KR102125695B1 - 단백질 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 동일한 출발 물질로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

단백질 정제 방법{A METHOD OF PURIFYING PROTEINS}
본 발명은 일반적으로 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 동일한 출발 물질로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
용혈은 적혈구 세포의 파괴를 특징으로 하고, 적혈구 세포 이상(abnormalities), 예를 들면, 효소 결핍, 헤모글로빈병증, 유전성 구상적혈구증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증 및 자침 세포 빈혈증, 및 외부 인자, 예를 들면, 비장 비대, 자가면역 장애(예를 들면, 신생아의 용혈성 질환), 유전적 장애(예를 들면, 겸상 세포 질환 또는 G6PD 결핍증), 미세혈관병증성 용혈, 그람-음성 세균 감염(예를 들면, 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 스태 필로코커스(Staphylococcus)), 기생충 감염(예를 들면, 플라스모디 움(Plasmodium)), 독소 및 외상(예를 들면, 화상)과 관련된 빈혈 장애의 특징이다. 또한, 용혈은 수혈, 특히, 대량 수혈, 그리고 체외 심폐 보조장치(extracorporeal cardio-pulmonary support)를 이용하는 환자에서의 통상의 장애이다.
용혈과 관련된 병태를 지닌 환자에서 보여지는 부작용은 적혈구 세포로부터의 철 및 철-함유 화합물, 예를 들면, 헤모글로빈(Hb) 및 헴(heme)의 방출에 크게 기인한다. 생리학적 조건 하에, 방출된 헤모글로빈은 가용성 단백질, 예를 들면, 합토글로빈에 의해 결합되고, 대식세포 및 간세포에 수송된다. 그러나, 용혈의 발생 정도가 가속화되어 사실상 병리학적이 되는 경우, 합토글로빈의 완충 능력은 제압된다. 그 결과, 헤모글로빈은 철-헤모글로빈(ferri-haemoglobin)으로 빠르게 산화되고, 이는 결국 유리 헴(프로토포르피린 IX 및 철 포함)을 방출한다. 헴이 몇몇의 생물학적 프로세스에서 (예를 들면, 필수 단백질, 예를 들면, 헤모글로빈 및 미오글로빈의 일부로서) 중요한 역할을 행하지만, 유리 헴은 매우 독성이다. 유리 헴은 산화 환원-활성 철의 공급원이고, 이는, 지질막, 단백질 및 핵산을 손상시키는 매우 독성의 반응성 산소 종(ROS)을 생산한다. 헴 독성은, 이의 지질막으로 개재되는 능력에 의해 추가로 악화되고, 여기서, 이는 막 구성성분의 산화를 야기하고, 세포 용해 및 사멸을 촉진시킨다.
지속적 저-수준 세포외 Hb/헴 노출의 점진적 가압은, 생리학적 정상(steady)-상태 조건 하에 그리고 온건한 용혈 동안에 유리 Hb/헴의 부작용을 제어하는 보상적 메커니즘을 초래하였다. 이들 시스템은, Hb 스캐빈저 합토글로빈(Hp) 및 헴 스캐빈저 단백질 헤모펙신(Hx) 및 α1-마이크로글로불린을 포함하는, Hb 또는 헴에 결합하는 혈장 단백질의 그룹의 방출을 포함한다. 그러나, 내인성 Hp 및 Hx는 생리학적 정상-상태 조건 하에 유리 Hb/헴의 부작용을 제어하지만, 이들은 병리학적 조건, 예를 들면, 용혈과 관련된 병리학적 조건 하에 정상-상태 Hb/헴 수준을 유지함에 있어서 거의 효과를 갖지 않는다.
본 발명은, 동일한 출발 물질로부터 Hp 및 Hx을 정제하는 방법을 제공한다. 정제된 단백질은, 용혈 및 이상 Hb/헴 수준과 관련된 병태를 치료하기 위한 조성물에 사용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 양상에서, 합토글로빈 및 헤모펙신 단백질 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은,
(i) 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 용액에 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계;
(iii) 헤모펙신을 함유하는 상기 용액으로부터 상기 침전된 합토글로빈을 분리하는 단계; 및
(iv) 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제하는 단계
를 포함하는, 합토글로빈 및 헤모펙신 단백질 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 합토글로빈을 포함하는, 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 헤모펙신을 포함하는, 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 트랜스페린을 포함하는, 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 합토글로빈 및 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 헤모펙신을 포함하는, 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 95% 이상의 합토글로빈 함량을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 80% 이상의 헤모펙신 함량을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 80% 이상의 조합된 헤모펙신 및 합토글로빈 함량을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 바와 같은 본 발명의 조성물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제형이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 용혈과 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시되어 있는 바와 같은 본 발명의 조성물 또는 제형을 투여함을 포함하는, 용혈과 관련된 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 용혈과 관련된 병태를 치료하기 위한 의약의 제조시, 본원에 개시되어 있는 바와 같은 본 발명의 조성물 또는 제형의 용도가 제공된다.
도 1은, 콘 분획화 프로세스(Cohn Fractionation Process)의 플로우 다이아그램이다. 당해 분야 숙련가는, 도 1에 기술되는 프로세스 파라미터들(예를 들면, pH, 에탄올 농도, 온도 등)에 대한 편차들도 콘 분획을 생성하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
도 2는, 2.0M, 2.5M, 3.0M, 3.5M 및 4.0M 황산 암모늄의 존재시 침전에 따른 잔존 여과물 중의 트랜스페린(TRF), 알부민(Alb), 헤모펙신(HPX) 및 합토글로빈(HAP)d의 회수를 나타낸다.
도 3은, 실험(DOE) 설계의 바람직한 정도 플롯을 나타내고, 이는, 용액 중에 헤모펙신을 유지하면서 혈장 분획으로부터 합토글로빈이 침전될 수 있는 바람직한 조건을 나타낸다. DOE는, 합토글로빈으로부터 헤모펙신을 분리하는 능력에 대한 pH 및 황산 암모늄 농도의 영향을 평가하기 위해 사용한 제어된 실험의 세트이다. 공업 수학적 설계를 사용하여 설계하였고, 데이터를 분석하였다. 도 3에 도시된 바람직한 정도 플롯은, 헤모펙신 및 합토글로빈 둘 다의 최상의 분리 및 회수를 초래할 수 있는 가장 바람직한 조건을 결정하기 위해 이러한 수학적 설계를 사용한다.
도 4는, 본원에 개시되어 있는 정제 프로세스에서 각종 단계들에 따라 회수된 헤모펙신의 SDS-PAGE 전기영동을 나타낸다. pre-cast 10% Tris-글리신 겔(Novex, EC6075)을 이용하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 모든 샘플들을 0.1mg/mL의 농도로 Tris-글리신 SDS 샘플 완충액(LC2676) 중에 희석시켰고, 각각의 샘플의 20μL를 겔의 샘플 웰에 부하하였다. 실행 시간 및 전압은 겔 제조업자의 권고(125V 정전압)에 따라 설정하였다. 사용하기 쉬운 유형의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 용액(Novex, Simply Blue Safestain, LC6065)으로 각각의 겔을 염색하였다. 레인 1(LMWS)은 Novex Sharp Unstained Protein Standards, LC5801을 함유한다.
도 5는, 본원에 개시되어 있는 정제 프로세스에서 각종 단계들에 따라 회수된 합토글로빈 중간물들의 SDS-PAGE 전기영동(도 4에 상기 기술된 방법을 이용함)을 나타낸다. 레인 2의 합토글로빈 표준은 Benesis(T043HPX)로부터의 표준이다.
도 6은, 10% Tris-글리신 비-환원 SDS-PAGE 전기영동 겔 상의 Capto Q 용출물의 웨스턴 블롯을 나타낸다(도 4에 기술된 방법을 이용함). 이어서, 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 상기 막을 차단하여 항체의 임의의 비-특이적 결합을 방지한다. 이어서, 니트로셀룰로스 막을, 사람 합토글로빈(토끼 항-사람 합토글로빈, Sigma H8636)에 대한 항체를 함유하는 용액과 함께 항온배양한다. 이어서, 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 링크된 2차 항체를 니트로셀룰로스 막(염소 항-토끼 HRP, Sigma A6154)과 함께 항온배양한다. 이어서, 니트로셀룰로스를, 과산화물을 함유하는 용액으로 전개시킴으로써 사람 합토글로빈을 특이적으로 함유하는 단백질 밴드만을 가시화한다. 레인은 Capto Q ImpRes 용출물(T0209001)을 상이한 농도(레인 2 - 1:10 희석, 0.1mg/mL, 20μL 부하됨; 레인 3 - 1:20; 레인 4 - 1:40; 레인 5 - 1:80; 레인 6 - 1:160; 레인 7 - 1:320; 레인 8 - 1:640; 레인 9 - 1:1280; 및 레인 10 - 1:2560)로 함유한다. 웨스턴 블롯은, Capto Q 용출물에서 나타난 밴드의 대부분이 합토글로빈임을 나타낸다.
도 7은, 본원에 개시되어 있는 정제 프로세스에서 각종 단계들에 따른 이온-교환 크로마토그래피(Capto DEAE)로부터 회수된 트랜스페린의 SDS-PAGE 전기영동(도 4에 기술된 방법을 이용함)을 나타낸다. 피크 1(레인 4)은 과도하게 부하되어 있지만, (레인 2, 사람 트랜스페린, Sigma T8158에 비하여) 순수한 트랜스페린인 것으로 밝혀진다. 이는, 옥틸 세파로즈 세척 분획으로부터 트랜스페린을 정제하는 것이 가능함을 나타내고, 또한, 동일한 출발 물질로부터 헤모펙신, 합토글로빈, 및 트랜스페린을 정제하는 것이 가능함을 의미한다.
도 8은, 본원에 개시되어 있는 정제 프로세스 동안 이온-교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 선형 농도 구배인 트랜스페린의 크로마토그램을 나타낸다. 1 내지 4로 표지된 피크들은 도 7에서 SDS-PAGE에 의해 분석되었다.
도 9는, 본원에 개시되어 있는 한 실시형태에 따른 헤모펙신 정제 프로세스의 플로우 다이아그램이다.
도 10은, 본원에 개시되어 있는 한 실시형태에 따른 합토글로빈 정제 프로세스의 플로우 다이아그램이다.
도 11은, 본원에 개시되어 있는 실시형태에 따른 조합된 합토글로빈/헤모펙신/트랜스페린 정제 프로세스의 플로우 다이아그램이다.
본 명세서에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다" 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은, 언급된 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 제외를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
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대상 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수 형태 "한", "하나의" 및 "상기"는, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 양상들을 포함함에 주의해야만 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 수지"에 대한 언급은 단일 수지, 및 2개 이상의 수지들을 포함하고; "상기 조성물"에 대한 언급은 단일 조성물, 및 2개 이상의 조성물들을 포함한다.
대조적인 임의의 표시의 부재시, 본 명세서에 걸쳐 "%" 함량에 대해 이루어진 언급은 % w/w(중량/중량)을 의미하는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들면, 총 단백질의 95% 이상의 합토글로빈 함량을 포함하는 용액은, 총 단백질의 95% w/w 이상의 합토글로빈 함량을 포함하는 용액을 의미하는 것으로 고려된다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 동일한 출발 물질로부터 합토글로빈 및 헤모펙신이 정제될 수 있다는 발견에 대해 예측된다. 따라서, 본 발명의 한 양상에서, 합토글로빈 및 헤모펙신 단백질 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은,
(i) 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 용액에 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계;
(iii) 헤모펙신을 함유하는 상기 용액으로부터 상기 침전된 합토글로빈을 분리하는 단계; 및
(iv) 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제하는 단계
를 포함하는, 합토글로빈 및 헤모펙신 단백질 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법이 제공된다.
합토글로빈(Hp)은, 성인 간에 의해 합성되어 혈장으로 분비되는 4쇄(α2β2) 당단백질이다. Hp의 프로펩타이드(propeptide) 형태는 α-쇄 및 β-쇄로 단백질분해적으로 개열된다. 이어서, Hp 단백질의 2개의 α-서브유닛 및 2개의 β-서브유닛은 쇄간 디설파이드 결합에 의해 연결되어 성숙한 펩타이드를 형성하고, 이는 (αβ)-이량체 또는 (αβ)-다량체일 수 있다. 헤모펙신(Hx)은, 도메인간 링커에 의해 연결된 2개의 도메인을 형성하는 단일 439개 아미노산 길이 펩타이드 쇄를 포함하는 60-kD 혈장 β-1B-당단백질이다. 이는, 임의의 특성확인된 헴-결합 단백질의 헴에 대한 공지의 최고의 친화도(Kd<1pM)를 갖고, 도메인간 링커에 의해 형성된 포켓(pocket) 내의 Hx의 2개의 도메인들 사이에 등몰비로 헴에 결합한다.
본 발명자들은, 약 2.0M 내지 약 2.5M의 범위 내, 바람직하게는 약 2.2M 내지 약 2.5M의 범위 내, 보다 바람직하게는 약 2.4M의 황산 암모늄 농도가, 동일한 출발 물질로부터 단백질 둘 다를 분리하는데 최적임을 발견하였다. 따라서, 한 실시형태에서, 상기 방법은, 상기 용액에 약 2.0M 내지 약 2.5M의 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 상기 용액에 약 2.2M 내지 약 2.5M의 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 상기 용액에 약 2.4M의 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 황산 암모늄 농도는 2.0M 또는 2.1M 또는 2.2M 또는 2.3M 또는 2.4M 또는 2.5M이다.
또한, 본 발명자들은, 약 8 이하, 바람직하게는 약 6 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7의 범위로 유지된 pH가, 출발 물질로부터 단백질 둘 다를 분리하는데 최적임을 밝혔다. 따라서, 한 실시형태에서, 상기 방법은, 8 이하의 pH에서 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 약 6 내지 약 8의 범위 내의 pH에서 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 약 7의 pH에서 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은, 6.0 내지 8.0, 또는 6.25 내지 7.75, 또는 6.5 내지 8.0, 또는 6.5 내지 7.75, 또는 6.5 내지 7.5, 또는 6.75 내지 7.25, 또는 6.75 내지 7.5 범위 내의 pH에서 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함한다. pH는 전형적으로 합토글로빈 및 헤모펙신 용액에서, 그리고, 이어서, 황산 암모늄의 첨가 및 합토글로빈의 침전 동안에 측정한다. 필요에 따라 pH는 조정될 수 있다(전형적으로 pH를 조정하기 위해 사용된 산(예를 들면, HCl) 또는 염기(예를 들면, NaOH)의 농도는 0.05M 내지 0.6M의 범위 내이다).
본원에 개시되어 있는 방법들에서, 출발 물질로부터의 합토글로빈의 대다수는 황산 암모늄 침전물 내에서 발견될 것이고, 출발 물질로부터의 헤모펙신의 대다수는 잔존 용액(현탁액으로서도 나타냄)에서 발견될 것이다. 그러나, 당해 분야 숙련가는, 침전물이 약간의 헤모펙신(예를 들면, 미량의 Hx)을 포함할 수 있고, 잔존 용액(또는 현탁액)이 약간의 합토글로빈(예를 들면, 미량의 Hp)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 현탁액 및 침전물에 각각 미량의 Hp 및 Hx가 존재하는 경우, 본원에 개시되어 있는 방법들에 따라 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제함으로써 이들을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 당해 분야 숙련가는, 예를 들면, 단백질 둘 다가 결국 동일한 조성물 중에 존재하는 경우, 현탁액 및 침전물에 각각 존재할 수 있는 미량의 Hp 및 Hx은 허용될 수 있음을 이해할 수 있다.
합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 포함하는 임의의 용액은, 본원에 개시되어 있는 본 발명의 방법에서 출발 물질로서 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액은 트랜스페린을 추가로 포함한다. 적합한 출발 물질은 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있고, 이의 예로는 혈장 분획, 예를 들면, 에탄올 분획화 프로세스로부터 유도된 각종 상청액들 및 침전물들이 포함된다. 이러한 에탄올 분획화 프로세스의 예로는 콘(Cohn) 분획화 및 키슬러-닛슈만(Kistler-Nitschmann) 분획화가 포함된다. 적합한 혈장 분획의 예로는 콘 분획 I, II, III, II+III, I+II+III, IV 및 V(도 1 참조) 또는 키슬러-닛슈만 분획, 예를 들면, 침전물 A 또는 B로부터 유도된 것들이 포함된다. 한 실시형태에서, 상기 용액은 사람 혈장 분획이다. 다른 실시형태에서, 상기 용액은 콘 분획 IV이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용액은 콘 분획 IV4이다. 특정 실시형태에서, 콘 분획 IV4는 콘 분획 II+III 또는 콘 분획 I+II+III로부터 유도된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 용액은 분획 IV4 침전물로부터 유도된다.
출발 물질이 침전물(예를 들면, 분획 IV4 침전물)로서 제공되는 경우, 본 발명의 방법에 적합한 출발 용액을 제공하기 위해 침전물을 초기에 재가용화시킬 필요가 있을 것임이 이해될 것이다. 침전물을 재가용화시키기 위해 사용되는 완충제는, 대략 pH 7에서 완충 능력을 갖는 임의의 제제 또는 제제들의 조합일 수 있다(예를 들면, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, MOPS, BES, TRIS을 포함할 수 있음). 전형적으로, 완충제는 약 5mM 내지 약 100mM의 농도로 존재할 것이다. 한 실시형태에서, 재가용화 완충액은 50mM Tris, pH 7이다. 몇몇의 실시형태에서, 재가용화 완충액은 출발 물질의 그램당 약 5 내지 약 30그램으로 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 재가용화 완충액은 출발 물질의 그램당 5 내지 10그램으로 첨가되거나, 출발 물질의 그램당 10 내지 15그램으로 첨가되거나, 출발 물질의 그램당 15 내지 20그램으로 첨가되거나, 출발 물질의 그램당 20 내지 25그램으로 첨가되거나, 출발 물질의 그램당 25 내지 30그램으로 첨가된다.
본 발명의 방법은 헤모펙신, 합토글로빈, 및 임의로 트랜스페린의 상업적/공업적 규모의 정제에 적합하다. 예를 들면, 출발 물질로서 혈장 분획을 사용하는 겨우, 상업적/공업적 규모로 본 발명의 방법을 사용하는 것은, 적어도 약 500kg의 혈장으로부터 유도된 혈장 분획의 사용을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 혈장 분획은 배치(batch)당 적어도 약 5,000kg, 7,500kg, 10,000kg 및/또는 15,000kg의 혈장으로부터 유도될 것이다.
당해 분야 숙련가는, 분획화를 위한 혈장이, 항응고제를 함유하는 리셉터클(receptacle)에 수집된 혈액으로부터 세포 요소들을 분리한 후에 잔존하는 혈액의 액체부, 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 임의의 다른 적합한 수단에 의해, 예를 들면, 성분 채집술(apheresis) 절차에서 항응고화된 혈액의 연속적 여과 또는 원심분리에 의해 분리된 혈액의 액체부임을 이해할 것이다.
한 실시형태에서, 침전된 합토글로빈, 및 헤모펙신을 함유하는 용액을 회수하고, 본 발명에 따라 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제하기 전에 별도로 보관한다. 다른 실시형태에서, 침전된 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 함유하는 용액을 회수하고, 즉시 본 발명의 방법에 따라 추가의 정제 단계를 수행한다; 즉, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제한다.
따라서, 한 실시형태에서, 상기 방법은,
(i) 완충액에 상기 침전된 합토글로빈을 용해시켜 합토글로빈 용액을 얻는 단계;
(ii) 상기 합토글로빈 용액을, 상기 합토글로빈이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
(iii) 상기 수지로부터 상기 합토글로빈을 용출시키는 단계; 및
(iv) 상기 용출된 합토글로빈을 회수하는 단계
를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 다른 실시형태에서, 상기 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다.
크로마토그래피에 의한 단백질의 정제는, 축류 컬럼(axial flow column), 예를 들면, GE Healthcare, Pall Corporation, Millipore 및 Bio-Rad로부터 입수가능한 것들을 이용하거나, 반경류 컬럼(radial flow column), 예를 들면, Proxcys 또는 Sepragen으로부터 입수가능한 것들을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 크로마토그래피는, 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있는 팽창층(expanded bed) 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
대부분의 크로마토그래피 프로세스는, 본원에서 수지 또는 매트릭스로서도 상호교환적으로 나타내어지는 고체 지지체를 사용한다. 적합한 고체 지지체는 당해 분야 숙련가들에게 친숙할 것이고, 선택은 정제되는 생성물의 유형에 의존할 것이다. 적합한 고체 지지체의 예로는 무기 담체, 예를 들면, 유리 및 실리카 겔, 유기, 합성 또는 천연 발생 담체, 예를 들면, 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 이기능성 아크릴레이트들의 비닐 공중합체, 및 각종 하이드록실화된 단량체들 등이 포함된다. 상업적으로 입수가능한 담체는 상품명 Sephadex™, Sepharose™, Hypercel™, Capto™, Fractogel™, MacroPrep™, Unosphere™, GigaCap™, Trisacryl™, Ultrogel™, Dynospheres™, Macrosorb™ 및 XAD™ 수지 하의 고체이다.
크로마토그래피 단계는 일반적으로 비-변성 조건 하에, 그리고, 약 -10℃ 내지 +30℃의 편리한 온도에서, 보다 통상적으로는 약 주위 온도에서 수행될 것이다. 크로마토그래피 단계는 편의에 따라 배치식으로(batch-wise) 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 임의의 편리한 분리 방법, 예를 들면, 컬럼, 원심분리, 여과, 또는 디켄팅 등을 사용할 수 있다.
합토글로빈 침전물을 용해시키기에 적합한 완충액은 당해 분야 숙련가들에게 친숙할 것이고, 크로마토그래피 정제 단계를 수행하기 위해 요구되는 조건에 의존할 수 있다. 전형적으로, 완충액은 약 5mM 내지 약 100mM의 완충제(즉, Tris) 농도를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 10mM 내지 약 60mM이다. 또한, 당해 분야 숙련가는, 완충액이 1개 초과의 완충제를 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 적합한 완충액의 예로는, pH 범위가 5.5 내지 9.0인 나트륨 아세테이트 및 Tris가 있다. 몇몇 실시형태에서, 합토글로빈 침전물을 용해시키기 위해 사용되는 완충액의 pH는 pH 7.5 내지 9.0, 또는 pH 7.75 내지 9.0, 또는 pH 8.0 내지 9.0, 또는 pH 8.25 내지 9.0, 또는 pH 8.4 내지 8.6이다. 바람직한 실시형태에서, 완충액은, pH가 약 pH 8.4 내지 약 pH 8.6인 약 50mM의 Tris이다.
실시형태들에서, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물(즉, 합토글로빈 용액)의 지질 함량은, 지질이 지질 제거제에 결합하도록 하는 조건 하에 상기 합토글로빈 용액을 지질 제거제에 노출시킴에 의해 감소된다. 이러한 지질 제거제의 예로는 흄드 실리카(fumed silica), 예를 들면, Aerosil이 포함된다. 한 실시형태에서, 지질 제거제는 흄드 실리카이다. 한 실시형태에서, 흄드 실리카는 Aerosil(예를 들면, Aerosil 380)이다. 실시형태들에서, Aerosil과 같은 지질 제거제는, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물에 등가의 혈장 리터당 약 0.5g 내지 약 4g으로 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 지질 제거제, 예를 들면, Aerosil은, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물에 등가의 혈장 리터당 1 내지 2g으로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 지질 제거제, 예를 들면, 흄드 실리카(예를 들면, Aerosil)는, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물에 당가의 혈장 리터당 1.6 내지 1.8g으로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 지질 제거제, 예를 들면, Aerosil은, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물에 등가의 혈장 리터당 1.8 내지 2.0g으로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 지질 제거제, 예를 들면, Aerosil은, 합토글로빈을 포함하는 추출된 침전물에 등가의 혈장 리터당 1.6g으로 첨가된다. 지질 제거는 특정 pH 범위 내에서 가장 효과적인 것으로 측정되었다. 5.5 내지 9.0의 pH 범위는, Aerosil과 함께 효과적인 것으로 밝혀졌다. 몇몇의 실시형태에서, pH 범위는 6.5 내지 8.6이다. 다른 실시형태에서, 지질 제거 단계 동안의 pH는 pH 5.5 내지 9.0, 또는 pH 5.75 내지 9.0, 또는 pH 6.0 내지 9.0, 또는 pH 6.25 내지 9.0, 또는 pH 6.5 내지 9.0, 또는 pH 6.75 내지 9.0, 또는 pH 7.0 내지 9.0, 또는 pH 7.25 내지 9.0, 또는 pH 7.5 내지 9.0, 또는 pH 7.75 내지 9.0, 또는 pH 8.0 내지 9.0, 또는 pH 8.25 내지 9.0, 또는 pH 8.4 내지 9.0 또는 pH 8.6 내지 9.0이다. 바람직한 실시형태는 8.4 내지 8.6의 pH 범위를 사용한다.
지질 제거제는, 여과 또는 원심분리와 같은 방법을 이용하여 제거될 수 있다. 특정 실시형태에서, 지질 제거제는 심층 여과에 의해 제거된다. 본 출원에서 사용하기 위한 심층 필터의 예로는 Cuno 70CA 또는 유사하거나 보다 작은 입자 크기 보유 능력의 필터가 있다.
당해 분야 숙련가는, 합토글로빈이 크로마토그래피 수지에 결합할 수 있고, 한편, 합토글로빈 용액 중의 소정 불순물이 수지를 통해 통과하도록 하는 한, 임의의 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 이용하여 합토글로빈 용액으로부터 합토글로빈을 별도로 정제할 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 강한 음이온 교환 수지이다. 다른 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 약한 음이온 교환 수지이다. 또한, 당해 분야 숙련가들은, 추출 완충액의 이온 강도 및 부하 용액의 후속적 pH 조정으로 인하여; 합토글로빈이 수지에 결합하도록 하기 위해 희석, 투석 여과, 크로마토그래피 탈염, 또는 완충액 교환/이온 강도 감소의 기타 방법이 요구될 수 있음을 결정할 수 있다. 적합한 수지는 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있다. 적합한 음이온 교환 수지의 예로는 기능성 4급 아민 그룹(Q) 및/또는 디에틸아미노프로필 그룹(ANX)을 포함하는 음이온 교환 수지가 있다. 한 실시형태에서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 기능성 4급 아민 그룹(예를 들면, Capto Q ImpRes™)을 포함한다.
크로마토그래피 배지의 평형화에 적합한 용액(종종 평형화 완충액으로서도 나타냄)은 일반적으로 약 5mM 내지 약 100mM의 완충제 농도를 갖는다. 평형화 완충액의 pH는 통상적으로 약 5 내지 약 9의 범위 내일 것이고, 전도도는 전형적으로 약 9mS/cm 미만이다. 이들 조건은 일반적으로 음이온 교환 배지에의 합토글로빈의 결합을 가능하게 한다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 10mM 내지 약 60mM의 농도 범위 내일 것이다. 특정 실시형태에서, 평형화 완충액의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0의 pH 범위 내이다. 몇몇의 실시형태에서, pH는 약 5.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 약 5.3 내지 약 5.7의 범위 내이다. 특정 실시형태에서, 평형화 완충액의 pH는 pH 5.3 ± 0.1, 또는 pH 5.4 ± 0.1, 또는 pH 5.5 ± 0.1, 또는 pH 5.6 ± 0.1, 또는 pH 5.7 ± 0.1, 또는 pH 5.8 ± 0.1이다. 몇몇의 실시형태에서, 평형화 완충액의 전도도는 약 7.0mS/cm 미만이다. 특정 실시형태에서, 평형화 완충액의 전도도는 6.0mS/cm 미만, 또는 5.0mS/cm 미만이다. 평형화 완충액용 완충제의 예로는 나트륨 아세테이트가 있다. 특정 실시형태는 5.0 내지 6.0 범위 내의 pH로의 50mM의 나트륨 아세테이트를 사용하고, 6.0mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 다른 실시형태는 약 5 내지 약 6의 pH로의 약 10 내지 약 40mM의 나트륨 아세테이트를 사용한다. 특정 실시형태에서, 평형화 완충액은 pH 5.3 내지 pH 5.7 범위의 pH, 및 5.0mS/cm 미만의 전도도를 갖는 50mM의 나트륨 아세테이트를 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피 수지를 거쳐 통과되는 합토글로빈 용액은, 수지에 결합하는 것을 가능하게 하기 위해서 이온 강도를 감소시키기 위해 완충액 교환, 탈염 또는 희석을 초기에 요구할 수 있다. 완충액 교환, 탈염 또는 희석에 적합한 용액으로는, 완충제를 약 5mM 내지 약 100mM의 농도로 갖는 용액이 포함된다. 이들 용액의 pH 범위는 전형적으로 약 pH 5 내지 약 9의 범위 내이다. 한편, 전도도는 일반적으로 약 8.0mS/cm 미만이다. 특정 실시형태에서, 완충액 교환, 탈염 또는 희석을 위한 용액은, 약 5 내지 약 9의 pH 범위 및 약 7.0mS/cm 미만의 전도도를 갖는, 약 10mM 내지 약 60mM 범위 내의 완충제를 포함할 것이다. 완충액 효관, 탈염 또는 희석을 위한 용액의 예로는 나트륨 아세테이트가 있다. 특정 실시형태는, 6.0mS/cm 미만의 전도도를 갖는 5.0 내지 6.0의 pH 범위에서 50mM의 나트륨 아세테이트를 이용한다. 다른 실시형태는 약 5 내지 약 6의 pH로의 약 10 내지 약 40mM 나트륨 아세테이트를 이용한다.
다른 실시형태는, 이온 강도를 감소시키기 위해 물(예를 들면, 주사용수(WFI))의 첨가에 의한 합토글로빈 부하 용액의 희석을 포함한다. 예를 들면, WFI로의 1:4 내지 1:5 희석시, pH 5.3 내지 5.7에서 50mM의 나트륨 아세테이트를 포함하는 합토글로빈 용액은 pH 5.3 내지 5.7에서 약 10 내지 13mM의 최종 나트륨 아세테이트 농도를 가질 수 있고, 5.0mS/cm 미만의 전도도를 가질 수 있다. 이는 일반적으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 대한 합토글로빈의 결합을 가능하게 한다.
합토글로빈 용액 중의 완충제/완충제들의 완충 범위 이상으로 pH 조정이 요구되는 경우, 합토글로빈 용액에 추가의 완충제를 첨가할 수 있다. 추가의 완충제는 전형적으로 약 5mM 내지 약 100mM의 농도, 및 약 5 내지 약 9의 pH 범위를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 추가의 완충제는 약 5 내지 약 9의 pH 범위에서 약 10mM 내지 약 60mM의 범위 내일 것이다. 추가의 완충제의 예로는 나트륨 아세테이트가 있다. 특정 실시형태는 5.0 내지 6.0의 pH 범위로의 50mM의 나트륨 아세테이트를 이용한다. 바람직한 실시형태에서, 완충액은 pH 5.3 내지 pH 5.7의 범위 내의 pH로의 50mM의 나트륨 아세테이트이다.
또한, 수지로부터 합토글로빈을 용출시키기에 적합한 완충액은 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 특정 실시형태에서, 적합한 완충제는 약 5mM 내지 약 100mM 범위 내의 농도를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 10mM 내지 약 60mM의 범위 내일 것이다. 한 예로는 나트륨 아세테이트가 포함된다. 특정 실시형태는 5.0 내지 6.0의 pH로의 50mM의 나트륨 아세테이트를 이용한다. 다른 실시형태는 약 5.0 내지 약 6.0의 pH로의 약 10 내지 약 40mM의 나트륨 아세테이트 완충액을 이용한다. 바람직한 실시형태에서, 완충액은 약 pH 5.3 내지 약 pH 5.7의 pH로의 약 50mM의 나트륨 아세테이트이다.
추가의 실시형태에서, 합토글로빈은, 약 100mM 내지 약 200mM의 NaCl을 포함하는 용출 완충액을 이용하여 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 이는, 약 10mS/cm(100mM NaCl) 내지 약 18mS/cm(200mM NaCl)의 전도도 범위를 갖는 용출 완충액에 해당한다. 특정 실시형태에서, 합토글로빈은 약 150 내지 170mM의 NaCl의 존재시 용출된다. 바람직한 실시형태에서, 합토글로빈은 약 160mM의 NaCl의 존재시에 용출된다. 그러나, 당해 분야 숙련가는, 용출 완충액의 NaCl 농도가, 컬럼에 적용된 단백질 부하에 의존할 것이고, 수지로부터 용출된 합토글로빈의 필수적 회수 및 순도를 달성하기 위해 기술된 한계 이상의 조정이 요구될 수 있음을 알 것이다.
한 실시형태에서, 용출된 합토글로빈은 회수하고 미래 사용을 위해 별도로 보관한다. 다른 실시형태에서, 용출된 합토글로빈은, 예를 들면, 용출된 합토글로빈을 한외여과막을 통해 농축 및 투석 여과하고/하거나 필요에 따라 농축되고/되거나 투석 여과된 합토글로빈을 멸균 여과함으로써 추가로 정제된다.
한 실시형태에서, 상기 방법은,
(i) 상기 헤모펙신을 함유하는 용액을, 상기 헤모펙신이 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
(ii) 상기 단계 (i)로부터 상기 통과액 분획을 수집하는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii) 이후에 상기 수지를 임의로 세척하고 상기 통과액 세척 분획을 수집하는 단계;
(iv) 상기 단계 (ii) 및/또는 상기 단계 (iii) 이후에 상기 수지로부터 상기 헤모펙신을 용출시키는 단계; 및
(v) 상기 용출된 헤모펙신을 회수하는 단계
를 추가로 포함한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는, 고정상(stationary phase)과 분리되는 단백질 사이의 소수성 상호작용에 근거한 단백질의 분리를 위해 빈번하게 사용되는 크로마토그래피 기술이다. 표적 단백질의 소수성 수준은, 종종 사용되는 HIC 수지의 유형을 좌우할 것이다. HIC 동안, 높은 양의 염은 전형적으로 상기 용액에 첨가되어 표적 단백질의 가용성을 감소시키고, 따라서, 적합한 소수성 그룹(예를 들면, 페닐, 부틸 및 옥타데실 그룹)으로 기능화된 HIC 수지와의 표적 단백질의 상호작용을 증가시킨다. 적합한 염으로는 전형적으로 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 염화 나트륨, 브롬화 나트륨, 및 티오시안산 나트륨이 포함된다. 적합한 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지는 당해 분야 숙련가에게 친숙할 수 있다. 예로는 옥틸 세파로즈 및 카프토 옥틸 크로마토그래피 수지가 포함된다. 헤모펙신이 수지에 결합하도록 하는 조건은 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 것이고, 예를 들면, 사용되는 수지의 유형 및 표적 단백질(즉, 헤모펙신)의 소수성에 의해 좌우될 것이다.
헤모펙신 부하 용액은 황산 암모늄을 함유하고, 따라서, 컬럼 평형화에 적합한 완충액은 완충제를 약 5mM 내지 약 100mM의 농도로 포함하고, 이는 약 6 내지 약 8의 pH를 유지할 수 있고, 대략 2 내지 2.5M 황산 암모늄을 함유할 것이다. 이들 조건은 소수성 상호작용 크로마토그래피 배지에의 헤모펙신의 결합을 가능하게 할 수 있다. 다른 실시형태는 pH 7.0 내지 8.0에서 2.2 내지 2.5M의 황산 암모늄을 사용한다. 특정 실시형태에서, 완충액은, 7.4의 pH에서 2.5M의 황산 암모늄을 함유하는 50mM의 Tris이다.
헤모펙신 부하 용액은, 전형적으로 약 6 내지 약 8의 pH로 완충된 약 2.0 내지 약 2.5M의 황산 암모늄을 함유한다. 이들 조건은, 소수성 상호작용 배지에의 헤모펙신의 결합을 가능하게 한다. 다른 실시형태에서, 헤모펙신 부하 용액은, 7.0 내지 8.0의 pH로 완충된 2.2M 내지 2.5M의 황산 암모늄을 함유하였다. 특정 실시형태에서, 헤모펙신 부하 용액은 완충제로서의 50mM의 Tris, 및 7.4의 pH로의 2.5M의 황산 암모늄을 함유한다.
일단 헤모펙신을 함유하는 용액이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지를 통해 통과되면, 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 통과액 분획을 수집하여 미래 사용을 위해 보관할 수 있다.
결합된 헤모펙신은, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 수단에 의해 수지로부터 용출될 수 있다. 수지로부터 헤모펙신을 용출하기 전에, 수지는, 임의로, 수지에 결합된 헤모펙신을 유지하는 조건 하에 적합한 세척액 또는 완충액을 이용하여 세척할 수 있다. 적합한 세척액 및 조건은 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 세척액 농도는 컬럼 부하에 대한 소정 정도에 의존하지만, 전형적인 세척액은 약 6 내지 약 8의 pH에서 완충 효과를 가질 것이고, 추가로 대략 0.8M 내지 1.5M의 황산 암모늄을 함유한다. 다른 실시형태에서, 세척액은 7.0 내지 8.0의 pH로의 0.9M 내지 1.3M 황산 암모늄을 함유한다. 특정 실시형태에서, 세척액은 완충제로서의 50mM의 Tris, 7.4의 pH로의 1.13M의 황산 암모늄을 함유한다. 또한, 통과액 세척 분획을 수집하여 필요에 따라 미래 사용을 위해 보관할 수 있다.
수지로부터 회수되는 용출된 헤모펙신은 미래 사용을 위해 보관할 수 있다. 또한, 용출된 헤모펙신은 추가의 정제를 수행하여 용출물 중의 임의의 불순물들ㅇ르 제거할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 상기 방법은,
(i) 상기 용출된 헤모펙신을, 상기 헤모펙신이 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
(ii) 상기 수지로부터 상기 헤모펙신을 용출시키는 단계; 및
(iii) 상기 용출된 헤모펙신을 회수하는 단계
를 추가로 포함한다.
고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 금속에 대한 아미노산(예를 들면, 히스티딘)의 공유결합적 부착에 근거하고, 이는, 단백질이, 고정화된 금속 이온, 예를 들면, 아연, 코발트, 니켈 또는 구리를 함유하는 컬럼 내에 유지되는 금속 이온에 대한 친화도를 갖도록 한다. 적합한 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지는 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 수 있다. 한 실시형태에서, 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지는 Ni-세파로즈이다.
평형화 및 결합에 적합한 완충액은, 크로마토그래피 배지에의 비-특이적 결합을 방지하도록 설계되고, 오염물 단백질의 결합을 최소화하면서 헤모펙신의 친화도를 증진시키도록 최적화된다. 평형화 및 결합에 사용된 완충액은 일반적으로 약 6 내지 약 9의 pH 범위 내일 수 있고, 소량(즉, 1 내지 50mM)의 히스티딘 또는 이미다졸의 첨가와 함께 약 0.5M 내지 약 1.0M 염화 나트륨의 첨가를 포함할 수 있다. 소정 실시형태에서, 완충액은, 약 pH 7 내지 약 8로의 pH 0.5mM 내지 100mM의 인산 나트륨, 약 0.5M 내지 약 1.0M의 염화 나트륨, 및 약 1mM 내지 약 50mM의 이미다졸로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 평형화 및 결합 완충액은 pH 7.4로의 20mM의 인산 나트륨, 0.5M의 NaCl, 및 30mM의 이미다졸로 이루어진다. 부하 용액(옥틸 용출물)은, 바람직한 고체 부형제의 첨가를 통해 또는 농축된 용액의 첨가에 의해 이들 농도를 조정할 수 있다.
일단 헤모펙신이 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지에 결합되면, 상기 수지를 세척하여, 수지에 결합된 헤모펙신을 유지하는 조건 하에 임의의 잔존하는 결합되지 않거나 약하게 결합된 불순물들을 제거할 수 있다. 세척 단계에 적합한 완충액은 6.0 내지 9.0의 pH 범위 내일 수 있고, 소량(즉, 1 내지 50mM)의 히스티딘 또는 이미다졸의 첨가와 함께 0.5M 내지 1.0M의 염화 나트륨의 첨가를 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 완충액은, 약 pH 7 내지 약 pH 8로의 약 0.5mM 내지 약 100mM의 인산 나트륨, 약 0.5M 내지 약 1.0M의 염화 나트륨, 및 약 1mM 내지 약 80mM의 이미다졸로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 세척 완충액은, pH 7.4로의 20mM의 인산 나트륨, 0.5M의 NaCl, 및 30mM의 이미다졸로 이루어진다.
결합된 헤모펙신은, 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있는 수단에 의해 수지로부터 용출될 수 있다. 용출에 적합한 완충액은 약 6 내지 약 9의 pH 범위 내일 수 있고, 용출을 가능하게 하는데 충분히 높은 농도로의 히스티딘 또는 이미다졸과 함께 약 0.5M 내지 약 1.0M의 염화 나트륨의 첨가를 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 용출 완충액은 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0으로의 약 0.5mM 내지 약 100mM의 인산 나트륨, 약 0.5M 내지 1.0M의 염화 나트륨, 및 약 80mM 미만의 이미다졸로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 용출 완충액은 pH 7.4로의 20mM의 인산 나트륨, 0.5M의 NaCl, 및 100mM의 이미다졸로 이루어진다. 대안으로, 결합된 헤모펙신은 약 pH 4.0 내지 약 pH 6.0의 낮은 pH 완충액의 적용을 통해 용출될 수 있다. 몇몇의 실시형태는, 용출 완충액으로서 약 4.0 내지 약 pH 6.0의 pH로의 약 5mM 내지 약 100mM의 나트륨 아세테이트 완충액을 약 0.5M 내지 약 1.0M의 NaCl과 함께 사용할 수 있다. 용출된 헤모펙신은, 예를 들면, 한외여과막을 통해 헤모펙신을 농축시키고 투석 여과하고/하거나, 필요에 따라 농축되고/되거나 투석 여과된 헤모펙신을 멸균 여과함으로써 추가로 정제될 수 있다.
또한, 본 발명자들은, 출발 물질 중에 존재할 수 있는 임의의 트랜스페린이, 황산 암모늄의 존재시의 합토글로빈의 침전 후에 용액 중에(즉, 헤모펙신을 포함하는 용액 중에) 잔존함을 발견하였다. 따라서, 본원에 개시되어 있는 본 발명의 방법은, 또한, 동일한 출발 물질로부터 트랜스페린을 정제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 동일한 출발 물질로부터 3개의 단백질들(Hp, Hx 및 트랜스페린) 모두를 정제하기 위해 최적인 조건들이 제공된다. 따라서, 한 실시형태에서, 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액(예를 들면, 출발 물질)은 트랜스페린을 추가로 포함할 것이다.
한 실시형태에서, 상기 방법은,
(a) 상기 헤모펙신을 함유하는 용액을, 상기 헤모펙신이 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 통과액 분획을 수집하는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 이후에 상기 수지를 임의로 세척하고 상기 통과액 세척 분획을 수집하는 단계;
(d) 상기 단계 (b)로부터의 통과액 분획 및/또는 상기 단계 (c)로부터의 통과액 세척 분획을, 트랜스페린이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계; 및
(e) 상기 수지로부터 상기 트랜스페린을 회수하는 단계
를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다.
적합한 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 적합한 음이온 교환 수지의 예로는 기능성 4급 아민 그룹(Q) 및/또는 디에틸아미노프로필 그룹(ANX)을 포함하는 것이 있다. 한 실시형태에서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 기능성 4급 아민 그룹(예를 들면, Capto Q ImpRes™)을 포함한다.
적합한 약한 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 예로는, 3차 또는 2차 아민 기능성 그룹을 포함하는 수지, 예를 들면, DEAE(디에틸아미노에틸)가 포함된다.
당해 분야 숙련가들은, 또한, HIC 세척 완충액의 이온 강도로 인하여; 트랜스페린이 음이온 교환 수지에 결합하도록 하기 위해 희석, 투석 여과, 크로마토그래피 탈염, 또는 완충액 교환/이온 강도 감소의 기타 방법이 요구될 수 있음을 결정할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 탈염의 한 방법은, 약 0.8M 내지 약 1.5M의 황산 암모늄을 함유하는 HIC 세척 분획(트랜스페린)을, 보다 강한 소수성 리간드, 예를 들면, 페닐 또는 부틸 컬럼 상에 직접적으로 결합시킴을 포함한다. 일단 결합되면, 트랜스페린은, 음이온 교환 크로마토그래피용 제제의 WFI 또는 저 이온 강도 완충액 중에 용출될 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 평형화 및 결합에 적합한 완충액은, 음이온 교환 배지에의 트랜스페린의 결합을 가능하게 하여 다른 불순물로부터의 트랜스페린의 크로마토그래피 분리를 촉진시킨다. 크로마토그래피 배지의 평형화에 적합한 완충액은 약 5mM 내지 약 100mM의 농도, 약 6 내지 약 9의 pH 범위, 약 9.0mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 이들 조건은 음이온 교환 배지에의 트랜스페린의 결합을 가능하게 한다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 10mM 내지 약 60mM의 범위 내일 것이고, 약 6 내지 약 9의 pH 범위를 갖고, 약 7.0mS/cm 미만의 전도도를 가질 것이다. 적합한 완충제의 예로는 Tris 및 인산 나트륨이 포함된다. 특정 실시형태는, 약 6.0mS/cm 미만의 전도도로 약 7 내지 약 9 범위 내의 pH 범위로의 50mM의 Tris를 사용한다. 다른 실시형태는, 약 5.0mS/cm 미만의 전도도로 약 7.0 내지 약 9.0의 pH로의 약 10 내지 약 40mM의 Tris 완충액을 사용한다.
또한, 수지로부터 트랜스페린을 용출시키기에 적합한 완충액도 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 특정 실시형태에서, 적합한 완충제는 약 5mM 내지 약 100mM 범위의 농도를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 10mM 내지 약 60mM의 범위 내일 것이다. 적합한 완충제의 예로는 Tris 또는 인산 나트륨이 포함된다. 특정 실시형태는 약 7 내지 약 9 범위 내의 pH로의 50mM Tris를 사용한다. 다른 실시형태는, 약 7 내지 약 9의 pH로의 약 10 내지 약 40mM의 나트륨 아세테이트 완충액을 사용한다. 당해 분야 숙련가들은, 용출 완충액 NaCl 농도가, 크로마토그래피 수지에 적용된 단백질 부하 정도에 의존함을 알 것이다. 용출 방법은, 완충액의 NaCl 농도는 단계별 분획에서 증가되어 트랜스페린을 용출시키는 농도 구배 단계로, 또는 완충액의 NaCl이 선형 방식으로 서서히 증가하고, 트랜스페린의 수집을 확실히 하기 위해 컬럼 용출액을 모니터링하는 선형 농도 구배를 사용하여 이루어질 수 있다.
일단 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 트랜스페린이 회수되면, 예를 들면, 한외여과막을 통해 트랜스페린을 농축시키고 투석 여과하고/하거나, 필요에 따라 농축되고/되거나 투석 여과된 트랜스페린을 멸균 여과함으로써 추가로 정제될 수 있다.
합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 용액이 임상학적 또는 수의학적 적용에(예를 들면, 용혈과 관련된 병태를 지닌 대상체에게의 투여에) 사용되는 경우, 당해 분야 숙련가들은, 용액 중의 활성 바이러스 함량(바이러스 역가) 및 다른 잠재적 감염성 제제(예를 들면, 프리온(prion))의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 이는, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 공급 원료(즉, 출발 물질)가 혈장으로부터 유도되는 경우에 특히 바람직할 수 있다. 용액 중의 바이러스 역가를 감소시키는 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 예로는 저온 살균(pasteurization)(예를 들면, 글리신(예를 들면, 2.75M) 및 슈크로스(예를 들면, 50%)와 같은 고농도의 안정화제 및/또는 다른 선택된 부형제들 또는 염들의 존재 하에 60℃에서 10시간 동안 항온배양함), 건식 열 처리, 바이러스 여과(나노-필터를 통해 용액을 통과시킴; 예를 들면, 20nm 컷-오프) 및/또는 용액 중의 바이러스를 불활성화시키기 위한 조건 하에 일정 시간 동안 적합한 유기 용매 및 세제로 상기 용액을 처리함이 포함된다. 용매 세제는, 특히 혈장-유도된 생성물 중의 외피 바이러스를 불활성화시키기 위해 20년에 걸쳐 사용되어 왔다. 따라서, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 시약들 및 방법들을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[US 4540573 및 US 4764369]을 참조한다). 적합한 용매로는 트리-n-부틸 포스페이트(TnBP) 및 에테르가 포함되고, 바람직하게는 TnBP(전형적으로는 약 0.3%)가 포함된다. 적합한 세제의 예로는 폴리소르베이트(Tween) 80, 폴리소르베이트(Tween) 20 및 Triton X-100(전형적으로는 약 0.3%)이 포함된다. 용매 및 세제 농도를 포함한 처리 조건의 선택은, 부분적으로, 일반적으로 보다 높은 시약 농도 및 보다 극한 반응 조건을 요구하는 덜 순수한 공급 원료로의 공급 원료의 특성들에 의존한다. 바람직한 세제는 폴리소르베이트 80이 있고, 특히 바람직한 조합은 폴리소르베이트 80 및 TnBP이다. 공급 원료는, 용매 및 세제 시약과 함께, 존재할 수 있는 임의의 외피 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 일정 온도에서 그리고 일정 시간 동안 스터링할 수 있다. 예를 들면, 용매 세제 처리는 25℃에서 약 4시간 동안 수행할 수 있다. 후속적으로, 예를 들면, 크로마토그래피 배지, 예를 들면, C-18 소수성 수지 상의 흡착, 또는 목적하는 단백질을 흡착시키는 조건 하에 이온 교환 수지의 적하액(drop-through) 분획에서 이들을 용출시킴에 의해 용매 세제 화학물질을 제거할 수 있다.
바이러스 불활성화 단계는, 본원에 개시되어 있는 방법의 임의의 적합한 단계로 수행할 수 있다. 한 실시형태에서, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 공급 원료는, 처음으로 기술된 양상으로부터의 상기 단계 (ii) 전에 바이러스 불활성화 단계를 수행한다. 다른 실시형태에서, 황산 암모늄 침전 단계로부터(즉, 상기 단계 (ii) 및/또는 (iii)으로부터) 회수되는, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 용액은 바이러스 불활성화 단계를 수행한다. 다른 실시형태에서, 바이러스 불활성화 단계는 상기 단계 (iii) 후에 수행한다.
본원에 개시되어 있는 한 실시형태에서, 바이러스 불활성화 단계는 저온 살균 및/또는 유기 용매 및 세제를 이용한 처리를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 용액을 55℃ 내지 61℃에서 약 30분 내지 약 12시간 동안 가열함을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 용액을 약 10 내지 약 10.5시간 동안 가열한다. 본원에 개시되어 있는 다른 실시형태에서, 바이러스 불활성화 단계는 바이러스 여과를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 용액을 15mm 내지 35mm 범위의 공극 크기를 갖는 바이러스 필터를 통해 여과함을 추가로 포함한다. 바이러스 여과가 사용되는 경우, 본 발명자들은, 여과 단계 전의 유리 아미노산(예를 들면, 아르기닌)의 첨가가, 필터를 통한 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린의 플럭스 속도(flux rate) 및 회수를 유의하게 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 이러한 방법의 예는 문헌[US7919592]에 기술되어 있다.
본원에 개시되어 있는 실시형태에서, 공급 원료, 또는 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 용액은, 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키기 전에 바이러스 불활성화 단계를 수행한다. 처리된 용액 또는 공급 원료를 크로마토그래피 수지, 예를 들면, 음이온 교환 수지를 통해 통과시키기 전에 바이러스 불활성화 단계, 예를 들면, 용매 세제 처리를 사용하는 것의 이점은, 즉, 수지에의 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린의 결합 및 통과액(적하액) 분획으로의 유기 용매 및 세제의 제거를 촉진시키는 조건을 이용함으로써 처리된 용액으로부터의 유기 용매 및 세제의 제거를 가능하게 한다.
저온 살균은 단백질 응집물 및 중합체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 몇몇의 예에서는 저온 살균된 용액 중의 응집물/중합체의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 달성될 수 있지만, 추가의 크로마토그래피 정제에 의해 편리하게 달성될 수 있다. 본원에 개시되어 있는 한 실시형태에서, 저온 살균된 용액 또는 공급 원료는, 임의의 응집물들 또는 중합체들이 통과액(적하액) 분획으로 제거되도록 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린에 관한 양성 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시킨다.
특정 실시형태에서, 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린의 정제 방법은 약 18℃ 내지 약 26℃의 온도 범위에서 일반적으로 수행된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법들에 의해 회수된 합토글로빈을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 80% 이상의 합토글로빈 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 90% 이상의 합토글로빈 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 95% 이상의 합토글로빈 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 98% 이상의 합토글로빈 함량을 포함한다. 특정 실시형태에서, 합토글로빈을 포함하는 조성물은 면역비탁계측(immunonephelometry)에 의해 측정시 합토글로빈의 mg당 0.03mg 미만의 IgA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 합토글로빈을 포함하는 조성물은, 합토글로빈 농도가 26mg/mL인 경우, 0.067mg/mL 미만의 IgG, 0.042mg/mL 미만의 IgM, 0.050mg/mL 미만의 알파-1-산 당단백질, 0.018mg/mL 미만의 프레-알부민, 0.021mg/mL 미만의 세룰로플라스민, 0.051mg/mL 미만의 헤모펙신, 0.053mg/mL 미만의 아포리포단백질 A-I, 0.227mg/mL 미만의 아포리포단백질 B, 0.031mg/mL 미만의 항트롬빈 III, 0.1mg/mL 미만의 트랜스페린, 0.07mg/mL 미만의 알파-1-항트립신, 0.1mg/mL 미만의 알파-2-마크로글로불린, 0.7mg/mL 미만의 IgA, 및 0.15mg/mL 미만의 알부민을 함유한다(면역비탁계측에 의해 측정된 바와 같음).
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수되는 헤모펙신을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 80% 이상의 헤모펙신 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 90% 이상의 헤모펙신 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 95% 이상의 헤모펙신 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 97% 이상의 헤모펙신 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 98% 이상의 헤모펙신 함량을 포함한다.
특정 실시형태에서, 헤모펙신을 포함하는 조성물은 98% 이상의 순도이고, 0.067mg/mL 미만의 IgG, 0.066mg/mL 미만의 IgA, 0.042mg/mL 미만의 IgM, 0.048mg/mL 미만의 알파-1-항트립신, 0.090mg/mL 미만의 트랜스페린, 0.050mg/mL 미만의 알파-1-산 당단백질, 0.018mg/mL 미만의 프레-알부민, 0.021mg/mL 미만의 세룰로플라스민, 0.053mg/mL 미만의 아포리포단백질 A-I, 0.227mg/mL 미만의 아포리포단백질 B, 0.031mg/mL 미만의 항트롬빈 III, 0.17mg/mL 미만의 합토글로빈 및 0.045mg/mL 미만의 알부민을 포함한다(면역비탁계측에 의해 측정시).
특정 실시형태에서, 헤모펙신을 포함하는 조성물은 97% 이상의 순도이고, 면역비탁계측에 의해 측정시, 1.7% 미만의 합토글로빈, 0.4% 미만의 트랜스페린, 0.2% 미만의 알부민, 및 0.1% 미만의 알파-2 마크로글로불린을 함유한다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 트랜스페린을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 80% 이상의 트랜스페린 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 90% 이상의 트랜스페린 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 95% 이상의 트랜스페린 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 98% 이상의 트랜스페린 함량을 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 합토글로빈 및 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 헤모펙신을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 80% 이상의 조합된 합토글로빈 및 헤모펙신 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 90% 이상의 조합된 합토글로빈 및 헤모펙신 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 95% 이상의 조합된 합토글로빈 및 헤모펙신 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 98% 이상의 조합된 합토글로빈 및 헤모펙신 함량을 포함한다.
한 실시형태에서, 상기 조성물은, 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 회수된 트랜스페린을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 80% 이상의 조합된 합토글로빈, 헤모펙신 및 트랜스페린 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 90% 이상의 조합된 합토글로빈, 헤모펙신 및 트랜스페린 함량을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 95% 이상의 조합된 합토글로빈, 헤모펙신 및 트랜스페린 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 총 단백질의 98% 이상의 조합된 합토글로빈, 헤모펙신 및 트랜스페린 함량을 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 80%, 90%, 95%, 또는 98% 이상의 합토글로빈 함량을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 80%, 90%, 95%, 또는 98% 이상의 헤모펙신 함량을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 양상에서, 총 단백질의 80%, 90%, 95%, 또는 98% 이상의 조합된 헤모펙신 및 합토글로빈 함량을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 총 단백질의 80%, 90%, 95%, 또는 98% 이상의 조합된 헤모펙신, 합토글로빈 및 트랜스페린 함량을 포함하는 조성물이 제공된다.
본원에 개시되어 있는 본 발명의 방법에 의해 회수된 합토글로빈, 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 조성물은, 이들이 보통 관련되어 있는 것과 다른 구성성분(예를 들면, 다른 혈장-유도된 단백질)을 실질적으로 포함하지 않을 것이다. 따라서, 한 실시형태에서, 합토글로빈, 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 조성물은 총 단백질의 20% 미만, 바람직하게는 총 단백질의 10% 미만, 보다 바람직하게는 총 단백질의 5% 미만의 이들이 보통 관련되어 있는 것과 다른 구성성분들(즉, 불순물)을 포함할 것이다. 당해 분야 숙련가는, 본 발명의 조성물 중에 존재하는 불순물의 수준이 조성물의 의도된 용도에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 상기 조성물이, 상기 조성물의 투여를 필요로 하는(즉, 임상학적 용도로) 사람 대상체에게 투여되는 경우, 상기 조성물이 (총 단백질의) 5% 미만의 불순물을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 반대로, 단백질이 시험관내에서 사용되는 경우, 상기 조성물이 (총 단백질의) 5% 미만의 불순물을 포함하는 경우가 허용가능할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 개시되어 있는 본 발명의 조성물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제형이 제공된다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있다. 예로는 용매, 분산 매질, 항진균제 및 항균제, 계면활성제, 등장성 제제 및 흡수제 등이 포함된다.
또한, 약제학적 제형은, 적합한 안정화제들(또는 이들의 조합), 예를 들면, 아미노산, 탄수화물, 염, 및 세제의 첨가에 의해 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 안정화제는 당 알콜 및 아미노산의 혼합물을 포함한다. 안정화제는 당(예를 들면, 슈크로스 또는 트레할로스), 당 알콜(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨), 및 아미노산(예를 들면, 프롤린, 글리신 및 아르기닌)의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 제형은 아미노산, 예를 들면, 아르기닌을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제형은 100mM 이하의 농도로의 2가의 금속 이온 및 US7045601에 기술되어 있는 바와 같은 착화제를 포함한다. 실시형태들에서, pH는 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5이고, 삼투질 농도는 240mosmol/kg 이상이다.
또한, 약제학적 제형은, 조제(dispensing) 및 장기 보관 전에 여관에 의해 멸균될 수 있다. 바람직하게, 제형은 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36개월, 또는 그 이상 동안 이의 본래 안정성 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예를 들면, 2 내지 8℃ 또는 25℃에서 보관된 제형은 전형적으로 6개월 이상 보관하는 경우 HPLC-SEC에 의해 측정시 실질적으로 동일한 분자 크기 분포를 보유할 수 있다. 약제학적 제형의 특정 실시형태는 2 내지 8℃ 및/또는 실온에서 보관하는 경우 적어도 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 그 이상 동안 안정하고 상업적 약제학적 용도에 적합할 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 다수의 가능한 용량형, 예를 들면, 주사가능한 제형으로 제형화될 수 있다. 제형 및 이들의 후속적 투여(투약)는 당해 분야 숙련가의 기술 범위 내이다. 투약은 치료에 대한 대상체의 반응도에 의존하지만, 바람직한 효과(예를 들면, 유리 Hb/헴의 수준의 감소)가 요구되는 한 변함없이 지속될 것이다. 당해 분야 숙련가는 최적의 용량, 투약 방법 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다.
본원에 개시되어 있는 한 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형은, 5mL 이상의 용적을 갖고 5mg/mL 이상의 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는, 용액이다. 다른 실시형태에서, 약제학적 제형은 5mL 이상의 용적을 갖고, 20mg/mL 이상의 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함한다. 특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 5mL 이상의 용적을 갖고, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 약 20mg/mL, 25mg/mL, 30mg/mL, 35mg/mL, 40mg/mL, 45mg/mL, 50mg/mL, 55mg/mL, 60mg/mL, 65mg/mL, 70mg/mL, 75mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL 또는 200mg/mL의 농도로 포함한다. 다른 양상에서, 5mL 이상의 안정한 약제학적으로 허용되는 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린 용액을 함유하는 용기(vessel)가 제공되고, 여기서, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린의 농도는 20mg/mL 이상이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린을 포함하는 약제학적 제형을 동결건조시킨다. 당(예를 들면, 슈크로스), 당 알콜(예를 들면, 만니톨), 및 아미노산(예를 들면, 글리신 또는 프롤린) 또는 이들의 조합물과 같은 동결건조 안정화제의 존재로 인하여, 동결건조는 긴 유통 기한을 갖는 안정한 분말을 수득한다. 이러한 분말은 보관되거나, 직접적으로 또는 분말로서의 보관 후에 사용되거나, 약제학적 제형을 제조하기 위한 재수화 후에 사용될 수 있다. 본 발명의 동결건조된 약제학적 제형은, 냉동 건조(freeze drying)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 동결건조 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 즉, 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린-함유 제형을 냉동시키고, 이어서, 감압 증발을 행한다. 제공되는 동결건조된 제형은 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36개월 또는 그 이상 동안 이들의 본래 안정성 특성을 실질적으로 보유할 수 있다. 예를 들면, 2 내지 8℃ 또는 25℃에서 보관된 동결건조된 제형은 전형적으로 6개월 이상 보관하는 경우 HPLC-SEC에 의해 측정시 실질적으로 동일한 분자 크기 분포를 보유할 수 있다. 합토글로빈 및/또는 헤모펙신 및/또는 트랜스페린 약제학적 제형의 특정 실시형태는 2 내지 8℃ 및/또는 실온에서 보관하는 경우 적어도 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 그 이상 동안 안정하고 상업적 약제학적 용도에 적합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조된 약제학적 제형은 헤모펙신을 포함한다. 본 발명은 동결건조된 약제학적 제형의 대규모 생산에 사용될 수 있다. 동결건조된 생성물은 벌크 제제로 제조될 수 있거나, 대안으로, 동결건조 전에 보다 작은 컨테이너(예를 들면, 단일 용량 단위)에 배분될 수 있고, 이러한 보다 작은 단위는 멸균 단위 용량형으로서 사용될 수 있다. 동결건조된 제형은, 단백질의 용액 또는 현탁액을 수득하기 위해 재구성될 수 있다. 동결건조된 분말은 수용액을 이용하여 적합한 용적으로 재수화된다. 바람직한 수용액은 주사용수(WFI), 포스페이트-완충 염수 또는 생리학적 염수액이다. 혼합물을 교반하여 재수화를 용이하게 할 수 있다. 바람직하게는 재구성 단계를 실온에서 행한다.
본 발명의 다른 양상에서, 용혈과 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시되어 있는 본 발명의 조성물 또는 제형을 투여함을 포함하는, 용혈과 관련된 병태의 치료 방법이 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는, 영장류(저등 또는 고등 영장류)를 포함하는 동물을 말한다. 고등 영장류는 사람을 포함한다. 본 발명은 사람에서의 표적 병태에의 특정 적용을 갖지만, 당해 분야 숙련가는, 본원에 개시되어 있는 조성물 및 방법으로부터 비-사람 동물도 이로울 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서, 숙련된 수신인은, 본 발명이 사람 및 수의학적 적용 둘 다를 가짐을 이해할 것이다. 편의상, "동물"은 가축 및 반려 동물, 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 카멜리드, 염소, 당나귀, 개 및 고양이를 포함한다. 말에 관해서, 이들은 레이싱 산업에 사용된 말, 및 레크레이션 또는 가축 산업에 사용된 말을 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 제형은 다수의 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로의 예로는 정맥내, 피하, 동맥-내 또는 주입에 의한 경로가 포함된다.
필요한 경우, 본 발명의 방법은 제2 치료학적 제제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 제2 치료학적 화합물은 대상체에게 순차적으로(본원에 개시되어 있는 조성물 또는 제형의 투여 전에 또는 이들의 투여 후에) 또는 동시에 공동-투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 치료학적 제제는 철 킬레이트화제(예를 들면, 데페리옥사민 또는 데페리프론)이다.
본 발명의 다른 양상에서, 용혈과 관련된 병태를 치료하기 위한 의약의 제조시, 본원에 개시되어 있는 본 발명의 조성물 또는 제형의 용도가 제공된다. 이러한 조성물 또는 제형은 바람직하게는 사람 환자에서의 용도에 적합하다.
용혈과 관련되어 있고 헤모글로빈/헴-매개된 독성의 위험이 있는 병태가 당해 분야에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 상기 병태는 급성 용혈성 병태 및/또는 만성 용혈성 병태로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 병태는, 용혈성 빈혈, 수혈-유도된 용혈, 용혈성 요독 증후군, 자가면역 질환, 말라리아 감염, 외상, 수혈, 심폐 우회술을 이용한 개심 수술, 및 화상 후 용혈을 수반하는 헤모글로빈혈증 또는 헤모글로빈뇨증의 치료시를 포함하는 화상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 병태는, 겸상 세포 빈혈, 유전성 구상적혈구증, 유전성 타원적혈구증, 지중해 빈혈증, 선천성 이형 적혈구 조혈성 빈혈 및 발작성 야간 헤모글로빈뇨증, 전신성 홍반성 루푸스, 및 만성 림프구성 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
당해 분야 숙련가들은, 본원에 기술되어 있는 본 발명은, 구체적으로 기술되어 있는 것들 이외의 변화 및 변형을 허용할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 정신 및 범위 내인 이러한 모든 변화 및 변형을 포함한다는 것이 이해되어야만 한다. 또한, 본 발명은, 본 명세서에 언급되거나 나타내어진 단계, 피쳐(feature), 조성물, 및 화합물의 전부를 개별적으로 또는 집합적으로, 그리고, 상기 단계들 또는 피쳐들 중 임의의 2개 이상의 임의의 및 모든 조합들을 포함한다.
본 발명의 소정 실시형태들은, 설명의 목적만을 위해 의도되고 본원의 상기에 기술되는 일반적 범위를 제한하도록 의도되는 것은 아닌 하기 실시예들을 참조하여 하기에 기술될 것이다.
실시예
실시예 1
출발 물질: 콘 분획 IV4 침전물을 합토글로빈, 헤모펙신, 및 트랜스페린의 정제를 위한 출발 물질로서 사용하였다(도 1 참조).
침전물 추출: 침전물의 추출은, 분획 IV4 침전물의 그램당 추출 완충액 20그램의 도입에 의해 수행하였다(20x 추출비). 완충액 및 침전물을 최소 1시간 동안 혼합하였다. 추출 완충액은, 농축된 HCl로 7.0의 pH로 조정된 50mM의 Tris로 이루어졌다. 추출 완충액은 20 내지 25℃의 온도에서 제조되었다. 또한, 침전물 추출도 20 내지 25℃의 온도에서 수행하였다. 추출 동안의 pH는 1시간의 추출 시간의 지속 기간 동안 7.0 내지 8.0(바람직하게는 7.0)으로 유지되었다.
황산 암모늄 침전: 2.0 내지 2.5M(바람직하게는 2.4M)의 최종 농도를 달성하기 위해 고체 황산 나트륨을 분획 IV4 추출물에 첨가하였다. 교반 하에, 황산 암모늄을 상기 추출물에 서서히 첨가하였고, 최소 1시간 동안 연속적으로 혼합되도록 하였다. 황산 암모늄 침전은 20 내지 25℃의 온도에서 수행하였다.
2.5M의 황산 암모늄 농도를 이용하여 지질을 침전시켜, 분획 IV4 추출물을 청징화하고, 한편, 헤모펙신 및 트랜스페린을 가용성으로 유지하였다. 동시 발생적으로, 이러한 황산 암모늄 농도는, 분획 IV4 추출물에 존재하는 합토글로빈의 상당한 부분의 침전을 초래하였다(도 2 참조). 2.2M 내지 2.5M 황산 암모늄에서 헤모펙신을 가용성으로 유지하면서 합토글로빈을 침전시키는 것은, 동일한 출발 분획으로부터의 헤모펙신 및 합토글로빈의 공동-정제를 가능하게 한다.
허용가능한 황산 암모늄 농도 범위를 추가로 좁히기 위해, pH 및 황산 암모늄 농도의 영향을 고려한 실험 설계(DOE)를 수행하였다. 도 3은 DOE의 바람직한 정도 플롯를 나타낸다. 이 플롯은, 가장 많은 헤모펙신을 가용성으로 유지하면서 가장 많은 합토글로빈을 침전시킬 수 있는 가장 바람직한 조건을 제공한다. 바람직한 정도 플롯은, 7 내지 8(바람직하게는 7.0)로 유지된 pH 및 2.2M 내지 2.5M(바람직하게는 2.4M)의 황산 암모늄 농도가, 동일한 출발 물질로부터 단백질 둘 다를 분리하는데 최적임을 보여준다. 또한, 트랜스페린은 2.5M 초과의 농도로 가용성을 유지하며, 따라서, 이들 조건은, 동일한 출발 물질로부터의 3개의 단백질들 모두의 정제에 최적이었다.
여과: 여과를 위한 황산 암모늄 처리된 추출물을 제조하기 위해서, 배치에 사용된 등가의 혈장 리터당 10그램의 C1000 필터 보조제(aid)를 첨가하였다. C1000 필터 보조제는, 여과를 실행하기 전에 최소 15분 동안 혼합되도록 하였다. 플레이트 및 프레임 필터 프레스를 여과에 이용하여 합토글로빈-농축된 침전물의 수집을 가능하게 한다. 플레이트 및 프레임 필터 프레스는 3M(Cuno) 70CA 심층 여과 필터 시트의 앞에 175 유형 필터지의 시트와 함께 조립하였다. 모두에 대해, 등가의 혈장 3L를 배치에 넣었고, 0.193mL의 침전물 수집 부위를 필요로 하였다(3L 혈장/4 Ertel 4S 필터 프레임). 이어서, 이중 다이아그램 가압된 에어 작동 펌프의 사용을 통해 황산 암모늄 처리된 추출물을 필터 프레스에 펌핑하였다.
C1000 혼합 시간의 종료 후, 처리된 추출물을 필터 프레스에 펌핑하였고, 필터 프레스를 통한 단일 통과 후 여과물을 수집하였다. 이어서, 필터 프레스를 2.4M의 황산 암모늄, 50mM Tris의 1 대 2 프레스 용적으로 후-세척하였고, pH 7.0으로 조정하였다. 20 내지 25℃의 온도에서 여과 프로세르르 수행하였다. 얻어진 여과물은 헤모펙신을 함유하고, 추가의 정제를 행할 때까지 2 내지 8℃에 보관할 수 있다. 얻어진 침전물은 합토글로빈을 함유하고, 추가의 정제를 행할 때까지 -20℃ 이하에서 보관할 수 있다.
여과물 분획으로부터의 헤모펙신(Hx)의 정제:
Hx 프로세스 스킴은 도 9에 강조되어 있다.
(a) 옥틸 세파로즈 크로마토그래피(HIC): 분획 IV4 침전물의 추출 및 황산 암모늄 처리로부터 얻어진 여과물을, 0.22㎛의 필터를 이용하여 추가로 청징화하였다. 이어서, 상기 여과물을, pH 7.4에서 2.5M 황산 암모늄, 50mM Tris의 3의 컬럼 용적으로 평형화된 옥틸 세파로즈 컬럼(GE Lifesciences) 상에 부하하였다. 대안으로, 이 단계에 대해서 capto 옥틸 컬럼을 사용할 수 있다. 8 내지 12 컬럼 용적(표적 = 10)의 여과물을 옥틸 세파로즈 컬럼 상에 부하하였다. pH 7.4에서 0.9M 내지 1.2M(표적 1.13M)의 황산 암모늄, 50mM Tris의 3의 컬럼 용적을 갖는 컬럼으로부터 불순물 및 임의의 결합되지 않은 단백질을 세척 제거하였다(세척). 세척 분획은 트랜스페린을 함유하였고, 이는 추가의 정제를 위해 저장할 수 있다. 이어서, 물(WFI)의 3의 컬럼 용적을 갖는 컬럼으로부터 헤모펙신 함유 분획(용출물)을 용출 제거하였다. 이어서, 추가의 트랜스페린 정제에 사용할 때까지 용출물을 2 내지 8℃에 보관하였다. 20 내지 25℃의 온도에서 옥틸 세파로즈 (HIC) 정제를 수행하였다.
(b) Ni - 세파로즈 크로마토그래피( IMAC ): 20mM의 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨, 및 30mM의 이미다졸을 옥틸 세파로즈 용출물에 첨가하였다. 일단 첨가하면, 옥틸 세파로즈 용출물의 pH를 7.4로 조정하였다. 이어서, 2 내지 3의 컬럼 용적의 옥틸 세파로즈 용출물을, 20mM의 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 및 임의로 30mM의 이미다졸을 함유하는 완충액으로 평형화되고 pH 7.4로 조정된 Ni-세파로즈(GE Lifesciences) 컬럼 상에 부하하였다. 옥틸 세파로즈 용출물(부하)에의 이미다졸의 첨가는 알부민 및 다른 불순물에 대한 Ni-세파로즈의 친화도를 감소시키고, 한편, 헤모펙신에 대한 이의 결합 친화도를 유지한다. 따라서, 부하 단계 동안에, 불순물들은 컬럼을 통해 유동하였고, 한편, 헤모펙신은 수지에 결합되었다. 부하의 종료 후, 컬럼을 pH 7.4의 20mM 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 및 30mM의 이미다졸의 2의 컬럼 용적으로 세척하여 임의의 결합되지 않은 불순물들을 제거하였다. 이어서, pH 7.4에서 20mM의 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 및 100mM의 이미다졸을 이용하여 컬럼으로부터 헤모펙신을 용출시켰다. Ni-세파로즈 용출물 중에 존재하는 헤모펙신은 SDS-PAGE에 의해 95% 초과인 것으로 추정되었다(도 4 참조). Ni-세파로즈 크로마토그래피(IMAC) 프로세스를 20 내지 25℃에서 수행하였고, 얻어진 용출물을 사용할 때까지 -20℃ 이하에 보관하였다.
(c) 농축/투석 여과: Ni-세파로즈 용출물을 바람직한 농도(1 내지 20% w/v)로 농축시키고, 이어서, 농축물의 용적당 10용적의 포스페이트 완충된 염수로 투석 여과하였다. 30kD 한외여과막을 이용하여 농축 및 투석 여과를 수행하였다. 일단 투석 여과가 종료되면, 농축물은 바람직한 농도로 존재하였고, 헤모펙신은 임의로 당 및 또는 아미노산과 함께 제형화하였고, 멸균 여과하였고, -20℃ 이하에 보관하였다. 정제된 헤모펙신은, 전-임상 동물 및 세포 연구에서 이러한 형태로 존재할 수 있다.
프로세스로부터 회수된 헤모펙신의 최종 수율은, 대략 0.151g/L 혈장인 것으로 추정되었다.
농축된 헤모펙신 제제(대략 2.3% w/v)는 면역비탁계측에 의해 특성확인되었다. 혈장 단백질, 예를 들면, IgG(검출 한계, LOD = <0.067mg/mL), IgA(LOD = <0.066mg/mL), IgM(LOD = <0.042mg/mL), 알파-1-항트립신(LOD = 0.048mg/mL), 트랜스페린(LOD = <0.090mg/mL), 알파-1-산 당단백질(LOD = 0.050mg/mL), 프레-알부민(LOD = 0.018mg/mL), 세룰로플라스민(LOD = 0.021mg/mL), 아포리포단백질 A-I(LOD = <0.053mg/mL), 아포리포단백질 B(LOD = <0.227mg/mL) 및 항트롬빈 III(LOD = 0.031mg/mL)은 검출가능한 수준 미만이었다. 다른 혈장 단백질, 예를 들면, 합토글로불린(0.165mg/mL) 및 알부민(0.038mg/mL)에 대해서는 미량만이 검출되었다. 이들 결과는, Hx가 제제 중의 총 단백질의 99% 이상을 차지하였음을 나타낸다.
추가의 배치의 헤모펙신이, 상기 기술되어 있는 방법에 따라 프로세싱되었다. 배치를 35mg/mL 단백질로 농축시켰다. 면역비탁계측에 의한 배치의 분석은, 1.6%의 합토글로빈, 0.3%의 트랜스페린, 0.2%의 알부민, 및 0.1%의 알파-2 마크로글로불린을 포함하는 불순물을 갖는 약 98%의 헤모펙신 순도를 나타냈다.
2.5M 황산 암모늄 침전물로부터의 합토글로빈(Hp)의 정제
Hp 프로세스 스킴은 도 10에 강조되어 있다.
(a) 침전물 추출 및 여과: 침전물의 그램당 20그램의 추출 완충액(20x 비)의 도입에 의해 침전물로부터 합토글로빈을 추출하였다. 추출 완충액은 50mM 나트륨 아세테이트로 이루어졌고, pH 5.5로 조정되었다. 완충액 및 침전물을 최소 1시간 동안 혼합하였다. 15분 후, pH를 5.4 내지 5.6의 범위 내로 조정하였다. 저 pH 추출 완충액을 이용하여 지질 추출을 감소시켰고, 한편, 후속적인 크로마토그래피 단계 동안에 저 pH를 이용하였다. 이어서, 나머지 필터 보조제 및 용해되지 않은 단백질 및 지질을 제거하기 위해서, 추출물을 Cuno 70CA 필터 또는 등가의 심층 필터를 통해 통과시켰다. 이어서, 여과물을 0.2㎛ 필터를 사용하여 청징화하였다. 얻어진 여과물은 후속적인 크로마토그래피 단계를 위해 준비하였다. 추출 완충액 제제, 추출 프로세스, 및 여과 프로세스는 모두 20 내지 25℃에서 수행하였다.
다른 실시형태에서, 침전물의 그램당 20그램의 추출 완충액(20x 비)의 도입에 의해 침전물로부터 합토글로빈을 추출하였다. 추출 완충액은 50mM Tris로 이루어졌고, pH 8.5로 조정되었다. 완충액 및 침전물을 최소 1시간 동안 혼합하였다. 15분 후, pH를 8.4 내지 8.6의 범위 내로 조정하였다. 추출된 침전물의 청징화에서 지질 함량 및 보조제를 감소시키기 위해서, 지질 흡착제, Aerosil(흄드 실리카)를 등가의 혈장 리터당 약 1.6 내지 약 1.8그램으로 첨가하였다. 이어서, Aerosil 처리된 추출물을 최소 1시간 동안 혼합되도록 하였다. 이어서, 나머지 필터 보조제 및 용해되지 않은 단백질 및 지질을 제거하기 위해서, 추출물을 Cuno 70CA 필터 또는 다른 유사한 심층 필터를 통해 통과시켰다. 이어서, 여과물을 0.2㎛ 필터를 사용하여 청징화하였다. 얻어진 여과물은 후속적인 크로마토그래피 단계를 위해 준비하였다. 추출 완충액 제제, 추출 프로세스, 및 여과 프로세스는 모두 20 내지 25℃에서 수행하였다.
(b) Capto Q ImpRes 크로마토그래피 단계: 상기 단계로부터 얻어진 여과물에 나트륨 아세테이트를 50mM의 최종 농도로 첨가하였고, 빙초산을 이용하여 여과물의 pH를 pH 5.5로 조정한다. 이어서, pH 조정된 여과물을 냉수(WFI)로 1:4 내지 1:5로 희석하였고, 약 2 내지 8℃의 온도에서, 50mM 나트륨 아세테이트, pH 5.5로 평형화된 GE Healthcare Capto Q ImpRes 크로마토그래피 컬럼 상에 부하하였다. 상기 부하는 저 pH 완충액으로서 나트륨 아세테이트가 요구되고, 합토글로빈이 컬럼에 결합할 수 있도록 부하의 전도도를 감소시키기 위해서 물로의 희석이 요구된다. 부하의 종료 후, 컬럼을 pH 5.5의 50mM 나트륨 아세테이트의 2의 컬럼 용적으로 세척하여 임의의 결합되지 않은 오염물 단백질들을 제거하였다. 이어서, pH 5.5에서 50mM의 나트륨 아세테이트, 100 내지 200mM의 NaCl(바람직하게는 162mM)을 이용하여 합토글로빈을 용출시켰다. 용출 조건은, 이용된 부하 용적에 부분적으로 의존하므로, 용출 완충액의 넓은 NaCl 농도 범위가 요구된다. 농축/투석 여과까지 용출물은 2 내지 8℃에서 단기 보관할 수 있고, -20℃ 이하에서 장기 보관할 수 있다. Capto Q ImpRes 용출물의 합토글로빈 함량은 SDS-PAGE에 의해 95% 초과인 것으로 추정되었다(도 5 및 도 6 참조). 크로마토그래피 완충액 및 크로마토그래피 단계는 모두 20 내지 25℃에서 수행하였다.
(c) 농축/투석 여과: Capto Q ImpRes 용출물을 특정 농도로 농축시켰고, 이어서, 농축물의 용적당 포스페이트 완충 염수 10 용적으로 투석 여과하였다. 30kD 한외여과막을 이용하여 농축 및 투석 여과를 수행하였다. 일단 투석 여과가 종료되면, 농축물은 바람직한 농도로 존재하였고, 정제된 합토글로빈 용액은 멸균 여과되었고, -20℃ 이하에 보관하였다.
임의로, 지질 흡착 단계는, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 또는 후에, 또는 농축/투석 여과 단계 후에 수행할 수 있다. 적합한 지질 흡착제의 예로는 Aerosil(예를 들면, Aerosil 380)과 같은 흄드 실리카가 있다.
프로세스로부터 회수된 합토글로빈의 최종 수율은, 대략 0.285g/L 혈장 투입인 것으로 추정되었다.
농축된 합토글로빈 제제(대략 2.6% w/v)는 면역비탁계측에 의해 특성확인되었다. 혈장 단백질, 예를 들면, IgG(검출 한계, LOD = <0.067mg/mL), IgM(LOD = <0.042mg/mL), 알파-1-산 당단백질(LOD = 0.050mg/mL), 프레-알부민(LOD = 0.018mg/mL), 세룰로플라스민(LOD = 0.021mg/mL), 헤모펙신(LOD = <0.051mg/mL), 아포리포단백질 A-I(LOD = <0.053mg/mL), 아포리포단백질 B(LOD = <0.227mg/mL) 및 항트롬빈 III(LOD = 0.031mg/mL)은 검출가능한 수준 미만이었고, 한편, 다른 혈장 단백질, 예를 들면, 트랜스페린(0.099mg/mL), 알파-1-항트립신(0.062mg/mL), 알파-2-마크로글로불린(0.086mg/mL), IgA(0.65mg/mL), 및 알부민(0.123mg/mL)에 대해서는 미량만이 검출되었다. 이들 결과는, Hp가 제제 중의 총 단백질의 96% 이상을 차지하였음을 나타낸다.
옥틸 1.13M 황산 암모늄 세척 분획으로부터의 트랜스페린의 정제:
옥틸 세척 분획에 대한 이온-교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 황산 암모늄을 투석 여과하였고, 보다 낮은 이온 강도 완충액으로 교환하였다. 이 때문에, 옥틸 용출물은 농축되었고, 용출물 용적당 50mM Tris, pH 7.0의 10 용적에 대항하여 투석 여과되었다. 30kD 한외여과막을 이용하여 농축 및 투석 여과를 수행하였다.
이어서, 투석 여과된 세척 분획을, 50mM Tris, pH 7.0으로 평형화된 GE Healthcare Capto DEAE 컬럼 상에 부하하였다. 이러한 분획으로부터 순수한 트랜스페린을 얻는 것이 실현가능한지를 결정하기 위해서, 출발 완충액으로서 50mM의 Tris, pH 7.0을 이용하고 50mM Tris, 0.5M NaCl, pH 7.0으로 종료시켜 10 컬럼 용적에 걸쳐 선형 농도 구배를 수행하였다(도 8 참조). 크로마토그램 상의 각각의 피크에 상응하는 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 수행하여 피크들 중 하나가 순수한 트랜스페린을 함유하였는지를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 피크 1은 과도하게 부하되었지만, 순수한 트랜스페린인 것으로 밝혀진다. 이는, 옥틸 세파로즈 세척 분획으로부터 트랜스페린을 정제하는 것이 가능함을 나타내고, 또한, 동일한 출발 물질로부터 헤모펙신, 합토글로빈, 및 트랜스페린을 정제하는 것이 가능함을 의미한다(또한, 도 11 참조).

Claims (25)

  1. 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 용액에 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계;
    (iii) 헤모펙신을 함유하는 상기 용액으로부터 상기 침전된 합토글로빈을 분리하는 단계; 및
    (iv) 합토글로빈 및/또는 헤모펙신을 하나 이상의 단계로 별도로 정제하는 단계
    를 포함하고, 이때 상기 용액에 2.3M 내지 2.5M의 황산 암모늄을 첨가함으로써, pH 6 내지 8에서, 상기 용액으로부터 합토글로빈이 침전되고,
    상기 단계 (iv)는
    (v) 완충액에 상기 침전된 합토글로빈을 용해시켜 합토글로빈 용액을 얻는 단계;
    (vi) 상기 합토글로빈 용액을, 상기 합토글로빈이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
    (vii) 상기 수지로부터 상기 합토글로빈을 용출시키는 단계; 및
    (viii) 상기 용출된 합토글로빈을 회수하는 단계
    를 포함하거나,
    상기 단계 (iv)는
    (ix) 상기 헤모펙신을 함유하는 용액을, 상기 헤모펙신이 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
    (x) 상기 단계 (ix)로부터 상기 통과액 분획을 수집하는 단계;
    (xi) 상기 단계 (x) 이후에 상기 수지를 임의로 세척하고 상기 통과액 세척 분획을 수집하는 단계;
    (xii) 상기 단계 (x) 및/또는 상기 단계 (xi) 이후에 상기 수지로부터 상기 헤모펙신을 용출시키는 단계; 및
    (xiii) 상기 용출된 헤모펙신을 회수하는 단계
    를 포함하는, 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 용액으로부터 합토글로빈 및 헤모펙신을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용액에 2.4M의 황산 암모늄을 첨가함으로써 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 7의 pH에서 상기 용액으로부터 합토글로빈을 침전시키는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 합토글로빈 및 헤모펙신 둘 다를 함유하는 상기 용액이 트랜스페린을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 사람 혈장 분획인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 용액이 콘 분획(Cohn Fraction) IV인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 용액이 콘 분획 IV4인, 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 지질이 지질 제거제에 결합하도록 하는 조건 하에 상기 합토글로빈 용액을 지질 제거제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 용출된 헤모펙신을, 상기 헤모펙신이 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 금속 이온 친화성 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;
    (ii) 상기 수지로부터 상기 헤모펙신을 용출시키는 단계; 및
    (iii) 상기 용출된 헤모펙신을 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제4항에 있어서,
    (xiv) 상기 단계 (x)로부터의 통과액 분획 및/또는 상기 단계 (xi)로부터의 통과액 세척 분획을, 트랜스페린이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계; 및
    (xv) 상기 수지로부터 상기 트랜스페린을 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 적어도 97%의 헤모펙신을 포함하고, 면역비탁계측(immunonephelometry)에 의해 측정시, 1.7% 미만의 합토글로빈, 0.4% 미만의 트랜스페린, 0.2% 미만의 알부민 및 0.1% 미만의 알파-2 마크로글로불린을 포함하는 조성물.
  14. 제13항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 용혈과 관련된 병태를 치료하기 위한 약제학적 제형.
  15. 제14항에 있어서, 아미노산, 탄수화물, 염 및 세제 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 제형.
  16. 제15항에 있어서, 당 알콜과 아미노산의 혼합물을 포함하는 약제학적 제형.
  17. 제15항에 있어서, 당, 임의로 슈크로스 또는 트레할로스, 당 알콜, 임의로 만니톨 또는 소르비톨, 및 아미노산, 임의로 프롤린, 글리신 및 아르기닌의 혼합물을 포함하는 약제학적 제형.
  18. 제15항에 있어서, 아르기닌을 포함하는 약제학적 제형.
  19. 제14항에 있어서, 6.5 내지 7.5의 pH 및 적어도 240 mosmol/kg의 삼투질농도(osmolarity)를 갖는 약제학적 제형.
  20. 제14항에 있어서, 동결건조된 약제학적 제형.
  21. 제20항에 있어서, 6개월 이상 보관하는 경우 HPLC-SEC에 의해 측정시 실질적으로 동일한 분자 크기 분포를 보유하는, 약제학적 제형.
  22. 적어도 5 mL의 용적을 갖는 제14항의 약제학적 제형을 포함하고, 적어도 5 mg/mL의 헤모펙신을 포함하는 용액.
  23. 제22항에 있어서, 적어도 20 mg/mL의 헤모펙신을 포함하는 용액.
  24. 삭제
  25. 삭제
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