JP6370792B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は一般的に、タンパク質の精製方法に関する。より詳細には、本発明は、同じ開始材料からのハプトグロビンおよびヘモペキシンの精製方法ならびにそれらの使用に関する。

溶血は、赤血球細胞の破壊を特徴とし、酵素欠損、ヘモグロビン異常症、遺伝性球状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症および棘細胞性貧血などの赤血球細胞異常、ならびに脾腫、自己免疫疾患（例えば、新生児溶血性疾患）、遺伝性障害（例えば、鎌状赤血球症またはＧ６ＰＤ欠損症）、微小血管症性溶血、グラム陽性菌感染（例えば、ストレプトコッカス、エンテロコッカスおよびスタフィロコッカス）、寄生生物感染（例えば、マラリア原虫）、毒素および外傷（例えば、熱傷）などの外因子に関連した貧血障害の指標である。溶血はまた、輸血、特に大量輸血および体外心肺補助を使用する患者における一般的な障害である。

溶血に関連した症状を有する患者に見られる有害作用は、主として赤血球細胞からの鉄ならびにヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘムなどの鉄含有化合物の放出に起因する。生理学的条件下では、放出されたヘモグロビンは、ハプトグロビンなどの可溶性タンパク質に結合し、マクロファージおよび肝細胞に輸送される。しかし、溶血の頻度が加速し、病的な状態になると、ハプトグロビンの緩衝能力は完全に消失する。結果として、ヘモグロビンは迅速にフェリヘモグロビンに酸化され、次々に遊離ヘム（プロトポルフィリンＩＸおよび鉄を含む）を放出する。ヘムは数々の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすが（例えば、ヘモグロビンおよびミオグロビンなどの必須タンパク質の一部として）、遊離ヘムは毒性が高い。遊離ヘムは、脂質膜、タンパク質および核酸に損傷を与える毒性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する酸化還元活性鉄の原料である。ヘムの毒性はさらに、脂質膜に入り込む能力によって増大し、膜成分の酸化を引き起こし、細胞溶解および死を促進する。

低レベルの細胞外Ｈｂ／ヘムに継続的に曝露することによる進化的圧力によって、生理学的定常状態においておよび軽度溶血の間に遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用を制御する代償機構が導かれた。これらの系には、Ｈｂ捕捉ハプトグロビン（Ｈｐ）およびヘム捕捉タンパク質ヘモペキシン（Ｈｘ）およびα１−ミクログロブリンを含むＨｂまたはヘムに結合する血漿タンパク質の一群の放出が含まれる。しかし、内在性ＨｐおよびＨｘは、生理学的定常状態における遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用は制御するが、溶血に関連した症状などの病態生理学的状態においては、Ｈｂ／ヘムの定常状態レベルを維持することにはほとんど効果がない。

本発明は、同じ開始材料からＨｐおよびＨｘを精製する方法を提供する。精製したタンパク質は、溶血に関連した症状および異常なＨｂ／ヘムレベルを治療するための組成物において使用することができる。

本発明の一態様では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって、
（ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
（ｉｉ）該溶液に硫酸アンモニウムを添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
（ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
（ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンを含む組成物を提供する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む組成物を提供する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンおよび本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。

本発明の別の態様では、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシン含量が全タンパク質の少なくとも８０％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシンおよびハプトグロビンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％である組成物を提供する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示したように、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む製剤を提供する。

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する方法であって、本明細書で開示したように、本発明の組成物または製剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する医薬品の製造における、本明細書で開示したような本発明の組成物または製剤の使用を提供する。

コーン分画法の流れ図を示した図である。当業者であれば、図１に記載した方法のパラメータ（例えば、ｐＨ、エタノール濃度、温度など）の変動もコーン画分を生成するために使用できることを認識する。 硫酸アンモニウム２．０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍおよび４．０Ｍの存在下での沈殿後の残存濾液中におけるトランスフェリン（ＴＲＦ）、アルブミン（Ａｌｂ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）およびハプトグロビン（ＨＡＰ）の回収を示した図である。 実験計画法（ＤＯＥ）の望ましさのプロット（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を示した図で、溶液中にヘモペキシンを維持しながら血漿画分からハプトグロビンを沈殿させる望ましい条件を示す。ＤＯＥは、ハプトグロビンからヘモペキシンを分離する能力に対するｐＨおよび硫酸アンモニウム濃度の影響を評価するために使用した一連の制御実験である。要因数学的設計（Ａ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｄｅｓｉｇｎ）を使用してデータを設計し、分析した。図３で示した望ましさのプロットは、ヘモペキシンおよびハプトグロビン両方の最良の分離および回収をもたらす最も望ましい条件を決定するためにこの数学的設計を使用した。 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後に回収されたヘモペキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予め形成した１０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ、ＥＣ６０７５）を使用して実施した。試料は全て、トリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液（ＬＣ２６７６）中０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、各試料２０μＬをゲルのサンプルウェルに添加した。泳動時間および電圧は、ゲル製造者の推奨（１２５Ｖ一定）に設定した。各ゲルは、クーマシーブリリアントブルー染色溶液の種類（Ｎｏｖｅｘ、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ、ＬＣ６０６５）を使用して容易に染色した。レーン１（ＬＭＷＳ）はＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ非染色タンパク質標準物ＬＣ５８０１を含有する。 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後に回収されたハプトグロビン中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である（図４で前述した方法を使用）。レーン２のハプトグロビン標準物はＢｅｎｅｓｉｓ（Ｔ０４３ＨＰＸ）から入手した。 １０％トリス−グリシン非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルでのＣａｐｔｏ Ｑ溶出液のウェスタンブロットを示した図である（図４で記載した方法を使用）。分離されたタンパク質は、次にニトロセルロース膜に移し、抗体のいかなる非特異的結合も防ぐために膜をブロックする。次に、ニトロセルロース膜をヒトハプトグロビンに対する抗体（ウサギ抗ヒトハプトグロビン、Ｓｉｇｍａ Ｈ８６３６）を含有する溶液でインキュベートする。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した２次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ Ａ６１５４）でニトロセルロース膜をインキュベートした。その後、ニトロセルロースを、過酸化物を含有する溶液で発色させ、それによってヒトハプトグロビンを特異的に含有するタンパク質バンドのみを視覚化する。レーンは、異なる濃度のＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液（Ｔ０２０９００１）を含有する（レーン２−１：１０希釈、０．１ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ添加；レーン３−１：２０；レーン４−１：４０；レーン５−１：８０；レーン６−１：１６０；レーン７−１：３２０；レーン８−１：６４０；レーン９ １：１２８０；およびレーン１０−１：２５６０）。ウェスタンブロットは、Ｃａｐｔｏ Ｑ溶出液中に存在するバンドのほとんどがハプトグロビンであることを示唆している。 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後にイオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ）から回収されたトランスフェリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である（図４で前述した方法を使用）。ピーク１（レーン４）は大量に添加されているが、純粋なトランスフェリンのように見える（レーン２、ヒトトランスフェリン、Ｓｉｇｍａ Ｔ８１５８と比較）。これは、オクチルセファロース洗浄画分からトランスフェリンを精製することが可能であることを示しており、同じ開始材料からヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを精製することが可能であることも意味する。 本明細書で開示した精製方法におけるイオン交換クロマトグラフィーカラムからのトランスフェリン直線勾配のクロマトグラムを示した図である。１から４で標識したピークは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 本明細書で開示した１実施形態によるヘモペキシンの精製方法の流れ図である。 本明細書で開示した１実施形態によるハプトグロビンの精製方法の流れ図である。 本明細書で開示した１実施形態によるハプトグロビン／ヘモペキシン／トランスフェリンを一緒に精製する方法の流れ図である。

本明細書を通じて、文脈で特に必要とされない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｍｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を含むが、いかなるその他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群も排除しないことを意味するものと理解されたい。

本明細書は、いかなる先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知のいかなる事項も参照するが、このような参照は、先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知の事項が、本明細書が関与する開発分野において共通の一般的知識の一部を構成するということを認識または承認または何らかの形態で示唆すると捉えられるものではなく、かつ捉えられるべきではない。

本明細書で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確に記載していなければ、複数の態様を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「樹脂（ａ ｒｅｓｉｎ）」というと単一の樹脂、ならびに２種以上の樹脂を含み；「組成物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」というと単一の組成物ならびに２種以上の組成物を含む、などである。

反対を示すものがない場合は、本明細書を通じて「％」含量という場合、％ｗ／ｗ（重量／重量）を意味するものと捉えられるべきである。例えば、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％である溶液は、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％ｗ／ｗである組成物を意味するものと捉えられる。

本発明は、少なくとも部分的には、ハプトグロビンおよびヘモペキシンは同じ開始材料から精製することができるという発見に基づいている。したがって、本発明の一態様では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって、
（ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
（ｉｉ）該溶液に硫酸アンモニウムを添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
（ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
（ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することを含む方法を提供する。

ハプトグロビン（Ｈｐ）は、成人肝臓によって合成され、血漿中に分泌されるテトラ鎖（α_２β_２）糖タンパク質である。Ｈｐのプロペプチドは、蛋白質分解によってα鎖およびβ鎖に切断される。Ｈｐタンパク質の２個のαサブユニットおよび２個のβサブユニットは次に、鎖間ジスルフィド結合によって結合して成熟ペプチドを形成し、（αβ）二量体または（αβ）多量体のいずれかになることができる。ヘモペキシン（Ｈｘ）は、４３９アミノ酸長の１本のペプチド鎖を含む６０−ｋＤ血漿β−１Ｂ−糖タンパク質で、ドメイン間リンカーによって結合した２個のドメインを形成する。いかなる特徴付けられたヘム結合タンパク質のヘムに対しても、知る限り最も高い親和性を有し（Ｋｄ＜１ｐＭ）、ドメイン間リンカーによって形成されたポケット内において、Ｈｘの２個のドメインの間で当モル比でヘムに結合する。

本発明者らは、約２．０Ｍから約２．５Ｍの範囲、好ましくは約２．２Ｍから約２．５Ｍの範囲、より好ましくは約２．４Ｍの硫酸アンモニウム濃度が、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを発見した。したがって、一実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．０Ｍから約２．５Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。別の実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．２Ｍから約２．５Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．４Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。特定の実施形態では、硫酸アンモニウム濃度は、２．０Ｍまたは２．１Ｍまたは２．２Ｍまたは２．３Ｍまたは２．４Ｍまたは２．５Ｍである。

本発明者らはまた、約８以下の範囲、好ましくは約６から約８、より好ましくは約７で維持されたｐＨが、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを示した。したがって、一実施形態では、この方法は、８以下のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。別の実施形態では、この方法は、約６から約８の範囲のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、約７のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。特定の実施形態では、この方法は、６．０から８．０、または６．２５から７．７５、または６．５から８．０、または６．５から７．７５、または６．５から７．５、または６．７５から７．２５、または６．７５から７．５の範囲のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。ｐＨは典型的に、ハプトグロビンおよびヘモペキシン溶液において、次いで硫酸アンモニウム添加中およびハプトグロビンの沈殿中に測定する。必要ならば、ｐＨは調節することができる（典型的に、ｐＨの調節に使用した酸（例えば、ＨＣｌ）または塩基（例えば、ＮａＯＨ）の濃度は０．０５Ｍから０．６Ｍの範囲である）。

本明細書で開示した方法では、開始材料のハプトグロビンの大部分は、硫酸アンモニウム沈殿物内に見いだされ、開始材料からのヘモペキシンの大部分は残存する溶液（懸濁液とも呼ぶ）中に見いだされる。しかし、当業者であれば、沈殿物がいくらかのヘモペキシン（例えば、微量のＨｘ）を含むこともあり、残存する溶液（または懸濁液）がいくらかのハプトグロビン（例えば、微量のＨｐ）を含むこともあることを理解する。微量のＨｐおよびＨｘが懸濁液および沈殿物中それぞれに存在する場合、本明細書で開示した方法に従って、１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することによってこれらを除去することが望ましい。しかし、当業者であれば、懸濁液および沈殿物中それぞれに存在し得る微量のＨｐおよびＨｘは、例えば、両タンパク質を結局同じ組成物中に入れる場合、許容することができることも理解する。

ハプトグロビンおよびヘモペキシン両方を含むいかなる溶液も、本明細書で開示した本発明の方法において開始材料として使用することができる。特定の実施形態では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液はさらに、トランスフェリンを含む。適切な開始材料は当業者には公知で、その例にはエタノール分画法から得られた様々な上清および沈殿物などの血漿画分が含まれる。このようなエタノール分画法の例には、コーン分画およびキストラーニッチェマン（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）分画が含まれる。適切な血漿画分の例には、コーン画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ＋ＩＩＩ、Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ（図１参照）または沈殿物ＡまたはＢなどのキストラーニッチェマン画分から得られた画分が含まれる。一実施形態では、溶液はヒト血漿画分である。別の実施形態では、溶液はコーン画分ＩＶである。さらに別の実施形態では、溶液はコーン画分ＩＶ_４である。特定の実施形態では、コーン画分ＩＶ_４はコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩまたはコーン画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩから得られる。特に好ましい実施形態では、溶液は画分ＩＶ_４沈殿物から得られる。

開始材料が沈殿物（例えば、画分ＩＶ_４沈殿物）として提供される場合、最初に沈殿物を再溶解して、本発明の方法のために適切な開始溶液を形成する必要があることがわかる。沈殿物を再溶解するために使用した緩衝剤は、ｐＨ約７で緩衝能力を有する任意の薬剤または薬剤の組み合わせであってもよい（例には、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＲＩＳを含めることができる）。典型的に、緩衝剤は、約５ｍＭから約１００ｍＭの濃度である。一実施形態では、再溶解緩衝液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７である。いくつかの実施形態では、再溶解緩衝液は、開始材料のグラム当たり約５から約３０グラムで添加することができる。特定の実施形態では、再溶解緩衝液は、開始材料のグラム当たり５から１０グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり１０から１５グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり１５から２０グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり２０から２５グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり２５から３０グラムで添加する。

本発明の方法は、ヘモペキシン、ハプトグロビン、場合によりトランスフェリンの商用／産業規模の精製のために適している。例えば、開始材料として血漿画分を使用する場合、本発明の方法を商用／産業規模で使用するには、少なくとも約５００ｋｇの血漿から得られた血漿画分を使用することが必要となり得る。より好ましくは、血漿画分は、バッチ当たり少なくとも約５，０００ｋｇ、７，５００ｋｇ、１０，０００ｋｇおよび／または１５，０００ｋｇの血漿から得られる。

当業者であれば、分画のための血漿は、抗凝固剤を含有する容器に収集した血液から細胞要素を分離した後残存する、またはアフェレーシス手法において抗凝固剤処理した血液の連続濾過または遠心など当業者に公知のその他の任意の適切な手段によって分離した血液の液体部分である。

一実施形態では、沈殿したハプトグロビンおよびヘモペキシンを含有する溶液を回収し、本発明によって、１回または複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製する前に別々に保存する。別の実施形態では、沈殿したハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを含有する溶液を回収し、すぐに本発明の方法によって；すなわち、１回または複数の工程におけるハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンの別々の精製によって、さらに精製工程を行う。

したがって、一実施形態では、方法にはさらに：
（ｉ）ハプトグロビン溶液を得るために、沈殿したハプトグロビンを緩衝液に溶解すること；
（ｉｉ）ハプトグロビンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、ハプトグロビン溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉｉ）該樹脂からハプトグロビンを溶出すること；および
（ｉｖ）溶出したハプトグロビンを回収することが含まれる。

特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。その他の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。

クロマトグラフィーによるタンパク質の精製は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＢｉｏ−Ｒａｄから市販されているものなどの軸流カラムを使用するか、またはＰｒｏｘｃｙｓもしくはＳｅｐｒａｇｅｎから市販されているものなどの放射流カラムを使用して実施することができる。クロマトグラフィーはまた、当業者に公知の膨張層技術を使用して実施することができる。

ほとんどのクロマトグラフィー法は、本明細書では樹脂またはマトリクスと同義に称される固相支持体を使用する。適切な固相支持体は、当業者にはよく知られており、選択は精製する生成物の種類に左右される。適切な固相支持体の例には、ガラスおよびシリカゲルなどの無機担体、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、二機能性アクリル酸のビニルコポリマーおよび様々なヒドロキシル化単体などの合成もしくは天然に生じる有機担体などが含まれる。市販の担体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）、Ｃａｐｔｏ（商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）、ＧｉｇａＣａｐ（商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（商標）、Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標）、Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ（商標）およびＸＡＤ（商標）樹脂の名称で販売されている。

クロマトグラフィー工程は一般的に、非変性条件下で、約−１０℃から＋３０℃の範囲の都合のよい温度で、より一般的にはおよそ周囲温度で実施する。クロマトグラフィー工程は、都合がよければ、バッチワイズまたは連続的に実施することができる。カラム、遠心、濾過、傾瀉などの都合のよい分離方法を使用することができる。

ハプトグロビン沈殿物を溶解するために適切な緩衝液は、当業者にはよく知られており、クロマトグラフィー精製工程を実施するために必要な条件に左右され得る。典型的に、緩衝液の緩衝剤（すなわち、トリス）の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭである。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭである。当業者はまた、緩衝液が複数の緩衝剤を含んでもよいことを認識する。適切な緩衝液の例は、ｐＨ範囲５．５から９．０の酢酸ナトリウムおよびトリスである。特定の実施形態では、７．５から９．０のｐＨを利用する。いくつかの実施形態では、ハプトグロビン沈殿物を溶解するために使用した緩衝液のｐＨは、ｐＨ７．５から９．０、またはｐＨ７．７５から９．０、またはｐＨ８．０から９．０、またはｐＨ８．２５から９．０、またはｐＨ８．４から８．６である。好ましい実施形態では、緩衝液はｐＨ約８．４からｐＨ約８．６のｐＨのトリス約５０ｍＭである。

実施形態では、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物（すなわち、ハプトグロビン溶液）の脂質含量は、脂質を脂質除去剤に結合させる条件下で、脂質除去剤に曝露させることによって低下する。このような脂質除去剤の例には、エアロジルなどのフュームドシリカが含まれる。一実施形態では、脂質除去剤はフュームドシリカである。一実施形態では、フュームドシリカはエアロジル（例えば、エアロジル３８０）である。実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、血漿同等物１リットル当たりハプトグロビン約０．５ｇから約４ｇを含む沈殿抽出物に添加することができる。特定の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１から２ｇで添加する。別の実施形態では、フュームドシリカ（例えば、エアロジル）などの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む抽出した沈殿物に血漿同等物１リットル当たり１．６から１．８ｇで添加する。別の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１．８から２．０ｇで添加する。別の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１．６ｇで添加する。脂質除去は、特定のｐＨ範囲で最も効果的であることが測定された。ｐＨ範囲５．５から９．０が、エアロジルと併用して効果的であることが見いだされた。いくつかの実施形態では、ｐＨ範囲は６．５から８．６である。その他の実施形態では、脂質除去工程中のｐＨは、ｐＨ５．５から９．０、またはｐＨ５．７５から９．０、またはｐＨ６．０から９．０、またはｐＨ６．２５から９．０、またはｐＨ６．５から９．０、またはｐＨ６．７５から９．０、またはｐＨ７．０から９．０、またはｐＨ７．２５から９．０、またはｐＨ７．５から９．０、またはｐＨ７．７５から９．０、またはｐＨ８．０から９．０、またはｐＨ８．２５から９．０、またはｐＨ８．４から９．０、またはｐＨ８．６から９．０である。好ましい実施形態では、ｐＨ範囲８．４から８．６を利用する。

脂質除去剤は、濾過およびまたは遠心などの方法を使用して除去することができる。特定の実施形態では、脂質除去剤は、深層濾過によって除去する。本出願で使用するための深層フィルターの一例は、Ｃｕｎｏ ７０ＣＡフィルター、または類似のもしくはより小さい粒径保持能力のフィルターである。

当業者であれば、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、溶液中のいくらかの不純物は樹脂を通過させる一方、ハプトグロビンがクロマトグラフィー樹脂に結合できる限り、ハプトグロビン溶液からハプトグロビンを別々に精製するために使用することができることを理解する。特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換樹脂である。その他の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換樹脂である。当業者であればまた、抽出緩衝液のイオン強度および添加溶液のその後のｐＨ調節によって、ハプトグロビンを樹脂に結合させるために、希釈、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィーによる脱塩、または緩衝液交換／イオン強度低下のその他の方法が必要となることを決定する。適切な樹脂は、当業者には公知である。適切な陰イオン交換樹脂の例は、機能的４級アミン基（Ｑ）および／またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含む樹脂である。一実施形態では、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、機能的４級アミン基（例えば、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（商標））が含まれる。

クロマトグラフィー媒体の平衡化に適切な溶液（平衡化緩衝液と呼ばれることも多い）の緩衝剤の濃度は通常、約５ｍＭから約１００ｍＭである。平衡化緩衝液のｐＨは通例、約５から約９の範囲で、伝導率は典型的に約９ｍＳ／ｃｍ未満である。これらの条件は一般的に、ハプトグロビンを陰イオン交換媒体に結合させる。特定の実施形態では、緩衝剤の濃度範囲は、約１０ｍＭから約６０ｍＭである。特定の実施形態での平衡化緩衝液のｐＨは、約５．０から約９．０のｐＨ範囲である。いくつかの実施形態では、ｐＨは約５．０から約７．０、または約５．０から約６．０、または約５．３から約５．７の範囲である。特定の実施形態では、平衡化緩衝液のｐＨは、ｐＨ５．３±０．１、またはｐＨ５．４±０．１、またはｐＨ５．５±０．１、またはｐＨ５．６±０．１、またはｐＨ５．７±０．１、またはｐＨ５．８±０．１である。いくつかの実施形態での平衡化緩衝液の伝導率は、約７．０ｍＳ／ｃｍ未満である。特定の実施形態では、平衡化緩衝液の伝導率は、６．０ｍＳ／ｃｍ未満または５．０ｍＳ／ｃｍ未満である。平衡化緩衝液のための緩衝剤の一例は、酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０、伝導率６．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態は、ｐＨ約５から約６の酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。特定の実施形態では、平衡化緩衝液には、ｐＨ範囲ｐＨ５．３からｐＨ５．７、伝導率５．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭが含まれる。

陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過するハプトグロビン溶液は、樹脂に結合させるために、イオン強度を低下させるため、最初に緩衝液の交換、脱塩または希釈を必要とすることがある。緩衝液の交換、脱塩または希釈のために適切な溶液には、約５ｍから約１００ｍＭの濃度の緩衝剤を有する溶液が含まれる。これらの溶液のｐＨ範囲は、典型的にｐＨ約５から約９の範囲である。一方、伝導率は通常、約８．０ｍＳ／ｃｍ未満である。特定の実施形態では、緩衝液の交換、脱塩または希釈のための溶液には、ｐＨ範囲約５から約９で、伝導率約７．０ｍＳ／ｃｍ未満の約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲の緩衝剤が含まれる。緩衝液の交換、脱塩または希釈のための溶液の一例は、酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０、伝導率６．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態は、ｐＨ約５から約６の酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。

その他の実施形態には、イオン強度を低下させるために水（注射用水（ＷＦＩ）など）を添加することによるハプトグロビン添加溶液の希釈が含まれる。例えば、ＷＦＩによって１：４から１：５に希釈すると、ｐＨ５．３〜５．７の酢酸ナトリウム５０ｍＭを含むハプトグロビン溶液の最終的な酢酸ナトリウム濃度は約１０〜１３ｍＭ、ｐＨは５．３から５．７、伝導率は５．０ｍＳ／ｃｍ未満である。これは一般的に、ハプトグロビンを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させる。

ハプトグロビン溶液において緩衝剤（複数）の緩衝範囲を超えるｐＨ調節が必要な場合、緩衝剤をさらにハプトグロビン溶液に添加することができる。添加する緩衝剤は典型的に、濃度が約５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ範囲が約５から約９である。特定の実施形態では、添加する緩衝剤は約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲で、ｐＨ範囲は約５から約９である。添加する緩衝剤の一例は酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。好ましい実施形態では、緩衝液はｐＨ５．３からｐＨ５．７の範囲のｐＨの酢酸ナトリウム５０ｍＭである。

樹脂からハプトグロビンを溶出するために適切な緩衝液はまた、当業者には公知である。特定の実施形態では、適切な緩衝剤の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭの範囲である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲である。一例には酢酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、ｐＨ５．０から６．０の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、約５．０から約６．０のｐＨの酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。好ましい実施形態では、緩衝液は約ｐＨ５．３から約ｐＨ５．７のｐＨの酢酸ナトリウム約５０ｍＭである。

さらなる実施形態では、ハプトグロビンはＮａＣｌ約１００ｍＭから約２００ｍＭを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出する。これは、伝導率範囲約１０ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌ １００ｍＭ）から約１８ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌ ２００ｍＭ）の溶出緩衝液と同等と見なされる。特定の実施形態では、ハプトグロビンは、ＮａＣｌ約１５０ｍＭから約１７０ｍＭの存在下で溶出する。好ましい実施形態では、ハプトグロビンは、ＮａＣｌ約１６０ｍＭの存在下で溶出する。しかし、当業者であれば、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度はカラムに加えたタンパク質添加に左右され、樹脂から溶出したハプトグロビンの必要な回収率および純度を実現するためには、記載した限界を超える調節が必要とされ得ることを知っている。

一実施形態では、溶出したハプトグロビンを回収し、将来使用するために別々に保存する。別の実施形態では、溶出したハプトグロビンは、必要ならば、例えば、溶出したハプトグロビンの限外濾過膜による濃縮およびダイアフィルトレーション、ならびに／または濃縮および／もしくはダイアフィルトレーションしたハプトグロビンの滅菌濾過によって、さらに精製する。

一実施形態では、本発明はさらに：
（ｉ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からの流出画分を収集すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）の後、および／または工程（ｉｉｉ）の後で該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
（ｖ）溶出したヘモペキシンを回収することを含む。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、定常相と分離するタンパク質との間の疎水性相互作用に基づいて、タンパク質を分離するためにしばしば使用されるクロマトグラフィー技術である。標的タンパク質の疎水性のレベルによって、使用するＨＩＣ樹脂の種類が決まることが多い。ＨＩＣの間、典型的に大量の塩を溶液に添加して、標的タンパク質の溶解性を低下させ、したがって標的タンパク質と適切な疎水性基（例えば、フェニル、ブチルおよびオクタデシル基）で機能化したＨＩＣ樹脂との間の相互作用を増加させる。適切な塩には典型的に、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウムおよびチオシアン酸ナトリウムが含まれる。適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、当業者にはよく知られている。例には、オクチルセファロースおよびカプトオクチルクロマトグラフィー樹脂が含まれる。ヘモペキシンを樹脂に結合させる条件は、当業者には公知で、例えば、使用する樹脂の種類および標的タンパク質（すなわち、ヘモペキシン）の疎水性によって決まる。

ヘモペキシン添加溶液は、硫酸アンモニウムを含有し、したがってカラムの平衡化に適切な緩衝液には、ｐＨを約６から約８に維持し、硫酸アンモニウム約２から２．５Ｍを含有する約５ｍＭから約１００ｍＭの濃度の緩衝剤が含まれる。これらの条件によって、ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体に結合させる。別の実施形態では、硫酸アンモニウム濃度２．２から２．５Ｍ、ｐＨ７．０から８．０を利用する。特定の実施形態では、緩衝溶液は硫酸アンモニウム２．５Ｍを含有し、ｐＨ７．４のトリス５０ｍＭである。

ヘモペキシン添加溶液は典型的に、ｐＨ約６から約８に緩衝された硫酸アンモニウム約２．０から約２．５Ｍを含有する。これらの条件によって、ヘモペキシンを疎水性相互作用媒体に結合させる。別の実施形態では、ヘモペキシン添加溶液は、ｐＨ７．０から８．０に緩衝された硫酸アンモニウム２．２Ｍから２．５Ｍを含有した。特定の実施形態では、ヘモペキシン添加溶液は、緩衝剤としてトリス５０ｍＭ、および硫酸アンモニウム２．５Ｍを含有し、ｐＨ７．４である。

ヘモペキシンを含有する溶液が一旦疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を通過したら、本明細書で開示したように、流出画分を収集し、将来使用するために保存することができる。

結合したヘモペキシンは、当業者に公知の手段によって樹脂から溶出することができる。樹脂からヘモペキシンを溶出する前に、樹脂を適切な洗浄液または緩衝液で、樹脂に結合したヘモペキシンを保持する条件下で場合により洗浄することができる。適切な洗浄液および条件は、当業者には公知である。洗浄液濃度は、ある程度カラム添加に左右されるが、典型的な洗浄液は、ｐＨ約６から約８で緩衝効果を有し、さらに硫酸アンモニウム約０．８Ｍから１．５Ｍを含有する。別の実施形態では、洗浄液は、ｐＨ７．０から８．０で硫酸アンモニウム０．９Ｍから１．３Ｍを含有する。特定の実施形態では、洗浄液は、緩衝剤としてトリス５０ｍＭ、および硫酸アンモニウム１．１３Ｍを含有し、ｐＨ７．４である。必要ならば、流出洗浄画分も収集し、将来使用するために保存することができる。

樹脂から回収した溶出ヘモペキシンは、将来使用するために保存することができる。溶出したヘモペキシンはまた、溶出液中のいかなる不純物も除去するために、さらに精製を行ってもよい。したがって、一実施形態では、方法にはさらに：
（ｉ）ヘモペキシンを金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、溶出ヘモペキシンを該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
（ｉｉｉ）溶出したヘモペキシンを回収することが含まれる。

固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、アミノ酸（例えば、ヒスチジン）の金属への共有結合に基づいており、金属イオンに親和性を有するタンパク質を亜鉛、コバルト、ニッケルまたは銅などの固定された金属イオンを含有するカラムに保持させる。適切な金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。一実施形態では、金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂はＮｉ−セファロースである。

平衡化および結合のために適切な緩衝液は、クロマトグラフィー媒体への非特異的結合を防御するように設計し、混入タンパク質の結合を最小限に抑えながらヘモペキシンへの親和性を促進するために最適化する。平衡化および結合のために使用した緩衝液は全般的に、約６から約９のｐＨ範囲内であり、少量（すなわち、１から５０ｍＭ）のヒスチジンまたはイミダゾールの添加と共に塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍの添加を含む。ある種の実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム０．５ｍＭから１００ｍＭ、ｐＨ約７から約８、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約１ｍＭから約５０ｍＭからなる。特定の実施形態では、平衡化および結合緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。添加溶液（オクチル溶出液）は、所望する固形賦形剤を添加するか、または濃縮した溶液を添加することによって、これらの濃度に調節することができる。

一旦、ヘモペキシンが金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂に結合したら、樹脂に結合したヘモペキシンを保持する条件下で、残存する未結合のまたは弱く結合した不純物を除去するために樹脂を洗浄することができる。洗浄工程に適切な緩衝液は、６．０から９．０のｐＨ範囲内であり、少量（すなわち、１から５０ｍＭ）のヒスチジンまたはイミダゾールの添加と共に塩化ナトリウム０．５Ｍから１．０Ｍの添加を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ約７からｐＨ約８、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約１ｍＭから約８０ｍＭからなる。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。

結合したヘモペキシンは、当業者に公知の手段によって樹脂から溶出することができる。溶出に適切な緩衝液は、約６から約９のｐＨ範囲内であり、溶出を容易にするために十分高い濃度のヒスチジンまたはイミダゾールと共に塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍの添加を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ約７．０から約ｐＨ８．０、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約８０ｍＭ未満からなる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール１００ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。あるいは、結合したヘモペキシンは、ｐＨ約４．０からｐＨ約６．０の間の低ｐＨ緩衝液を加えることによって溶出することができる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液として、ＮａＣｌ約０．５Ｍから約１．０Ｍを含み、ｐＨが約４．０から約ｐＨ６．０の間の約５ｍＭから約１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を利用する。溶出したヘモペキシンは、必要ならば、例えば、限外濾過膜によるヘモペキシンの濃縮およびダイアフィルトレーションならびに／または濃縮および／またはダイアフィルトレーションしたヘモペキシンの滅菌濾過によって、さらに精製することができる。

本発明者らはまた、開始材料中に存在することがあるトランスフェリンが、硫酸アンモニウムの存在下でのハプトグロビンの沈殿後に、溶液中（すなわち、ヘモペキシンを含む溶液中）に残存することを見いだした。したがって、本明細書で開示した本発明の方法はまた、同じ開始材料からトランスフェリンを精製するために使用することができる。したがって、３種類のタンパク質（Ｈｐ、Ｈｘおよびトランスフェリン）全てを同じ開始材料から精製するために最適な条件を提供する。したがって、一実施形態では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方（例えば、開始材料）を含有する溶液はさらに、トランスフェリンを含む。

一実施形態では、本発明はさらに：
（ａ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｂ）工程（ａ）からの流出画分を収集すること；
（ｃ）工程（ｂ）の後で場合により樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
（ｄ）トランスフェリンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、工程（ｂ）からの流出画分および／または工程（ｃ）からの流出洗浄画分を該樹脂に通過させること；ならびに
（ｅ）該樹脂からトランスフェリンを回収することを含む。

特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。その他の特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。

適切な強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。適切な陰イオン交換樹脂の例は、機能的４級アミン基（Ｑ）および／またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含む樹脂である。一実施形態では、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、４級アミン官能基（例えば、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（商標））が含まれる。

適切な弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。例には、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）などの３級または２級アミン官能基を含む樹脂が含まれる。

当業者であればまた、ＨＩＣ洗浄画分のイオン強度によって；トランスフェリンを陰イオン交換樹脂に結合させるために、希釈、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィーによる脱塩、または緩衝液交換／イオン強度低下のその他の方法が必要であることを決定する。クロマトグラフィーによる脱塩のこのような１方法には、硫酸アンモニウム約０．８Ｍから約１．５Ｍを含有するＨＩＣ洗浄画分（トランスフェリン）を、フェニルまたはブチルカラムなどのより強い疎水性リガンドに直接結合させることが含まれる。一旦結合したら、トランスフェリンは、ＷＦＩまたは陰イオン交換クロマトグラフィー用に調製した低イオン強度緩衝液で溶出することができる。

陰イオン交換クロマトグラフィー平衡化および結合に適切な緩衝液は、トランスフェリンを陰イオン交換媒体に結合させて、クロマトグラフィーによるトランスフェリンのその他の不純物からの分離を促進する。クロマトグラフィー媒体の平衡化に適切な緩衝液の濃度は約５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ範囲は約６から約９、伝導率は約９．０ｍＳ／ｃｍ未満である。これらの条件は、トランスフェリンを陰イオン交換媒体に結合させる。特定の実施形態では、緩衝剤は約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲で、ｐＨ範囲は約６から約９、伝導率は約７．０ｍＳ／ｃｍ未満である。適切な緩衝剤の例には、トリスおよびリン酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、ｐＨ範囲が約７から約９の範囲、伝導率約６．０ｍＳ／ｃｍ未満のトリス５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、７．０から９．０のｐＨ、伝導率約５．０ｍＳ／ｃｍ未満の約１０ｍＭから約４０ｍＭトリス緩衝液を利用する。

樹脂からトランスフェリンを溶出するために適切な緩衝液はまた、当業者には公知である。特定の実施形態では、適切な緩衝剤の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭの範囲である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲である。適切な緩衝剤の例には、トリスまたはリン酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、約７から約９の範囲のｐＨのトリス５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、約７から約９のｐＨの酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。当業者であれば、溶出緩衝液ＮａＣｌ濃度はクロマトグラフィー樹脂に加えるタンパク質添加の範囲に左右されることはわかる。溶出方法は、緩衝液のＮａＣｌ濃度がトランスフェリンを溶出するためにステップワイズ型で増加する段階勾配、または緩衝液のＮａＣｌが直線状にゆっくり増加する直線勾配の使用によることからなり、トランスフェリンの収集を確認するためにカラム溶出液をモニターする。

一旦トランスフェリンを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から回収すると、必要ならば、例えば、限外濾過膜によるトランスフェリンの濃縮およびダイアフィルトレーションならびに／または濃縮および／またはダイアフィルトレーションしたトランスフェリンの滅菌濾過によって、さらに精製することができる。

ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液を、臨床または獣医学的適用のため（例えば、溶血に関連した症状を有する対象に投与するため）に使用する場合、当業者であれば、溶液中の活性のあるウイルス含量（ウイルス力価）およびその他の可能性のある感染因子（例えば、プリオン）のレベルを低下させることが所望され得ることを理解する。これは特に、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料（すなわち、開始材料）が血漿から得られる場合、所望され得る。溶液中のウイルス力価を低下させる方法は当業者には公知である。例には、低温殺菌（例えば、グリシン（例えば、２．７５Ｍ）およびスクロース（例えば、５０％）などの高濃度の安定化剤および／またはその他の選択された賦形剤または塩の存在下で溶液を６０℃で１０時間インキュベートする）、乾熱処理、ウイルス濾過（溶液をナノフィルター；例えば、２０ｎｍカットオフに通過させる）および／または溶液を適切な有機溶媒および界面活性剤で、溶液中のウイルスを不活性化する期間および条件下で処理することが含まれる。溶媒界面活性剤は、特に血漿由来生成物中のエンベロープウイルスを不活性化するために、２０年に亘って使用されてきた。したがって、当業界で公知の様々な試薬および方法を使用して実施することができる（例えば、本明細書に参照によって組み入れた米国特許第４５４０５７３号および米国特許第４７６４３６９号を参照のこと）。適切な溶媒には、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）およびエーテル、特にＴｎＢＰ（典型的に約０．３％）が含まれる。適切な界面活性剤には、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０およびトリトンＸ−１００（典型的に約０．３％）が含まれる。溶媒および界面活性剤濃度を含む処理条件の選択は、一部には原料の特性に左右され、純度が低い原料は一般的に高濃度の試薬およびより極端な反応条件を必要とする。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０で、特に好ましい組み合わせはポリソルベート８０およびＴｎＢＰである。原料は、存在する可能性があるいかなるエンベロープウイルスも不活性化するのに十分な温度および時間で、溶媒および界面活性剤試薬と撹拌することができる。例えば、溶媒界面活性剤処理は、２５℃で約４時間実施することができる。溶媒界面活性剤化学物質はその後、例えば、Ｃ−１８疎水性樹脂などのクロマトグラフィー媒体への吸着か、または関心のあるタンパク質を吸着する条件下でのイオン交換樹脂のドロップスルー（ｄｒｏｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分への溶出によって除去する。

ウイルス不活性工程は、本明細書で開示した方法の任意の適切な段階で実施することができる。一実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料に、最初に記載した態様の工程（ｉｉ）の前にウイルス不活性化工程を行う。別の実施形態では、硫酸アンモニウム沈殿工程（すなわち、工程（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ））から回収したハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液にウイルス不活性化工程を行う。その他の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、工程ｉｉｉ）の後で実施する。

本明細書で開示した一実施形態では、ウイルス不活性化工程には、低温殺菌および／または有機溶媒および界面活性剤による処理が含まれる。一実施形態では、本発明の方法はさらに、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンのいずれかを含む溶液を５５℃から６１℃で約３０分から約１２時間加熱することを含む。特定の実施形態では、溶液は、約１０から約１０．５時間加熱する。本明細書で開示した別の一実施形態では、ウイルス不活性化工程は、ウイルス濾過を含む。特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液を孔径１５ｎｍから３５ｎｍの範囲のウイルスフィルターに通すことを含む。ウイルス濾過を使用する場合、本発明者らは、濾過工程前に遊離アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加すると、フィルターからのハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの流動速度および回収を顕著に改善することができることを見いだした。このような方法の一例は、米国特許第７９１９５９２号に記載されている。

本明細書で開示した一実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料または溶液に、クロマトグラフィー樹脂に通過させる前にウイルス不活性化工程を行う。処理した溶液または原料を陰イオン交換樹脂などのクロマトグラフィー樹脂に通過させる前に溶媒界面活性剤処理などのウイルス不活性化工程を使用する利点は、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの樹脂への結合ならびに流出（ドロップスルー）画分による有機溶媒および界面活性剤の除去を促進する条件を利用することによって、有機溶媒および界面活性剤を処理した溶液から除去することを可能にすることである。

低温殺菌は、タンパク質凝集および重合体を生成し得る。したがって、場合によっては、低温殺菌した溶液中の凝集／重合体のレベルを低下させることが所望され得る。これは、当業者に公知の任意の手段によって実現することができるが、さらなるクロマトグラフィー精製によって便利に実現することができる。本明細書で開示した一実施形態では、低温殺菌した溶液または原料は、いかなる凝集または重合体も流出（ドロップスルー）画分で除去されるように、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンに関してはポジティブモードで陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる。

特定の実施形態では、明らかに記載されていない限り、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを精製する方法は一般的に、約１８℃から約２６℃の温度範囲で実施する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンを含む組成物を提供する。一態様では、組成物のハプトグロビン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、少なくとも９５％である。さらに別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、少なくとも９８％である。特定の実施形態では、ハプトグロビンを含む組成物は、免疫比濁法によって測定すると、ハプトグロビン１ｍｇ当たりＩｇＡ０．０３ｍｇ未満を含む。特定の実施形態では、ハプトグロビンを含む組成物は、ハプトグロビン濃度が２６ｍｇ／ｍＬのとき、ＩｇＧ ０．０６７ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＭ ０．０４２ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−酸糖タンパク質０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、プレアルブミン０．０１８ｍｇ／ｍＬ未満、セルロプラスミン０．０２１ｍｇ／ｍＬ未満、ヘモペキシン０．０５１ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ ０．０５３ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ｂ ０．２２７ｍｇ／ｍＬ未満、アンチトロンビンＩＩＩ ０．０３１ｍｇ／ｍＬ未満、トランスフェリン０．１ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−アンチトリプシン０．０７ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−２−マクログロブリン０．１ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＡ ０．７ｍｇ／ｍＬ未満およびアルブミン０．１５ｍｇ／ｍＬ未満（免疫比濁法によって測定）を含有する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示された方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の態様では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９５％である。別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９７％である。さらに別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９８％である。

特定の実施形態では、ヘモペキシンを含む組成物は、少なくとも９８％純粋で、ＩｇＧ ０．０６７ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＡ ０．０６６ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＭ ０．０４２ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−アンチトリプシン０．０４８ｍｇ／ｍＬ未満、トランスフェリン０．０９０ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−酸糖タンパク質０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、プレアルブミン０．０１８ｍｇ／ｍＬ未満、セルロプラスミン０．０２１ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ ０．０５３ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ｂ ０．２２７ｍｇ／ｍＬ未満、アンチトロンビンＩＩＩ ０．０３１ｍｇ／ｍＬ未満、ハプトグロビン０．１７ｍｇ／ｍＬ未満およびアルブミン０．０４５ｍｇ／ｍＬ未満（免疫比濁法によって測定）を含む。

特定の実施形態では、ヘモペキシンを含む組成物は少なくとも９７％純粋で、免疫比濁法によって測定すると、ハプトグロビン１．７％未満、トランスフェリン０．４％未満、アルブミン０．２％未満およびアルファ−２ マクログロブリン０．１％未満を含有する。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、少なくとも９８％である。

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンおよび本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９８％である。

一実施形態では、組成物はさらに、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む。一実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９８％である。

本発明の別の態様では、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシン含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシンおよびハプトグロビンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明のさらに別の態様では、ヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。

本明細書で開示した本発明の方法によって回収したハプトグロビン、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む組成物は、通常関連するその他の成分（例えば、その他の血漿由来タンパク質）を実質的に含まない。したがって、一実施形態では、ハプトグロビン、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む組成物は、通常関連するその他の成分（すなわち、不純物）を全タンパク質の２０％未満、好ましくは全タンパク質の１０％未満、より好ましくは全タンパク質の５％未満含む。当業者であれば、本発明の組成物中に存在する不純物のレベルは、組成物の企図される使用に左右され得ることを理解する。例えば、組成物をそれらを必要とするヒト対象に投与する場合（すなわち、臨床使用では）、組成物に含まれる不純物は（全タンパク質の）５％未満であることが所望される。反対に、タンパク質をインビトロで使用する場合、組成物が（全タンパク質の）５％を上回る不純物を含んでいても許容され得る。

本発明の別の態様では、本明細書で開示したように、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む製剤を提供する。

適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤は、当業者には公知である。例には、溶媒、分散媒、抗真菌剤および抗菌剤、表面活性剤、等張剤および吸収剤などが含まれる。

医薬製剤はまた、適切な安定化剤、例えば、アミノ酸、炭水化物、塩および界面活性剤を添加（または組み合わせ）することによって製剤化することができる。特定の実施形態では、安定化剤には、糖アルコールおよびアミノ酸の混合物が含まれる。安定化剤は、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）およびアミノ酸（例えば、プロリン、グリシンおよびアルギニン）の混合物を含むことができる。好ましい実施形態では、製剤は、アルギニンなどのアミノ酸を含む。その他の実施形態では、製剤は、最高１００ｍＭの濃度の２価金属イオンおよび米国特許第７０４５６０１号に記載されたような複合体形成剤を含む。実施形態では、ｐＨは、好ましくは約６．５から７．５であり、浸透圧は少なくとも２４０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである。

医薬製剤はまた、分注および長期貯蔵前に濾過によって滅菌してもよい。好ましくは、製剤は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６ヵ月またはそれ以上の月数、元々の安定特性を実質的に保持する。例えば、２−８℃または２５℃で保存した製剤は典型的に、６ヵ月以上保存しても、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定すると、実質的に同じ分子サイズ分布を保持することができる。医薬製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または室温で保存したとき、少なくとも６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月、３６ヵ月またはそれ以上であっても、商用の薬学的使用のために安定であり、適切であることができる。

本明細書で記載した組成物は、注射製剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。製剤およびその後の投与（投薬）は、当業者の範囲内である。投薬は、治療する対象の応答性に左右されるが、所望する効果（例えば、遊離Ｈｂ／ヘムレベルの低下）が望まれる限り一定して継続する。当業者は、最適な投薬量、投与方法および反復数を容易に決定することができる。

本明細書で開示した一実施形態では、本発明の医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬ含む溶液である。別の実施形態では、医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを約２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬまたは２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。別の態様では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの濃度が少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、安定した薬学的に許容されるハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリン溶液の少なくとも５ｍＬを含有する容器を提供する。

本発明の別の実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンをふくむ医薬製剤を凍結乾燥する。糖（例えば、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）およびアミノ酸（例えば、グリシンもしくはプロリン）またはそれらの組み合わせのような凍結乾燥安定化剤が存在するため、凍結乾燥によって長期保存期間を有する安定した粉末が得られる。医薬製剤を形成するために、この粉末を保存し、直接もしくは保存後粉末として使用するか、または再水和してから使用することができる。本発明の凍結乾燥した医薬製剤は、限定はしないが、凍結乾燥を含む、当業界で公知の任意の凍結乾燥方法を使用して、すなわち、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含有する製剤を凍結後、減圧エバポレーションして、形成することができる。提供された凍結乾燥製剤は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６ヵ月またはそれ以上の月数、元々の安定特性を実質的に保持することができる。例えば、２〜８℃または２５℃で保存した凍結乾燥製剤は典型的に、６ヵ月以上保存しても、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定すると、実質的に同じ分子サイズ分布を保持することができる。ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリン医薬製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または室温で保存したとき、少なくとも６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月、３６ヵ月またはそれ以上であっても、商用の薬学的使用のために安定であり、適切であることができる。特定の実施形態では、凍結乾燥した医薬製剤はヘモペキシンを含む。本発明は、凍結乾燥した医薬製剤を大規模生産するために使用することができる。凍結乾燥製品は、大量調製のために製造することができ、あるいは、凍結乾燥前に、小さな容器（例えば、単回用量単位）に配分してもよく、このような小さな単位は、滅菌単位投与形態として使用することができる。凍結乾燥した製剤は、タンパク質の溶液または懸濁液を得るために、再構成することができる。凍結乾燥した粉末は、水性溶液で適切な容量に再水和する。好ましい水性溶液は、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水または生理学的食塩水である。混合物を撹拌して、再水和を促進する。好ましくは、再構成工程は、室温で実施する。

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する方法であって、本明細書で開示したように、本発明の組成物または製剤をそれらを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

本明細書で使用した「対象」という用語は、霊長類（低級または高級霊長類）を含む動物を意味する。高級霊長類には、ヒトが含まれる。本発明は、ヒトにおける症状の標的化に特に適用されるが、非ヒト動物も本明細書で開示した組成物および方法から利益を得ることができることを当業者であれば理解する。したがって、本発明はヒトおよび動物の両方に適用されることは当業者であればわかる。便宜上、「動物」には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ、ロバ、イヌおよびネコなどの家畜および伴侶動物が含まれる。ウマに関しては、これらには、レース業界で使用されるウマならびに娯楽または畜産業のために使用されるウマが含まれる。

本発明の組成物または製剤は、いくつかの方法で対象に投与することができる。適切な投与経路の例には、静脈内、皮下、動脈内または注入が含まれる。一実施形態では、分子は静脈内投与される。

必要ならば、本発明の方法はさらに、第２の治療薬の投与を含んでもよい。第２の治療用化合物は、対象に連続的に（本明細書で開示した組成物または製剤の投与の前後）または同時に一緒に投与することができる。一実施形態では、第２の治療薬は、鉄キレート剤（例えば、デスフェリオキサミンまたはデフェリプロン）である。

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療するための医薬品の製造における、本明細書で開示したような本発明の組成物または製剤の使用を提供する。このような組成物または製剤は、好ましくはヒト患者で使用するために適切である。

溶血に関連し、ヘモグロビン／ヘムによって媒介される毒性の危険性がある症状は、当業界では公知である。一実施形態では、症状は、急性溶血性疾患および／または慢性溶血性疾患から選択される。一実施形態では、症状は、溶血性貧血、輸血誘発溶血、溶血性***症候群、自己免疫疾患、マラリア感染、外傷、輸血、心肺バイパスを使用した直視下心臓手術および熱傷からなる群から選択され、熱傷後の溶血に関連したヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿の治療が含まれる。一実施形態では、症状は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。

当業者であれば、本明細書で記載した本発明は、特に記載したもの以外の変更および改変を受け入れることができることがわかる。本発明には、精神および範囲内に入るこのような変更および改変が全て含まれることを理解されたい。本発明はまた、本明細書で述べるかまたは示した工程、特徴、組成物および化合物全てを、個別にまたは集合的に含み、前記工程または特徴の任意の２種以上のありとあらゆる組み合わせも含む。

本発明のある特定の実施形態について、ここで以下の実施例を参照して記載するが、実施例は単に例示することを目的とするものであって、前述した概説の範囲を限定するものではない。

〔実施例１〕
開始材料：ハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンの精製のための開始材料として、コーン画分ＩＶ_４沈殿物を使用した。（図１参照）。

沈殿物の抽出：沈殿物の抽出は、画分ＩＶ_４沈殿物１グラム当たり抽出緩衝液２０グラムを導入することによって実施した（２０×抽出比）。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。抽出緩衝液は、濃ＨＣｌでｐＨ７．０に調節したトリス５０ｍＭから構成された。抽出緩衝液は、２０〜２５℃の温度で調製した。沈殿物抽出も２０〜２５℃の温度で実施した。抽出中のｐＨは、１時間の抽出時間中７．０から８．０の間（好ましくは７．０）に維持した。

硫酸アンモニウム沈殿：最終濃度２．０から２．５Ｍ（好ましくは２．４Ｍ）を実現するために、固形の硫酸アンモニウムを画分ＩＶ_４抽出物に添加した。撹拌しながら、硫酸アンモニウムをゆっくり抽出物に添加し、最低限１時間継続的に混合した。硫酸アンモニウム沈殿は、２０〜２５℃の温度で実施した。

ヘモペキシンおよびトランスフェリンの可溶性を維持しながら脂質を沈殿させ、画分ＩＶ_４抽出物を清澄化するために、硫酸アンモニウム濃度２．５Ｍを利用した。同時に、この硫酸アンモニウム濃度は、画分ＩＶ_４抽出物中に存在するハプトグロビンの大部分の沈殿を引き起こした（図２参照）。ヘモペキシンを可溶性に維持しながら、硫酸アンモニウム２．２Ｍから２．５Ｍでハプトグロビンが沈殿することは、同じ開始画分からのヘモペキシンおよびハプトグロビンの同時精製を可能にする。

許容される硫酸アンモニウム濃度範囲をさらに狭めるために、ｐＨおよび硫酸アンモニウム濃度の影響を検討する実験計画法（ＤＯＥ）を実施した。図３は、ＤＯＥの望ましさのプロット（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を示す。このプロットは、ほとんどのヘモペキシンを可溶性に維持しながら、ほとんどのハプトグロビンを沈殿させる最も望ましい条件を示す。望ましさのプロットは、ｐＨを７〜８の間（好ましくは７．０）に、硫酸アンモニウム濃度を２．２Ｍと２．５Ｍの間（好ましくは２．４Ｍ）に維持することが、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを示している。さらに、トランスフェリンは、２．５Ｍを上回る濃度で可溶性を維持するので、これらの条件は、同じ開始材料から３種類のタンパク質全てを精製するために最適であった。

濾過：硫酸アンモニウム処理抽出物を濾過用に調製するために、バッチで利用するための血漿同等物１リットル当たりＣ１０００濾過助剤１０グラムを添加した。濾過を遂行する前に、Ｃ１０００濾過助剤を最低限１５分間混合させた。ハプトグロビンの豊富な沈殿物の収集を可能にするために、濾過用にプレートフレームフィルタープレスを利用した。プレートフレームフィルタープレスは、３Ｍ（Ｃｕｎｏ）７０ＣＡ深層濾過フィルターシートの前面に１７５型フィルター紙のシートを組み合わせた。バッチに投入した血漿同等物３Ｌ毎に、沈殿収集物領域０．１９３ｍＬが必要であった（３Ｌ血漿／４”Ｅｒｔｅｌ ４Ｓフィルターフレーム）。硫酸アンモニウム処理した抽出物を次に、ダブルダイアグラム加圧エア作動型ポンプを使用して、フィルタープレスに送り込んだ。

Ｃ１０００混合時間完了後、処理した抽出物をフィルタープレスに送り込み、フィルタープレスを１回通過させた後の濾液を収集した。次に、フィルタープレスを、１から２プレス量のｐＨ７．０に調節した硫酸アンモニウム２．４Ｍ、トリス５０ｍＭで後洗浄した。濾過行程は、２０〜２５℃の温度で実施した。得られた濾液はヘモペキシンを含有し、さらに精製を実施するまで、２〜８℃で保存することができる。得られた沈殿物はハプトグロビンを含有し、さらに精製を実施するまで、−２０℃以下で保存することができる。

濾過画分からのヘモペキシン（Ｈｘ）の精製：
Ｈｘ処理計画を図９に表示する。

（ａ）オクチルセファロースクロマトグラフィー（ＨＩＣ）：画分ＩＶ_４沈殿物の抽出および硫酸アンモニウム処理から得られた濾液はさらに、０．２２μｍフィルターを使用して清澄化した。次に、３カラム体積の硫酸アンモニウム２．５Ｍ、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ７．４で平衡化したオクチルセファロースカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に濾液を添加した。あるいは、カプトオクチルカラムを次工程のために使用することができる。８から１２カラム体積（目標＝１０）の濾液をオクチルセファロースカラムに添加した。不純物およびいかなる未結合タンパク質も、３カラム体積の硫酸アンモニウム０．９Ｍから１．２Ｍ（目標１．１３Ｍ）、トリス５０ｍＭ、ｐＨ７．４（洗浄用）によってカラムから洗浄した。洗浄画分はトランスフェリンを含有し、さらに精製するために保存することができる。次に、ヘモペキシンを含有する画分（溶出液）を３カラム体積の水（ＷＦＩ）でカラムから溶出させた。その後、さらなるトランスフェリン精製に使用するまで、溶出液は２〜８℃で保存した。オクチルセファロース（ＨＩＣ）精製は、２０〜２５℃の温度で実施した。

（ｂ）Ｎｉ−セファロースクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）：リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール３０ｍＭをオクチルセファロース溶出液に添加した。一旦添加したら、オクチルセファロース溶出液のｐＨを７．４に調節した。次に、３カラム体積のオクチルセファロース溶出液を、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、場合によりイミダゾール３０ｍＭを含有し、ｐＨ７．４に調節した緩衝液で平衡化したＮｉ−セファロース（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに添加した。イミダゾールをオクチルセファロース溶出液（添加液）に添加することによって、ヘモペキシンに対する結合親和性を維持しながら、Ｎｉ−セファロースのアルブミンおよびその他の不純物に対する親和性を低下させる。したがって、添加工程の間に、不純物はカラムから流出し、一方、ヘモペキシンは樹脂に結合した。添加完了後、カラムを２カラム体積のリン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４で洗浄し、いかなる未結合不純部物も除去した。次に、ヘモペキシンをリン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール１００ｍＭ、ｐＨ７．４を使用してカラムから溶出した。Ｎｉ−セファロース溶出液中に存在するヘモペキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を上回ることが推定された（図４参照）。Ｎｉ−セファロースクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）方法は、２０〜２５℃で実施し、得られた溶出液は使用するまで−２０℃以下で保存した。

（ｃ）濃縮／ダイアフィルトレーション：Ｎｉ−セファロース溶出液を所望する濃度まで濃縮し（１〜２０％ｗ／ｖ）、次に濃縮物体積当たりリン酸緩衝生理食塩水１０体積でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。一旦ダイアフィルトレーションが完了し濃縮物が所望する濃度になったら、ヘモペキシンに場合により糖およびまたはアミノ酸を配合し、滅菌濾過して、−２０℃以下で保存した。精製したヘモペキシンは、この形態で前臨床動物実験および細胞実験で使用することができる。

方法から回収したヘモペキシンの最終収率は、約０．１５１ｇ／Ｌ血漿と推定された。

濃縮したヘモペキシン調製物（約２．３％ｗ／ｖ）の特徴は、免疫比濁法によって調べた。ＩｇＧ（検出限界、ＬＯＤ＝＜０．０６７ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＡ（ＬＯＤ＝＜０．０６６ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＭ（ＬＯＤ＝＜０．０４２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−アンチトリプシン（ＬＯＤ＝０．０４８ｍｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（ＬＯＤ＝＜０．０９０ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−酸糖タンパク質（ＬＯＤ＝０．０５０ｍｇ／ｍＬ）、プレアルブミン（ＬＯＤ＝０．０１８ｍｇ／ｍＬ）、セルロプラスミン（ＬＯＤ＝０．０２１ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＬＯＤ＝＜０．０５３ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＬＯＤ＝＜０．２２７ｍｇ／ｍＬ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＬＯＤ＝０．０３１ｍｇ／ｍＬ）などの血漿タンパク質は検出レベルを下回った。ハプトグロビン（０．１６５ｍｇ／ｍＬ）およびアルブミン（０．０３８ｍｇ／ｍＬ）などのその他の血漿タンパク質はほんの微量検出された。これらの結果は、Ｈｘが調製物中の全タンパク質の少なくとも９９％を占めることを示唆する。

ヘモペキシンの他のバッチは、前述した方法によって処理した。バッチは、３５ｍｇ／ｍＬタンパク質まで濃縮した。免疫比濁法によってバッチを分析すると、ヘモペキシンの純度は約９８％で、ハプトグロビン１．６％、トランスフェリン０．３％、アルブミン０．２％およびアルファ−２ マクログロブリン０．１％を含む不純物が含まれることが示された。

硫酸アンモニウム２．５Ｍ沈殿物からのハプトグロビン（Ｈｐ）の精製
Ｈｐ処理計画を図１０に表示する。

（ａ）沈殿物の抽出および濾過：ハプトグロビンは、抽出緩衝液２０グラム／グラム沈殿物（２０×比）を導入することによって沈殿物から抽出した。抽出緩衝液はｐＨ５．５に調節した酢酸ナトリウム５０ｍＭから構成された。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。１５分後、ｐＨを５．４から５．６の範囲内に調節した。その後のクロマトグラフィー工程において低ｐＨを利用する間、低ｐＨ抽出緩衝液を利用して、脂質の抽出を低下させた。残存する濾過助剤および不溶性タンパク質および脂質を除去するため、次に、抽出物をＣｕｎｏ ７０ＣＡフィルターまたは同等の深層フィルターに通過させた。その後、濾液は０．２μｍフィルターを使用することによって清澄化した。得られた濾液は、その後のクロマトグラフィー工程のために準備した。抽出緩衝液調製、抽出方法および濾過方法は全て、２０〜２５℃で実施した。

別の実施形態では、ハプトグロビンは、抽出緩衝液２０グラム／グラム沈殿物（２０×比）を導入することによって沈殿物から抽出した。抽出緩衝液はｐＨ８．５に調節したトリス５０ｍＭから構成された。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。１５分後、ｐＨを８．４から８．６の範囲内に調節した。脂質含量を低下させ、抽出した沈殿物の清澄化を助長するために、脂質吸着剤、エアロジル（フュームドシリカ）を血漿同等物１リットル当たり約１．６から約１．８グラムで添加した。次に、エアロジル処理した抽出物を最低限１時間混合した。残存する濾過助剤およびいかなる不溶性タンパク質および脂質も除去するために、抽出物をＣｕｎｏ ７０ＣＡフィルターまたはその他の類似の深層フィルターに通過させた。その後、濾液は０．２μｍフィルターを使用することによって清澄化した。得られた濾液は、その後のクロマトグラフィー工程のために準備した。抽出緩衝液調製、抽出方法および濾過方法は全て、２０〜２５℃で実施した。

（ｂ）Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィー工程：酢酸ナトリウムを、前記工程から得られた濾液に最終濃度５０ｍＭまで添加して、氷酢酸を使用して濾液のｐＨをｐＨ５．５に調節した。次に、ｐＨ調節した濾液を冷水（ＷＦＩ）で１：４から１：５に希釈し、酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ５．５で平衡化したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーカラムに約２〜８℃の温度で添加した。添加は、低ｐＨ緩衝液として酢酸ナトリウムを必要とし、ハプトグロビンがカラムに結合するように添加物の伝導率を低下させるために水で希釈することが必要である。添加完了後、カラムを２カラム体積の酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ５．５で洗浄し、いかなる未結合混入タンパク質も除去した。次に、ハプトグロビンを４カラム体積の酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ１００〜２００ｍＭ（好ましくは１６２ｍＭ）、ｐＨ５．５で溶出した。溶出条件が利用した添加体積に一部左右されるので、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度は広範囲であることが必要である。溶出液は、濃縮／ダイアフィルトレーションまで、短期間の場合２〜８℃で、長期間の場合、−２０℃以下で保存することができる。Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液のハプトグロビン含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を上回ることが推定された（図５および６参照）。クロマトグラフィー緩衝液およびクロマトグラフィー工程は全て、２０〜２５℃で実施した。

（ｃ）濃縮／ダイアフィルトレーション：Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液を特定の濃度まで濃縮し、次に濃縮物体積当たりリン酸緩衝生理食塩水１０体積でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。一旦ダイアフィルトレーションが完了し濃縮物が所望する濃度になったら、精製したハプトグロビン溶液を滅菌濾過して、−２０℃以下で保存した。

場合により、脂質吸着工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程前後または濃縮／ダイアフィルトレーション工程後に実施することができる。適切な脂質吸着剤の一例は、エアロジルのようなフュームドシリカ（例えば、エアロジル３８０）である。

方法から回収したハプトグロビンの最終収率は、約０．２８５ｇ／Ｌ投入血漿と推定された。

濃縮したハプトグロビン調製物（約２．６％ｗ／ｖ）の特徴は、免疫比濁法によって調べた。ＩｇＧ（検出限界、ＬＯＤ＝＜０．０６７ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＭ（ＬＯＤ＝＜０．０４２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−酸糖タンパク質（ＬＯＤ＝＜０．０５０ｍｇ／ｍＬ）、プレアルブミン（ＬＯＤ＝＜０．０１８ｍｇ／ｍＬ）、セルロプラスミン（ＬＯＤ＝＜０．０２１ｍｇ／ｍＬ）、ヘモペキシン（ＬＯＤ＝＜０．０５１ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＬＯＤ＝＜０．０５３ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＬＯＤ＝＜０．２２７ｍｇ／ｍＬ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＬＯＤ＝＜０．０３１ｍｇ／ｍＬ）などの血漿タンパク質は検出レベルを下回り、トランスフェリン（０．０９９ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−アンチトリプシン（０．０６２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−２−マクログロブリン（０．０８６ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＡ（０．６５ｍｇ／ｍＬ）およびアルブミン（０．１２３ｍｇ／ｍＬ）などのその他の血漿タンパク質はほんの微量検出された。これらの結果は、Ｈｐが調製物中の全タンパク質の少なくとも９６％を占めることを示す。

オクチル１．１３Ｍ硫酸アンモニウム洗浄画分からのトランスフェリンの精製：
オクチル洗浄画分にイオン交換クロマトグラフィーを実施する前に、硫酸アンモニウムをダイアフィルトレーションして、低イオン強度の緩衝液に交換した。このために、オクチル溶出液を濃縮し、溶出液体積当たり１０体積のトリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。

次に、ダイアフィルトレーションした洗浄画分を、トリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０で平衡化したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥカラムに添加した。この画分から純粋なトランスフェリンを得ることが実行可能かどうかを決定するために、開始緩衝液としてトリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０および終了緩衝液としてトリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ７．０を使用して、１０カラム体積の直線勾配を実施した（図８参照）。クロマトグラムの各ピークに対応する画分を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ピークの１つが純粋なトランスフェリンを含有するかどうかを決定するために実施した。図７に示したように、ピークには大量に添加されているが、純粋なトランスフェリンのように見える。これは、オクチルセファロース洗浄画分からトランスフェリンを精製することが可能であることを示しており、同じ開始材料からヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを精製することが可能であることも意味している（図１１も参照）。

Claims (12)

1. ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって：
   （ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
   （ｉｉ）硫酸アンモニウムを該溶液に添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
   （ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
   （ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよびヘモペキシンを別々に精製することを含み、
   ハプトグロビンを６から８の範囲内のｐＨで、溶液に硫酸アンモニウム２．３Ｍから２．５Ｍを添加することによって、該溶液から沈殿させることを特徴とする、
   前記方法。
2. 溶液に硫酸アンモニウム２．４Ｍを添加することによって、該溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む、請求項１に記載の方法。
3. ７のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液がさらにトランスフェリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 溶液がヒト血漿画分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 溶液がコーン画分ＩＶである、請求項５に記載の方法。
7. 溶液がコーン画分ＩＶ₄である、請求項６に記載の方法。
8. （ｉ）ハプトグロビン溶液を得るために、沈殿したハプトグロビンを緩衝液に溶解する
   こと；
   （ｉｉ）ハプトグロビンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、ハプトグロビン溶液を該樹脂に通過させること；
   （ｉｉｉ）該樹脂からハプトグロビンを溶出すること；および
   （ｉｖ）溶出したハプトグロビンを回収することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 脂質を脂質除去剤に結合させる条件下で、ハプトグロビン溶液を該脂質除去剤に曝露する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. （ｉ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
    （ｉｉ）工程（ｉ）の流出画分を収集すること；
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；ならびに
    （ｉｖ）工程（ｉｉ）の後および／または工程（ｉｉｉ）の後で該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；ならびに
    （ｖ）溶出したヘモペキシンを回収することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. （ｉ）ヘモペキシンを金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、溶出したヘモペキシンを該樹脂に通過させること；
    （ｉｉ）該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
    （ｉｉｉ）溶出したヘモペキシンを回収することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. （ａ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
    （ｂ）工程（ａ）の流出画分を収集すること；
    （ｃ）工程（ｂ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
    （ｄ）トランスフェリンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、工程（ｂ）の流出画分および／または工程（ｃ）の流出洗浄画分を該樹脂に通過させること；ならびに
    （ｅ）該樹脂からトランスフェリンを回収することをさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。