。
　本発明の第１の態様に従えば、試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と対物レンズを有する観察光学系と、試料を保持するステージおよび対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸と同じ方向に移動させる制御部と、を備える顕微鏡であって、制御部は、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させることを特徴とする、顕微鏡が提供される。
　本発明の第２の態様に従えば、試料が載置されるステージと、試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、試料を保持するステージおよび対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸と同じ方向に移動させる制御部と、対物レンズを介して試料の撮像を行う撮像装置と、対物レンズの光軸方向における観察位置毎の撮像条件を記憶する記憶部と、を備え、撮像条件は、照明光の試料への入射角度に関する情報を含み、制御部は、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、撮像条件に基づいて、照明光の試料に対する入射角度を変化させることを特徴とする、顕微鏡が提供される。
　本発明の第３の態様に従えば、試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、を備え、試料を保持するステージおよび対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸と同じ方向に移動可能な顕微鏡を用いる観察方法であって、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させることを含むことを特徴とする、観察方法が提供される。
　本発明の第４の態様に従えば、試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、を備え、試料を保持するステージおよび対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸と同じ方向に移動可能な顕微鏡の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって、制御は、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させることを含むことを特徴とする、制御プログラムが提供される。
第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 角度調整部による照明光の試料に対する入射角度の調整を示す図である。 照明光学系の照野と観察光学系の視野とを示す図である。 第１実施形態に係る算出部が算出する観察位置と入射角度との関係を示す図である。 実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。 第２実施形態に係る算出部が算出する観察位置と入射角度との関係を示す図である。 第４実施形態に係る顕微鏡１を示す図である。 第４実施形態に係る照明と撮像のシーケンスの一例を示す図である。 画像処理部が生成する画像の例を概念的に示す図である。
［第１実施形態］
　第１実施形態について説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡１を示す図である。顕微鏡１は、観察対象の試料Ｓを斜方照明し、試料Ｓの像を観察可能な顕微鏡である。顕微鏡１は、例えば、試料Ｓに対する照明光の照射角度を変更可能に構成されている。ここでは、顕微鏡１が蛍光顕微鏡であるものとして説明するが、顕微鏡１は、蛍光顕微鏡以外の顕微鏡でもよい。顕微鏡１は、試料Ｓの内部を観察可能であり、例えば試料Ｓの厚み方向の断面を積み重ねた画像（例、Ｚ－ｓｔａｃｋ）を生成可能である。顕微鏡１は、試料Ｓの厚み方向の１つの断面のみを観察可能なものでもよい。
　顕微鏡１は、ステージ２、光源装置３と、照明光学系４と、第１の観察光学系５と、撮像部６と、角度調整部７と、制御装置８とを備える。制御装置８は、顕微鏡１の各部を包括的に制御する制御部９を備える。
　ステージ２は、観察対象の試料Ｓを保持する。ステージ２は、例えば、その上面に試料Ｓを載置可能である。図１などに示すＸＹＺ直交座標系において、Ｘ方向およびＹ方向は、ステージ２の上面に平行な方向であり、Ｚ方向はステージ２の上面に垂直な方向である。ステージ２は、例えば、Ｘ方向、Ｙ方向、Ｚ方向に移動可能な機構を有してもよい。
　光源装置３は、光源１１、シャッタ１２、音響光学素子１３、及びレンズ１４を備える。光源１１は、例えば、レーザダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの発光素子を含む。顕微鏡１が蛍光観察に用いられる場合、光源１１は、試料Ｓに含まれる蛍光物質を励起させる励起光を含む照明光Ｌを射出する。シャッタ１２は、制御部９により制御され、光源１１からの照明光Ｌを通す状態と、照明光Ｌを遮る状態とを切り替え可能である。音響光学素子１３は、シャッタ１２の光出射側に設けられる。音響光学素子１３は、例えば音響光学フィルタなどである。音響光学素子１３は、制御部９に制御され、照明光Ｌの光強度を調整可能である。また、音響光学素子１３は、制御部９に制御され、照明光Ｌが音響光学素子１３を通る状態（以下、通光状態という）と、音響光学素子１３により遮られる状態または強度が低減される状態（以下、遮光状態という）とを切り替え可能である。レンズ１４は、例えばカプラであり、音響光学素子１３からの照明光Ｌを導光部材１６に集光する。
　なお、顕微鏡１は、光源装置３の少なくとも一部を備えなくてもよい。例えば、光源装置３は、ユニット化されており、顕微鏡１に交換可能（取り付け可能、取り外し可能）に設けられていてもよい。例えば、光源装置３は、顕微鏡１による観察時などに、顕微鏡１に取り付けられてもよい。
　照明光学系４は、光源装置３からの照明光Ｌを、試料Ｓに対して斜方から照射可能である。照明光学系４は、導光部材１６、レンズ１７、レンズ１８、フィルタ１９、ダイクロイックミラー２０、及び対物レンズ２１を備える。図１などにおいて、照明光学系４の光軸を符号４ａで表す。
　導光部材１６は、例えば光ファイバであり、照明光Ｌをレンズ１７へ導く。レンズ１７は、例えばコリメータであり、照明光Ｌを平行光に変換する。レンズ１８は、例えば、照明光Ｌを対物レンズ２１の瞳面（後側焦点面）又はその近傍の位置に集光する。ここで、瞳面（後側焦点面）の近傍とは、例えば、瞳面（後側焦点面）から±１０ｍｍの範囲内である。フィルタ１９は、例えば、試料Ｓに含まれる蛍光物質を励起させる励起光の波長（以下、励起波長という）を含む波長帯の光が透過する特性を有する。フィルタ１９の波長特性は、励起波長以外の波長の光の少なくとも一部が遮られるように設定される。ダイクロイックミラー２０は、照明光Ｌが反射し、試料Ｓからの光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が透過する特性を有する。フィルタ１９からの光は、ダイクロイックミラー２０で反射し、対物レンズ２１に入射する。観察時において、試料Ｓの一部は、対物レンズ２１の前側焦点面に配置される。
　なお、上述した照明光学系４は一例であり、適宜、変更可能である。例えば、上述した照明光学系４の一部は、省略されてもよいし、光源装置３に含まれてもよい。また、照明光学系４は、光源装置３の少なくとも一部を含んでいてもよい。また、照明光学系４は、開口絞り、視野絞りなどを備えてもよい。また、照明光学系４のうち最も試料Ｓに近い光学要素は、図１において対物レンズ２１であるが、プリズム、ミラーなどでもよい。
　第１の観察光学系５は、試料Ｓからの光により像を形成する。例えば、第１の観察光学系５は、試料Ｓに含まれる蛍光物質からの蛍光の像を形成する。第１の観察光学系５は、対物レンズ２１、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、レンズ２５、光路切替部材２６、レンズ２７、及びレンズ２８を備える。第１の観察光学系５は、対物レンズ２１およびダイクロイックミラー２０を照明光学系４と共用している。対物レンズ２１の光軸２１ａは、照明光学系４の光軸４ａと同軸であり、第１の観察光学系５の光軸５ａと同軸である。図１に示す例では、対物レンズ２１の光軸２１ａは、Ｚ方向である。
　試料Ｓからの蛍光は、対物レンズ２１およびダイクロイックミラー２０を通ってフィルタ２４に入射する。フィルタ２４は、試料Ｓからの光のうち所定の波長帯の光が選択的に透過する特性を有する。この所定の波長帯は、試料Ｓからの蛍光の波長（以下、蛍光波長という）を含むように設定される。フィルタ２４は、例えば、試料Ｓで反射した照明光、外光、迷光などを遮断する。フィルタ２４は、例えば、フィルタ１９およびダイクロイックミラー２０とユニット化され、このフィルタユニット２９は、交換可能に設けられる。フィルタユニット２９は、例えば、光源装置３から射出される照明光Ｌの波長、試料Ｓから放射される蛍光の波長などに応じて交換可能でもよいし、複数の励起波長、蛍光波長に対応した単一のフィルタユニットを利用したものでもよい。
　フィルタ２４を通った光は、レンズ２５を介して光路切替部材２６に入射する。レンズ２５から射出された光は、光路切替部材２６に入射する。光路切替部材２６は、例えばプリズムであり、第１の観察光学系５の光路に挿脱可能に設けられる。光路切替部材２６は、例えば、制御部９により制御される駆動部（図示せず）によって、第１の観察光学系５の光路に挿脱される。光路切替部材２６は、第１の観察光学系５の光路に挿入された状態において、試料Ｓからの蛍光を内面反射によって撮像部６へ向かう光路へ導く。試料Ｓからの蛍光は、光路切替部材２６を経由した後、レンズ２７およびレンズ２８を介して、撮像部６へ入射する。第１の観察光学系５において、対物レンズ２１およびレンズ２５は、例えば、試料Ｓの一次像（例、中間像）を形成する。また、第１の観察光学系５において、レンズ２７およびレンズ２８は、試料Ｓの二次像（例、最終像）を形成する。
　なお、上述した第１の観察光学系５は一例であり、適宜、変更可能である。例えば、上述した第１の観察光学系５の一部は、省略されてもよい。また、第１の観察光学系５は、開口絞り、視野絞りなどを備えてもよい。また、第１の観察光学系５は、照明光学系４と独立に設けられてもよく、例えば、試料Ｓに対して対物レンズ２１の反対側に設けられてもよい。
　本実施形態に係る顕微鏡１は、観察範囲の設定などに利用される第２の観察光学系３０を備える。第２の観察光学系３０は、試料Ｓから観察者の視点Ｖｐに向かう順に、対物レンズ２１、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、レンズ２５、ミラー３１、レンズ３２、ミラー３３、レンズ３４、レンズ３５、ミラー３６、及びレンズ３７を備える。第２の観察光学系３０は、対物レンズ２１からレンズ２５までの構成を第１の観察光学系５と共用している。試料Ｓからの光は、レンズ２５を通った後に、光路切替部材２６が第１の観察光学系５の光路から退避した状態において、ミラー３１に入射する。ミラー３１で反射した光は、レンズ３２を介してミラー３３に入射し、ミラー３３で反射した後に、レンズ３４およびレンズ３５を介してミラー３６に入射する。ミラー３６で反射した光は、レンズ３７を介して、視点Ｖｐに入射する。第２の観察光学系３０は、例えば、レンズ３５とレンズ３７との間の光路に試料Ｓの中間像を形成する。レンズ３７は、例えば接眼レンズであり、観察者は、中間像を観察することにより観察範囲の設定などを行うことができる。
　撮像部６は、第１の観察光学系５が形成した像を撮像する。撮像部６は、撮像素子４０および制御部４１を備える。撮像素子４０は、例えばＣＭＯＳイメージセンサであるが、ＣＣＤイメージセンサなどでもよい。撮像素子４０は、例えば、二次元的に配列された複数の画素を有し、各画素にフォトダイオードなどの光電変換素子が配置された構造である。撮像素子４０は、例えば、光電変換素子に蓄積された電荷を、読出回路によって読み出す。撮像素子４０は、読み出された電荷をデジタルデータに変換し、画素の位置と階調値とを関連付けたデジタル形式のデータ（例、画像のデータ）を出力する。制御部４１は、制御装置８の制御部９から入力される制御信号に基づいて撮像素子４０を動作させ、撮像画像のデータを制御装置８に出力する。また、制御部４１は、電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を制御装置８に出力する。
　顕微鏡１は、入出力装置４２および記憶装置４３を備える。入出力装置４２は、制御装置８と有線または無線により通信可能に接続される。入出力装置４２は、表示装置４４（表示部、出力部）および入力装置４５（入力部）を備える。表示装置４４は、例えば、液晶ディスプレイなどである。表示装置４４は、例えば、顕微鏡１の各種設定を示す画像、撮像部６による撮像画像、撮像画像から生成された画像などの各種画像を表示する。制御部９は、表示装置４４を制御し、表示装置４４に各種画像を表示させる。例えば、制御部９は、画像処理部５６が生成した画像のデータを表示装置４４に供給し、この画像を表示装置４４に表示させる。入力装置４５は、例えば、キーボード、マウス、トラックボールなどのユーザが操作可能な入力部である。入力装置４５は、例えばユーザから、観察条件、顕微鏡１の各部に対する動作指令などの各種情報の入力を受け付ける。入力装置４５は、自装置に入力された情報を制御装置８に供給する。入出力装置４２は、上記の構成に限定されず、例えば表示部および入力部が一体化されたタッチパネルなどでもよいし、表示装置４４の代わりに他の出力部（例、プリンタ）を備えてもよい。
　本実施形態において、顕微鏡１は、照明光学系４の光軸４ａの方向において、試料Ｓにおける観察位置を変更可能である。試料Ｓにおける観察位置は、対物レンズ２１の前側焦点面の位置またはその近傍に設定される。試料Ｓにおける観察位置は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａ（照明光学系４の光軸４ａ）の方向において試料Ｓと対物レンズ２１とを相対移動することにより、変更可能である。例えば、試料Ｓが載置されたステージ２を対物レンズ２１の光軸２１ａの方向に移動させることで、試料Ｓにおける観察位置を変更可能である。なお、試料Ｓにおける観察位置の変更は、対物レンズ２１を光軸の方向に移動させることにより行ってもよい。つまり、試料Ｓにおける観察位置の変更は、ステージ２を動かしてもよいし、対物レンズ２１を動かしてもよいし、それら両方を動かしてもよい。
　角度調整部７は、照明光学系４の光軸４ａの方向における試料Ｓの観察位置に応じて、照明光学系４から照射される照明光Ｌの角度を調整する。角度調整部７は、例えば、保持部材５１および駆動部５２を備える。保持部材５１は導光部材１６の光出射側の端部を保持する。駆動部５２は、保持部材５１を照明光学系４の光軸４ａと垂直の方向に移動させることができる。なお、保持部材５１は、対物レンズ２１の瞳共役面または、その近傍に設けられている。角度調整部７については、後に図２および図３などを参照してより詳しく説明する。
　制御装置８は、顕微鏡１の各部を総括して制御する。制御装置８は、制御部９、算出部５５、及び画像処理部５６を備える。制御部９は、駆動部５２を制御し、駆動部５２によって保持部材５１を移動させる。これにより、試料Ｓに対する照明光Ｌの入射角（例、照明光Ｌと光軸４ａとの角度）が調整される。なお、駆動部５２が保持部材５１を移動させる代わりに、手動により保持部材５１を移動してもよい。
　また、制御部９は、例えば、撮像部６の制御部４１から供給される電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を示す信号（撮像タイミングの情報）に基づいて、音響光学素子１３に、光源装置３からの光を通す通光状態と、光源装置３からの光を遮る遮光状態とを切り替える制御信号を供給する。音響光学素子１３は、この制御信号に基づいて、通光状態と遮光状態とを切り替える。なお、制御部９の代わりに制御部４１は、電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を示す信号（撮像タイミングの情報）に基づいて、音響光学素子１３に遮光状態と通光状態とを切り替える制御信号を供給し、音響光学素子１３を制御してもよい。
　また、制御部９は、撮像部６を制御し、撮像素子４０に撮像を実行させる。制御部９は、撮像部６から撮像結果（撮像画像のデータ）を取得する。画像処理部５６は、撮像部６の撮像結果を用いて画像処理を行う。例えば、制御部９は、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向におけるステージ２の位置を変更することで、試料Ｓにおける観察位置を変更する。また、制御部９は、各観察位置について撮像素子４０に撮像を実行させ、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向の複数の観察位置において、撮像画像を取得させる。画像処理部５６は、例えば、取得した複数の撮像画像を用いて、試料Ｓの三次元的な画像を生成可能である。
　次に、角度調整部７について説明する。図２は、角度調整部７による照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度の調整を示す図である。角度調整部７は、照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度を調整する。ここで、照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度とは、対物レンズ２１の光軸２１ａ（照明光学系４の光軸４ａ）と、照明光Ｌが試料Ｓに対して入射する方向とがなす角（図２のα１、α２等）である。また、照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度（図２のα１、α２等）が変化すると、対物レンズ２１の光軸（照明光学系４の光軸４ａ）と試料Ｓを照明する（通過する）照明光Ｌとの角度（図２のβ１、β２等）も変化する。ここでは、角度調整部７が照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度を小さくする例（α１からα２）を説明するが、大きくしてもよい。
　導光部材１６の光出射側の端１６ａには、概ね点光源とみなすことができる光源像が形成される。導光部材１６の端１６ａは、保持部材５１によって、対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１と光学に共役な瞳共役面ＰＵ２の位置、または瞳共役面ＰＵ２の近傍に配置される。ここでは、照明光Ｌの角度を調整する前において、保持部材５１は、瞳共役面ＰＵ２上の位置Ｑ１に配置されているものとする。導光部材１６から出射した照明光Ｌは、対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上の入射位置Ｐ１に入射した後、試料Ｓに対して角度α１で入射する。ここでは、試料Ｓがカバーガラスなどの透明部材２ａ上に載置され、透明部材２ａがステージ２に支持されている。透明部材２ａの下面と対物レンズ２１の端面との間の空間は、浸液ＬＱで満たされている。浸液ＬＱの屈折率は、例えば透明部材２ａの屈折率とほぼ同じである。試料Ｓの屈折率と、試料Ｓが載置されている透明部材２ａの屈折率が異なる場合、図２に示すように、照明光Ｌは、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａで屈折する。ここでは、角度α１で試料Ｓに入射して試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａで屈折した照明光Ｌと対物レンズ２１の光軸２１ａ（照明光学系４の光軸４ａ）との角度をβ１で表す。
　駆動部５２は、照明光Ｌの角度を小さくする際に、導光部材１６の端１６ａを保持した保持部材５１を、位置Ｑ１よりも光軸４ａに近い位置Ｑ２に移動させる。これにより、対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置は、入射位置Ｐ１よりも光軸４ａに近い入射位置Ｐ２へ変化し、照明光の角度がα１よりも小さいα２へ変化する。ここでは、角度α２で試料Ｓに入射して界面Ｓａで屈折した照明光Ｌと光軸４ａとの角度をβ２で表す。α２がα１よりも小さいので、β２はβ１よりも小さくなる。
　図３は、照明光学系の照野と観察光学系の視野とを示す図である。ここでは、試料Ｓにおける観察位置は、対物レンズ２１の前側焦点面と同じ位置であるものとする。なお、以下、説明の便宜上、対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上に照明光Ｌが集光する場合を例示するが、必ずしも対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上に照明光Ｌが集光する必要はない。例えば、照明光Ｌは瞳面ＰＵ１上の近傍に集光してもよい。図３（Ａ）において、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ１は、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａと同じ位置に設定されている。対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上の入射位置Ｐ１に集光した照明光Ｌは、平行光となり、試料Ｓを照明し、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａに照野ＬＦ１を形成する。照野ＬＦ１は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）を中心に形成される。第１の観察光学系５（図１参照）の視野ＶＦ（例、試料Ｓ上の観察範囲）は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）を中心に形成される。照野ＬＦは、例えば、視野ＶＦの全体が収まる領域に形成される。
　図３（Ｂ）は、図３（Ａ）の状態から例えばステージ２を対物レンズ２１に近づけた様子を示している。図３（Ｂ）において、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ２は、対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）の方向において試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａから離れた位置（試料Ｓの内部）に設定されている。対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上で集光した照明光Ｌは、平行光となり、前側焦点面ＦＰ２上に照野ＬＦ２を形成する。試料Ｓに入射した照明光Ｌは、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａでの屈折により対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）との角度がβ１になっており、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａと前側焦点面ＦＰ２とにギャップ（ΔＺ）があることから、照野ＬＦ２は、照野ＬＦ１と比較して＋Ｘ方向に移動量ΔＸだけ移動する。移動量ΔＸは、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａと前側焦点面ＦＰ２との距離ΔＺ、及び角度β１などに依存する量である。距離ΔＺが大きくなるほど、あるいは角度β１が大きくなるほど、移動量ΔＸが大きくなる。移動量ΔＸが大きくなるにつれて、照野ＬＦ２と視野ＶＦとの重なり面積が小さくなり、試料Ｓの像を良好に取得することが難しくなる。そこで、図２に示した角度調整部７は、対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）の方向における試料Ｓの観察位置（対物レンズ２１の前側焦点面）に応じて、照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度を調整する。
　図３（Ｃ）において、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ２は、図３（Ｂ）と同じ位置に設定されている。角度調整部７（図２参照）は、例えば、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ２の位置に応じて、対物レンズ２１の瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置（集光位置）を、入射位置Ｐ３に調整する。入射位置Ｐ３は、図３（Ｂ）の入射位置Ｐ１よりも対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）に近い位置に設定される。入射位置Ｐ３において集光した照明光Ｌは、平行光となって、試料Ｓに向かう。試料Ｓに向かう照明光Ｌの角度α３（照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度）は、図３（Ｂ）の角度α１よりも小さく、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａで屈折した照明光Ｌの角度（界面Ｓａで屈折した照明光Ｌと対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）との角度）β３は、図３（Ｂ）の角度β１よりも小さい。そのため、照野ＬＦ３は、図３（Ｂ）の照野ＬＦ２と比較して－Ｘ方向に移動する。これにより、照野ＬＦ３と視野ＶＦとの重なり面積が図３（Ｂ）と比較して増加し、試料Ｓの像を良好に取得することができる。
　図２に示した角度調整部７は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）の方向における試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａから観察位置（対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ２）までの距離ΔＺに応じて、入射位置Ｐを調整する。例えば、角度調整部７は、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰ２が試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａから離れているほど（ΔＺが大きいほど）、照明光Ｌの入射位置Ｐを対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）に近づく方向に移動させる。つまり、ステージ２を対物レンズ２１の光軸２１ａに沿って対物レンズ２１に近づく方向に動かすと、試料Ｓの深い（ここでは、界面Ｓａからの距離が大きくなる方向に離れた）部分が観察位置となる。この場合、上述したように、照明光Ｌの試料Ｓに対する入射角度が一定のままであると、照野と視野との重なり面積が小さくなるため、ステージ２を光軸に沿って動かすとともに、制御部９は、角度調整部７の駆動部５２を制御し、駆動部５２によって、入射位置Ｐが対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）に近づくように保持部材５１を移動させる。また、対物レンズ２１を光軸に沿ってステージ２に近づく方向に動かしても同様に、試料Ｓの深い部分が観察位置となる。この場合にも、同様に、対物レンズ２１を光軸に沿って動かすとともに、制御部９は、角度調整部７の駆動部５２を制御し、駆動部５２によって、入射位置Ｐが対物レンズ２１の光軸２１ａ（光軸４ａ）に近づくように保持部材５１を移動させる。
　本実施形態において、図１に示した算出部５５は、対物レンズ２１の前側焦点面ＦＰの試料Ｓにおける位置に対して入射位置（例、図３の入射位置Ｐ３）の目標値を算出する。制御部９は、算出部５５の算出結果に基づいて角度調整部７を制御する。算出部５５は、例えば、入力装置４５を介して入力された情報に基づいて、瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置の目標値を算出する。
　図４（Ａ）は、本実施形態に係る算出部５５が算出する観察位置と入射角度との関係を示す図である。算出部５５は、例えばユーザーが指定した観察位置（対物レンズ２１の試料Ｓにおける前側焦点面ＦＰの位置）と照明光Ｌの入射位置Ｐとの組を２組以上用いて、他の観察位置に応じた照明光Ｌの入射位置Ｐの目標値を算出する。図４（Ａ）において、横軸は、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａを基準（０μｍ）として試料Ｓの内部を正とする観察位置（単位はμｍ）である。図４（Ａ）において、縦軸は、瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置Ｐを示す値であり、その単位は任意単位（ａ．ｕ．）である。ここでは、保持部材５１の可動範囲で規格化した例を示す。符号Ｕ１は、ユーザが指定した第１観察位置（例、約０μｍ）に対応する入射位置Ｐの目標値（約０．８９７）を示す。符号Ｕ２は、ユーザが指定した第２の観察位置（例、約４．５μｍ）に対応する入射位置Ｐ（例、約０．８４１）の目標値を示す。算出部５５は、例えば、プロットＵ１とプロットＵ２との間を補間することによって、第１観察位置と第２観察位置との間の第３観察位置に対する入射位置Ｐの目標値を算出する。具体的には、図４において算出部５５は、線形補間を用いて、Ｕ３～Ｕ１２を線形補間する。また、上記では、ユーザは、Ｕ１とＵ２を指定して、Ｕ１とＵ２との間を補間したが、例えば、ユーザは、Ｕ５とＵ１０とを指定して、Ｕ１～Ｕ４、Ｕ６～Ｕ９およびＵ１１～Ｕ１２を算出してもよい。なお、観察位置の数は、観察条件などに応じて適宜設定される。
　図４（Ｂ）は、本実施形態に係る算出部５５の動作の他の例を示す図である。本例において、算出部５５は、非線形な補間法によって、瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置Ｐを算出する。例えば、算出部５５は、プロットＵ１、Ｕ２が端点となり、かつ複数のプロットＵ１～Ｕ１２が下に凸の曲線上に配置されるように、プロットＵ１、Ｕ２の間の区間を補間する。例えば、算出部５５は、入射位置の目標値が観察位置の指数を含む関数形で表される補間法（例、γ補間）を用いて、複数のプロットＵ３～Ｕ１２を算出する。なお、算出部５５が用いる補間法は、上述の例に限定されず、折れ線状の分布となる補間法などでもよい。制御部９は、対物レンズ２１の位置に応じた入射角度に関する情報の複数の算出方法を選択可能に入出力装置４２に出力してもよい。例えば、制御部９は、補間法の複数の候補を（例、線形補間、γ補間等）表示装置４４に表示させ、ユーザは、入力装置４５を操作することにより、用いる補間法を複数の候補から選択可能でもよい。また、算出部５５は、入出力装置４２から入力された算出方法に基づいて、対物レンズ２１の位置に応じた入射角度に関する情報を算出し、制御部９は、算出部５５が算出した情報に基づいて、入射角度を変化させてもよい。また、制御部９は、ステージ２の位置に応じた入射角度に関する情報の複数の算出方法を選択可能に入出力装置４２に出力し、算出部５５は、入出力装置４２から入力された算出方法に基づいて、ステージ２の位置に応じた入射角度に関する情報を算出し、制御部９は、算出部５５が算出した情報に基づいて、入射角度を変化させてもよい。
　なお、上記図４では、横軸は、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａを基準（０μｍ）として試料Ｓの内部を正とする観察位置としたが、ステージ２の位置又は対物レンズ２１の位置としてもよい。ユーザは、第１観察位置とその入射位置Ｐの目標値と、第２観察位置とその入射位置Ｐの目標値とを指定するが、算出部５５は、第１観察位置に対応するステージ２の位置（第１ステージ位置）および第２観察位置に対応するステージ２の位置（第２ステージ位置）を取得して、第１ステージ位置とその入射位置Ｐの目標値、第２ステージ位置とその入射位置Ｐの目標値とを関連づけてもよい。この場合、算出部５５は、ステージ２の位置に応じた入射位置Ｐの目標値を算出する。このとき、上記図４において、横軸はステージ２の絶対座標位置でもよいし、第１ステージ位置を基準としてもよい。同様に、ユーザは、第１観察位置とその入射位置Ｐの目標値と、第２観察位置とその入射位置Ｐの目標値とを指定するが、算出部５５は、第１観察位置に対応する対物レンズ２１の位置（第１対物レンズ位置）および第２観察位置に対応する対物レンズ２１の位置（第２対物レンズ位置）を取得して、第１対物レンズ位置とその入射位置Ｐの目標値、第２対物レンズ位置とその入射位置Ｐの目標値とを関連づけてもよい。この場合、算出部５５は、対物レンズ２１の位置に応じた入射位置Ｐの目標値を算出する。このとき、上記図４において、横軸は対物レンズ２１の絶対座標位置でもよいし、第１対物レンズ位置を基準としてもよい。
　制御部９は、算出部５５の算出結果に基づいて角度調整部７を制御する。この場合、制御部９は、予め記憶装置４３に記憶された入射位置Ｐに対応する保持部材５１の位置を用いて、角度調整部７を制御する。
　なお、上記図４では、縦軸は、瞳面ＰＵ１上の照明光Ｌの入射位置Ｐとしたが、保持部材５１の位置としてもよい。この場合、ユーザは、第１観察位置とその保持部材５１の位置と、第２観察位置とその保持部材５１の位置とを指定し、算出部５５は、観察位置に応じた保持部材５１の位置を算出する。この場合、入射位置Ｐに対応する保持部材５１の位置を予め記憶装置４３記憶しておく必要はない。
　なお、制御部９は、対物レンズ２１の位置に応じた入射角度に関する情報（以下、第１の参照情報という）に基づいて、入射角度を変化させてもよい。第１の参照情報は、例えば、対物レンズ２１の絶対位置情報に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。絶対位置情報は、例えば、予め定められた基準位置に対する対物レンズ２１の位置の情報であり、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向（Ｚ方向）の座標などである。例えば、基準位置は顕微鏡１の電源を入れた時等に制御部９によって定められるものである。この場合、第１の参照情報として、例えば、対物レンズ２１の絶対位置と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。また、第１の参照情報は、対物レンズ２１の移動量に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。この場合、第１の参照情報として、例えば、対物レンズ２１の移動量と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。また、第１の参照情報は、ステージ２に対する対物レンズ２１の相対位置情報に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。この相対位置情報は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向（Ｚ方向）における、ステージ２の座標と対物レンズ２１の座標との差の情報である。この場合、第１の参照情報として、例えば、ステージ２の位置を基準とする対物レンズ２１の絶対位置と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。
　なお、制御部９は、ステージ２の位置に応じた入射角度に関する情報（以下、第２の参照情報という）に基づいて、入射角度を変化させてもよい。第２の参照情報は、例えば、ステージ２の絶対位置情報に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。絶対位置情報は、例えば、予め定められた基準位置に対するステージ２の位置の情報であり、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向（Ｚ方向）におけるステージ２の座標などである。例えば、基準位置は顕微鏡１の電源を入れた時等に制御部９によって定められるものである。この場合、第２の参照情報として、例えば、ステージ２の絶対位置と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。また、第２の参照情報は、ステージ２の移動量に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。この場合、第２の参照情報として、例えば、ステージ２の移動量と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。また、第２の参照情報は、対物レンズ２１に対するステージ２の相対位置情報に関連づけられた入射角度に関する情報でもよい。この相対位置情報は、例えば、対物レンズ２１の光軸２１ａの方向（Ｚ方向）における、ステージ２の座標と対物レンズ２１の座標との差の情報である。この場合、第２の参照情報として、例えば、対物レンズ２１の位置を基準とするステージ２の絶対位置と入射角度との関係を示す関数（例、数式、数値テーブル）を用いることができる。
　以下、上述の顕微鏡１の構成に基づき、実施形態に係る観察方法を説明する。図５は、実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１で、ユーザは、入力装置４５を用いて観察条件を設定する。観察条件は、例えば、第１観察位置（観察位置の下限）およびその際の入射位置、第２観察位置（観察位置の上限）およびその際の入射位置、並びに対物レンズ２１の光軸方向における観察位置の数などである。ここで、ユーザは、保持部材５１を移動させて入射位置を変更して撮像された複数の画像のコントラスト、光強度等に基づいて、第１観察位置および第２観察位置における最適な入射位置を決定する。上記の観察条件は、例えば、予め記憶部４３に記憶されていてもよい。
　ステップＳ２において、算出部５５は、観察位置と入射位置の関係を算出する。例えば、算出部５５は、観察条件に定められた第１観察位置、第２観察位置、及び対物レンズ２１の光軸方向における観察位置の数を用いて、第１観察位置と第２観察位置との間の観察位置を算出する。また、算出部５５は、例えば図４に示したように、第１観察位置の場合の入射位置と、第２観察位置の場合の入射位置を用いて、その間の各観察位置における入射位置を算出する。
　ステップＳ３において、顕微鏡１は、例えばユーザの指令により、観察に関する動作を開始する。ステップＳ４において、制御部４１は、ステージ２を制御し、ステージ２を第１観察位置に応じた位置に移動させる。ステップＳ５において、制御部４１は、観察位置と入射角度との関係を用いて、保持部材５１を移動させる。ステップＳ６において、制御部４１は、照明光学系４から照明光が試料Ｓに照射された状態で、第１の観察光学系５が形成した像を撮像部６に撮像させ、画像を取得させる。ステップＳ７において、制御部４１は、全ての観察位置に対して画像の取得が完了したか否かを判定する。制御部４１は、ステップＳ１において観察条件に設定された観察位置の一部が完了していないと判定した場合（ステップＳ７；Ｎｏ）、ステップＳ８において、ステージ２を次の観察位置に応じた位置へ移動させ、ステップＳ５からステップＳ７の処理を繰り返し行う。また、制御部４１は、全ての観察位置に対する画像の取得が完了したと判定した場合（ステップＳ７；Ｙｅｓ）、一連の処理を終了する。上記では、ステップＳ２において、算出部５５は、観察位置と入射位置の関係を算出したが、観察位置と入射位置の関係は、予め記憶装置４３に記憶しておいてもよい。この場合、ステップＳ２は省略される。
［第２実施形態］
　第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。本実施形態において、顕微鏡１の構成は図１と同様であるが、算出部５５の動作が第１実施形態と異なる。
　図６は、第２実施形態に係る算出部５５が算出する観察位置と入射角度との関係を示す図である。第２実施形態では、第１実施形態と異なり、ユーザは、観察位置（対物レンズ２１の試料Ｓにおける前側焦点面ＦＰの位置）と照明光Ｌの入射位置Ｐとの組を指定する必要がなく、算出部５５は、予め決められた観察条件に基づいて、観察位置と入射位置Ｐの目標値との関係を、図６の符号Ｄ１に示すように算出する。上記の観察条件は、例えば、試料Ｓと対物レンズ２１との間の屈折率（例：透明部材の屈折率、浸液の屈折率）、試料Ｓの屈折率、対物レンズの種類、環境の温度、カバーガラス２ａの厚さなどを含む。ユーザは、観察位置（対物レンズ２１の試料Ｓにおける前側焦点面ＦＰの位置）と照明光Ｌの入射位置Ｐを指定する場合、その観察位置で入射角度Ｐを変化させ、画像を複数枚取得して、最適な入射位置Ｐを決定する必要があるが、第２実施形態では、その手間を省くことができる。なお、算出部５５は、例えば、収差、エバネッセント場の影響などを考慮して、例えば、試料Ｓと透明部材２ａとの界面Ｓａに近い領域については、図６の符号Ｄ２に示すように算出してもよい。
［第３実施形態］
　第３実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。本実施形態において、顕微鏡１の構成は図１と同様であるが、算出部５５の動作が第１実施形態と異なる。
　第１実施形態では、ユーザは、観察位置（対物レンズ２１の試料Ｓにおける前側焦点面ＦＰの位置）と照明光Ｌの入射位置Ｐとの組（符号Ｕ１、Ｕ２等）を指定したが、本実施形態では、入射位置Ｐを指定する必要がない。言い換えると、ユーザは、観察位置（対物レンズ２１の試料Ｓにおける前側焦点面ＦＰの位置）を指定することにより、算出部５５は、観察位置と入射位置Ｐとの関係を算出する。例えば、ユーザにより第１観察位置が指定されると、制御部９は、駆動部５２を制御し、保持部材５１を移動させ、指定された観察位置において、異なる入射位置Ｐで照明された試料Ｓの複数の画像を撮像部６に撮像させる。、算出部５５は、入射位置Ｐを変化させる毎に検出される試料Ｓからの光に関する情報に基づいて、ユーザにより入力された第１観察位置に対応する入射位置Ｐの目標値を決定する。例えば、算出部５５は、試料Ｓからの光の強度またはコントラストが最も大きい入射位置Ｐを、第１観察位置における入射位置Ｐの目標値とする。算出部５５は、同様に、第２観察位置における入射位置Ｐの目標値を算出する。さらに、算出部５５は、第１観察位置および第２観察位置以外の観察位置（例：Ｕ３～Ｕ１２等）についても同様に、入射位置Ｐを変化させる毎に検出される試料Ｓからの光に関する情報に基づいて、入射位置Ｐの目標値を算出してもよい。この場合、Ｕ１とＵ２からＵ３～Ｕ１２を線形補間する場合に比べ、より精度よく観察位置と入射位置Ｐとの関係を算出することができる。第１実施形態では、ユーザは、観察位置に対応する入射位置Ｐの目標値を指定する必要があったが、第３実施形態では、算出部５５が、ユーザが指定した観察位置に対応する入射位置Ｐを算出するため、ユーザの手間を省くことができる。
［第４実施形態］
　第４実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図７は、本実施形態に係る顕微鏡１を示す図である。本実施形態に係る顕微鏡は、例えば、ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等のSingle-molecule Localization Microscopy法を利用した顕微鏡である。実施形態に係る顕微鏡は、１種類の蛍光物質で標識（ラベル）された試料の蛍光観察、及び２種類以上の蛍光物質で標識された試料の蛍光観察のいずれにも利用できる。また、実施形態に係る顕微鏡は、例えば、２次元の超解像画像を生成するモード、及び３次元の超解像画像を生成するモードを有し、２つのモードを切り替え可能であるが、２つのモードの片方のみを有するものでもよい。本実施形態では、標識に用いられる蛍光色素（例、レポータ色素）が２種類である形態について説明するが、蛍光色素（例、レポータ色素）の数は１種類でもよいし、３種類以上でもよい。
　試料は、生きた細胞（ライブセル）を含むものでもよいし、ホルムアルデヒド溶液等の組織固定液を用いて固定された細胞を含むものでもよく、組織等でもよい。蛍光物質は、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料等の蛍光色素でもよいし、蛍光タンパク質でもよい。蛍光色素は、活性化された状態（以下、活性化状態という）で励起光を受けた場合に蛍光を発するレポータ色素を含む。また、蛍光色素は、活性化光を受けてレポータ色素を活性化状態にするアクティベータ色素を含む場合がある。蛍光色素がアクティベータ色素を含まない場合、レポータ色素は、活性化光を受けて活性化状態になる。蛍光色素は、例えば、２種類のシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料を結合させた染料対（例、Ｃｙ３－Ｃｙ５染料対（Ｃｙ３、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ２－Ｃｙ５染料対（Ｃｙ２、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７染料対（Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））、１種類の染料（例、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））である。蛍光タンパク質は、例えばＰＡ－ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａなどである。
　本実施形態において、照明光学系４は、蛍光物質（例、レポータ色素）に応じた２種類の波長の励起光を試料Ｓに照射する。光源装置３は、活性化光源１１ａ、励起光源１１ｂ、励起光源１１ｃ、シャッタ１２ａ、シャッタ１２ｂ、シャッタ１２ｃ、ミラー６１、ダイクロイックミラー６２、及びダイクロイックミラー６３を備える。
　活性化光源１１ａは、照明光として、試料Ｓに含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光Ｌ０を発する。ここでは、蛍光物質がレポータ色素を含み、アクティベータ色素を含まないものとする。蛍光物質のレポータ色素は、活性化光Ｌ０が照射されることで、蛍光を発することが可能な活性化状態となる。活性化光Ｌ０の波長は、例えば、４０５ｎｍである。蛍光物質は、レポータ色素およびアクティベータ色素を含むものでもよく、この場合、アクティベータ色素は、活性化光Ｌ０を受けた場合にレポータ色素を活性状態にする。なお、蛍光物質は、例えばＰＡ－ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａなどの蛍光タンパク質でもよい。シャッタ１２ａは、活性化光源１１ａの光出射側に配置される。シャッタ１２ａは、制御部９により制御され、活性化光源１１ａからの活性化光Ｌ０を通す状態と、活性化光Ｌ０を遮る状態とを切り替え可能である。
　励起光源１１ｂは、照明光として、第１波長の第１励起光Ｌ１を発する。シャッタ１２ｂは、励起光源１１ｂの光出射側に配置される。シャッタ１２ｂは、制御部９により制御され、励起光源１１ｂからの第１励起光Ｌ１を通す状態と、第１励起光Ｌ１を遮る状態とを切り替え可能である。励起光源１１ｃは、照明光として、第１波長と異なる第２波長の第２励起光Ｌ２を発生する。ここでは、第２波長は、第１波長よりも短波長であるとする。例えば、第１波長は６４７ｎｍであり、第２波長は５６１ｎｍである。シャッタ１２ｃは、励起光源１１ｃの光出射側に配置される。シャッタ１２ｃは、制御部９により制御され、励起光源１１ｃからの第２励起光Ｌ２を通す状態と、第２励起光Ｌ２を遮る状態とを切り替え可能である。
　ミラー６１は、シャッタ１２ｃの光出射側に配置される。シャッタ１２ｃを通った第２励起光Ｌ２は、ミラー６１で反射してダイクロイックミラー６２に入射する。ダイクロイックミラー６２は、シャッタ１２ｂの光出射側に配置される。ダイクロイックミラー６２は、第２励起光Ｌ２が透過し、第１励起光Ｌ１が反射する特性を有する。ダイクロイックミラー６２で反射した第１励起光Ｌ１、及びダイクロイックミラー６２を透過した第２励起光Ｌ２は、同じ光路を通ってダイクロイックミラー６３に入射する。ダイクロイックミラー６３は、シャッタ１２ａの光出射側に配置される。ダイクロイックミラー６３は、第１励起光Ｌ１および第２励起光Ｌ２が反射する特性を有し、活性化光Ｌ０が透過する特性を有する。第１励起光Ｌ１および第２励起光Ｌ２は、活性化光Ｌ０と同じ光路を通って、試料Ｓに照射される。
　角度調整部７は、例えば、照明光の波長に応じて照明光の入射角度を調整してもよい。例えば、活性化光Ｌ０に最適な入射角度としてもよいし、第１励起光Ｌ１に最適な入射角度としてもよいし、第２励起光Ｌ２に最適な入射角度でもよいし、これらのうちの最小角度と最大角度との間の角度を、入射角度としてもよい。第１励起光Ｌ１が照射される場合に、第１励起光Ｌ１の波長に最適な入射角度になるように設定し、第２励起光Ｌ２が照射される場合には、第２励起光Ｌ２の波長に最適な入射角度に再設定してもよい。なお、活性化光Ｌ０は、必ずしも斜光照明する必要はない。
　画像処理部５６は、撮像部６の撮像結果を用いて、個々の像の重心位置を求めるなどの画像処理を行う。制御部９は、撮像部６に複数のフレーム期間で撮像させ、画像処理部５６は、複数のフレーム期間で得られた撮像結果の少なくとも一部を用いて１枚の画像を生成する。例えば、画像処理部５６は、複数の撮像画像のそれぞれについて、各画像に含まれる蛍光の像（点像）の重心位置を算出する。例えば、画像処理部５６は、撮像画像において点像に対応する領域の画素値の分布に対してガウシアンフィッティングを行うことにより、重心位置を算出する。画像処理部５６は、例えば、蛍光の像の重心位置を輝点で表し、複数の撮像画像に含まれる複数の蛍光の像に応じた複数の輝点の少なくとも一部を用いて（マージして）１枚の画像（例、超解像画像）を生成する。
　第１の観察光学系５は、非点収差光学系（例、シリンドリカルレンズ６５）を備える。シリンドリカルレンズ６５は、試料Ｓからの蛍光の少なくとも一部に作用し、蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる。すなわち、シリンドリカルレンズ６５などの非点収差光学系は、蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させて、非点隔差を発生させる。シリンドリカルレンズ６５は、試料Ｓと撮像部６（例、撮像素子４０）との間の光路に挿脱可能に設けられる。画像処理部５６は、例えば、非点収差を用いて、試料Ｓの深さ方向（対物レンズ２１の光軸２１ａ、すなわち第１の観察光学系５の光軸５ａ方向）における蛍光物質の位置を算出する。画像処理部５６は、例えば、楕円ガウシアンフィッティングを行うことにより、試料Ｓにおける蛍光物質の位置を算出することができる。なお、図７に示されるように、シリンドリカルレンズ６５は、挿脱可能に設けられている。
　図８は、本実施形態に係る照明と撮像のシーケンスの一例を示す図である。図９は、画像処理部５６が生成する画像の例を概念的に示す図である。なお、以下、図４、図６等に示される観察位置と入射位置Ｐとの関係は、算出部５５により予め算出されているものとして説明する。制御部９は、ステージ２を対物レンズ２１の光軸２１ａに沿って動かして所定の観察位置（図８のＺ０）に設定する。また、制御部９は、図４、図６等に示される観察位置と入射位置Ｐとの関係を用いて、角度調整部７の駆動部５２を制御し、第１画像生成期間Ｔ１において入射位置がＰ０－１になるように保持部材５１を移動させ、第２画像生成期間Ｔ２において入射位置がＰ０－２になるように保持部材５１を移動させる。制御部９は、所定の観察位置（図９のＺ０）において、以下の通り、撮像シーケンスを実行する。
　制御部９は、画像生成期間Ｔ１において、第１励起光（第１励起光Ｌ１）を照射させ、第２励起光（第２励起光Ｌ２）を照射させない。また、制御部９は、画像生成期間Ｔ１において、活性化光Ｌ０も照射させる。また、制御部９は、画像生成期間Ｔ１の複数のフレーム期間Ｔｆのそれぞれにおいて、撮像部６に撮像させる（図中の第１撮像処理；ＯＮ）。制御部９は、画像生成期間Ｔ１の次の画像生成期間Ｔ２において、第２励起光を照射させ、第１励起光を照射させない。また、制御部９は、画像生成期間Ｔ２において、活性化光Ｌ０も照射させる。また、制御部９は、画像生成期間Ｔ２の複数のフレーム期間Ｔｆのそれぞれにおいて、撮像部６に撮像させる（図中の第２撮像処理；ＯＮ）。活性化光Ｌ０の強度は、例えば、蛍光物質に応じて調整される。例えば、活性化光Ｌ０の強度は、第２励起光の照射時に、第１励起光の照射時よりも強く設定される。例えば、制御部９は、音響光学素子１３を制御し、活性化光の強度を調整する。
　画像処理部５６は、画像生成期間Ｔ１における複数の第１撮像処理により得られる撮像結果（例、撮像画像）の少なくとも一部を用いて、第１の画像Ｐａ０を生成する。また、画像処理部５６は、画像生成期間Ｔ２における複数の第２撮像処理により得られる撮像結果（例、撮像画像）の少なくとも一部を用いて、第２の画像Ｐｂ０を生成する。２種類の蛍光物質（例、レポータ色素）は、試料Ｓにおいて異なる小器官などに標識されており、第１の画像Ｐａ０と第２の画像Ｐｂ０とで異なる小器官などの画像が得られる。画像処理部５６は、例えば、第１の画像Ｐａ０および第２の画像Ｐｂ０を合成して、図９（Ｃ）に示すように１枚の画像Ｐｔ０を生成することができる。
　なお、画像処理部５６は、第１の画像Ｐａ０および第２の画像Ｐｂ０を用いずに、１枚の画像Ｐｔ０を生成してもよい。例えば、画像処理部５６は、複数の第１撮像処理により得られる撮像結果の少なくとも一部と、第２撮像処理により得られる撮像結果の少なくとも一部とを用いて、１枚の画像Ｐｔ０を生成してもよい。また、画像処理部５６は、画像Ｐｔ０を生成しなくてもよい。
　次に、制御部９は、ステージ２を対物レンズ２１の光軸２１ａに沿って動かして次の観察位置（図８のＺ１）に設定する。また、制御部９は、図４、図６等に示される観察位置と入射位置Ｐとの関係を用いて、角度調整部７の駆動部５２を制御し、第１画像生成期間Ｔ１において入射位置がＰ１－１になるように保持部材５１を移動させ、第２画像生成期間Ｔ２において入射位置がＰ１－２になるように保持部材５１を移動させる。制御部９は、この観察位置においても、上述した撮像シーケンスを実行し、第１の画像Ｐａ１、第２の画像Ｐｂ１、画像Ｐｔ1が得られる。このように、図８に示すように、観察位置Ｚ０～Ｚｎそれぞれにおいて、第１の画像Ｐａ０～Ｐａｎ、第２の画像Ｐｂ０～Ｐｂｎ画像Ｐｔ0～Ｐｔ nが得られる。
　例えば、画像処理部５６は、図９（Ａ）に示すように、第１の画像Ｐａ0～Ｐａnを用いて、３次元画像画像Ｐａを生成可能である。また、画像処理部５６は、図９（Ｂ）に示すように、第２の画像Ｐｂ0～Ｐb nを用いて、３次元画像画像Ｐｂを生成可能である。画像処理部５６は、例えば３次元画像画像Ｐａと３次元画像画像Ｐｂとを合成することで、３次元画像（例、図９（Ｃ）の３次元画像Ｐｔ）を生成可能である。また、画像処理部５６は、図９（Ｃ）に示すように、第１の画像Ｐａ0および第２の画像Ｐｂ0を用いて、画像Ｐｔ0を生成可能であり、同様にして画像Ｐｔ１～Ｐｔｎを生成可能である。画像処理部５６は、画像Ｐｔ０～Ｐｔｎを用いて３次元画像画像Ｐｔを生成することもできる。なお、第１の画像Ｐａ0～Ｐａnおよび第２の画像Ｐｂ0～Ｐb nそれぞれは、３次元画像であるが、図７においてシリンドリカルレンズ６５を光路から退避させた場合は、2次元画像となる。
　本実施形態では、観察位置Ｚ0～Ｚnそれぞれにおいて、励起光（第１励起光、第２励起光）の試料への入射角度が最適に設定されるため、高精度の画像を得ることができる。　
　なお、本実施形態では、ステージ２を動作させて、それぞれの観察位置Ｚ0～Ｚnにおいて、画像生成期間Ｔ１および画像生成期間Ｔ２を実行したが、それぞれの観察位置Ｚ0～Ｚnにおいて、画像生成期間Ｔ１のみを実行してもよい。この場合、再度、ステージ２を動作させて、それぞれの観察位置Ｚ0～Ｚnにおいて、画像生成期間Ｔ２のみを実行すればよい。
　高解像度の画像が生成可能である、ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等のSingle-molecule Localization Microscopyにおいて、照明光の試料に対する入射角度ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させることは、特に有用である。照明光の試料に対する入射角度を変化させない場合、解像度が低下してしまう可能性があるが、本実施形態のように、照明光の試料に対する入射角度を適切に変化させることにより、Single-molecule Localization Microscopyにおいて、例えば、蛍光の像に相当する光強度の分布が歪むことを抑制することができる。したがって、例えば蛍光の像の重心位置を高精度に求めることができ、厚みのある試料の断面画像についても高解像度で取得することができる。
［第５実施形態］
　第５実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。本実施形態において、顕微鏡１の構成は図１と同様であるが、制御部９の動作が第１実施形態と異なる。本実施形態において、制御部９は、ステージ２および対物レンズ２１の少なくとも一方を移動させる場合に、異なる複数の入射角度で撮像部６に複数の画像を撮像させる。例えば、制御部９は、ステージ２と対物レンズ２１とが第１の相対位置で配置された状態で、１つの入射角度に対して１または２以上の画像を撮像部６に撮像させ、複数の入射角度のそれぞれに対しても１または２以上の画像を撮像部６に撮像させる。制御部９は、入射角度が異なる複数の画像に基づいて、第１の相対位置に対応する入射角度を決定してもよい。例えば、制御部９は、入射角度が異なる複数の画像のうち、輝度値が最も高い画像に対応する入射角度を、第１の相対位置における入射角度として採用してもよい。また、画像処理部５６は、入射角度が異なる複数の画像から、画像処理に用いる画像を選択してもよい。例えば、画像処理部５６は、入射角度が異なる複数の画像のうち、輝度値が所定の範囲内に収まる画像を選択し、選択した画像のみを用いて画像処理（例、図８に示した第１の画像Ｐａ０の生成処理）を行ってもよい。
　また、制御部９は、ステージ２と対物レンズ２１とが第１の相対位置と異なる第２の相対位置で配置された状態で、１つの入射角度に対して１または２以上の画像を撮像部６に撮像させ、複数の入射角度のそれぞれに対しても１または２以上の画像を撮像部６に撮像させてもよい。画像処理部５６は、入射角度が異なる複数の画像のうち、輝度値が所定の範囲内に収まる画像を選択し、選択した画像のみを用いて画像処理（例、図８に示した第１の画像Ｐａ１の生成処理）を行ってもよい。また、制御部９は、第２の相対位置に関しても第１の相対位置と同様に、第２の相対位置に対応する入射角度を決定してもよい。また、算出部５５は、第１の相対位置用の入射角度と、第２の相対位置用の入射角度とを用いて、第１の相対位置と第２の相対位置との間の第３の相対位置用の入射角度を算出してもよい。
　上述の実施形態において、制御部９は、例えばコンピュータシステムを含む。制御部９は、記憶装置４３に記憶されているプログラムを読み出し、このプログラムに従って各種の処理を実行する。このプログラムは、例えば、試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、を備え、試料を保持するステージおよび対物レンズの少なくとも一方を、対物レンズの光軸と同じ方向に移動可能な顕微鏡の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって制御は、ステージおよび対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、照明光の試料に対する入射角度を変化させることを含む。このプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記録されて提供されてもよい。
　なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。
１・・・顕微鏡、４・・・照明光学系、４ａ・・・光軸、５・・・結像光学系、７・・・角度調整部、９・・・制御部、１６・・・導光部材、２１・・・対物レンズ、４５・・・入力装置、５２・・・駆動部、５５・・・算出部、ＦＰ１・・・焦点面、ＦＰ２・・・焦点面、Ｌ・・・照明光、ＬＦ１・・・照野、ＬＦ２・・・照野、ＬＦ３・・・照野、ＰＵ１・・・瞳面、ＰＵ２・・・瞳共役面、Ｓ・・・試料

Claims (19)

  1. 　試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、
    　対物レンズを有する観察光学系と、
    　前記試料を保持するステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を、前記対物レンズの光軸と同じ方向に移動させる制御部と、
    　前記観察光学系において形成された像を撮像する撮像部と、を備える顕微鏡であって、
    　前記制御部は、前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、前記照明光の前記試料に対する入射角度を変化させることを特徴とする、顕微鏡。
  2. 　前記制御部は、前記照明光の波長に応じて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
  3. 　前記照明光学系は、前記対物レンズを含み、前記対物レンズを介して、前記照明光を前記試料に入射させることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
  4. 　前記制御部は、
    　前記対物レンズの光軸の方向において前記対物レンズと前記試料との距離が小さくなるように前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動する場合に、前記入射角度が小さくなるように変化させる、請求項３に記載の顕微鏡。
  5. 　前記制御部は、前記照明光の前記対物レンズの瞳面における入射位置を調整することにより、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項４に記載の顕微鏡。
  6. 　前記制御部は、前記入射位置を、前記対物レンズの光軸と直交する面内において変化させることを特徴とする、請求項５に記載の顕微鏡
  7. 　前記制御部は、前記対物レンズの位置に応じた前記入射角度に関する情報に基づいて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項３から請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  8. 　入出力装置を備え、
    　前記制御部は、前記対物レンズの位置に応じた前記入射角度に関する情報の複数の算出方法を選択可能に前記入出力装置に出力し、
    　前記入出力装置から入力された前記算出方法に基づいて、前記対物レンズの位置に応じた前記入射角度に関する情報を算出し、算出した情報に基づいて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項７に記載の顕微鏡。
  9. 　前記制御部は、
    　予め決められた前記対物レンズの第１の位置に対応する第１の入射角度に関する情報と、前記第１の位置とは異なる第２の位置に対応する第２の入射角度に関する情報とに基づいて、前記対物レンズの位置に応じた前記入射角度に関する情報を決定し、前記決定した情報に基づいて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項６又は請求項７に記載の顕微鏡。
  10. 　前記制御部は、前記ステージの位置に応じた前記入射角度に関する情報に基づいて、前記照明光の入射角度を変化させることを特徴とする、請求項３から請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  11. 　入出力装置を備え、
    　前記制御部は、前記ステージの位置に応じた前記入射角度に関する情報の複数の算出方法を選択可能に前記入出力装置に出力し、
    　前記入出力装置から入力された前記算出方法に基づいて、前記ステージの位置に応じた前記入射角度に関する情報を算出し、算出した情報に基づいて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項１０に記載の顕微鏡。
  12. 　前記制御部は、
    　予め決められた前記ステージの第１の位置に対応する第１の入射角度に関する情報と、前記第１の位置とは異なる第２の位置に対応する第２の入射角度に関する情報とに基づいて、前記ステージの位置に応じた前記入射角度に関する情報を決定し、前記決定した情報に基づいて、前記入射角度を変化させることを特徴とする、請求項１０又は請求項１１に記載の顕微鏡。
  13. 　前記制御部は、前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、異なる複数の入射角度で前記撮像部に複数の画像を撮像させることを特徴とする、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  14. 　前記照明光学系は、前記照明光を導光する導光部材を有し、
    　前記制御部は、前記導光部材の位置を移動させることにより、前記入射位置を変化させることを特徴とする、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  15. 　前記試料に対する入射角度に関する情報は、前記導光部材の位置に関する情報を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の顕微鏡。
  16. 　前記照明光は、前記試料に含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光と、前記活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光とを含み、
    　前記制御部は、前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、前記励起光の前記試料に対する入射角度を変化させることを特徴とする、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  17. 　試料が載置されるステージと、
    　試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、
    　対物レンズを有する観察光学系と、
    　前記試料を保持するステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を、前記対物レンズの光軸と同じ方向に移動させる制御部と、
    　前記対物レンズを介して前記試料の撮像を行う撮像装置と、
    　前記対物レンズの光軸方向における観察位置毎の撮像条件を記憶する記憶部と、を備え、
    　前記撮像条件は、前記照明光の試料への入射角度に関する情報を含み、
    　前記制御部は、前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、前記撮像条件に基づいて、前記照明光の前記試料に対する入射角度を変化させることを特徴とする、顕微鏡。
  18. 　試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、を備え、前記試料を保持するステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を、前記対物レンズの光軸と同じ方向に移動可能な顕微鏡を用いる観察方法であって、
    　前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、前記照明光の前記試料に対する入射角度を変化させることを含むことを特徴とする、観察方法。
  19. 　試料に対して斜方から照明光を照射する照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系と、を備え、前記試料を保持するステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を、前記対物レンズの光軸と同じ方向に移動可能な顕微鏡の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって、
    　前記制御は、前記ステージおよび前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる場合に、前記照明光の前記試料に対する入射角度を変化させることを含むことを特徴とする、制御プログラム。
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