WO2017170597A1 - 血中でハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤 - Google Patents

血中でハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤 Download PDF

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了輔 中野
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that binds to human haptoglobin in blood to form a multivalent immune complex and has a high binding activity to an Fc ⁇ receptor, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA,
  • the present invention relates to a transformant obtained by introducing a vector, a method for producing an antibody using the transformant, and an autoimmune disease therapeutic agent comprising the antibody as an active ingredient.
  • IVIG Intravenous Immunoglobulin
  • IgG Intravenous Immunoglobulin
  • IVIG include, for example, Mitsubishi Tanabe Pharma's Venoglobulin IH, Teijin Pharma's Benilon-I, Japanese Red Cross Polyglobin N, Baxter's Gamma Guard, Japan Pharmaceutical's Globenin-I, CSL Examples include Behring's Privigen.
  • ITP immune thrombocytopenia
  • ITP idiopathic (immune) thrombocytopenic purpura
  • Non-patent Document 3 Although the development of the Fc ⁇ R III a antibody (product name GMA161) manufactured by Macrogenics was interrupted by Phase I, its efficacy in ITP has been confirmed (ClinicalTrials.gov NCT00244257) (Non-patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 Hypothesis that inhibition of Fc ⁇ R by IVIG is enhanced by components such as various immune complexes (Immune Complex: IC) formed by antibodies and serum proteins contained in IVIG, and antibody dimers or aggregates contained in IVIG Has also been proposed (Non-Patent Document 5).
  • IC immune Complex
  • Non-Patent Documents 6 and 7 show that IVIG contains up to about 3% of a component that reacts with its own serum protein, and forms a soluble immune complex when the component is mixed with serum.
  • Non-Patent Documents 6 and 7 show that a soluble immune complex has a higher specific activity than IVIG against a mouse ITP model.
  • the dose of IVIG for autoimmune diseases is a very high dose of 0.4 g / kg per day for 5 consecutive days in a basic formulation.
  • High-dose administration causes problems such as side effects such as thrombosis and long administration time due to infusion (Non-patent Document 9). Therefore, there is a high need for replacing IVIG with a drug composed of an active ingredient having a high specific activity and reducing the dose.
  • an active ingredient contained in IVIG and substituting it for IVIG is expected as a means that can simplify autoimmune disease treatment in which a high dose of IVIG must be administered. Therefore, the present invention can be used as an alternative to IVIG, an antibody having high binding activity to an Fc ⁇ receptor, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, An object of the present invention is to provide a method for producing an antibody using the transformant, and an autoimmune disease therapeutic agent comprising the antibody as an active ingredient.
  • an IgG component that recognizes serum protein haptoglobin (Hp, sometimes referred to as Hp) was identified as an IgG component in which the binding activity with high reproducibility was detected.
  • This component is considered to be one of the active ingredients in IVIG.
  • the anti-Hp antibody that binds to CD16a more strongly than IVIG was successfully obtained by forming an immune complex comprising the antibody and Hp, and the present invention was completed. .
  • the present invention relates to the following (1) to (22).
  • An antibody comprising the heavy chain of an antibody comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40, 41 and 42 (c) An antibody comprising an H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 and an L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 d) An antibody comprising the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 and comprising the L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (3)
  • a monoclonal antibody selected from (A) CDR1 to CDR3 contain the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 31, 32 and 33, respectively, and CDR1 to CDR3 represent the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 34, 35 and 36, respectively.
  • the antibody comprising the L chain of the antibody comprising (b) CDR1 to CDR3 comprises the H chain of an antibody comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, respectively, and CDR1 to 3 are SEQ ID NOs: 40, 41 and An antibody comprising an L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by 42 (c) An antibody comprising the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (D) an antibody comprising the L chain of an antibody comprising the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 Of ⁇ -chain of the amino acid sequence of the human haptoglobin represented by issue 70, at least, it binds to 44th Phe and 49 th Glu, (1) ⁇ (3) The monoclonal antibody according to any one of the.
  • any one of (1) to (3) which binds to at least the 155th Ser, the 156th Thr, and the 157th Val in the amino acid sequence of the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70 1.
  • the monoclonal antibody according to 1. (6) The monoclonal antibody according to any one of (1) to (5), which is a recombinant antibody. (7) The monoclonal antibody according to (6), which is a recombinant antibody selected from a human chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody.
  • the multivalent immune complex formed by the monoclonal antibody binds to at least one human Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of human Fc ⁇ receptor III, human Fc ⁇ receptor II and human Fc ⁇ receptor I.
  • the transformant according to (13) is cultured in a medium, the monoclonal antibody according to any one of (1) to (10) is produced and accumulated in the culture, and the antibody is collected from the culture
  • a therapeutic agent for an autoimmune disease comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (10) and a pharmacologically acceptable carrier.
  • An autoimmune disease therapeutic agent comprising a monoclonal antibody that binds to human haptoglobin.
  • the therapeutic agent for autoimmune disease according to (17), wherein the monoclonal antibody is a recombinant antibody.
  • the autoimmune disease therapeutic agent according to (18), wherein the monoclonal antibody is a recombinant antibody selected from a human chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody.
  • the multivalent immune complex formed by the monoclonal antibody binds to at least one human Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of human Fc ⁇ receptor III, human Fc ⁇ receptor II and human Fc ⁇ receptor I.
  • the therapeutic agent for autoimmune diseases according to (20) or (21), wherein the polyvalent immune complex formed by the monoclonal antibody comprises at least two antibodies and one human haptoglobin molecule.
  • the antibody of the present invention binds to human haptoglobin to form a multivalent immune complex, thereby binding to CD16a in the Fc domain of the antibody and inhibiting antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) reaction more strongly than IVIG.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • FIGS. 1A to 1F show the binding activity of CDIGa to an immune complex composed of an anti-Hp antibody, an anti-Hp antibody and human Hp, and IVIG.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents absorbance (415-490 nm).
  • 1A shows antibody # 4
  • FIG. 1B shows antibody # 6
  • FIG. 1C shows antibody # 27
  • FIG. 1D shows antibody # 105
  • FIG. 1E shows antibody # 96-6
  • FIG. 1F shows IVIG binding activity.
  • ⁇ represents an immune complex composed of an anti-Hp antibody and human Hp (FIGS. 1A to 1F).
  • FIGS. 3A to 3E show the binding activity to CD32a of an immune complex composed of an anti-Hp antibody, an anti-Hp antibody and human Hp.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents absorbance (415-490 nm).
  • 3A shows antibody # 4
  • FIG. 3B shows antibody # 6
  • FIG. 3C shows antibody # 27, FIG.
  • FIG. 3D shows antibody # 105
  • FIG. 3E shows antibody # 96-6 binding activity
  • ⁇ indicates anti-Hp antibody
  • ⁇ indicates an immune complex composed of an anti-Hp antibody and human Hp.
  • FIG. 4 shows the inhibitory activity against binding between anti-DNP antibody and CD16a by anti-Hp antibody (fucose-bound and non-fucose-bound), immune complex comprising non-fucose-bound anti-Hp antibody and human Hp, and IVIG. It is a thing.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents fluorescence intensity.
  • FIG. 5 shows the anti-Hp antibody (fucose-bound and non-fucose-bound), immunoconjugate composed of non-fucose-bound anti-Hp antibody and human Hp, and the inhibitory activity against ADCC reaction using PBMC by IVIG It is.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents ADCC (%).
  • FIG. 6A shows antibody # 27, antibody # 105, anti-DNP antibodies, various modified versions of these antibodies, and inhibitory activity against IVCC reaction using normal donor peripheral blood and rituximab by IVIG.
  • the vertical axis shows the count proportional to the number of B cells.
  • 1 shows a sample in which ADCC has not reacted
  • 2 shows a sample in which ADCC reaction has been performed with rituximab
  • 3 to 14 show the results of samples in which ADCC reaction has been performed with rituximab in the presence of various antibodies.
  • 3 is IVIG (3333 ⁇ g / mL)
  • 4 is antibody # 105 (250 ⁇ g / mL)
  • 5 is antibody # 27 (250 ⁇ g / mL)
  • 6 is a non-fucose-binding type of antibody # 105.
  • FIG. 6B shows inhibitory activity against ADCC reaction using various modified versions of antibody # 4 and antibody # 27 and IVIG using normal donor peripheral blood and rituximab.
  • the vertical axis shows the proportion of B cells in the lymphocytes. 1 is a sample that has not undergone ADCC reaction, 2 is a sample that has undergone ADCC reaction with rituximab, and 3 to 8 are the results of samples that have undergone ADCC reaction with rituximab in the presence of various antibodies.
  • 3 is IVIG (2000 ⁇ g / mL)
  • 4 is IVIG (8000 ⁇ g / mL)
  • 5 is Fc amino acid modified (S239D, S298A, I332E) antibody # 4 non-fucose-binding type (50 ⁇ g / mL)
  • 6 was Fc amino acid modified (S239D, S298A, I332E) antibody # 27 non-fucose-bound (50 ⁇ g / mL)
  • 7 was Fc amino acid modified (S239D, S298A, I332E)
  • Antibody # 4 is a fucose non-binding type (10 ⁇ g / mL)
  • 8 is an anti-fucose binding type (10 ⁇ g / mL) of antibody # 27 subjected to Fc amino acid modification (S239D, S298A, I332E).
  • FIG. 7 shows the action in a mouse immune thrombocytopenia (ITP) model.
  • the vertical axis represents the platelet count (x10 3 / ⁇ L).
  • 1 is a group not administered with anti-platelet antibody
  • 2 is a control group
  • 3 and 4 are groups where IVIG is administered at doses of 10 and 40 mg / head, respectively
  • 5 to 8 are non-fucose-binding type Fc of # 105
  • the result of the group which administered the amino acid modification type (G236A, S239D, I332E) at the doses of 0.08, 0.4, 2, 10 mg / head, respectively, is shown.
  • Human haptoglobin is a glycoprotein in which two or more subunits composed of one ⁇ chain and one ⁇ chain (hereinafter referred to as ⁇ / ⁇ -subunit) are linked. The synthesis process of human haptoglobin is divided into three stages.
  • the ⁇ chain and ⁇ chain encoded by one open reading frame are linked and expressed as a single polypeptide.
  • a haptoglobin precursor composed of two or more polypeptides is formed by disulfide bonds between the ⁇ chains of the polypeptides.
  • a disulfide bond is formed between the ⁇ chain and the ⁇ chain in the polypeptide molecule.
  • the polypeptide is separated into ⁇ chain and ⁇ chain by specific proteolysis, and ⁇ chain and ⁇ chain become ⁇ / ⁇ -subunit in which disulfide bond is formed.
  • human haptoglobin forms a structure in which two or more of the above ⁇ / ⁇ -subunits are linked [Redox Rep., 6,379 (2001)].
  • the basic structure of human haptoglobin in the present invention is a combination of four ⁇ / ⁇ -subunits.
  • GenBank accession number NM_005143.3 SEQ ID NO: 67
  • NM_001126102.1 SEQ ID NO: 67
  • haptoglobin containing an ⁇ chain generated by translating SEQ ID NO: 67 has three or more ⁇ / ⁇ -subunits linked by disulfide bonds. Large multimers can be formed [J. Biochem. Mol. Biol., 40, 1028 (2007)].
  • the amino acid sequence of the ⁇ chain is the 19th to 160th amino acid sequence (SEQ ID NO: 69) of GenBank accession number NP_005134.1 (SEQ ID NO: 65), or the 19th to 101st amino acids of NP_00111959571 (SEQ ID NO: 66). It is represented by the sequence (SEQ ID NO: 71).
  • the amino acid sequence of the ⁇ chain is from amino acid sequence 162 to 406 of GenBank accession number NP_005134.1 (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 70), or from position 103 to 347 of NP_001119574.1 (SEQ ID NO: 66). It is represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 70).
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as the ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain, and having the function of human haptoglobin In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as the ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain, one or more amino acids of the ⁇ chain and / or the ⁇ chain are deleted, substituted, or inserted
  • ⁇ chain and / or ⁇ chain is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably
  • human haptoglobin The function of human haptoglobin is to specifically bind with hemoglobin released in the blood by hemolysis to form an immune complex, preventing the loss of free hemoglobin in the urine, thereby preventing iron leakage from the body and Prevention of oxidative vascular injury and renal tubule injury by free hemoglobin.
  • Methods for obtaining peptides include site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research , 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69, 70 or 71, that is, site-specific mutation into a gene encoding human haptoglobin To introduce Ri may be obtained.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human haptoglobin include the base sequence represented by SEQ ID NO: 67 or 68.
  • telomere sequence a sequence and encoding a polypeptide having a human haptoglobin function, and a DNA hybridizing under stringent conditions with a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 67 or SEQ ID NO: 68 And a DNA encoding a polypeptide having the function of human haptoglobin
  • Such gene are also included in the gene encoding the haptoglobin present invention.
  • a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 67 or 68 is used as a probe, colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot, It means a hybridizable DNA obtained by a hybridization method or a DNA microarray method.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a DNA or DNA derived from a hybridized colony or plaque, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • a DNA or DNA derived from a hybridized colony or plaque or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • 0.1 to 2 times concentrated SSC solution composition of 1 times concentrated SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L citric acid
  • the DNA capable of hybridizing is DNA having at least 60% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 67 or 68, preferably DNA having 80% or more homology, more preferably 95%. Examples thereof include DNA having the above homology.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale variation is caused in the nucleotide sequence due to such polymorphism, and is included in the gene encoding haptoglobin used in the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, but for the base sequence, BLAST [J. Mol. Biol ., 215, 403 (1990)] for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7,649 (1997), http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] and numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 if blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value f If r-gapped alignment in bits is 15 and Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, it is 50, and programs other than blastn are 25 (http: //www.ncbi.nv. /blast/html/blastcgihelp
  • Examples of a method for obtaining a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as an ⁇ chain and a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as a ⁇ chain include, for example, SEQ ID NO: 69, 70 or It can be prepared by culturing a transformant into which a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by 71 is deleted and a recombinant vector containing this is introduced.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as the ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain. Can also be obtained using the aforementioned site-directed mutagenesis method or the like.
  • polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as an ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as a ⁇ chain, or SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: as an ⁇ chain
  • a polypeptide having an amino acid sequence represented by 71 and an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as a ⁇ chain is fluorenylmethyloxy It can also be produced by a chemical synthesis method such as a carbonyl (Fmoc) method or a t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • the monoclonal antibody of the present invention (hereinafter, also referred to as the antibody of the present invention) is an antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the ⁇ chain or its three-dimensional structure in human haptoglobin, and is highly abundant in blood. To form an immune complex.
  • human haptoglobin including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as the ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain can be taken in a natural state. Any structure may be used as long as it has the same effect as the structure.
  • the three-dimensional structure that human haptoglobin can take in the natural state refers to the natural three-dimensional structure of human haptoglobin.
  • the polyvalent immune complex in the present invention include an immune complex containing at least two molecules of the antibody of the present invention and at least one molecule of human haptoglobin.
  • the immune complex exhibits high binding activity to CD16 and CD32 and exhibits excellent inhibitory activity against ADCC reaction.
  • the one molecule of human haptoglobin has an ⁇ / ⁇ - consisting of one ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 and one ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70. Four subunits are included.
  • the molecular weight of the polyvalent immune complex formed by binding of the monoclonal antibody of the present invention and human haptoglobin is preferably 5 ⁇ 10 5 or more, and more preferably 7 ⁇ 10 5 or more.
  • the molecular weight of the immune complex is 5 ⁇ 10 5 or more, high binding activity to CD16 and CD32 is exhibited, and excellent inhibitory activity against ADCC reaction is exhibited.
  • the formation of a multivalent immune complex by the antibody of the present invention can be confirmed, for example, by gel filtration chromatography using HPLC or the like.
  • the immune complex formed by the antibody of the present invention contains at least two molecules of the antibody of the present invention and at least one molecule of human haptoglobin.
  • the molecular weight of the immune complex can be measured, for example, by separating and detecting the immune complex by gel filtration chromatography using HPLC or the like. Since the molecular weight of the antibody of the present invention is about 150 kDa and the molecular weight of human haptoglobin is about 200 to 220 kDa, the number of antibodies and antigens contained in the immune complex can be calculated.
  • the antibody of the present invention is an antibody that binds to at least the 44th Phe (phenylalanine) and the 49th Glu (glutamic acid) in the amino acid sequence of the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70. Is mentioned.
  • the antibody of the present invention specifically includes at least 155th Ser (serine), 156th Thr (threonine) and 157 of the amino acid sequence of the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70.
  • the antibody include the following monoclonal antibodies (a) and (b).
  • (A) CDR1 to CDR3 contain the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 31, 32 and 33, respectively, and CDR1 to CDR3 represent the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 34, 35 and 36, respectively.
  • the antibody comprising the L chain of the antibody comprising (b) CDR1 to CDR3 comprises the H chain of an antibody comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, respectively, and CDR1 to 3 are SEQ ID NOs: 40, 41 and Antibody comprising L chain of antibody comprising amino acid sequence represented by 42
  • the monoclonal antibody of the present invention includes the following monoclonal antibody (c) or (d).
  • (d) represented by SEQ ID NO: 27 An antibody comprising an H chain of an antibody comprising an amino acid sequence and an L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28
  • the monoclonal antibody of the present invention the same epitope as that contained in human haptoglobin that specifically recognizes the amino acid sequence of human haptoglobin or its three-dimensional structure and competes with the monoclonal antibody and binds to the monoclonal antibody. And monoclonal antibodies that bind to.
  • an antibody that competes with a monoclonal antibody refers to an antibody that has the same or partially the same epitope (also referred to as an antigenic determinant) as the monoclonal antibody of the present invention and binds to the epitope.
  • the antibody that binds to the same epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds refers to an antibody that recognizes and binds to the same sequence as the amino acid sequence of human haptoglobin recognized by the monoclonal antibody of the present invention.
  • the binding of the monoclonal antibody of the present invention to the amino acid sequence of human haptoglobin, or the three-dimensional structure thereof, includes radioimmunoassay, enzyme immunoassay (ELISA), Western blot, immunohistochemical staining (IHC), and known immunology. It can be confirmed by a method for examining the binding activity of a specific antigen and an antibody to the specific antigen, such as a method of detection.
  • a fluorescent antibody staining method using the FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)]
  • a fluorescent staining method using flow cytometry a fluorescent staining method using flow cytometry
  • a Biacore system GE Health
  • ITC isothermal titration calorimetry using ITC (manufactured by DKSH) and the like.
  • an anti-IgG antibody is used as a sensor.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include an antibody produced by a hybridoma, or a recombinant antibody produced by a transformant transformed with a recombinant vector containing an antibody gene.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also referred to as an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody. It is a feature.
  • epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody and a three-dimensional structure composed of the amino acid sequence, an amino acid sequence modified by post-translational modification, and a three-dimensional structure composed of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence modified by post-translational modification includes an amino acid sequence to which an O-linked sugar chain is added (the sugar chain is bound to threonine and serine having an OH substituent), and an amino acid sequence to which an N-linked sugar chain is added. (Binding to glutamine and asparagine having an NH 2 substituent), and amino acid sequences to which sulfate groups have been added (sulfuric acid molecules are bound to threonine having an OH substituent).
  • the epitope of human haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds is a deletion in which a partial domain of human haptoglobin is deleted, a mutant in which a part of amino acid of human haptoglobin is substituted with another amino acid, another protein It can be determined by examining the binding activity of the monoclonal antibody of the present invention to a human haptoglobin mutant substituted with the domain derived from, a partial peptide fragment of human haptoglobin, and the like.
  • the epitope of human haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds can also be determined by adding the antibody of the present invention to human haptoglobin digested with proteolytic enzyme and performing epitope mapping using known mass spectrometry. can do.
  • the epitope of human haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds is contained in the 25th to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain of haptoglobin.
  • the epitope of the haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds contains at least the 44th Phe and the 49th Glu of the amino acid sequence of the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70.
  • the epitope of the haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds includes at least the 155th Ser, the 156th Thr, and the 157th Val of the amino acid sequence of the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70. included.
  • the hybridoma is prepared, for example, by preparing the above human haptoglobin as an antigen, inducing antibody-producing cells having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, and further fusing the antibody-producing cells and myeloma cells.
  • An anti-haptoglobin monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma or administering the hybridoma cell to an animal to cause ascites cancer, and separating and purifying the culture solution or ascites.
  • Any animal can be used as the animal to immunize with the antigen as long as it can produce a hybridoma.
  • a mouse, a rat, a hamster, a chicken or a rabbit is used.
  • An antibody produced by a hybridoma prepared by obtaining a cell capable of producing an antibody from such an animal, immunizing the cell in vitro, and then fusing it with a myeloma cell is also an antibody of the present invention. Is included.
  • the recombinant antibody includes antibodies produced by genetic recombination, such as human chimeric antibodies, human CDR-grafted antibodies, and human antibodies.
  • a recombinant antibody having characteristics of a monoclonal antibody, low antigenicity, and extended blood half-life is preferable as a therapeutic agent.
  • Examples of the recombinant antibody include those obtained by modifying the monoclonal antibody of the present invention using a gene recombination technique.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) and light chain constant region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody.
  • CH heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human haptoglobin or its three-dimensional structure. Each of these can be inserted into an animal cell recombinant vector having a gene encoding CH and CL to construct a human chimeric antibody recombinant vector, which can be expressed and produced by introduction into an animal cell.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but preferably the hIgG class is used, and hIgG1, hIgG2, hIgG3, Alternatively, any subclass such as hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the chimeric antibody of the present invention competes with the monoclonal antibody of the present invention, specifically recognizes the amino acid sequence of human haptoglobin, or its three-dimensional structure, and an epitope present in human haptoglobin to which the monoclonal antibody binds. Mention may be made of chimeric antibodies that bind to the same epitope.
  • the human CDR-grafted antibody is sometimes referred to as a humanized antibody, and refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibodies VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention has an amino acid sequence of human haptoglobin, or a VH and VL CDR amino acid sequence of a monoclonal antibody of a non-human animal that specifically recognizes and binds to its three-dimensional structure.
  • a cDNA encoding the V region transplanted to the VH and VL framework regions (hereinafter referred to as FR) of the human antibody is constructed, and a recombinant vector for animal cells having genes encoding the CH and CL of the human antibody is constructed.
  • FR VH and VL framework regions
  • Each can be inserted to construct a human CDR-grafted antibody recombinant vector, which can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • any CH can be used as long as it belongs to hIg, but preferably the hIgG class is used, and any subclass such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class is used. be able to.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention includes the VH of an antibody comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 31 to 33, respectively, and CDRs 1 to 3 are represented by SEQ ID NOs: 34 to 34, respectively.
  • a humanized antibody comprising a VL of an antibody comprising the amino acid sequence represented by 36, and CDR1 to 3 each comprising the VH of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 37 to 39, and each of the CDRs 1 to 3
  • the humanized antibody of the present invention is an epitope present in human haptoglobin that specifically recognizes the amino acid sequence of human haptoglobin or its three-dimensional structure in competition with the monoclonal antibody of the present invention and binds to the monoclonal antibody. And humanized antibodies that bind to the same epitope.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • the antibody naturally present in the human body can be cultured by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating it.
  • human antibody-producing hybridomas are obtained and cultured using normal hybridoma production methods performed in non-human animals to produce human antibodies in the culture supernatant. It can be produced by accumulating.
  • human antibody of the present invention include a human antibody comprising an amino acid sequence in which the antibody VH is represented by SEQ ID NO: 25 and the antibody VL is represented by SEQ ID NO: 26, and the antibody VH is SEQ ID NO: 27 and the antibody VL. Include a human antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28.
  • the multivalent immune complex formed by the antibody of the present invention binds to the human Fc ⁇ receptor via the Fc region of the antibody of the present invention. Therefore, the antibody of the present invention can inhibit a reaction caused by binding of an autoantibody to an Fc ⁇ receptor.
  • the human Fc ⁇ receptor to which the multivalent immune complex formed by the antibody of the present invention binds includes any human Fc ⁇ receptor that specifically binds to the Fc region of a human IgG antibody. , Human Fc ⁇ receptor III (CD16), human Fc ⁇ receptor II (CD32) and human Fc ⁇ receptor I (CD64). These human Fc ⁇ receptors are expressed on the surface of cells such as leukocytes and macrophages.
  • Human Fc ⁇ receptor III [J. Exp. Med., 170, 481 (1989)] refers to three types expressed on the surface of human cells having the activity of binding to the Fc region of a human IgG antibody having heavy chain ⁇ . Of type Fc ⁇ receptors, it means type III Fc ⁇ receptor. There are two isoforms of human Fc ⁇ receptor III, encoded by different and distinct genes, human Fc ⁇ receptor IIIa (including CD16a, allotype V158 and F158) and human Fc ⁇ receptor IIIb (CD16b, allotype Fc ⁇ RIIIb). -NA1 and allotype Fc ⁇ RIIIb-NA2). In the present invention, human Fc ⁇ receptor III includes any isoform or allotype.
  • Human Fc ⁇ receptor II [J. Exp. Med., 170, 1369 (1989)] refers to three types expressed on the surface of human cells having an activity of binding to the Fc region of a human IgG antibody having heavy chain ⁇ . Of type Fc ⁇ receptors, it means type II Fc ⁇ receptor.
  • Human Fc ⁇ receptor II has three isoforms encoded by different and distinct genes, including human Fc ⁇ receptor IIa (including allotype H131 [H type] and R131 [R type]), human Fc ⁇ receptor It is classified into IIb (including Fc ⁇ RIIb-1 and Fc ⁇ RIIb-2), human Fc ⁇ receptor IIc.
  • human Fc ⁇ receptor III includes any isoform or allotype.
  • Human Fc ⁇ receptor I [J Biol Chem., 266, 13449 (1991)] refers to three types of Fc ⁇ expressed on the surface of human cells having the activity of binding to the Fc region of a human IgG antibody having heavy chain ⁇ . Among receptors, it means type I Fc ⁇ receptor. Human Fc ⁇ receptor I has three isoforms encoded by different genes, and is classified into human Fc ⁇ receptor Ia, human Fc ⁇ receptor Ib, and human Fc ⁇ receptor Ic. In the present invention, human Fc ⁇ receptor I includes any isoform.
  • Human Fc ⁇ receptor I is known to bind to monomeric human IgG antibodies with high affinity for binding, and human Fc ⁇ receptor II and III are more potent than monomeric human IgG antibodies. It is known to bind to immune complexes with high affinity [Trends in Immunology, 29, 608 (2008)]. Therefore, the antibody of the present invention binds to human Fc ⁇ receptor I regardless of the formation of immune complexes.
  • Examples of reactions caused by binding of autoantibodies to Fc ⁇ receptors that can be inhibited by the antibodies of the present invention include IgG class autoantibodies that bind to Fc ⁇ receptors on the cell surface of leukocytes and macrophages, and Reactions that cause injury and phagocytosis are mentioned.
  • Examples of self-cell damage and phagocytosis include antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis activity (ADCP activity).
  • ADCC activity refers to autoantibody perforin by binding an autoantibody molecule bound to self tissue to, for example, natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) expressing Fc ⁇ receptors via the Fc portion.
  • NK cells natural killer cells
  • ADCP activity is self-tissue injury caused by phagocytosis and destruction when autoantibody molecules bound to self-tissue are captured by, for example, macrophages that express Fc ⁇ receptor via Fc part.
  • the antibody of the present invention includes an antibody obtained by modifying the amino acid in the Fc region of the antibody so that the binding activity to the Fc ⁇ receptor is increased.
  • an antibody obtained by combining the antibody of the present invention with the technology of the topical technology and / or the technology of modifying the Fc amino acid of the antibody is Fc of the antibody that forms an immune complex with Hp.
  • the domain binds more strongly to CD16a and inhibits ADCC activity more potently than IVIG.
  • fucose is present in N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region of the antibody.
  • examples include unbound antibodies.
  • Examples of antibodies in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region of the antibody include, for example, CHO cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene (International Publication No. 2005/035586, WO 02/31140).
  • the antibody of the present invention uses this technique as a method of inhibiting ADCC activity that is enhanced in pathological conditions by increasing affinity with Fc ⁇ receptor and binding to NK cells or the like that expressed Fc ⁇ receptor. be able to.
  • an antibody in which the amino acid in the Fc region of the antibody is modified so that the binding activity to the Fc ⁇ receptor is increased for example, an antibody molecule prepared by the method described in US Pat. No. 7,317,091 is used. Can be mentioned.
  • the antibody of the present invention can increase the blood half-life by modifying the surface charge of the polypeptide containing the variable region of the antibody or the antigen binding activity at a pH in the early endosome.
  • Monoclonal antibodies in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence constituting the above antibody and have the same activity as the above antibody are also encompassed by the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is one or more, and the number is not particularly limited. Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad It is the number that can be deleted, substituted or added by a known technique such as site-directed mutagenesis described in Sci USA, 82, 82488 (1985). For example, the number is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the antibody of the present invention indicates the following. That is, it means that there is a deletion, addition, substitution, or insertion of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the antibody.
  • deletion, addition, substitution, or insertion may occur simultaneously, and the amino acid residue to be deleted, added, substituted, or inserted may be either a natural type or a non-natural type.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • B group aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoser
  • the transformant of the present invention includes a DNA encoding an antibody molecule that specifically recognizes the ⁇ chain of human haptoglobin represented by SEQ ID NO: 70, binds to the human haptoglobin, and forms a multivalent immune complex. Any transformant is also included as long as it is a transformant obtained by introducing a recombinant vector containing the above into a host cell and produces the antibody of the present invention.
  • Specific examples of host cells include the following (1) to (5). (1) Chinese hamster ovary tissue-derived CHO cells; (2) Rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells; (3) mouse myeloma cell line NS0 cells; (4) Mouse myeloma cell line SP2 / 0-Ag14 cells; (5) Syrian hamster kidney tissue-derived BHK cells;
  • the transformant of the present invention that produces an antibody in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region of the antibody includes WO 2005/035586.
  • a host cell having a reduced or deficient glycosyltransferase produced by the method described in WO 02/31140 can be used.
  • the present invention relates to an autoimmune disease therapeutic agent comprising the monoclonal antibody of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to an autoimmune disease therapeutic agent comprising a monoclonal antibody that binds to human haptoglobin.
  • the human haptoglobin is preferably human haptoglobin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 71 as the ⁇ chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 as the ⁇ chain.
  • Autoimmune diseases include autoimmune diseases that involve tissue damage due to autoantibodies, including but not limited to immune thrombocytopenic purpura (both idiopathic thrombocytopenic purpura or thrombocytopenia) Say), Kawasaki disease, ANCA-related vasculitis, Guillain-Barre syndrome, chronic demyelinating polyradiculoneuritis, myasthenia gravis, multifocal motor neuropathy, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune hemolytic anemia, strong Autoimmune diseases in which IVIG products such as dermatosis, autoimmune urticaria, pemphigus, Goodbascher syndrome, psoriatic arthritis, Sjogren's syndrome, polymyositis / dermatomyositis are used as therapeutic agents, IgG4-related diseases, etc. Autoimmune diseases in which production of autoantibodies is involved in the pathological condition.
  • the therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention can be used for treatment and / or prevention of autoimmune diseases related to tissue damage caused by autoantibodies.
  • the therapeutic agent of the present invention may contain only the antibody as an active ingredient or a derivative thereof. However, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and formulated. Provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the art. *
  • the most effective treatment is preferably used.
  • oral administration or parenteral administration such as oral, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous or intraperitoneal administration is preferable.
  • parenteral administration such as oral, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous or intraperitoneal administration is preferable.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age and weight, but is usually 10 ⁇ g / kg to 100 mg / kg per day for an adult.
  • the therapeutic agent of the present invention may be used alone or in combination with at least one other therapeutic agent.
  • the therapeutic agent used in combination with the therapeutic agent of the present invention may be administered simultaneously with the therapeutic agent of the present invention or continuously administered.
  • other therapeutic agents include steroids, aspirin, cyclophosphamide, cyclosporine and the like.
  • Antibody Production Method Preparation of Antigen Human haptoglobin or cells expressing human haptoglobin as an antigen is a recombinant containing the full-length ⁇ -chain and ⁇ -chain forming human haptoglobin or cDNA encoding their partial length.
  • a body vector can be obtained by introducing it into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells or the like. It can also be obtained by purifying human haptoglobin from various human cultured cells, human tissues and the like that express a large amount of human haptoglobin.
  • the cultured cells or the tissues can be used as antigens as they are.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of human haptoglobin can be prepared by a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method, and used as an antigen.
  • Human haptoglobin or a synthetic peptide having a partial sequence of human haptoglobin may be added with a known tag such as FLAG or His at the C-terminal or N-terminal.
  • the human haptoglobin used in the present invention is a method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc.
  • the DNA encoding human haptoglobin can be expressed in a host cell and produced by the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding ⁇ chain and ⁇ chain forming human haptoglobin downstream of a promoter of an appropriate recombinant vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing a polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the recombinant vector.
  • Any recombinant vector can be used as long as it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can be used.
  • any microorganism that belongs to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells can be used so long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector can autonomously replicate in the prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a portion encoding human haptoglobin, and a transcription termination sequence. It is preferable that the vector contains The recombinant vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene. Furthermore, the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter. *
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the human haptoglobin can be substituted so that the codon is optimal for expression in the host, thereby improving the production rate of the target human haptoglobin.
  • Any recombinant vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 hereinafter, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Qiagen
  • pKYP10 Japanese Patent Laid-Open Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agricultural Biologic Chemistry, 48, 669) (1984)
  • pLSA1 Agric Biol. Chem., 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Examples of host cells include E. coli XL-1 Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ .
  • any method for introducing DNA into a host cell to be used can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]. *
  • any recombinant vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • pcDNA I, pcDM8 above, Funakoshi
  • pAGE107 Japanese Patent Laid-Open No. 03-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)
  • pAS3-3 Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-27075
  • pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)]
  • pcDNA I / Amp PcDNA3.1, pREP4 (Invitrogen)
  • pAGE103 J.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • SV40 early promoter a retroviral promoter
  • Metallothionein promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • heat shock promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • SR ⁇ promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer e.g., a promoter of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • host cells include human leukemia cells Namalwa cells, monkey kidney tissue-derived COS cells, Chinese hamster ovary tissue-derived CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci.
  • mice also referred to as YB2 / 0 cells
  • mouse myeloma cell line NS0 cells mouse myeloma cell line SP2 / 0-Ag14 cells
  • Syrian hamster kidney tissue-derived BHK or HBT5637 cells Japanese hamster kidney tissue-derived BHK or HBT5637 cells
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electroporation method Cytotechnology, 3, 133 (1990)
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) )
  • electroporation method Cytotechnology, 3, 133 (1990)
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)
  • a microorganism having a recombinant vector incorporating a human haptoglobin-encoding DNA obtained as described above or a transformant derived from an animal cell is cultured in a medium, and the human haptoglobin is produced in the culture.
  • Human haptoglobin can be produced by accumulating and collecting from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host include, for example, a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science]. 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Examples include a Dulbecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • IMDM Dulbecco's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • a method for producing human haptoglobin there are a method of producing in a host cell, a method of secreting it outside the host cell, or a method of producing it on the host cell outer membrane.
  • the host cell to be used or the structure of human haptoglobin to be produced is determined. By changing, an appropriate method can be selected.
  • the obtained human haptoglobin can be isolated and purified as follows, for example. *
  • the cells When human haptoglobin is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, or dynomill. Use to crush the cells to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), A single method such as hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose or phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing Or use it in combination to obtain a purified preparation. Kill. *
  • human haptoglobin When human haptoglobin is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is collected and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble substance of human haptoglobin as a precipitate fraction. The recovered insoluble human haptoglobin is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the human haptoglobin is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified polypeptide preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above. *
  • the derivative such as the human haptoglobin or a modified sugar thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • the human haptoglobin used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method. Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. *
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously, ridge, intravenously or intraperitoneally, together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limothemoyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole Limothemoyanin
  • the antigen is administered 1 to 10 times every 1 to 4 weeks after the first administration. On days 1 to 14 after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A-Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. .
  • tissues containing antibody-producing cells such as spleen and lymph nodes are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • spleen cells When spleen cells are used, the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • the myeloma cells were subcultured in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS and 8-azaguanine], and subcultured into normal medium 3-4 days before cell fusion. Secure 2 ⁇ 10 7 or more cells on the day of fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PBS disodium phosphate 1. 83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, sodium chloride 7.65 g, distilled water 1 liter, pH 7.2
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing human haptoglobin and does not react with an antigen not containing human haptoglobin is selected by a hybridoma selection method described later.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and a stable and strong antibody titer was observed.
  • first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used
  • a stable and strong antibody titer was observed.
  • One is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma-SFM medium and cultured for 3 to 7 days. To do.
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the obtained supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Daigo GF21 can be added to the Hybridoma-SFM medium. *
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm. *
  • the monoclonal antibody is selected by analyzing the binding activity to human haptoglobin and mouse haptoglobin by enzyme immunoassay (ELISA) as shown below.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Human haptoglobin or mouse haptoglobin is dispensed into a plate such as a 96-well plate, and after immobilizing the protein, a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as the first antibody, React. After the reaction, the plate is thoroughly washed with PBS containing 0.1% Tween (hereinafter referred to as PBST), and then anti-immunoglobulin labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radiation compound as a second antibody. Dispense antibody to react. After thoroughly washing with PBST or the like, a reaction corresponding to the substance is performed for labeling the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with human haptoglobin or mouse haptoglobin is selected.
  • PBST PBS containing 0.1% Tween
  • a monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody of the present invention and binds to human haptoglobin and mouse haptoglobin can be obtained by adding the test antibody to the above-described binding reaction detection system using ELISA. That is, by screening for an antibody that inhibits the binding of the monoclonal antibody of the present invention when a test antibody is added, the amino acid sequences of human haptoglobin and mouse haptoglobin, or their binding to the three-dimensional structure, were obtained in the present invention. Monoclonal antibodies that compete with the monoclonal antibodies can be obtained. *
  • the monoclonal antibody that binds to the same epitope as the epitope contained in human haptoglobin or mouse haptoglobin to which the monoclonal antibody of the present invention binds identifies the epitope of the antibody obtained by the above-described binding reaction detection system using ELISA. It can be obtained by preparing a partial synthetic peptide of the identified epitope or a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of the epitope and immunizing it.
  • a recombinant antibody expression vector is a recombinant vector for animal cells into which DNA encoding CH and CL of a human antibody is incorporated. It can be constructed by cloning DNAs encoding CH and CL of human antibodies into body vectors, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for the DNA encoding CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any animal cell recombinant vector may be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)].
  • promoters and enhancers include SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant vectors, ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a recombinant vector of the type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)] is used.
  • a type in which the strands are present on separate vectors can also be used.
  • tandem recombinant vector pKANTEX93 (International Publication No. WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] and the like are used.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence, respectively.
  • non-human animal for producing a hybridoma cell producing a non-human antibody a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it can produce a hybridoma cell. . *
  • RNA easy kit For preparation of total RNA from hybridoma cells, a kit such as guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], or RNA easy kit (Qiagen) is used.
  • oligo (dT) immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] or Oligo-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit
  • kit such as (Takara Bio).
  • mRNA can be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience). *
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP ExPress [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAPIII (Stratagene)
  • ⁇ gt10, ⁇ gt11 [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • Lambda BlueMid (Clontech)
  • pT7T3-18U Pharmacia
  • pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]
  • pUC18 Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL-1 Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol ., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • Selection of cDNA clones encoding non-human antibody VH or VL from a cDNA library can be achieved by colony hybridization method using isotope or fluorescently labeled probe, or plaque hybridization method [Molecular Cloning, A Laboratory Laboratory Manual , SecondCEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • PCR method Polymerase Chain Reaction method
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the base sequence of the cDNA is determined by a commonly used base sequence analysis method or the like.
  • the base sequence analysis method includes, for example, a dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] and then ABI PRISM 3700 (PE Biosystems) or A.I. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used. *
  • the complete amino acid sequence of the VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence is compared with the entire amino acid sequence of the known antibody VH and VL [ALFDNA, US Dept.Health and Human Services (1991)]
  • the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and further the subgroup to which they belong can be known.
  • the amino acid sequences of CDRs of VH and VL can also be found by comparing with the amino acid sequences of known antibodies VH and VL [A.L.F.DNA, US Dept.Health and Human Services (1991)]. *
  • VH and VL complete amino acid sequences
  • BLAST method J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) against any database such as SWISS-PROT or PIR-Protein.
  • the complete amino acid sequences of VH and VL can be confirmed.
  • a recombinant vector for expressing a human chimeric antibody can be constructed by cloning cDNAs encoding VH or VL, respectively.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the recombinant antibody expression vector obtained in (1). Cloning and construction of a recombinant vector for human chimeric antibody expression. *
  • a recombinant antibody expression vector obtained in (1) by amplifying cDNA encoding non-human antibody VH or VL by a PCR method using a synthetic DNA having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively. can also be cloned.
  • the amino acid sequence of the VH or VL FR of the human antibody to be transplanted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody. *
  • human antibody FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or common subsequences of human antibody FR subgroups [ALFDNA, US Dept.Health and Human Services (1991)], etc. Is used.
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the VH or VL FR amino acid sequence of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the humanized antibody is designed.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the codon usage frequency [ALFDNA, US Dept.Health and Human Services (1991)] found in the base sequence of the antibody gene, and VH or VL of the humanized antibody DNA sequences encoding the amino acid sequences are designed respectively.
  • a cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be easily obtained by introducing a restriction enzyme recognition sequence into the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends to obtain the gene set obtained in (1). It can be cloned into a vector for expression of a replacement antibody.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired humanized antibody
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the full length of the H chain or the full length of the L chain is obtained.
  • a product obtained by synthesizing the full length VH and the full length VL as one long chain DNA based on the designed DNA sequence can be used in place of the PCR amplification product.
  • the cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be easily converted into the recombinant antibody expression vector obtained in (1). Can be cloned into.
  • a humanized antibody can only have its antigen-binding activity by transplanting only the VH and VL CDRs of a non-human antibody into the VH and VL FRs of a human antibody. [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence is introduced at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends. Then, the gene for the recombinant antibody expression vector obtained in (1) is cloned upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL so that they are expressed in an appropriate form.
  • Transient expression of recombinant antibodies Using recombinant vectors for expression of recombinant antibodies obtained in (3) and (6), or recombinant vectors obtained by modifying them, Transient expression can be performed, and the antigen-binding activity of many types of humanized antibodies prepared can be efficiently evaluated.
  • Any host cell that can express a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant vector is introduced.
  • COS-7 cells ATCC number: CRL1651 are used [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)].
  • the expression level and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are determined by the enzyme immuno-antibody method [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Thiral Antibodies-Principles and Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)], etc.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC number: CCL-61
  • DUkXB11 ATCC number: CCL-9096
  • Pro-5 ATCC number: CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice 20 also referred to as YB2 / 0
  • mouse myeloma cell NS0 mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • mouse P3-X63-Ag8653 cell ATCC number: CRL1580
  • dihydrofolate reductase gene Dihydroformate Reductase (hereinafter referred to as DHFR) -deficient CHO cells [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 4216 (1980)], Lec13 that has acquired lectin resistance [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)], CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene (WO 2005/035586, WO 02/31140), rat YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells (ATCC number: CRL1662) are used.
  • a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or a sugar chain in which the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of an N-glycoside-linked complex sugar chain
  • Host cells in which the activity of proteins such as enzymes involved in modification, or proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus are reduced or deleted, such as ⁇ 1,6-fucose transferase gene deficient CHO cells (International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 02/31140) and the like can also be used.
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (Japanese Patent Laid-Open No. 02-257891). Issue gazette). *
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (Invitrogen), GIT medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), EX-CELL301 medium (JRH), IMDM medium (Invitrogen), Hybridoma-SFM medium (Invitrogen), Or the culture medium etc. which added various additives, such as FBS, to these culture media are used.
  • RPMI1640 medium Invitrogen
  • GIT medium Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • EX-CELL301 medium JRH
  • IMDM medium Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium Invitrogen
  • the culture medium etc. which added various additives, such as FBS, to these culture media are used.
  • the obtained transformant is cultured in a medium to express and accumulate the recombinant antibody in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the expression level of the recombinant antibody produced by the transformant can be increased using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 02-257891). *
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A-column [Monoclonal-Antibodies-Principles-and-practice, Third-edition, Academic-Press (1996), Antibodies-A-Laboratory-Manual, Cold-Spring-Harbor-Laboratory (1988)].
  • methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory (1988)].
  • Method for controlling the amount of fucose also referred to as core fucose
  • GlcNAc glucosamine
  • a method for controlling by modifying amino acid residues in the Fc region of is known.
  • the effect of the monoclonal antibody of the present invention can be controlled by any method.
  • the effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of the antibody, and ADCC activity, CDC activity, or ADCP activity by phagocytes such as macrophages or dendritic cells is known.
  • inflammatory cells as targets, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as effectors, and inflammatory cell-specific antibodies are mixed and incubated for about 4 hours. Lactate dehydrogenase (LDH) released as an indicator of cell damage can be measured as effector activity.
  • human PBMC may be mixed with an antibody recognizing a blood cell-specific antigen such as CD20, and after incubation, the decrease in the number of cells by free LDH or flow cytometry may be measured as an effector activity. it can.
  • the effector activity of the antibody can be increased or decreased.
  • a method for reducing the content of fucose bound to the N-linked complex type sugar chain bound to the Fc of the antibody expressing the antibody using CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene, An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is not bound (hereinafter also referred to as non-fucose-bound type) has a higher binding activity to CD16a than an antibody to which fucose is bound (hereinafter also referred to as fucose-bound type). Along with this, it is known to have high ADCC activity. *
  • the antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced.
  • an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower binding activity to CD16a than an antibody to which fucose is not bound. In addition, it has low ADCC activity.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody.
  • the CDC activity of an antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165. *
  • ADCC activity is achieved by performing amino acid modification described in US Pat. No. 6,737,056, US Pat. No. 7,297,775, or US Pat. No. 7,317,091.
  • CDC activity can be increased or decreased.
  • the antibody of the present invention can be used for the treatment of autoimmune diseases related to tissue injury caused by autoantibodies.
  • Autoimmune diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases involving tissue damage due to autoantibodies, including immune thrombocytopenic purpura, Kawasaki disease, ANCA-related vasculitis, Guillain-Barre syndrome, chronic prolapse Myelogenous polyneuropathy, myasthenia gravis, multifocal motor neuropathy, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune hemolytic anemia, scleroderma, autoimmune urticaria, pemphigus, Goodbascher syndrome, Examples include autoimmune diseases in which IVIG preparations such as psoriatic arthritis, Sjogren's syndrome, polymyositis / dermatomyositis are used as therapeutic agents, and autoimmune diseases in which production of autoantibodies such as IgG4-related diseases is involved in the pathology It is done.
  • autoimmune diseases involving tissue damage due to autoantibodies, including immune thrombocytopenic purpur
  • Examples of the administration route include oral administration and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules. *
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • sugars such as water, sucrose, sorbitol or fructose
  • glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil
  • p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol
  • disintegrants such as starch or sodium alginate
  • lubricants such as magnesium stearate or talc
  • polyvinyl alcohol hydroxy
  • hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin
  • a surfactant such as a fatty acid ester
  • plasticizer such as glycerin
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays. *
  • Injection is manufactured using a carrier composed of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and in which the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment is dispersed as fine particles to facilitate absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • Example 1 Preparation of soluble CD16a (1) Preparation of human peripheral blood mononuclear cell cDNA After collecting 30 mL of venous blood of a healthy person and adding 0.5 mL of heparin sodium (Shimizu Pharmaceutical Co., Ltd.), gently mixing the mixture, It was mixed with 30 mL of physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). 10 mL of the mixture was gently overlaid on 4 mL of Lymphoprep (NYCOMED PHARMA AS), and centrifuged at 2000 rpm for 30 minutes at room temperature.
  • the separated mononuclear cell fraction was collected from each centrifuge tube, mixed, suspended in 30 mL of RPMI1640 (GIBCO) [hereinafter RPMI1640-FBS (10)] containing 10% FBS (GIBCO), and 1200 rpm at room temperature. For 15 minutes.
  • the prepared peripheral blood mononuclear cell suspension (5 mL) was centrifuged at room temperature at 800 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, suspended in 5 mL of PBS (Phosphate buffered saline), and centrifuged at room temperature at 800 rpm for 5 minutes.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • cDNA was prepared using SUPERSCRIPT TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Life Technologies) according to the attached document.
  • CD16a cDNA of human CD16a (hereinafter referred to as CD16a) was obtained as follows.
  • PCR was performed using the human peripheral blood mononuclear cell-derived cDNA prepared in Example 1 (1) as a template and the above-mentioned two kinds of primers (SEQ ID NOs: 1 and 2). PCR was performed based on the instructions attached to DNA polymerase ExTaq (Takara Bio Inc.).
  • reaction solution was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached document. After digestion with restriction enzymes EcoRI (Takara Bio Inc.) and BamHI (Takara Bio Inc.), it was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to recover a specific amplified DNA fragment (about 800 bp).
  • plasmid pBluescript II SK ( ⁇ ) (Stratagene) was digested with restriction enzymes EcoRI (Takara Bio) and BamHI (Takara Bio), and then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis and about 2.9 kbp. DNA fragments were recovered.
  • CD16a (V) Plasmid pBs CD16a (V) containing DNA encoding cDNA (SEQ ID NO: 3) was obtained.
  • soluble CD16a Soluble CD16a (V) having an extracellular region of CD16a (positions 1 to 193 of SEQ ID NO: 4) and a histidine tag (an amino acid sequence in which six Hiss are continuous) at the C-terminus
  • a cDNA encoding [hereinafter soluble CD16a (V)] was constructed as follows.
  • a primer FcgR3-1 (SEQ ID NO: 5) specific to the extracellular region was designed from the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of CD16a (V) cDNA.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 1 (2) using 5 ng of pBs CD16a (V) and DNA polymerase ExTaq (Takara Bio Inc.).
  • reaction solution was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached document and dissolved in sterilized water. After digestion with restriction enzymes PstI (Takara Bio Inc.) and BamHI (Takara Bio Inc.), it was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to recover a specific amplified DNA fragment (about 110 bp).
  • G418 was added to a concentration of 1.0 mg / mL, followed by culturing for 1 to 2 weeks.
  • the MTX concentration is increased sequentially from 50 nmol / L, and finally can be grown in Hybridoma-SFM-FBS (10) medium containing 1.0 mg / mL G418 and 200 nmol / L MTX, and soluble CD16a Highly transformed cells were obtained.
  • Hybridoma-SFM-GF containing 1.0 mg / mL of G418 and 200 nmol / L of MTX was used as the transformed cell producing soluble CD16a (V) obtained in Example 1 (5).
  • (5) Suspended in [Hybridoma-SFM medium (Life Technology) containing 5% Daigo's GF21 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] to 3 ⁇ 10 5 cells / mL, and 182 cm 2 flask (Greiner) 50 mL was dispensed.
  • Soluble CD16a (V) was purified from the culture supernatant using a Ni-NTA agarose (Qiagen) column according to the attachment.
  • Example 2 Separation and analysis of components having high CD16a binding activity in IVIG (1) Separation of components having high CD16a binding activity 0.25 mg of His-CD16a was added to HiTrap NHS-activated HP column (GE Healthcare To the solid phase according to the attachment. At that time, the unreacted activated ester group was blocked using 0.5 mol / L Tris-HCl (pH 8.0) as a blocking buffer, and the column which was only blocked without immobilizing CD16a was controlled. Column.
  • the supernatant of the reaction solution was collected in a tube containing 1/100 volume of 5% formic acid containing 50% acetonitrile, and the peptide was extracted from the gel piece with 5% formic acid containing water and 50% acetonitrile. After collecting the extract, acetonitrile contained in the solution was removed with a centrifugal concentrator to prepare an analysis sample.
  • Xencor type antibodies that are bound by replacing Xencor type antibodies such as aggregates contained in IVIG and immune complexes of serum proteins and autoreactive components in IVIG. It was considered to be a component having CD16a binding activity equal to or higher than that.
  • the analysis results were analyzed using a mass spectrometry analysis search engine MASCOT (Matrix science) to identify proteins.
  • MASCOT mass spectrometry analysis search engine
  • the high-scoring band was considered to be derived from the H chain fragment / polymer.
  • Human Hp was identified from a band with a molecular weight of 43 kDa.
  • Example 3 Immunization to human antibody-producing animals
  • human Hp ATHENS RESEARCH & TECHNOLOGY, mixed type
  • two human antibody-producing animals with an adjuvant was used for 3 to 4 weeks.
  • Each immunized a total of 5 times.
  • the antibody titer was analyzed for binding activity against human and mouse Hp by ELISA, and both showed binding activity.
  • Example 4 Production of hybridoma After three to five immunizations, the lymphatic tissue was surgically removed and subjected to cell fusion. First, the extracted lymphoid tissue was suspended in DMEM medium (Invitrogen), and the tissue was ground and washed with DMEM medium. The obtained cells were mixed with the mouse myeloma cell line Sp2 / 0 and washed with DMEM medium.
  • DMEM medium Invitrogen
  • DMEM medium that had been warmed to 37 ° C. over 4 minutes was added, and 10 mL of medium was further added over 1 minute.
  • the suspension was warmed in a 37 ° C. bath for 5 minutes, and then centrifuged at room temperature and 1200 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the cells were suspended in DMEM medium, seeded in a 96-well plate (BD), and cultured. On the following day, the cells were cultured in a drug selection medium for about 1 week.
  • Hybridoma screening The binding activity of the hybridoma prepared in Example 4 to the culture supernatant human Hp and mouse Hp was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • BSA-PBS bovine serum albumin
  • the plate was washed 3 times with PBST, and Goat anti Human IgG (H & L) -HRP (American Qualex) diluted with 1% BSA-PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Goat anti Human IgG (H & L) -HRP American Qualex
  • the plate was washed 3 times with PBST, and ABTS was dispensed at 50 ⁇ L / well for color development.
  • ABTS sodium dodecyl sulfate
  • 1% SDS sodium dodecyl sulfate
  • RNA was prepared according to the following procedure. From the obtained total RNA, cDNA was prepared using SMARTER RACE cDNA amplification kit (Clontech) according to the attached document.
  • clones # 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6 were identified as VH and VL base sequences and amino acid sequences excluding the signal sequence.
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 and the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively, and the nucleotide sequences of VH and VL of clone # 6, SEQ ID NOs: 13 and 14, and clones # 4 and VH, respectively.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23 and 24, the base sequences of VH and VL of clone # 27 are SEQ ID NOs: 15 and 16, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 25 and 26, and the VH and VL of clone # 105, respectively.
  • the base sequences are SEQ ID NOs: 17 and 18, and the respective amino acid sequences are SEQ ID NOs: 27 and 28, the VH and VL base sequences of clone # 96-6 are SEQ ID NOs: 19 and 20, and the respective amino acid sequences are SEQ ID NO: 29 and 30.
  • amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of VH of clone # 27 are shown in SEQ ID NOs: 31, 32, and 33, respectively, and the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of VL of clone # 27 are shown in SEQ ID NOs: 34, 35, and 36, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of VH of clone # 105 are shown in SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, respectively, and the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of VL of clone # 105 are shown in SEQ ID NOs: 40, 41 and 42, respectively. It was shown to.
  • Example 7 Construction of recombinant vector for expression of human IgG1-type anti-Hp antibody
  • the recombinant vector for expression of human IgG1-type anti-Hp antibody is variable in heavy chain and light chain of anti-Hp antibody determined in Example 6.
  • the region genes were generated by linking to human IgG1 heavy chain and kappa chain constant region genes, respectively.
  • human IgG1 heavy chain recombinant vector pFUSEss-CHIg-hG1 InvivoGen
  • human IgG1 kappa chain recombinant vector pFUSE2ss-CLIg-hk InvivoGen
  • the heavy chain variable region gene is between the restriction enzyme EcoRI and the BsiWI site
  • the light chain variable region gene is between the restriction enzyme EcoRI and the NheI site
  • the CloneEZ® PCR Cloning Kit (GenScript).
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells TOYOBO were transformed, and culture, plasmid extraction, and sequence confirmation were performed to prepare a recombinant vector for human IgG1-type anti-Hp antibody expression.
  • the medium LB Broth (Difco) supplemented with Zeocin (Invitrogen) at a final concentration of 50 ⁇ g / mL was used as the heavy chain recombinant vector, and the kappa chain recombinant vector was Fast- Media Blas TB (InvivoGen) was used.
  • Example 8 Transient expression of anti-Hp antibody
  • the recombinant vector produced in Example 7 was introduced into a host cell.
  • a host cell Freestyle 293F cell (Invitrogen) was used.
  • Plasmid introduction was performed according to the attached document using 293Fectin Transfection Reagent (Invitrogen).
  • the human IgG1-type anti-Hp antibody recombinant vector the one prepared by mixing the heavy chain recombinant vector and the ⁇ chain recombinant vector prepared in Example 7 at 2: 3 was used.
  • the collected culture supernatant was centrifuged, and the obtained culture supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m filter to prepare a culture supernatant containing human IgG1-type anti-Hp antibody.
  • Example 9 Purification of anti-Hp antibody The human IgG1-type anti-Hp antibody transient expression strain obtained in Example 8 was suspended in Free style 293 expression medium (Invitrogen) and cultured in an Erlenmeyer flask for 6 days, and then the culture supernatant was collected. Human IgG1-type anti-Hp antibody was purified from the prepared culture supernatant using MabSelect SuRe (GE Healthcare).
  • the culture supernatant is passed through the column, the column is washed with a washing buffer solution (0.15 mol / L NaCl, 0.2 mol / L Na borate / pH 7.5), and then an elution buffer solution having a pH of 3.5. Elute with (0.1 mol / L Na citrate / pH 3.5).
  • the eluted fraction was immediately neutralized with a neutralization buffer (1 mol / LTris-HCl / pH 8.5).
  • the absorbance at 280 nm (A 280 ) of each fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was recovered as an antibody fraction.
  • the buffer solution was exchanged with PBS, and a 0.22 ⁇ m filter was used as a purified protein.
  • the concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.4.
  • Example 10 CD16a binding activity (ELISA) Using the anti-Hp antibodies (# 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6) prepared in Example 9, the CD16a binding activity of the immune complex of anti-Hp antibody and human Hp was measured by ELISA. .
  • ELISA ELISA
  • anti-Hp antibodies # 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6
  • the CD16a binding activity of the immune complex of anti-Hp antibody and human Hp was measured by ELISA.
  • anti-Tetra-His antibody Qiagen
  • 1% BSA-PBS was dispensed at 100 ⁇ L / well, allowed to stand at room temperature for 1 hour to block, and washed 5 times with PBST.
  • the soluble CD16a prepared in Example 1 diluted with 1% BSA-PBS so as to be 5 ⁇ g / mL was dispensed at 50 ⁇ L / well, reacted at room temperature for 2 hours, and washed 5 times with PBST. .
  • a mixed solution of anti-Hp antibody and human Hp (hereinafter also referred to as IC) was prepared by diluting with 1% BSA-PBS and then allowing to stand at room temperature for 1 hour. Concentrations were such that when the anti-Hp antibody was 150 kDa and the human Hp was 200 kDa, the molar ratio of anti-Hp antibody to human Hp was 1: 2.
  • a mixed solution appropriately diluted with 1% BSA-PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 5 times with PBST, and Goat anti Human IgG (H & L) -HRP (American Qualex) diluted with 1% BSA-PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Goat anti Human IgG (H & L) -HRP American Qualex
  • the plate was washed 5 times with PBST, and ABTS was dispensed at 50 ⁇ L / well for color development. When an appropriate color was obtained, 1% SDS was dispensed at 50 ⁇ L / well, and the absorbance at a sample wavelength of 415 nm and a reference wavelength of 490 nm was measured using a plate reader.
  • the EC50 value of IVIG was 1.06 ⁇ g / mL
  • the EC 50 value of each antibody alone was 1.99 ⁇ g / mL for # 4, 0.805 ⁇ g / mL for # 6, # 27 was 0.763 ⁇ g / mL
  • # 105 was 0.405 ⁇ g / mL
  • # 96-6 was 0.473 ⁇ g / mL. All of the anti-Hp antibodies were found to have higher binding activity against CD16a than that of IVIG (FIGS. 1A to 1F).
  • the EC 50 value when each antibody was mixed with human Hp was 0.298 ⁇ g / mL for # 4, 0.0664 ⁇ g / mL for # 6, and 0.2 for # 27. 0490 ⁇ g / mL, # 105 was 0.0540 ⁇ g / mL, and # 96-6 was 0.0459 ⁇ g / mL. This indicates that when the antibody was mixed with human Hp, an immune complex was formed with human Hp, and the binding activity to CD16a was enhanced (FIGS. 1A to 1E).
  • Anti-Hp antibodies (# 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6) were prepared by the method described below.
  • (1) Construction of recombinant vector for expression of anti-Hp antibody for stable expression As a recombinant vector, pDELTA was used as a recombinant vector containing a human IgG1 ⁇ constant region gene. The heavy chain variable region gene is inserted between the restriction enzyme NotI and ApaI sites, and the light chain variable region gene is inserted between the restriction enzyme EcoRI and BsiWI sites using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) for stable expression. A recombinant vector for expression of anti-Hp antibody was prepared.
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells were transformed, and a recombinant vector was prepared by carrying out culture, plasmid extraction, and sequence confirmation.
  • a recombinant vector for human IgG1-type anti-Hp antibody expression prepared in Example 7 was used as a template, and the primers shown in SEQ ID NOs: 43-62 were used as PCR primers.
  • Example 11 (1) Production of fucose-binding antibody
  • the recombinant vector prepared in Example 11 (1) was introduced into a host cell.
  • CHO-K1 cells were used as host cells.
  • Gene transfer, culture, and drug selection of recombinant vectors into cells by electroporation were performed by general methods.
  • the medium containing the drug was exchanged once a week in the culture, and the one in which the ratio of viable cells was recovered to about 98% was defined as a stable expression bulk strain.
  • This stable expression strain was added to a medium of 3 ⁇ 10 5 cells / mL in a medium such as EX-CELL 325 PF CHO Serum-Free Medium for CHO Cells (Sigma-Aldrich) containing 8 mmol / LGln and 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai Tesque). After suspending in the manner as described above and culturing for 14 days, the culture supernatant was recovered. Anti-Hp antibody was purified from the culture supernatant by the method described in Example 9.
  • Example 11 (1) Preparation of non-fucose-binding antibody
  • FUT8 knockout CHO cells International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 02/31140 were used as host cells, and the subsequent operation was performed according to the method described in Example 11 (2).
  • DNP antibody A negative control antibody, dinitrophenhydrine (DNP) antibody, was prepared according to a known method (Motoki K et. Al., Clin. Cancer Res. 11, 3126-3135, 2005). did.
  • a recombinant vector is a human IgG1 Fc region gene sequence (SEQ ID NO: 63) containing an amino acid modification (S239D, I332E) (hereinafter referred to as hCg1 Xen 239 332).
  • Synthetic DNA which may be abbreviated) (GENEWIZ) was prepared by inserting between the restriction enzyme NheI and BamHI sites of the recombinant vector prepared in Example 11 (1).
  • the recombinant vector could be prepared using ApaI instead of NheI.
  • Example 11 (3) The subsequent operation was carried out according to the method described in Example 11 (3), to produce a non-fucose-bound and Fc amino acid-modified anti-Hp antibody.
  • an anti-Hp antibody of non-fucose-binding type and Fc amino acid modification type with three Fc amino acid modifications (S239D, S298A, I332E) was prepared.
  • Example 13 Antigen-binding activity of anti-Hp antibody Using the anti-Hp antibodies (# 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6) prepared in Example 9, anti-Hp antibodies against human Hp The binding activity was analyzed by ELISA. First, in a 96-well plate (MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Thermo Fisher Scientific), human Hp (Japan Blood Products Organization) prepared in PBS to 5 ⁇ g / mL was dispensed at 50 ⁇ L / well at 4 ° C. It was allowed to stand overnight for adsorption.
  • MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE Thermo Fisher Scientific
  • 1% BSA-PBS was dispensed at 100 ⁇ L / well, allowed to stand at room temperature for 1 hour to block, and washed 3 times with PBST.
  • 50 ⁇ L / well of anti-Hp antibody diluted with 1% BSA-PBS to an appropriate concentration was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Subsequent operations were performed according to the method described in Example 5, except for measuring the absorbance with a plate reader (sample wavelength: 405 nm).
  • the four antibodies # 6, # 27, # 105 and # 96-6 all showed high binding activity to human Hp (FIG. 2).
  • # 4 also showed binding activity equivalent to these 4 antibodies.
  • the anti-Hp antibodies (# 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6) prepared in Example 9 were detected by Western blotting against either ⁇ chain or ⁇ chain of human Hp. It was analyzed whether it has binding activity.
  • human Hp prepared using a reducing condition sample buffer containing mercaptoethanol was separated by SDS-PAGE electrophoresis and then blotted onto a PVDF membrane. After reacting with each anti-Hp antibody, the bound antibody was detected with Goat anti Human IgG (H & L) -HRP (American Qualex).
  • antibodies # 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6 all showed specific binding activity to the ⁇ chain. From the above, it has been found that all the antibodies # 4, # 6, # 27, # 105 and # 96-6 are antibodies that specifically recognize the ⁇ chain and bind to human Hp.
  • Example 14 Molecular weight analysis of immune complex of anti-Hp antibody and human Hp In order to confirm that the anti-Hp antibody and human Hp bind to form an immune complex, gel filtration chromatography (Size Exclusion Chromatography, SEC) using HPLC (Prominence, Shimadzu Corporation) (column; BioSep SEC-s4000, 7.8 ⁇ 300 mm, phenomenex).
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • the column was equilibrated with mobile phase [50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0, 500 mmol / L NaCl)], and anti-Hp antibody and human Hp (Japan Blood Products Organization) were 0.5 mg / mL and 1.3 mg, respectively.
  • the solution was diluted with PBS so as to be / mL, mixed, and allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours.
  • Multi-angle light scattering detector (MALS) (miniDAWN TREOS, Wyatt Technology) for each peak detected at a wavelength of 280 nm after separating components contained in 50 ⁇ L of the mixture at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the molecular weight was calculated using the maximum value of the scattering intensity detected by. The results are shown in Table 1.
  • Hp can have a structure with a plurality of molecular weights depending on how many ⁇ / ⁇ -subunits are included.
  • MALS molecular weight analysis by MALS
  • the molecular weight of human Hp was calculated to be 206 ⁇ 10 3 . Therefore, it was estimated that the main component of human Hp used here contains four ⁇ / ⁇ -subunits [J Sep Sci., 32, 1224 (2009)].
  • the molecular weight of the immune complex is higher for the immune complex formed by # 6, # 27, # 105 and # 96-6 than for the immune complex formed by # 4. It was big.
  • the molecular weight of the antibody was 150 ⁇ 10 3
  • the number of molecules of the antibody and human Hp contained in the immune complex was estimated.
  • the immune complex formed by # 4 contains one antibody molecule and human Hp1 molecule.
  • the immune complex formed by # 27 was presumed to contain 2 antibodies and human Hp1 molecules, and the immune complex formed by # 6, # 105 and # 96-6 contained 2 antibodies and human Hp2 molecules or more. .
  • Example 15 CD32a binding activity (ELISA) (1) Preparation of soluble CD32a According to the method described in Example 1, histidine tag-fused soluble CD32a was prepared. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 64.
  • Example 10 by mixing the antibody with human Hp, an immune complex was formed with human Hp, and 4 antibodies (# 6, # 27, # 105 and # 96-6) also showed enhanced binding activity to CD32a by mixing with human Hp in the analysis of binding activity to CD32a. On the other hand, # 4 did not show enhanced activity (FIG. 3).
  • Example 16 Inhibitory activity for binding of CD16a to anti-DNP antibody (1) Construction of recombinant vector of CD16a cDNA encoding full-length CD16a (V) (SEQ ID NO: 4) prepared in Example 1 (2) After digesting 5.0 ⁇ g of plasmid pBs CD16a (V) containing restriction enzyme NotI (Takara Bio) and BamHI (Takara Bio), it was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 800 bp. did.
  • CD16a-expressing cells The recombinant vector pKANTEX CD16a (V) encoding the full-length CD16a (V) constructed in Example 16 (1) was introduced into the DHFR gene-deficient CHO cell strain DG44 (CHO / DG44 cells). Then, CD16a stably producing cells were prepared as follows.
  • PKANTEX CD16a V was introduced into CHO / DG44 cells by electroporation. Similar to the method described in Example 1 (5), the MTX concentration was sequentially increased, and finally IMDM (GIBCO) containing 0.5 mg / mL G418 and 500 nmol / L MTX and 10% FBS (GIBCO) was used. ) To obtain a transformed cell that was capable of growing and highly expressed CD16a.
  • the obtained transformed cells were detached with a 0.02% EDTA solution (Nacalai Tesque), washed with PBS (phosphate buffered saline), then FCM buffer 1 (2% FBS, 0.05% NaN 3 and It was suspended in PBS containing 1 mmol / L EDTA).
  • the cells were seeded in a 96-well U-bottom plate (Falcon) so as to be 2 ⁇ 10 5 cells / well, stained with PE-labeled anti-human CD16 antibody (BD Bioscience), washed, and then the cells were subjected to FCM buffer. 1 and the fluorescence intensity was analyzed with a flow cytometer (BD Bioscience, FACS Canto II) to confirm that CD16a was highly expressed.
  • the CD16a-expressing cells prepared in Example 16 (2) were seeded in a 96-well plate so as to be 1.2 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the anti-Hp antibody prepared in Example 11 (fucose-binding type and non-fucose-binding type), an immune complex comprising non-fucose-binding type anti-Hp antibody and human Hp, and IVIG were diluted with buffer solution 1 for FCM. Then, it was left at room temperature for 1 hour to obtain a subject.
  • An immune complex consisting of a non-fucose-binding anti-Hp antibody and human Hp was prepared so that the molar ratio of anti-Hp antibody to human Hp was 1: 2 when the anti-Hp antibody was 150 kDa and the human Hp was 200 kDa. . These subjects were added at 10 ⁇ L / well to the plate previously seeded with cells, and reacted at 4 ° C. for 5 minutes.
  • the anti-DNP antibody prepared in Example 11 (4) and DNP (2-4-Dinitrophenol) -BSA Protein Biotin Conjugate (Alpha Diagnostics) were mixed at 0.05 mg / mL at room temperature. For 1 hour to prepare an anti-DNP antibody solution.
  • IC 50 values were # 27 fucose-bound type and # 27 fucose-unbound type, 238 ⁇ g / mL and 53.8 ⁇ g / mL, respectively. .
  • the IC 50 values were 11.7 ⁇ g / mL and 7.
  • the concentration was 92 ⁇ g / mL, indicating a stronger binding inhibitory activity due to immune complex formation.
  • the IC 50 values of IVIG was 540 ⁇ g / mL.
  • Example 17 Inhibitory activity against ADCC reaction using PBMC Inhibitory activity by anti-Hp antibody and immunocomplexed anti-Hp antibody in ADCC reaction using PBMC was examined. ADCC activity was measured according to the method described in International Publication No. 2007/011041.
  • Her2-positive human breast cancer cell SK-BR-3 was used as a target cell, and frozen PBMC (Lonza) derived from a healthy donor was used as an effector cell.
  • Target cells were opsonized with 100 ng / mL commercial anti-Her2 antibody Herceptin. Experiments were performed at a ratio of effector cells to target cells of 1:20.
  • the anti-Hp antibody (fucose-bound and non-fucose-bound) prepared in Example 11 an immune complex composed of a non-fucose-bound anti-Hp antibody and human Hp, and IVIG were diluted with RPMI 1640 containing 5% FBS. Then, it was allowed to stand at room temperature for 1 hour to obtain a subject.
  • An immune complex composed of non-fucose-binding anti-Hp antibody and human Hp is prepared so that the molar ratio of anti-Hp antibody to human Hp is 1: 2 when anti-Hp antibody is 150 kDa and human Hp is 200 kDa. did.
  • Example 18 Inhibitory activity of ADCC reaction using peripheral blood of healthy donor (1) Production of non-fucose-bound rituximab Non-fucose-bound anti-CD20 antibody rituximab (US Pat. No. 5,736,137) was prepared according to a known method (Masuda K et. Al., Mol. Immunol. 44, 3122-3131, 2007).
  • anti-Hp antibody, anti-DNP antibody, various modified versions of these antibodies, and IVIG prepared in Example 11 and Example 12 and IVIG were prepared at 15 times the final concentration with RPMI 1640 and used as subjects.
  • RPMI1640 was dispensed in place of fucose-unbound rituximab in wells that had not reacted with ADCC, and RPMI1640 was dispensed in place of the subject in wells that had undergone an ADCC reaction with non-fucose-bound rituximab in the absence of the subject. . After culturing the 48-well plate at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 20 hours, the number of B cells was counted.
  • FcR Blocking Reagent human (Miltenyi Biotech) was dispensed at 5 ⁇ L / well, allowed to stand at 4 ° C. for 5 minutes, and further diluted with FCM buffer 2.
  • Dead cells were stained using LIVE / DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm exitation (Molecular Probes) according to the attached instructions. After washing the cells again, the cells were suspended in FCM buffer 2 and the fluorescence intensity was analyzed using flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II). B cells were detected as LIVE / DEAD negative, CD19 positive, and CD2 negative fractions in the lymphocyte fraction of FSC-SSC development.
  • the ADCC activity was evaluated by either a method of analyzing the number of B cells per 2400 count bright abstract counting beads, or a method of analyzing the ratio of LIVE / DEAD negative and CD 19 positive in the lymphocyte fraction.
  • the anti-DNP antibody is considered to exist as a monomer without containing a ligand in peripheral blood. Therefore, these results suggest that the anti-Hp antibody of the present invention can exert high inhibitory activity by forming an immune complex with human Hp in blood.
  • the non-fucose-bound type # 27 subjected to Fc amino acid modification (S239D, S298A, I332E) showed high inhibitory activity as in the experiment of FIG. 6A. From this, it was revealed that the inhibitory activity against the ADCC reaction is remarkably enhanced by Fc amino acid modification (S239D, S298A, I332E).
  • Example 19 Effect on binding of human Hp and anti-Hp antibody (1) Preparation of enzyme-labeled antibody Anti-Hp antibody (# 6, # 105 and # 96-6) prepared in Example 11 (2) and anti-Hp Rabbit polyclonal antibody (Rockland Immunochemical) (hereinafter referred to as anti-Hp polyclonal antibody) was labeled using Peroxidase Labeling Kit-NH 2 (Dojindo Laboratories) based on the attached instructions. After replacing 200 ⁇ g of the solvent of each anti-Hp antibody with a washing buffer using Filtration Tube, NH 2 -Reactive Peroxidase was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the solvent of the labeled antibody was again replaced with a washing buffer.
  • 1% BSA-PBS was dispensed at 100 ⁇ L / well, allowed to stand at room temperature for 1 hour to block, and washed 3 times with PBST.
  • anti-Hp antibody # 27, # 105, # 6, or # 96-6) diluted to 1 ⁇ BSA-PBS to 20 ⁇ g / mL, or anti-DNP antibody (Example 11 (4 )
  • anti-Hp polyclonal antibody was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • a labeled anti-Hp antibody (# 6, # 105 or # 96-6) diluted in 1% BSA-PBS (prepared in Example 19 (1)) was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. I put it. The plate was washed with PBST three times, and ABTS was dispensed at 50 ⁇ L / well for color development. When an appropriate color was obtained, 1% SDS was dispensed at 50 ⁇ L / well, and the absorbance at a sample wavelength of 415 nm and a reference wavelength of 490 nm was measured using a plate reader.
  • anti-Hp antibody (# 27 or # 105) diluted to 1 ⁇ g / mL with 1% BSA-PBS, commercially available anti-Hp antibody (commercially available 2B11 antibody or commercially available 2F4 antibody) or control antibody (anti-DNP antibody, mouse IgG1 type) 50 ⁇ L / well of isotype control antibody or labeled anti-Hp polyclonal antibody) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • commercially available anti-Hp antibody commercially available 2B11 antibody or commercially available 2F4 antibody
  • control antibody anti-DNP antibody, mouse IgG1 type 50 ⁇ L / well of isotype control antibody or labeled anti-Hp polyclonal antibody
  • This plate was washed 3 times with PBST, and then Goat anti Human IgG (H & L) -HRP or Rabbit anti-Mouse IgG-HRP diluted with 1% BSA-PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. I put it. The plate was washed 3 times with PBST, and 50 ⁇ L / well of TMB (Dako) was dispensed for color development. When an appropriate color was obtained, 0.5 mol / L H 2 SO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dispensed at 50 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • # 27 and # 105 bound to mouse Hp, whereas the commercially available 2F4 antibody did not bind to mouse Hp. From this, it became clear that # 27 and # 105 recognize non-homologous amino acid residues in human-bovine, similar to the commercially available 2F4 antibody. In addition, # 27 and # 105 bind to homologous amino acid residues in human-mouse, whereas the commercially available 2F4 antibody is shown to bind to heterologous amino acid residues in human-mouse. And # 105 was found to recognize a different epitope from the commercially available 2F4 antibody.
  • Example 20 Epitope analysis of acquired anti-Hp antibody (1) Preparation of human Hp / bovine Hp chimeric protein As described in Example 13, # 27 and # 105 recognize the ⁇ chain of human Hp Has been suggested. Epitope analysis was performed for the purpose of clarifying which amino acids of # 27 and # 105 recognize human Hp ⁇ chain and comparing them with the epitope of commercially available 2F4 antibody.
  • the recombinant vector for expression of the chimeric Hp ⁇ chain was designed to be encoded in this order from the 5 ′ end to the human Hp ⁇ chain (SEQ ID NO: 71), the chimeric Hp ⁇ chain, and the histidine tag.
  • the chimeric Hp ⁇ chain is expressed in a form in which a histidine tag is bound to the C-terminal side and the human Hp ⁇ chain is linked by a disulfide bond (hereinafter referred to as chimera AF).
  • Table 5 shows the positions and types of substituted amino acid residues in the produced chimeras A to F.
  • the amino acid sequences of the prepared chimeras A to F are shown in SEQ ID NOs: 75 to 80, and the base sequences of synthetic DNAs (Fasmac or GENEWIZ) containing the base sequences encoding the amino acid sequences of chimeras A to F are shown in SEQ ID NOs: 81 to 86. Shown in
  • Recombinant vectors for expression of chimeras A to F are prepared by inserting synthetic DNA (SEQ ID NOs: 81 to 86) between restriction enzyme EcoRI and SalI site of pCI vector using In-Fusion HD cloning kit. did.
  • synthetic DNA SEQ ID NOs: 81 to 86
  • restriction enzyme EcoRI EcoRI
  • SalI site of pCI vector using In-Fusion HD cloning kit.
  • a recombinant vector for expression was prepared in the same manner as the chimeric protein.
  • the amino acid sequence of the prepared recombinant human Hp is shown in SEQ ID NO: 87, and the sequence of the synthetic DNA is shown in SEQ ID NO: 88.
  • Chimeric AF and recombinant human Hp were prepared by transient expression using Expectamine 293 Transfect Kit (Gibco) according to the instructions.
  • Expi293F (Life technologies) was used as the host cell, and Expi293 Expression Medium (Gibco) was used as the culture medium. From the collected culture supernatant, chimera AF and recombinant human Hp were purified using cComplete His-Tag Purification Resin (Roche) according to the attached instructions.
  • a plurality of chimeric Hp ⁇ chains were designed in which the amino acid residues of the human Hp ⁇ chain (SEQ ID NO: 70) were partially substituted with mouse amino acid residues.
  • the amino acid sequence of human Hp (SEQ ID NO: 65), the amino acid sequence of bovine Hp (SEQ ID NO: 73) and the amino acid sequence of mouse Hp (SEQ ID NO: 74) are compared, and the human Hp ⁇ chain (SEQ ID NO: 70) is compared.
  • amino acid residues that were heterologous in human-bovine and heterologous in human-mouse were extracted. Further, the extracted residue was substituted with the corresponding amino acid residue of mouse Hp.
  • the chimeric Hp ⁇ chain is expressed in a manner in which a histidine tag is bound to the C-terminal side and a human Hp ⁇ chain (SEQ ID NO: 71) is linked by a disulfide bond, as in the method described in Example 20 (1). (Hereinafter referred to as chimera G to K).
  • Table 7 shows the positions and types of substituted amino acid residues in the produced chimeras G to K.
  • the amino acid sequences of the prepared chimeras G to K are shown in SEQ ID NOs: 89 to 93, and the base sequences of synthetic DNAs are shown in SEQ ID NOs: 94 to 98.
  • Example 20 (4) Binding to human Hp / mouse Hp chimeric protein According to the method described in Example 20 (2), the binding of the commercially available 2F4 antibody to chimeric G to K prepared in Example 20 (3) was evaluated. . The results are shown in Table 8. Taking the absorbance of the wells in which each anti-Hp antibody and recombinant human Hp were reacted as 1, the ratio was calculated from the absorbance of the sample reaction wells.
  • Table 9 shows epitopes of # 27 and # 105 [identified in Example 20 (2)] and commercially available 2F4 antibody epitopes.
  • Example 21 Preparation of anti-Hp antibody of non-fucose-binding type and CD16a / CD32a high-affinity Fc amino acid modified type
  • Recombinant vector is human IgG1 Fc region gene sequence containing amino acid modification (G236A, S239D, I332E)
  • a synthetic DNA (GENEWIZ) (SEQ ID NO: 72, hereinafter sometimes abbreviated as hCg1 Xen236 239 332) is inserted between the ApaI and BamHI sites of the recombinant vector prepared in Example 11 (1). It was prepared by. Subsequent operations were carried out in accordance with the method described in Example 11 (3) to produce a non-fucose-binding and CD16a / CD32a high affinity Fc amino acid modified anti-Hp antibody.
  • Example 22 Action in mouse immune thrombocytopenia (ITP) model (1) Production of anti-mouse platelet antibody As a recombinant vector, a pCI vector into which a mouse IgG2b ⁇ constant region gene was inserted was used. . Weight of anti-mouse platelet antibody clone 6A6 [Mizutani H et al., Blood. 82 (3), 837-844, 1993] cloned from NZW x BXSB F1 mice exhibiting systemic autoimmune disease symptoms such as thrombocytopenia The variable region genes of the chain and light chain were inserted using In-Fusion HD cloning Kit.
  • E. coli DH5 ⁇ -competent cells were transformed, cultured, extracted with a plasmid, and sequence confirmed to produce a recombinant vector for mouse IgG2b type anti-mouse platelet 6A6 antibody expression.
  • An antibody was prepared by transient expression using Expifectamine 293 Transfection Kit (Gibco) according to the instructions. The collection of the culture supernatant and the purification of the antibody were performed according to the methods described in Examples 8 and 9, using Ab-Capcher (Protenova) as the antibody purification resin.
  • PBS was administered to the control group. 30 minutes after administration of the subject, the anti-mouse platelet 6A6 antibody prepared in Example 22 (1) was intravenously administered at a dose of 10 ⁇ g / head to induce thrombocytopenia. PBS was administered instead of the anti-mouse platelet 6A6 antibody to the control group for grasping the platelet count when it was not induced. 24 hours after administration of the anti-mouse platelet 6A6 antibody, blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, placed in a blood collection tube containing EDTA, and the platelet count was measured using ADVIA 120 Hematology System (SIEMES).
  • SIEMES ADVIA 120 Hematology System
  • # 105 fucose non-binding type and Fc amino acid modified type suppressed platelet reduction by anti-mouse platelet 6A6 antibody in a dose-dependent manner.
  • # 105 fucose non-binding type and modified Fc amino acid (G236A, S239D, I332E) of # 105 showed an effect equal to or higher than that of IVIG at a dose lower than that of IVIG (FIG. 7).
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of PCR forward primer for cloning human CD16a
  • SEQ ID NO: 2 base sequence of PCR reverse primer for cloning human CD16a
  • SEQ ID NO: 3 base sequence of human CD16a (V)
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of human CD16a No. 5: Primer for preparing soluble human CD16a recombinant vector FcgR3-1 base sequence
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of soluble histidine tag fusion CD16a
  • SEQ ID NO: 8 base sequence of primer hhiu3 No.
  • nucleotide sequence of primer hk2 SEQ ID NO: 10 nucleotide sequence of primer hk5 SEQ ID NO: 11: nucleotide sequence of # 4-VH SEQ ID NO: 12: nucleotide sequence of # 4-VL SEQ ID NO: 13: nucleotide sequence of # 6-VH SEQ ID NO: 14: # 6-V L nucleotide sequence SEQ ID NO: 15: # 27-VH nucleotide sequence SEQ ID NO: 16: # 27-VL nucleotide sequence SEQ ID NO: 17: # 105-VH nucleotide sequence SEQ ID NO: 18: # 105-VL nucleotide sequence SEQ ID NO: 19: # 96-6-VH nucleotide sequence SEQ ID NO: 20: # 96-6-VL nucleotide sequence SEQ ID NO: 21: # 4-VH amino acid sequence SEQ ID NO: 22: # 4-VL amino acid sequence SEQ ID NO: 23 # 6-V

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Abstract

本発明は、ＩＶＩＧの代替とし得る、Ｆｃγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤を提供することを目的とする。本発明は、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体に関する。

Description

血中でハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤
　本発明は、血中でヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成し、Ｆｃγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤に関する。
　静注用免疫グロブリン（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＩＶＩＧ）は健康な人の血漿に由来するＩｇＧを高純度に精製した血液製剤である。低ガンマグロブリン血症又は無ガンマグロブリン血症などに対しては感染防御を目的として用いられ、自己免疫疾患に対しては免疫抑制を目的として用いられている。
　ＩＶＩＧの具体的な例としては、例えば、田辺三菱製薬社のヴェノグロブリンＩＨ、帝人ファーマ社のベニロン－Ｉ、日本赤十字社のポリグロビンＮ、バクスター社のガンマガード、日本製薬社のグロベニン－Ｉ、ＣＳＬベーリング社のプリビジェンなどが挙げられる。
　ＩＶＩＧの薬効メカニズムとしては、様々な説が提唱されている。例えば、マクロファージ細胞表面上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の阻害、マクロファージにおけるＦｃγＲ　ＩＩ　ｂの発現上昇を介した貪食機能の抑制、シアリル化抗体によるマクロファージでのＦｃγＲ　ＩＩ　ｂの発現上昇、Ｂ細胞の増殖抑制やアポトーシス誘導、Ｂ細胞の自己抗体産生抑制、抗イディオタイプ抗体による自己抗体の中和、自己抗体による補体の消費の阻害、サイトカインやＴ細胞の機能阻害などである（非特許文献１、２）。
　ＦｃγＲの阻害に基づくＩＶＩＧの薬効は、例えば、免疫性血小板減少症［ＩＴＰ、特発性（免疫性）血小板減少性紫斑病とも言う］の治療においてもたらされる。ＩＴＰは、血小板に対する自己抗体により、オプソニン化された血小板が網内系で各種ＦｃγＲを介してマクロファージに貪食されることにより発症する（非特許文献１）。
　従って、ＩＶＩＧは、ＦｃγＲを阻害することにより、血小板が貪食されることを阻害すると考えられている（非特許文献３）。実際に、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ社のＦｃγＲ　ＩＩＩ　ａ抗体（製品名ＧＭＡ１６１）は、開発はＰｈａｓｅ　Ｉで中断されたものの、ＩＴＰにおける薬効が確認されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ　ＮＣＴ００２４４２５７）（非特許文献４）。
　ＩＶＩＧによるＦｃγＲの阻害は、ＩＶＩＧに含まれる抗体と血清タンパク質が形成する様々な免疫複合体（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＩＣ）や、ＩＶＩＧに含まれる抗体のダイマーあるいは凝集体などの成分により増強されるという仮説も提唱されている（非特許文献５）。
　特に、Ｌｅｍｉｅｕｘらは、ＩＶＩＧには自己の血清タンパク質に反応する成分が最大で３％程度含まれており、該成分が血清と混合された時に可溶性免疫複合体を形成することを示している（非特許文献６、７）。また、マウスのＩＴＰモデルに対して可溶性免疫複合体がＩＶＩＧよりも高い比活性を持つことが示されている（非特許文献８）。
　これらの知見は、ＩＶＩＧに含まれる成分が血清タンパク質と結合することにより、ＦｃγＲを介した自己組織に対する貪食機能を阻害する免疫抑制効果を示すことを示唆している。実際に、自己抗体を精製して自己免疫疾患治療に使用するという概念も提唱されている（特許文献１）。
　さらに、自己免疫疾患に対するＩＶＩＧの投与量は、基本処方で１日０．４ｇ／ｋｇの連続５日間投与と極めて高用量であることが知られている。高用量投与は、血栓症などの副作用、点滴による長い投与時間などの問題を齎す（非特許文献９）。従って、ＩＶＩＧを比活性が高い有効成分からなる薬剤に置き換え、用量を減らすニーズは高いと考えられる。
米国特許出願公開第２００４／０１０１９０９号明細書
Trends in Immunology, 2008. 29(12):p. 608-615 Science. 2006, 313(5787):p. 670-673 池田康夫, 最新医学別冊　血小板減少症・増加症　最新医学社 ASH Annual Meeting 2006 Abstract 1074 J Clin Invest. 2005, 115(1):p. 25-27 Int Immunol. 2004, 16(7):p. 929-936 Curr Pharm Des. 2006, 12(2):p. 173-179 Br J Haematol. 2004, 127(1):p. 90-96 血液フロンティア2007, 17(1):p. 17-19
　ＩＶＩＧに含まれる有効成分を同定し、ＩＶＩＧの代替とすることは、高用量のＩＶＩＧを投与しなければならない自己免疫疾患治療をより簡便にし得る手段として期待されている。したがって、本発明は、ＩＶＩＧの代替とし得る、Ｆｃγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＩＶＩＧから有効成分を同定する目的で、ＦｃγＲ　ＩＩＩ　ａ（ＣＤ１６ａ）を固相化したカラムを用い、ＩＶＩＧと血清の混合液に含まれる、ＣＤ１６ａに対する高い結合活性を有するＩｇＧ成分の分離と同定を試みた。
　その結果、再現性よく高い該結合活性が検出されるＩｇＧ成分として、血清タンパク質であるハプトグロビン（Ｈａｐｔｐｇｌｏｂｉｎ；Ｈｐ、以下Ｈｐと表記する場合もある）を認識するＩｇＧ成分を同定した。該成分は、ＩＶＩＧ中の有効成分の一つであると考えられる。
　そこで、抗Ｈｐ抗体の取得を試みたところ、該抗体及びＨｐからなる免疫複合体を形成することにより、ＩＶＩＧよりも強くＣＤ１６ａに結合する抗Ｈｐ抗体の取得に成功し、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の（１）～（２２）に関する。
（１）配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
（２）以下の（ａ）～（ｄ）から選ばれる１の抗体と競合して配列番号７０で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４、３５及び３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、３８及び３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０、４１及び４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｄ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（３）以下の（ａ）～（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体。
（ａ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４、３５及び３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、３８及び３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０、４１及び４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｄ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（４）配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、４４番目のＰｈｅ及び４９番目のＧｌｕに結合する、（１）～（３）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（５）配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１５５番目のＳｅｒ、１５６番目のＴｈｒ及び１５７番目のＶａｌに結合する、（１）～（３）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（６）遺伝子組換え抗体である、（１）～（５）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（７）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（６）に記載のモノクローナル抗体。
（８）モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ及びヒトＦｃγ受容体Ｉからなる群から選ばれる少なくとも１つのヒトＦｃγ受容体に結合する、（１）～（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（９）モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体２分子及びヒトハプトグロビン１分子を含む、（１）～（８）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（１０）抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、（１）～（９）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体。
（１１）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１３）（１２）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１４）（１３）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養物から該抗体を採取することを特徴とする（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（１５）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
（１６）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む、自己免疫疾患治療剤。
（１７）ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤。
（１８）モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、（１７）に記載の自己免疫疾患治療剤。
（１９）モノクローナル抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（１８）に記載の自己免疫疾患治療剤。
（２０）モノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体である、（１７）～（１９）のいずれか１に記載の自己免疫疾患治療剤。
（２１）モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ及びヒトＦｃγ受容体Ｉからなる群から選ばれる少なくとも１つのヒトＦｃγ受容体に結合する、（１７）～（２０）のいずれか１に記載の自己免疫疾患治療剤。
（２２）モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体２分子及びヒトハプトグロビン１分子を含む、（２０）又は（２１）に記載の自己免疫疾患治療剤。
　本発明の抗体はヒトハプトグロビンと結合して多価の免疫複合体を形成することにより、該抗体のＦｃドメインにおいてＣＤ１６ａと結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）反応をＩＶＩＧよりも強力に阻害する。したがって、本発明により、ヒトハプトグロビンに結合する抗体を有効成分として含有する自己免疫疾患治療剤が提供される。
図１Ａ～図１Ｆは抗Ｈｐ抗体、抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧの、ＣＤ１６ａに対する結合活性を示したものである。横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸に吸光度（４１５－４９０ｎｍ）を示す。図１Ａは抗体＃４、図１Ｂは抗体＃６、図１Ｃは抗体＃２７、図１Ｄは抗体＃１０５、図１Ｅは抗体＃９６－６、図１ＦはＩＶＩＧの結合活性を示しており、■は抗Ｈｐ抗体（図１Ａ～図１Ｅ）又はＩＶＩＧ（図１Ｆ）、□は抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体を示す（図１Ａ～図１Ｆ）。 図２は抗Ｈｐ抗体のヒトＨｐに対する結合活性を示したものである。横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸に吸光度（４０５ｎｍ）を示す。■は抗体＃６、□は抗体＃２７、▲は抗体＃１０５、△は抗体＃９６－６、○は抗ＤＮＰ抗体を示す。 図３Ａ～図３Ｅは抗Ｈｐ抗体、抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体の、ＣＤ３２ａに対する結合活性を示したものである。横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸に吸光度（４１５－４９０ｎｍ）を示す。図３Ａは抗体＃４、図３Ｂは抗体＃６、図３Ｃは抗体＃２７、図３Ｄは抗体＃１０５、図３Ｅは抗体＃９６－６の結合活性を示しており、■は抗Ｈｐ抗体、□は抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体を示す。 図４は抗Ｈｐ抗体（フコース結合型及びフコース非結合型）、フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧによる、抗ＤＮＰ抗体及びＣＤ１６ａ間の結合に対する阻害活性を示したものである。横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸に蛍光強度を示す。●はＩＶＩＧ、■は抗体＃２７、□は抗体＃２７のフコース非結合型、◇は抗体＃２７のフコース非結合型による免疫複合体、△は抗体＃１０５のフコース非結合型による免疫複合体、＊は抗体なしを示す。 図５は抗Ｈｐ抗体（フコース結合型及びフコース非結合型）、フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧによる、ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ反応に対する阻害活性を示したものである。横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸にＡＤＣＣ（％）を示す。●はＩＶＩＧ、■は抗体＃１０５、□は抗体＃１０５のフコース非結合型、△は抗体＃２７のフコース非結合型による免疫複合体、◇は抗体＃１０５のフコース非結合型による免疫複合体、＊は抗体なし、－はヒトＨｐのみを示す。 図６Ａは、抗体＃２７、抗体＃１０５、抗ＤＮＰ抗体及びこれら抗体の各種改変型、並びにＩＶＩＧによる、健常人ドナー末梢血液及びｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いたＡＤＣＣ反応に対する阻害活性を示したものである。縦軸にＢ細胞数に比例するカウントを示す。１はＡＤＣＣ未反応のサンプル、２はｒｉｔｕｘｉｍａｂによりＡＤＣＣ反応を行ったサンプル、３から１４は、各種抗体等存在下、ｒｉｔｕｘｉｍａｂによりＡＤＣＣ反応を行ったサンプルの結果を示す。各種抗体等として具体的には、３はＩＶＩＧ（３３３３μｇ／ｍＬ）、４は抗体＃１０５（２５０μｇ／ｍＬ）、５は抗体＃２７（２５０μｇ／ｍＬ）、６は抗体＃１０５のフコース非結合型（２５０μｇ／ｍＬ）、７は抗体＃２７の非フコース結合型（２５０μｇ／ｍＬ）、８は抗ＤＮＰ抗体のフコース非結合型（２５０μｇ／ｍＬ）、９はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃１０５のフコース非結合型（５０μｇ／ｍＬ）、１０はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃２７のフコース非結合型（５０μｇ／ｍＬ）、１１はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗ＤＮＰ抗体のフコース非結合型（５０μｇ／ｍＬ）、１２はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃１０５のフコース非結合型（１０μｇ／ｍＬ）、１３はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃２７のフコース非結合型（１０μｇ／ｍＬ）、１４はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗ＤＮＰ抗体のフコース非結合型（１０μｇ／ｍＬ）を示す。図６Ｂは抗体＃４及び抗体＃２７の各種改変型、並びにＩＶＩＧによる、健常人ドナー末梢血液及びｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いたＡＤＣＣ反応に対する阻害活性を示したものである。縦軸にリンパ球に占めるＢ細胞の割合を示す。１はＡＤＣＣ未反応のサンプル、２はｒｉｔｕｘｉｍａｂによりＡＤＣＣ反応を行ったサンプル、３から８は、各種抗体等存在下、ｒｉｔｕｘｉｍａｂによりＡＤＣＣ反応を行ったサンプルの結果を示す。各種抗体等として具体的には、３はＩＶＩＧ（２０００μｇ／ｍＬ）、４はＩＶＩＧ（８０００μｇ／ｍＬ）、５はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃４のフコース非結合型（５０μｇ／ｍＬ）、６はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃２７のフコース非結合型（５０μｇ／ｍＬ）、７はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃４のフコース非結合型（１０μｇ／ｍＬ）、８はＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗体＃２７のフコース非結合型（１０μｇ／ｍＬ）を示す。 図７は、マウス免疫性血小板減少症（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：ＩＴＰ）モデルにおける作用を示したものである。縦軸に血小板数（ｘ１０３／μＬ）を示す。１は抗血小板抗体を投与しなかった群、２はコントロール群、３及び４はＩＶＩＧをそれぞれ１０、４０ｍｇ／ｈｅａｄの用量にて投与した群、５～８は＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）をそれぞれ０．０８、０．４、２、１０ｍｇ／ｈｅａｄの用量にて投与した群の結果を示す。
　ヒトハプトグロビンは、１つのα鎖と１つのβ鎖からなるサブユニット（以下、α／β－サブユニットと記す）が２つ以上結合した糖タンパク質である。ヒトハプトグロビンの合成過程は３段階に分けられる。
　第１段階目では、１つのオープンリーディングフレームにコードされているα鎖とβ鎖が連結して１本のポリペプチドとして発現する。
　第２段階目では、ポリペプチドのα鎖間のジスルフィド結合によって２本以上のポリペプチドによって構成されるハプトグロビン前駆体を形成する。同時に、ポリペプチドの分子内でもα鎖とβ鎖の間にジスルフィド結合を形成する。
　第３段階目では、ポリペプチドが特異的なタンパク質分解によりα鎖とβ鎖に分離され、α鎖とβ鎖がジスルフィド結合を形成したα／β－サブユニットとなる。以上の過程によって、ヒトハプトグロビンは、前記のα／β－サブユニットが２つ以上結合した構造を形成する［Redox Rep., 6,379(2001)］。
　本発明におけるヒトハプトグロビンは、α／β－サブユニットが４つ結合したものを基本構造とする。この、α鎖とβ鎖を連結してコードするヒトハプトグロビン遺伝子には、２種類の遺伝子多型が存在し、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１４３．３（配列番号６７）又はＮＭ＿００１１２６１０２．１（配列番号６８）で示される。これら遺伝子の違いは、α鎖をコードする部分にあり、β鎖をコードする部分は同一である。
　具体的には、配列番号６７では、α鎖のエキソン３及びエキソン４領域が重複している。この重複している領域にシステイン残基がコードされているため、配列番号６７が翻訳されて生成するα鎖を含むハプトグロビンは、ジスルフィド結合によりα／β－サブユニットが３つ以上結合した、より大きな多量体を形成し得る［J.Biochem.Mol.Biol.,40,1028(2007)］。
　α鎖のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５１３４．１（配列番号６５）の１９番目から１６０番目のアミノ酸配列（配列番号６９）、又はＮＰ＿００１１１９５７４．１（配列番号６６）の１９番目から１０１番目のアミノ酸配列（配列番号７１）で表される。β鎖のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５１３４．１（配列番号６５）の１６２番目から４０６番目のアミノ酸配列（配列番号７０）、又はＮＰ＿００１１１９５７４．１（配列番号６６）の１０３番目から３４７番目のアミノ酸配列（配列番号７０）で表される。
　本発明におけるヒトハプトグロビンとしては、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列において、α鎖及び／又はβ鎖の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列と、α鎖及び／又はβ鎖が６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド並びにα鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるα鎖及び／又はβ鎖のアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。また、本発明におけるヒトハプトグロビンとしては、日本血液製剤機構が販売しているヒトハプトグロビンなどが挙げられる。
　ヒトハプトグロビンの機能としては、溶血によって血液中に遊離されたヘモグロビンと特異的に結合して免疫複合体を形成し、尿中への遊離ヘモグロビンの喪失を防ぐことにより、体内からの鉄の漏出や、遊離ヘモグロビンによる酸化的血管障害及び腎細尿管障害を防ぐことが挙げられる。
　α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons(1987－1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)］などを用いて、例えば配列番号６９、７０又は７１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、即ち、ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子としては、配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列が挙げられる。配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のハプトグロビンをコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃にてハイブリダイゼーション［Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons(1987－1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University,(1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号６７又は配列番号６８で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明で用いるハプトグロビンをコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J.Mol.Biol.,215,403(1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)、Genome Res.,7,649(1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ　の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ　の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
　α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを得る方法としては、例えば、配列番号６９、７０又は７１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む組換え体ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
　また、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも、前述の部位特異的変異導入法などを用いて得ることができる。
　さらに、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、あるいは、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法又はｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう）は、ヒトハプトグロビンのうち、β鎖のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合する抗体であり、血中で多価の免疫複合体を形成する。
　本発明におけるヒトハプトグロビンの立体構造としては、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むヒトハプトグロビンが天然状態で取り得る構造と同等の効能を有していれば、いずれの構造でもよい。ヒトハプトグロビンが天然状態で取り得る立体構造とは、ヒトハプトグロビンの天然型の立体構造のことをいう。
　本発明における、多価の免疫複合体とは、具体的には、少なくとも２分子の本発明の抗体及び少なくとも１分子のヒトハプトグロビンを含む免疫複合体が挙げられる。該免疫複合体に少なくとも抗体２分子及びヒトハプトグロビン１分子を含むことにより、ＣＤ１６及びＣＤ３２に対する高い結合活性を示し、ＡＤＣＣ反応に対する優れた阻害活性を示す。
　前記１分子のヒトハプトグロビンには、配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列を有する１つのα鎖及び配列番号７０で表されるアミノ酸配列を有する１つのβ鎖からなるα／β－サブユニットが４つ含まれる。
　本発明のモノクローナル抗体及びヒトハプトグロビンが結合して形成される多価の免疫複合体の分子量は５×１０５以上であることが好ましく、７×１０５以上であることがより好ましい。該免疫複合体の分子量が５×１０５以上であることにより、ＣＤ１６及びＣＤ３２に対する高い結合活性を示し、ＡＤＣＣ反応に対する優れた阻害活性を示す。
　本発明の抗体が多価の免疫複合体を形成することは、例えば、ＨＰＬＣ等を用いたゲルろ過クロマトグラフィーで確認することができる。
　本発明の抗体が形成する免疫複合体が、少なくとも２分子の本発明の抗体及び少なくとも１分子のヒトハプトグロビンを含むことは、免疫複合体の分子量から確認できる。免疫複合体の分子量は、例えば、ＨＰＬＣ等を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって該免疫複合体を分離及び検出することにより、測定することができる。本発明の抗体の分子量が約１５０ｋＤａであること及びヒトハプトグロビンの分子量が約２００～２２０ｋＤａであることから、該免疫複合体に含まれる抗体と抗原の分子数を算出することができる。
　本発明の抗体としては、具体的には、配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、４４番目のＰｈｅ（フェニルアラニン）及び４９番目のＧｌｕ（グルタミン酸）に結合する抗体が挙げられる。また、本発明の抗体としては、具体的には、配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１５５番目のＳｅｒ（セリン）、１５６番目のＴｈｒ（スレオニン）及び１５７番目のＶａｌ（バリン）に結合する抗体が挙げられる。
　前記抗体として、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のモノクローナル抗体が挙げられる。
（ａ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４、３５及び３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、３８及び３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０、４１及び４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
　また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ｃ）又は（ｄ）のモノクローナル抗体が挙げられる。
（ｃ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｄ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
　さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を挙げることができる。
　本発明において、モノクローナル抗体と競合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体と同一又は部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトハプトグロビンのアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
　本発明のモノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織染色（ＩＨＣ）法、公知の免疫学的検出法等、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合活性を調べる方法により確認することができる。
　具体的には、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Cancer Immunol.Immunother.、36、373（1993）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光染色法、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、ＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することを、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴で確認する場合は、抗ＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、該抗体を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度のヒトハプトグロビン又はその融合体を流し、結合、解離を測定するのが好ましい。
　また、その他の公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies－Principles and Practice、Third edition、Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory　Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて確認することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、又は抗体遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
　エピトープとしては、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列からなる立体構造並びに翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列及び該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、Ｏ結合型糖鎖が付加されたアミノ酸配列（糖鎖がＯＨ置換基を有するスレオニン及びセリンに結合）、Ｎ結合型糖鎖が付加されたアミノ酸配列（ＮＨ２置換基を有するグルタミン及びアスパラギンに結合）、並びに硫酸基が付加されたアミノ酸配列（硫酸分子がＯＨ置換基を有するスレオニンに結合）などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、ヒトハプトグロビンの一部のドメインを欠失させた欠損体、ヒトハプトグロビンの一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換させた変異体、他のタンパク質由来のドメインと置換させたヒトハプトグロビン変異体及びヒトハプトグロビンの部分ペプチド断片等に対する、本発明のモノクローナル抗体の結合活性を調べることにより決定することができる。
　また、本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したヒトハプトグロビンに本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いたエピトープマッピングを行うことによっても決定することができる。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、ハプトグロビンのβ鎖として配列番号７０で示されるアミノ酸配列のうち、２５番目から２３９番目のアミノ酸配列に含まれる。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するハプトグロビンのエピトープには、配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、４４番目のＰｈｅ及び４９番目のＧｌｕが含まれる。また、本発明のモノクローナル抗体が結合するハプトグロビンのエピトープには、配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１５５番目のＳｅｒ、１５６番目のＴｈｒ及び１５７番目のＶａｌが含まれる。
　ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトハプトグロビンを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を取得することができる。
　抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
　本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
　ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用組換え体ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体組換え体ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと記す）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
　さらに、本発明のキメラ抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに存在するエピトープと同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと記す）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用組換え体ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体組換え体ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、具体的には、ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３１～３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４～３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体、並びに、ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７～３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
　さらに、本発明のヒト化抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに存在するエピトープと同じエピトープに結合するヒト化抗体を挙げることができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
　本発明のヒト抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号２５及び抗体のＶＬが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むヒト抗体、並びに、抗体のＶＨが配列番号２７及び抗体のＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むヒト抗体などが挙げられる。
　本発明の抗体が形成する多価の免疫複合体は、本発明の抗体のＦｃ領域を介して、ヒトＦｃγ受容体に結合する。従って、本発明の抗体は、自己抗体がＦｃγ受容体に結合することで引き起こす反応を阻害することができる。
　本発明の抗体が形成する多価の免疫複合体が結合するヒトＦｃγ受容体としては、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域に特異的に結合するヒトＦｃγ受容体であればいずれも包含されるが、例えば、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ（ＣＤ１６）、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ（ＣＤ３２）及びヒトＦｃγ受容体Ｉ（ＣＤ６４）が挙げられる。これらヒトＦｃγ受容体は、例えば、白血球やマクロファージなどの細胞表面に発現する。
　ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ［J. Exp. Med., 170, 481 (1989)］とは、重鎖γを有するヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する３種類のＦｃγ受容体のうち、タイプＩＩＩのＦｃγ受容体を意味する。ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩには、別々の異なる遺伝子にコードされる２つのアイソフォームが存在し、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ、アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）とヒトＦｃγ受容体ＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ、アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ１及びアロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ２を含む）に分類される。本発明において、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩとは、いずれのアイソフォーム又はアロタイプも含まれる。
　ヒトＦｃγ受容体ＩＩ［J. Exp. Med., 170, 1369 (1989)］とは、重鎖γを有するヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する３種類のＦｃγ受容体のうち、タイプＩＩのＦｃγ受容体を意味する。ヒトＦｃγ受容体ＩＩには、別々の異なる遺伝子にコードされる３つのアイソフォームが存在し、ヒトＦｃγ受容体ＩＩａ（アロタイプＨ１３１［Ｈ型］及びＲ１３１［Ｒ型］を含む）、ヒトＦｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、ヒトＦｃγ受容体ＩＩｃに分類される。本発明において、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩとは、いずれのアイソフォーム又はアロタイプも含まれる。
　ヒトＦｃγ受容体Ｉ［J Biol Chem., 266, 13449 (1991)］とは、重鎖γを有するヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する３種類のＦｃγ受容体のうち、タイプＩのＦｃγ受容体を意味する。ヒトＦｃγ受容体Ｉには、別々の異なる遺伝子にコードされる３つのアイソフォームが存在し、ヒトＦｃγ受容体Ｉａ、ヒトＦｃγ受容体Ｉｂ、ヒトＦｃγ受容体Ｉｃに分類される。本発明において、ヒトＦｃγ受容体Ｉとは、いずれのアイソフォームも含まれる。
　ヒトＦｃγ受容体Ｉは単量体のヒトＩｇＧ抗体に結合に高い親和性で結合することが知られており、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ及びＩＩＩはヒトＩｇＧ抗体に対して、単量体のよりも高い親和性で免疫複合体に結合することが知られている［Trends in Immunology, 29, 608 (2008)］。よって、本発明の抗体は免疫複合体の形成の有無によらずヒトＦｃγ受容体Ｉに結合する。
　本発明の抗体が阻害できる、自己抗体がＦｃγ受容体に結合することで引き起こす反応としては、例えば、ＩｇＧクラスの自己抗体が白血球やマクロファージの細胞表面上のＦｃγ受容体に結合し、自己細胞の傷害や貪食を引き起こす反応が挙げられる。自己細胞の傷害や貪食としては、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）や抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス活性（ＡＤＣＰ活性）が挙げられる。
　ＡＤＣＣ活性とは、自己組織に結合した自己抗体分子が、Ｆｃ部分を介して、Ｆｃγ受容体を発現した例えばナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と表記する）などに結合することにより、自己抗体パーフォリンやグランザイムなどの細胞傷害性分子の放出や貪食作用の亢進などによって生じる細胞傷害反応［Clark M、Chemical Immunology, 65, 88(1997)；Gorter Aら、Immunol Today, 20, 576(1999)］である。
　また、ＡＤＣＰ活性とは、自己組織に結合した自己抗体分子が、Ｆｃ部分を介して、Ｆｃγ受容体を発現した、例えばマクロファージなどに捕捉され、貪食及び破壊によって生じる自己組織傷害である。
　本発明の抗体には、抗体のＦｃ領域のアミノ酸を、Ｆｃγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体が包含される。具体的には、例えば、本発明の抗体に、ポテリジェント技術及び／又は該抗体のＦｃアミノ酸に改変を施す技術を組み合わせて得られた抗体は、Ｈｐと免疫複合体を形成した該抗体のＦｃドメインがより強くＣＤ１６ａに結合し、ＡＤＣＣ活性をＩＶＩＧよりも強力に阻害する。
　抗体のＦｃ領域のアミノ酸を、Ｆｃγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が挙げられる。
　抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えば、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いて作製される抗体が挙げられる。
　従来、既存の抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の構造を、Ｎ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない構造に改変する技術は、既存の抗体のＡＤＣＣ活性を高めるために用いられてきた。しかしながら、本発明の抗体には、Ｆｃγ受容体との親和性を高め、Ｆｃγ受容体を発現したＮＫ細胞等に結合することにより、病態で亢進するＡＤＣＣ活性を阻害する方法として、この技術を用いることができる。
　抗体のＦｃ領域のアミノ酸を、Ｆｃγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、例えば、米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載の方法で作製された抗体分子を挙げることができる。
　また、本発明の抗体は、抗体の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変することにより、血中半減期を伸ばすことができる。
　抗体分子の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変し血中半減期を伸ばす方法としては、例えば日本国特開２０１３－１６５７１６号公報、日本国特許第４９６１５０１号明細書に記載の方法が挙げられる。
　上述の抗体を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつ上述の抗体と同様な活性を有するモノクローナル抗体も、本発明の抗体に包含される。
　欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数である。例えば、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
　本発明の抗体のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、抗体のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加、置換、又は挿入があることを意味する。また、欠失、付加、置換、又は挿入が同時に生じる場合もあり、欠失、付加、置換、又は挿入されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明の形質転換体としては、配列番号７０で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖に特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合し、多価の免疫複合体を形成する抗体分子をコードするＤＮＡを含有する組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の抗体を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。宿主細胞として具体的には、以下の（１）～（５）などが挙げられる。
（１）チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（２）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（３）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（４）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞；
（５）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
　また、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体を生産する本発明の形質転換体には、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号に記載の方法で作製された糖転移酵素の低下又は欠損した宿主細胞を用いることができる。
　本発明は、本発明のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む自己免疫疾患治療剤に関する。
　また、本発明は、ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤に関する。該ヒトハプトグロビンとしては、α鎖として配列番号６９又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号７０で表されるアミノ酸配列を有するヒトハプトグロビンが好ましい。
　自己免疫疾患としては、自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患が挙げられ、限定するものではないが、免疫性血小板減少性紫斑病（特発性血小板減少性紫斑病、又は、血小板減少症とも言う）、川崎病、ＡＮＣＡ関連血管炎、ギランバレー症候群、慢性脱髄性多発性根神経炎、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫性蕁麻疹、天疱瘡、グッドバスチャー症候群、乾癬性関節炎、シェーングレン症候群、多発性筋炎／皮膚筋炎などのＩＶＩＧ製剤が治療薬として用いられる自己免疫疾患や、ＩｇＧ４関連疾患などの自己抗体の産生が病態に関与している自己免疫疾患が挙げられる。
　また、本発明の自己免疫疾患治療剤は自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
　本発明の治療剤は、有効成分としての該抗体、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。　
　投与経路としては、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏又はテープ剤などが挙げられる。　
　投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。
　本発明の治療薬は、単独で使用してもよく、少なくとも１つのその他の治療薬を併用してもよい。本発明の治療薬とその他の治療薬との併用方法としては、本発明の治療薬と併用される治療薬が、本発明の治療薬と同時に投与されてもよいし、連続的に投与されてもよい。その他の治療薬としては、例えば、ステロイド、アスピリン、シクロフォスファミド又はシクロスポリン等が挙げられる。　
　以下に、本発明の抗体の製造方法及び疾患の治療方法について、具体的に説明する。
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるヒトハプトグロビン又はヒトハプトグロビンを発現させた細胞は、ヒトハプトグロビンを形成するα鎖及びβ鎖の全長又はそれらの部分長をコードするｃＤＮＡを含む組換え体ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ヒトハプトグロビンを多量に発現している各種ヒト培養細胞、ヒト組織などからヒトハプトグロビンを精製することによっても、得ることができる。
　また、該培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりヒトハプトグロビンの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原として用いることもできる。
　ヒトハプトグロビン又はヒトハプトグロビンの部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端若しくはＮ末端にＦＬＡＧ若しくはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
　本発明で用いられるヒトハプトグロビンは、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)又はCurrent Protocols inmolecular Biology、John Wiley＆Sons(1987－1997)などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、該ヒトハプトグロビンをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。　
　まず、ヒトハプトグロビンを形成するα鎖及びβ鎖をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な組換え体ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該組換え体ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。　
　組換え体ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。　
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換え体ベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトハプトグロビンをコードする部分を含むＤＮＡ及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換え体ベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換え体ベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。　
　該組換え体ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ヒトハプトグロビンをコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトハプトグロビンの生産率を向上させることができる　
　組換え体ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社）、ｐＱＥ－８（キアゲン社）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric Biol.Chem.、53、277(1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、4306(1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第５，１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。 
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。　
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ－１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110(1972)、Gene、17、107(1982)、Molecular＆General Genetics、168、111(1979)］が挙げられる。　
　動物細胞を宿主として用いる場合、組換え体ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐｃＤＭ８（以上、フナコシ社）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平０３－２２９７９号公報；Cytotechnology、3、133(1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Nature、329、840(1987)］、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲＥＰ４（以上、インビトロジェン社）、ｐＡＧＥ１０３［J.Biochemistry、101、1307(1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６００１３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社）及びトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。　
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。　
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル腎臓組織由来ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine、108、945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Genetics、55、513(1968)；Chromosoma、41、129(1973)；Methods in Cell Science、18、115(1996)；Radiation Research、148、260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Cell、6、121(1975)；Molecular　Cellgenetics、Appendix I、II(pp.883－900)］、CＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（又はＹＢ２／０細胞ともいう）、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７細胞（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。　
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)］などが挙げられる。　
　以上のようにして得られるヒトハプトグロビンをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ヒトハプトグロビンを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ヒトハプトグロビンを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたヒトハプトグロビンを得ることができる。　
　誘導性のプロモーターを用いた組換え体ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology、8、396(1959)］、１９９培地［Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、73、1(1950)］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。　
　ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］を用いることができる。　
　ヒトハプトグロビンの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるヒトハプトグロビンの構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。　
　ヒトハプトグロビンが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J.Biol.Chem.、264、17619(1989)］、ロウらの方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、8227(1989)、Genes Develop.、4、1288(1990)］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ヒトハプトグロビンを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。　
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してヒトハプトグロビンの生産量を上昇させることもできる。　
　得られたヒトハプトグロビンは、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。　
　ヒトハプトグロビンが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。　
　ヒトハプトグロビンが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトハプトグロビンの不溶体を回収する。回収した該ヒトハプトグロビンの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ヒトハプトグロビンを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。　
　ヒトハプトグロビン又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトハプトグロビン又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。　
　また、本発明において用いられるヒトハプトグロビンは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテインテクノロジインストルメント社、シンセセル－ベガ社、パーセプチブ社、又は島津製作所社などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。　
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ハプトグロビンノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。また、ヒト抗体産生動物から抗体産生細胞を採取することもできる。
　免疫は、動物の皮下、尾根部、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。　
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～４週間おきに１～１０回行う。各投与後１～１４日目に眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies－A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］などを用いて測定する。 
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓やリンパ節などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology、18、1(1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J.Immunology、6、511(1976)］、SP2/0-Ag14(SP-2)［Nature、276、269(1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J.Immunology、123、1548(1979)］、又はＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature、256、495(1975)］などを用いる。　
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ及び８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。　
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。　
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃にて、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。　
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のハイブリドーマの選択方法により、ヒトハプトグロビンを含む抗原に反応し、ヒトハプトグロビンを含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。　
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラム又はプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。　
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。　
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は、以下に示す通り、ヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンに対する結合活性を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で解析することにより行う。
　ヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンを９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、該タンパク質を固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後のプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと記す）などでよく洗浄した後、第２抗体として、ビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳＴなどでよく洗浄した後、第２抗体の標識に物質に応じた反応を行い、ヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。　
　また、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体は、上述のＥＬＩＳＡを用いた結合反応検出系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時に本発明のモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、本発明で取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。　
　さらに、本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンに含まれるエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体は、上述のＥＬＩＳＡを用いた結合反応検出系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。　
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用組換え体ベクターであり、動物細胞用組換え体ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。　
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。　
　動物細胞用組換え体ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol.、3、133(1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J.Biochem.、101、1307(1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene、27、223(1984)］、ｐＫＣＲ［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、1527(1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Cytotechnol.、4、173(1990)］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol.、13、79(1993)］などを用いる。　
　動物細胞用組換え体ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J.Biochem.、101、1307(1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem.Biophys.Res.Commun.、149、960(1987)］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell、41、479(1985)］とエンハンサー［Cell、33、717(1983)］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、組換え体ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の組換え体ベクター［J.Immunol.Methods、167、271(1994)］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の組換え体ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Hybridoma、17、559(1998)］などを用いる。 
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。　
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。　
　前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。　
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。　
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol.、154、3(1987)］、又はＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社）などのキットを用いる。 
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。　
　ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley＆Sons(1987－1997)］、ＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社）、又はＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　ＥｘＰｒｅｓｓ［Strategies、5、58(1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research、17、9494(1989)］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach、I、49(1985)］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘ　Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社）、ｐｃＤ２［Mol.Cell.Biol.、3、280(1983)］、又はｐＵＣ１８［Gene、33、103(1985)］などを用いる。 
　ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ［Strategies、5、81(1992)］、Ｃ６００［Genetics、39、440(1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science、222、778(1983)］、ＮＭ５２２［J.Mol.Biol.、166、1(1983)］、Ｋ８０２［J.Mol.Biol.、16、118(1966)］、又はＪＭ１０５［Gene、38、275(1985)］などを用いる。 
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］などを用いる。 
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と記す、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley＆Sons(1987－1997)］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。　
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、5463(1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。　
　決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)］と比較することによって見出すことができる。　
　また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J.Mol.Biol.、215、403(1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現用組換え体ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現用の組換え体ベクターを構築することができる。　
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。　
　作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現用の組換え体ベクターを構築する。　
　また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。　
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。　
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。　
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。　
　次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。　
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖それぞれについて各６本の合成ＤＮＡを設計する。　
　また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、容易に、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターに、クローニングすることができる。　
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＨ鎖全長又はＬ鎖全長のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。　
　又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長及びＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO／TECHNOLOGY、9、266(1991)］。
　ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。　
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J.Mol.Biol.、112、535(1977)］又はコンピューターモデリング［Protein Engineering、7、1501(1994)］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。　
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。　
（６）ヒト化抗体発現用組換え体ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現用組換え体ベクターを構築することができる。　
　例えば、（４）及び（５）で得られるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクター、又はそれらを改変した組換え体ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。　
　組換え体ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press、283(1991)］。
　ＣＯＳ－７細胞への組換え体ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press(1991)］、又はリポフェクション法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)］などを用いる。 
　組換え体ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Thiral Antibodies-Principles and Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体を得ることができる。　
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平０２－２５７８９１号公報、Cytotechnology、3、133(1990)］などを用いる。 
　組換え体ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ＤＨＦＲと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular Genetics、12、55(1986)］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質、又はＮ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、又は細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下又は欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
　組換え体ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平０２－２５７８９１号公報）。　
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）、ＧＩＴ培地（日本製薬社）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。　
　得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平０２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換体が産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。　
　遺伝子組換え抗体は、形質転換体の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。　
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature、227、680(1970)］、又はウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies－Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］などを用いて測定することができる。 
３．精製モノクローナル抗体の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体の活性評価、例えば、ヒトハプトグロビンに対する結合活性は、前述の１．（６）記載のＥＬＩＳＡを用いた結合反応検出系を用いて測定できる。　
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端Ｎ＝アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、又は抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体には、いずれの方法を用いてもエフェクター活性を制御することができる。　
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞によるＡＤＣＰ活性などが知られている。　
　エフェクター活性の測定法として、例えばＡＤＣＣ活性については、標的として炎症性細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして炎症性細胞特異的な抗体を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞障害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を、エフェクター活性として測定することができる。若しくは、ヒトＰＢＭＣに、例えばＣＤ２０の様な血液細胞特異的な抗原を認識する抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離ＬＤＨやフローサイトメトリーによる該細胞数の減少を、エフェクター活性として測定することができる。
　抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体（以下、フコース非結合型ともいう）は、フコースが結合している抗体（以下、フコース結合型ともいう）に比べて、ＣＤ１６ａに対して高い結合活性を有する。また、それに伴って、高いＡＤＣＣ活性を有することが知られている。　
　一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体に比べて、ＣＤ１６ａに対して低い結合活性を有する。また、それに伴って、低いＡＤＣＣ活性を有する。　
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。　
　また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書、又は米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明のモノクローナル抗体を用いた疾患の治療方法
　本発明の抗体は、自己抗体による組織傷害が関係する自己免疫疾患の治療に用いることができる。
　自己免疫疾患としては、自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患が挙げられ、限定するものではないが、免疫性血小板減少性紫斑病、川崎病、ＡＮＣＡ関連血管炎、ギランバレー症候群、慢性脱髄性多発性根神経炎、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫性蕁麻疹、天疱瘡、グッドバスチャー症候群、乾癬性関節炎、シェーングレン症候群、多発性筋炎／皮膚筋炎などのＩＶＩＧ製剤が治療薬として用いられる自己免疫疾患や、ＩｇＧ４関連疾患などの自己抗体の産生が病態に関与している自己免疫疾患が挙げられる。
　投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。　
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。　
　乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。　
　カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。　
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、又は噴霧剤などが挙げられる。　
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　坐剤はカカオ脂、水素化脂肪、又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。　
　噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。　
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］可溶性ＣＤ１６ａの作製
（１）ヒト末梢血単核球ｃＤＮＡの作製
　健常人の静脈血３０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社）０．５ｍＬを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水（大塚製薬社）３０ｍＬと混合した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ　ＰＨＡＲＭＡ　ＡＳ社）４ｍＬに対して、該混合液１０ｍＬを穏やかに重層し、室温下２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。
　分離された単核球画分を各遠心管より集めて混合し、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）［以下、ＲＰＭＩ１６４０－ＦＢＳ（１０）］３０ｍＬに懸濁し、室温下１２００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行った。
　遠心分離後、上清を除去し、該細胞をＲＰＭＩ１６４０－ＦＢＳ（１０）２０ｍＬに懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０－ＦＢＳ（１０）を用いて２×１０６個／ｍＬの末梢血単核球懸濁液を調製した。
　調製した末梢血単核球懸濁液５ｍＬについて、室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。遠心分離後、上清を除去し、５ｍＬのＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）に懸濁して、室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。
　遠心分離後、上清を除去し、得られたペレットから、ＱＩＡａｍｐ　ＲＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付書に従い、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
　得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ２μｇから、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、添付書に従い、ｃＤＮＡを調製した。
（２）ヒトＣＤ１６ａをコードするｃＤＮＡの取得
　ヒトＣＤ１６ａ（以下、ＣＤ１６ａと表記する）のｃＤＮＡの取得は、以下のように行った。
　まず、ＣＤ１６ａのｃＤＮＡの塩基配列［J. Exp. Med., 170, 481 (1989)］より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー（配列番号１に示す）及び翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー（配列番号２に示す）を設計した。
　次に、実施例１（１）で調製したヒト末梢血単核球由来ｃＤＮＡを鋳型として、上記２種類のプライマー（配列番号１及び２）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）に添付の説明書に基づき行った。
　ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付書に従い精製した。制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅ＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）を回収した。
　一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（－）２．５μｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
　これら約８００ｂｐのＤＮＡ断片と約２．９ｋｂｐの断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換して、ヒトＣＤ１６ａのアミノ酸配列の１７６番目がバリン［以下、ＣＤ１６ａ（Ｖ）と表記する］であるｃＤＮＡ（配列番号３）をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＢｓ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）を取得した。
（３）可溶性ＣＤ１６ａをコードするｃＤＮＡの取得
　ＣＤ１６ａの細胞外領域（配列番号４の１～１９３番目）とＣ末端にヒスチジンタグ（６個のＨｉｓが連続したアミノ酸配列）を有する可溶性ＣＤ１６ａ（Ｖ）［以下、可溶性ＣＤ１６ａ（Ｖ）］をコードするｃＤＮＡは、以下のように構築した。
　まず、ＣＤ１６ａ（Ｖ）のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）より、細胞外領域に特異的なプライマーＦｃｇＲ３－１（配列番号５）を設計した。次に、ｐＢｓ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）を５ｎｇとＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を用いて、実施例１（２）と同様にしてＰＣＲを行った。
　ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付書に従い精製し、滅菌水に溶解した。制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅ＤＮＡ断片（約１１０ｂｐ）を回収した。
　一方、ｐＢｓ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）２．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂｐの断片を回収した。これら約１１０ｂｐのＤＮＡ断片と約３．５ｋｂｐの断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換して、ヒスチジンタグ融合可溶性ＣＤ１６ａ（配列番号６）をコードするプラスミドｐＢｓｓＣＤ１６ａ（Ｖ）－Ｈｉｓを取得した。
（４）可溶性ＣＤ１６ａの組換え体ベクターの構築
　実施例１（３）で得られたプラスミドｐＢｓｓＣＤ１６ａ（Ｖ）－Ｈｉｓ　３．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約６２０ｂｐの断片を回収した。
　一方、国際公開第９７／１０３５４号に記載のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３　２．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約１０．７ｋｂｐの断片を回収した。
　これら約６２０ｂｐのＤＮＡ断片と約１０．７ｋｂｐの断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換して、ヒスチジンタグ融合可溶性ＣＤ１６ａをコードする組換え体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ｓＣＤ１６ａ（Ｖ）－Ｈｉｓを取得した。
（５）可溶性ＣＤ１６ａの安定生産細胞の作製
　実施例１（４）で構築した組換え体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ｓＣＤ１６ａ（Ｖ）－ＨｉｓをラットミエローマＹＢ２／０細胞［ATCC CRL-1662、 J. Cell. Biol., 93, 576 (1982)]に導入し、可溶性ＣＤ１６ａの安定生産細胞を以下のように作製した。
　制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、線状化したｐＫＡＮＴＥＸ　ｓＣＤ１６ａ（Ｖ）－Ｈｉｓ　１０μｇをエレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］により４×１０６個のＹＢ２／０細胞へ導入後、１０％ＦＢＳを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社）［以下、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ－ＦＢＳ（１０）］４０ｍＬに懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。
　５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１～２週間培養した。ＭＴＸ濃度を５０ｎｍｏｌ／Ｌから順次上昇させ、最終的に、１．０ｍｇ／ｍＬのＧ４１８及び２００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ－ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能であり、かつ、可溶性ＣＤ１６ａを高生産する形質転換細胞を得た。
（６）可溶性ＣＤ１６ａの精製
　実施例１（５）で得られた可溶性ＣＤ１６ａ（Ｖ）を生産する形質転換細胞を、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌで含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ－ＧＦ（５）［５％Ｄａｉｇｏ’ｓ　ＧＦ２１（和光純薬社）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社）］に３×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に５０ｍＬ分注した。
　５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃にて４日間培養し、培養上清を回収した。培養上清よりＮｉ－ＮＴＡ　ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社）カラムを用いて、添付書に従い、可溶性ＣＤ１６ａ（Ｖ）を精製した。
［実施例２］ＩＶＩＧ中の高いＣＤ１６ａ結合活性をもつ成分の分離と分析
（１）高いＣＤ１６ａ結合活性を持つ成分の分離
　０．２５ｍｇのＨｉｓ－ＣＤ１６ａを、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）に添付書に従い固相化した。その際、未反応の活性化エステル基は０．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をブロッキング用緩衝液として用いてブロッキングし、ＣＤ１６ａを固相化せずにブロッキングのみ行ったカラムをコントロールカラムとした。
　２倍希釈血清２．４ｍＬに５０ｍｇ／ｍｌ　ＩＶＩＧ　１００μＬを添加し（終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、室温で１時間回転混和した。そこに競合抗体として０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｘｅｎｃｏｒ型抗Ｇａｌ抗体２．５ｍＬを添加し（終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ロードサンプルとした。
　ＣＤ１６ａ固相化カラム又はコントロールカラムに、ロードサンプル２ｍＬをアプライした。素通り画分を再度アプライする操作を２回繰り返した。４ｍＬの０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）（以下、ＰＢＳＴと記す）で７回（計２８ｍｌ）洗浄し、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌを含む４ｍＬのＰＢＳで３回溶出した。
（２）溶出画分の分析
（ｉ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離
　１回目の溶出画分のうち１．７ｍｌを４１μＬまで濃縮した後、メルカプトエタノールを含む還元条件のサンプル緩衝液を用いて希釈し９０℃にて５分間加熱した。加熱後、半分の液量を用いて、１２％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動（濃縮ゲル２０ｍＡ　１時間、分離ゲル４０ｍＡ　１時間）を行った後、ＳＹＰＲＯ　Ｒｕｂｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｌ　ｓｔａｉｎ（インビトロジェン社）を用いて染色した。
　その結果、コントロールとの差があり、かつ分析に必要とする十分なタンパク質量のバンドが認められた。
（ｉｉ）ゲル内消化
　目的のバンドを切り出し１ｍｍ四方に切断し、還元用緩衝液［１０ｍＭ　ＤＴＴ（ナカライテスク社）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３］を加えて５６℃にて１時間還元した。上清を取り除いた後アルキル化用緩衝液［５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＡＡ（ナカライテスク社）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３］を加えて暗所にて室温で１時間反応させた。
　ゲル片を２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄後、さらに５０％アセトニトリル（和光純薬工業社）を含む２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３による洗浄を２回行い遠心濃縮機で完全に乾燥させた。そこにＴｒｙｐｓｉｎ溶液［Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）が２０μＬ辺り１８ｎｇになるように２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３で希釈した溶液］を２０μＬ加えて４℃にて３０分静置した後、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨ４ＨＣＯ３を８０μＬ加えてｖｏｒｔｅｘし、３７℃にて１６時間、Ｔｒｙｐｓｉｎで消化した。
　反応液上清を、５０％アセトニトリルを含む５％ギ酸が上清の１／１００量入ったチューブに回収し、水と５０％アセトニトリルを含む５％ギ酸で、ゲル片からペプチドを抽出した。抽出液を回収後、該液に含まれるアセトニトリルを遠心濃縮機で除去し、分析サンプルとした。
（ｉｉｉ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
　分析サンプルをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＨＰＬＣ；Ｍａｇｉｃ　２００２、Ｍｉｃｈｒｏｍｅ　ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社、カラム；ＭｏｎｏＣａｐ　Ｃ１８　Ｎａｎｏ－ｆｌｏｗ、０．２×５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社、ＭＳ；ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。
　まず、抗体Ｈ鎖に相当する分子量５１ｋＤａのバンド（以下５１ｋ－Ｈと記す）の分析において、３３２Ｉｌｅ→Ｇｌｕの変異を含むＸｅｎｃｏｒ型ペプチド（ｍ／ｚ＝８３８．５０４，ｚ＝１，ＡＬＰＡＰＥＥＫ）、又は変異を含まない非Ｘｅｎｃｏｒ型ペプチド（ｍ／ｚ＝８５４．４６２，ｚ＝１，ＡＬＰＡＰＩＥＫ）のＭＳピークのシグナル強度を算出することで、溶出画分に含まれるＸｅｎｃｏｒ型抗体の割合を算出した。
　ＭＳデータの解析は解析ソフトウェアＸｃａｌｉｂｕｒ　Ｑｕａｌ　Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。その結果、Ｘｅｎｃｏｒ型ペプチドのシグナル強度が４．０７×１０６、非Ｘｅｎｃｏｒ型ペプチドのシグナル強度が１．０６×１０６であり、シグナル強度の比較から約８割がＸｅｎｃｏｒ型抗体、約２割が非Ｘｅｎｃｏｒ型抗体であると思われた。
　溶出画分に含まれる約２割の非Ｘｅｎｃｏｒ型抗体はＩＶＩＧ中に含まれる会合体や血清タンパク質とＩＶＩＧ中の自己反応成分の免疫複合体など、Ｘｅｎｃｏｒ型抗体に置き換わって結合したＸｅｎｃｏｒ型抗体と同等以上のＣＤ１６ａ結合活性を持つ成分と考えられた。
　次に、免疫複合体を構成する血清タンパク質の同定を試みた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離において、コントロールとの差があり、かつ分析に用いるのに十分なタンパク質量のバンド７本について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。
　分析結果を質量分析解析検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ　ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて解析し、タンパク質の同定を行った。その結果、高スコアのバンドは、Ｈ鎖の断片・重合体由来と考えられた。分子量４３ｋＤａのバンドからヒトＨｐが同定された。
［実施例３］ヒト抗体産生動物への免疫
　ヒトＨｐに対するモノクローナル抗体を取得するために、ヒト抗体産生動物２匹にアジュバントで混合したヒトＨｐ（ＡＴＨＥＮＳ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社、ｍｉｘｅｄ　ｔｙｐｅ）を３週間から４週間ごとに合計５回免疫した。抗体価は、免疫後約１０日後に、ヒト及びマウスＨｐに対する結合活性をＥＬＩＳＡにより解析し、２匹とも結合活性を示した。
［実施例４］ハイブリドーマの作製　
　３回から５回免疫後、外科的にリンパ組織を摘出し、細胞融合に供した。まず、摘出したリンパ組織をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に懸濁し、組織をすりつぶし、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。得られた細胞をマウスミエローマ細胞株Ｓｐ２／０と混合し、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。
　遠心分離により上清を除いたのち、あらかじめ３７℃に温めていたＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）１ｍＬを６秒ごとに１００μＬずつ添加した。添加後２分間、手で温めながら懸濁液を混合した。
　その後、４分間かけて４ｍｌの３７℃に温めていたＤＭＥＭ培地を添加し、更に１分間かけて１０ｍＬの培地を添加した。懸濁液を３７℃の温浴で５分間温めた後、室温、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心分離後、細胞をＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルプレート（ＢＤ社）に播種し培養した。翌日以降、薬剤選択培地で約１週間培養した。
［実施例５］ハイブリドーマスクリーニング　　
　実施例４で作製したハイブリドーマの培養上清ヒトＨｐ及びマウスＨｐに対する結合活性を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により解析した。まず、９６ウェルプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ　ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、ヒトＨｐ（ＡＴＨＥＮＳ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社、ｍｉｘｅｄ　ｔｙｐｅ）あるいはマウスＨｐ（Ｌｉｆｅ　Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
　固相化液を取り除いた後、１％ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと記す）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次にハイブリドーマの培養上清を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＡＢＴＳを５０μＬ／ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
［実施例６］抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
　ヒトＨｐとマウスＨｐの両方に対して反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付書に従い、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、添付書に従い、ｃＤＮＡを調製した。
　得られたｃＤＮＡを鋳型に、プライマーｈｈｉｕ１（配列番号７）及びｈｈｉｕ３（配列番号８）を用いて、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子を、プライマーｈｋ２（配列番号９）及びｈｋ５（配列番号１０）を用いて、ヒト軽鎖（κ鎖）遺伝子を、それぞれＰＣＲにより増幅した。増幅した遺伝子をサブクローニングし、塩基配列を解析した。
　その結果、クローン＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６についてシグナル配列を除いたＶＨ及びＶＬの塩基配列並びにアミノ酸配列を同定した。クローン＃４のＶＨ及びＶＬのそれぞれの塩基配列を配列番号１１及び１２並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２１及び２２、クローン＃６のＶＨ及びＶＬのそれぞれの塩基配列を配列番号１３及び１４並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２３及び２４、クローン＃２７のＶＨ及びＶＬのそれぞれの塩基配列を配列番号１５及び１６並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２５及び２６、クローン＃１０５のＶＨ及びＶＬのそれぞれの塩基配列を配列番号１７及び１８並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２７及び２８、クローン＃９６－６のＶＨ及びＶＬのそれぞれの塩基配列を配列番号１９及び２０並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２９及び３０で示した。
　また、クローン＃２７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３１、３２及び３３に、クローン＃２７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４、３５及び３６に、クローン＃１０５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３７、３８及び３９に、クローン＃１０５のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４０、４１及び４２に示した。
［実施例７］ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターの構築
　ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターは、実施例６で決定された抗Ｈｐ抗体重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより作製した。
　組換え体ベクターとしては、ヒトＩｇＧ１重鎖組換え体ベクターｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）及びヒトＩｇＧ１κ鎖組換え体ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用いた。
　実施例５で得られた転写産物から、重鎖可変領域遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｉＷＩサイト間に、軽鎖可変領域遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｈｅＩサイト間に、ＣｌｏｎｅＥＺ（登録商標）ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を用いて挿入した。大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターを作製した。
　形質転換した大腸菌の培養には、重鎖組換え体ベクターは終濃度５０μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（インビトロジェン社）を添加した培地ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社）を用いて、κ鎖組換え体ベクターはＦａｓｔ－Ｍｅｄｉａ　Ｂｌａｓ　ＴＢ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用いた。
［実施例８］抗Ｈｐ抗体の一過性発現 
　ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体の一過性発現株を作製するため、宿主細胞に実施例７で作製された組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としては、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社）を用いた。
　プラスミド導入は２９３Ｆｅｃｔｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を用いて、添付書に従って行った。ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体組換え体ベクターとして、実施例７で作製した、重鎖組換え体ベクターとκ鎖組換え体ベクターを２：３で混合したものを用いた。回収した培養上清を遠心分離し、得られた培養上清を０．２２μｍフィルターを用いてろ過することでヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体を含む培養上清を調製した。
［実施例９］抗Ｈｐ抗体の精製       
　実施例８で得られたヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体一過性発現株を、Ｆｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）に懸濁し、三角フラスコで６日間培養した後、培養上清を回収した。調製した培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体を精製した。
　まず、培養上清をカラムに通し、洗浄用緩衝液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ　ホウ酸Ｎａ／ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した後、ｐＨ３．５の溶出用緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸Ｎａ／ｐＨ３．５）で溶出した。
　溶出したフラクションは速やかに中和用緩衝液（１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ　８．５）で中和した。それぞれのフラクションの２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。
　Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ　１０ＤＧ　ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて、ＰＢＳに緩衝液を交換し、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．４として、濃度を算出した。
［実施例１０］ＣＤ１６ａ結合活性（ＥＬＩＳＡ）   
　実施例９で作製した抗Ｈｐ抗体（＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６）を用いて、抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐの免疫複合体のＣＤ１６ａ結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。９６ウェルプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ　ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、抗Ｔｅｔｒａ－Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
　固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に実施例１で作製した可溶性ＣＤ１６ａを５μｇ／ｍＬになるように１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したものを５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で２時間反応させて、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
　抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐの混合溶液（以下、ＩＣと記す場合もある）を、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した後に室温で１時間静置して調製した。濃度は抗Ｈｐ抗体を１５０ｋＤａ、ヒトＨｐを２００ｋＤａとした時に、抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐのモル比が１：２になるように添加した。適宜１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した混合溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間反応させた。
　このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ＡＢＴＳを５０μＬ／ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、１％ＳＤＳを５０μＬ／ウェルずつ分注し、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
　その結果、ＩＶＩＧのＥＣ５０値が１．０６μｇ／ｍＬであったのに対し、各抗体単独でのＥＣ５０値は、＃４は１．９９μｇ／ｍＬ、＃６は０．８０５μｇ／ｍＬ、＃２７は０．７６３μｇ／ｍＬ、＃１０５は０．４０５μｇ／ｍＬ、＃９６－６は０．４７３μｇ／ｍＬであった。いずれの抗Ｈｐ抗体も、ＩＶＩＧに比べ、ＣＤ１６ａに対する結合活性が高いことが明らかとなった（図１Ａ～図１Ｆ）。
　また、驚くべきことに、各抗体をヒトＨｐと混合した際のＥＣ５０値は、＃４は０．２９８μｇ／ｍＬであるのに対し、＃６は０．０６６４μｇ／ｍＬ、＃２７は０．０４９０μｇ／ｍＬ、＃１０５は０．０５４０μｇ／ｍＬ、＃９６－６は０．０４５９μｇ／ｍＬであった。これは抗体をヒトＨｐと混合することにより、ヒトＨｐと免疫複合体が形成され、ＣＤ１６ａに対する結合活性が亢進したことを示している（図１Ａ～図１Ｅ）。
［実施例１１］安定発現による抗Ｈｐ抗体の作製
　以下に記載する方法で抗Ｈｐ抗体（＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６）を作製した。
（１）安定発現用の抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターの構築
　組換え体ベクターとしては、ヒトＩｇＧ１κの定常領域遺伝子を含む組換え体ベクターとしてｐＤＥＬＴＡを用いた。重鎖可変領域遺伝子は制限酵素ＮｏｔＩとＡｐａＩのサイト間に、軽鎖可変領域遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｉＷＩサイト間に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入し、安定発現用抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターを作製した。
　大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、組換え体ベクターを作製した。ＰＣＲには、鋳型として実施例７で作製されたヒトＩｇＧ１型抗Ｈｐ抗体発現用組換え体ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号４３－６２で示すプライマーを用いた。
（２）フコース結合型抗体の作製
　フコース結合型抗Ｈｐ抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例１１（１）で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いた。エレクトロポレーション法による組換え体ベクターの細胞への遺伝子導入、培養、薬剤選抜は一般的な方法で行った。培養一週間に一度、薬剤入りの培地を交換し、生細胞の割合が９８％程度に回復したものを安定発現バルク株とした。
　この安定発現株を８ｍｍｏｌ／ＬＧｌｎ及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を含むＥＸ－ＣＥＬＬ　３２５　ＰＦ　ＣＨＯ　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ＣＨＯ　Ｃｅｌｌｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）等の培地に３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して１４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清から実施例９に記載の方法で抗Ｈｐ抗体を精製した。
（３）フコース非結合型抗体の作製
　フコース非結合型抗Ｈｐ抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例１１（１）で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用い、その後の操作は実施例１１（２）に記載の方法に準じて実施した。
（４）陰性対照抗体ＤＮＰ抗体の作製
　陰性対照抗体であるｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＮＰ）抗体は、公知の方法（Motoki K et. al., Clin.Cancer Res.11,3126-3135,2005）に準じて作製した。
［実施例１２］Ｆｃアミノ酸改変型の抗Ｈｐ抗体の作製
　組換え体ベクターは、アミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ領域遺伝子配列（配列番号６３）（以下、ｈＣｇ１　Ｘｅｎ　２３９　３３２と略記する場合もある）の合成ＤＮＡ（ＧＥＮＥＷＩＺ社）を、実施例１１（１）で作製した組換え体ベクターの制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入することによって作製した。また、当該組換え体ベクターは、ＮｈｅＩではなく、ＡｐａＩを用いても、作製することができた。
　その後の操作を、実施例１１（３）に記載の方法に準じて行うことによって、フコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型の抗Ｈｐ抗体を作製した。同様の方法で、３カ所のＦｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施したフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型の抗Ｈｐ抗体を作製した。
［実施例１３］抗Ｈｐ抗体の抗原結合活性
　実施例９で作製した抗Ｈｐ抗体（＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６）を用いて、抗Ｈｐ抗体のヒトＨｐに対する結合活性をＥＬＩＳＡにより解析した。まず、９６ウェルプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ　ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、ヒトＨｐ（日本血液製剤機構）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
　固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に１％ＢＳＡ－ＰＢＳで適当な濃度になるように希釈した抗Ｈｐ抗体を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。その後の操作は、プレートリーダーによる吸光度測定（サンプル波長４０５ｎｍ）以外は、実施例５に記載の方法に準じて実施した。
　その結果、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６の４抗体はいずれもヒトＨｐに対して高い結合活性を示した（図２）。なお、＃４もこれら４抗体と同等の結合活性を示した。次に、ウェスタンブロッティングにより、実施例９で作製した抗Ｈｐ抗体（＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６）が、ヒトＨｐのうち、α鎖又はβ鎖のいずれに対し結合活性を有するかを解析した。まず、メルカプトエタノールを含む還元条件のサンプル緩衝液を用いて調製したヒトＨｐをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分離した後、ＰＶＤＦ膜にブロットした。各抗Ｈｐ抗体と反応させた後、結合している抗体をＧｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社）で検出した。
　その結果、＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６の５抗体は、いずれもβ鎖に対する特異的な結合活性を示した。以上より、＃４、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６の５抗体は、いずれもβ鎖を特異的に認識してヒトＨｐに結合する抗体であることがわかった。
［実施例１４］抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐの免疫複合体の分子量解析   
　抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐが結合し、免疫複合体を形成していることを確認するために、ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）（カラム；ＢｉｏＳｅｐ　ＳＥＣ－ｓ４０００、７．８×３００ｍｍ、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）による分析を行った。
　移動相［５０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）］でカラムを平衡化し、抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐ（日本血液製剤機構）がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬと１．３ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈して混合し、３７℃にて１６時間静置した。
　混合液５０μＬに含まれる成分を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで分離後、波長２８０ｎｍで検出される各ピークについて、多角度光散乱検出器（Ｍｕｌｔｉ　Ａｎｇｌｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＭＡＬＳ）（ｍｉｎｉＤＡＷＮ　ＴＲＥＯＳ、Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）によって検出される散乱強度の最大値を用いて分子量を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、混合液を分析した際は、抗Ｈｐ抗体あるいはヒトＨｐをそれぞれ単独で分析した場合よりも、溶出時間が速い高分子量のピークが検出され、このピークは抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体を形成していることが示唆された。
　前記の通り、Ｈｐはα／β－サブユニットがいくつ含まれるかにより、複数の分子量の構造をとり得る。ＭＡＬＳによる分子量解析において、ヒトＨｐの分子量は２０６×１０３と算出された。よって、ここで用いたヒトＨｐの主成分はα／β－サブユニットが４つ含まれるものであると推定された［J Sep Sci., 32, 1224 (2009)］。
　また、表１に示すように、免疫複合体の分子量は＃４が形成する免疫複合体と比較して、＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６が形成する免疫複合体の方が大きかった。
　さらに、抗体の分子量を１５０×１０３として、免疫複合体に含まれる抗体及びヒトＨｐの分子数を推定した。その結果、＃４が形成する免疫複合体では抗体１分子及びヒトＨｐ１分子を含むと推定された。一方、＃２７が形成する免疫複合体では抗体２分子及びヒトＨｐ１分子、＃６、＃１０５及び＃９６－６が形成する免疫複合体では抗体２分子及びヒトＨｐ２分子以上を含むと推定された。
［実施例１５］ＣＤ３２ａ結合活性（ＥＬＩＳＡ）   
（１）可溶性ＣＤ３２ａの作製
　実施例１に記載の方法に準じて、ヒスチジンタグ融合可溶性ＣＤ３２ａを作製した。アミノ酸配列を配列番号６４に示す。
（２）抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐの免疫複合体のＣＤ３２ａ結合活性
　実施例１５（１）で作製した可溶性ＣＤ３２ａを用いて、実施例１０と同様の方法で抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐの免疫複合体のＣＤ３２ａ結合活性を解析した。
　その結果、実施例１０において、抗体をヒトＨｐと混合することにより、ヒトＨｐと免疫複合体が形成され、ＣＤ１６ａに対する結合活性が亢進した抗体のうち４抗体（＃６、＃２７、＃１０５及び＃９６－６）は、ＣＤ３２ａに対する結合活性解析においても、ヒトＨｐと混合することにより、ＣＤ３２ａに対する結合活性の亢進を示した。一方、＃４は、活性の亢進を示さなかった（図３）。
［実施例１６］ＣＤ１６ａと抗ＤＮＰ抗体の結合に対する阻害活性
（１）ＣＤ１６ａの組換え体ベクターの構築
　実施例１（２）で作製した、全長ＣＤ１６ａ（Ｖ）（配列番号４）をコードするｃＤＮＡを含む、プラスミドｐＢｓ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）５．０μｇを制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化後、１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
　一方、国際公開第９７／１０３５４号に記載のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３　１０μｇを制限酵素ＮｏｔＩ　Ｉ（タカラバイオ社）及びＢａｍＨＩ　Ｉ（タカラバイオ社）で消化後、１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、約１１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これら約８００ｂｐのＤＮＡ断片と約１１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０（タカラバイオ社製）にて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換して、全長ＣＤ１６ａ（Ｖ）をコードする組換え体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）を取得した。
（２）ＣＤ１６ａ発現細胞の作製
　実施例１６（１）で構築した全長ＣＤ１６ａ（Ｖ）をコードする組換え体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）をＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）に導入し、ＣＤ１６ａの安定生産細胞を以下のように作製した。
　ｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ１６ａ（Ｖ）をエレクトロポレーション法によりＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に遺伝子導入した。実施例１（５）に記載の方法と同様にＭＴＸ濃度を順次上昇させ、最終的に０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８及び５００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸ及び１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）を含むＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ社）で増殖可能であり、かつ、ＣＤ１６ａを高発現する形質転換細胞を得た。
　得られた形質転換細胞を０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、ＦＣＭ用緩衝液１（２％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ３及び１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で懸濁した。
　次に、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種しＰＥ標識抗ヒトＣＤ１６抗体（ＢＤバイオサイエンス社）で染色、洗浄後に、細胞をＦＣＭ用緩衝液１で懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析し、ＣＤ１６ａが高発現していることを確認した。
（３）ＣＤ１６ａと抗ＤＮＰ抗体の結合に対する阻害活性
　実施例１１で作製した抗Ｈｐ抗体（フコース結合型及びフコース非結合型）、フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧを用いて、ＣＤ１６ａと抗ＤＮＰ抗体の結合に対する阻害活性を検討した。
　実施例１６（２）で作製されたＣＤ１６ａ発現細胞を１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。次に、実施例１１で作製した抗Ｈｐ抗体（フコース結合型及びフコース非結合型）、フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧを、ＦＣＭ用緩衝液１で希釈した後、室温で１時間静置し被験体とした。
　フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体は、抗Ｈｐ抗体を１５０ｋＤａ、ヒトＨｐを２００ｋＤａとした時に、抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐのモル比が１：２になるように調製した。これら被験体を、先に細胞を播種したプレートに１０μＬ／ウェル加え、４℃にて５分間反応させた。
　別で、実施例１１（４）で作製した抗ＤＮＰ抗体とＤＮＰ（２－４－Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）－ＢＳＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｌｐｈａ　Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）がいずれも０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように混合し、室温で１時間静置することにより、抗ＤＮＰ抗体溶液とした。
　被験体を添加して４℃にて５分間反応させた前記プレートに、競合抗体として抗ＤＮＰ抗体溶液を１０μＬ／ウェル加え、４℃にて３時間反応させた。ＦＣＭ用緩衝液１でこのプレートを洗浄後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて、結合している抗ＤＮＰ抗体を検出することにより、ＣＤ１６ａ結合阻害活性を検討した。
　その結果、ＩＣ５０値は、＃２７のフコース結合型と＃２７のフコース非結合型、それぞれ２３８μｇ／ｍＬと５３．８μｇ／ｍＬとなり、フコース非結合型にすることでより強い阻害活性を示した。
　また、驚くべきことに、＃２７のフコース非結合型又は＃１０５のフコース非結合型をヒトＨｐとそれぞれ混合し免疫複合体を形成させると、ＩＣ５０値はそれぞれ１１．７μｇ／ｍＬと７．９２μｇ／ｍＬとなり、免疫複合体形成によってさらに強い結合阻害活性を示した。ＩＶＩＧのＩＣ５０値は５４０μｇ／ｍＬであった。
　このことから、＃２７又は＃１０５による、ＣＤ１６ａと抗ＤＮＰ抗体の結合に対する阻害活性は、＃２７及び＃１０５をそれぞれフコース非結合型への改変することにより、さらに、それぞれがヒトＨｐと免疫複合体形成することにより、大幅に亢進することが明らかとなった（図４）。
［実施例１７］ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ反応に対する阻害活性     
　ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ反応における、抗Ｈｐ抗体及び免疫複合体化した抗Ｈｐ抗体による阻害活性を検討した。ＡＤＣＣ活性は、国際公開第２００７／０１１０４１号に記載の方法に準じて測定した。
　標的細胞としてＨｅｒ２陽性ヒト乳癌細胞ＳＫ－ＢＲ－３を用い、エフェクター細胞には健常人ドナー由来の凍結ＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。標的細胞は１００ｎｇ／ｍＬの市販抗Ｈｅｒ２抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎでオプソニン化した。標的細胞に対するエフェクター細胞の比は１：２０で実験を行った。
　まず、実施例１１で作製した抗Ｈｐ抗体（フコース結合型及びフコース非結合型）、フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体、並びにＩＶＩＧを、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈した後に室温で１時間静置し被験体とした。フコース非結合型抗Ｈｐ抗体及びヒトＨｐからなる免疫複合体は、抗Ｈｐ抗体を１５０ｋＤａ、ヒトＨｐを２００　ｋＤａとした時に、抗Ｈｐ抗体とヒトＨｐのモル比が１：２になるように調製した。
　次に、９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、被験体、エフェクター細胞、標的細胞の順に添加して３７℃（５％ＣＯ２）で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ－Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔｅｓｔ（和光純薬社）を用いて、添付の説明書にしたがって測定した。ＡＤＣＣ（％）は以下の式により算出した。
ＡＤＣＣ（％）＝１００×（Ｓ－Ａｂ）／（Ｍａｘ－Ｔ）
Ｓ＝サンプル反応ウェル吸光度－培地ウェル吸光度
Ａｂ＝抗体無添加ウェル吸光度－培地ウェル吸光度
Ｔ＝標的ウェル吸光度－培地ウェル吸光度
Ｍａｘ＝１００％反応ウェル吸光度－１００％反応対照ウェル吸光度
　その結果、＃２７のフコース非結合型又は＃１０５のフコース非結合型をヒトＨｐと混合しそれぞれ免疫複合体を形成させると、ＩＶＩＧ及び＃２７のフコース非結合型と比べて低濃度からＡＤＣＣ活性を阻害する作用を示した。このことから、ＡＤＣＣ活性は、免疫複合体形成によって大幅に減弱することが明らかとなった（図５）。＃６及び＃９６－６に関しても、同様に本評価系に供することによって高い阻害活性を示すことを確認した。
［実施例１８］健常人ドナーの末梢血液を用いたＡＤＣＣ反応の阻害活性
（１）フコース非結合型ｒｉｔｕｘｉｍａｂの作製
　フコース非結合型抗ＣＤ２０抗体ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）は公知の方法（Masuda K et. al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007）に準じて作製した。
（２）健常人ドナーの末梢血液を用いたＡＤＣＣ反応の阻害活性
　健常人ドナーの末梢血液を用いたＡＤＣＣ反応における、抗Ｈｐ抗体の阻害活性を検討した。健常人ドナーの末梢血液を用いたＡＤＣＣ反応は、公知の方法（Masuda K et.al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007）に準じて測定した。
　まず、実施例１１及び実施例１２で作製した抗Ｈｐ抗体、抗ＤＮＰ抗体、及びこれら抗体の各種改変型、並びにＩＶＩＧを、ＲＰＭＩ１６４０で終濃度の１５倍に調製し、被験体とした。
　次に、４８ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ社）の各ウェルに、被験体３０μＬと健常人ドナーの末梢血液を３９０μＬ、それぞれ分注した。３７℃（５％ＣＯ２）で３０分間培養後、（１）で作製されたフコース非結合型ｒｉｔｕｘｉｍａｂを、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０で希釈して各ウェルに３０μＬずつ分注した。
　ＡＤＣＣ未反応のウェルには、フコース非結合型ｒｉｔｕｘｉａｍａｂの代わりにＲＰＭＩ１６４０を、被験体非存在下でフコース非結合型ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるＡＤＣＣ反応を行ったウェルには、被験体の代わりにＲＰＭＩ１６４０を分注した。４８ウェルプレートを３７℃（５％ＣＯ２）で２０時間培養後、Ｂ細胞数をカウントした。
　具体的には、各ウェルから１５０μＬを分取し、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ，ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を３０μＬ／サンプルで添加した後、溶血用溶液［１０×ＲＢＣ　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｅ－ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を滅菌水で１０倍に希釈したもの］を用いて添付書に従って溶血操作をした。
　遠心分離後、上清を捨て、沈査として得られた細胞を９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に移し、ＦＣＭ用緩衝液２（０．０５％ＮａＮ３及び１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含む１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）７５μＬに懸濁した。
　ＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社）を５μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて５分間静置した後、さらにＦＣＭ用緩衝液２で希釈したＡＰＣ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ１９（ＢＤバイオサイエンス社）、ＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ２（ＢＤバイオサイエンス社）を添加し、４℃にて３０分以上反応を行った。
　死細胞はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｖｉｏｌｅｔ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ，ｆｏｒ　４０５ｎｍ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて添付の説明書に従い染色した。再び細胞を洗浄した後、ＦＣＭ用緩衝液２に懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）を用いて解析した。Ｂ細胞をＦＳＣ－ＳＳＣ展開のリンパ球画分におけるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ陰性、ＣＤ１９陽性、ＣＤ２陰性画分として検出した。
　ＡＤＣＣ活性は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ　２４００個あたりのＢ細胞数を解析する方法、あるいは、リンパ球画分におけるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ陰性、ＣＤ１９陽性の割合を解析する方法のいずれかにより評価した。
　その結果、＃２７のフコース非結合型及び＃１０５のフコース非結合型は、Ｆｃドメインが同じ構造を持つ抗ＤＮＰ抗体のフコース非結合型よりも、高いＡＤＣＣ反応に対する阻害活性を示すことが明らかになった。その阻害活性は、ＩＶＩＧと比較して大幅に高かった。また、Ｆｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を施した抗Ｈｐ抗体のフコース非結合型は、さらに高い阻害活性を示した（図６Ａ）。
　抗ＤＮＰ抗体は、本発明の抗Ｈｐ抗体と異なり、末梢血液中にリガンドを含まず、単量体で存在すると考えられる。従って、これらの結果は、本発明の抗Ｈｐ抗体が、血液中でヒトＨｐと免疫複合体を形成することで、高い阻害活性を発揮できることを示唆している。
　以上の結果から、ＡＤＣＣ反応に対する阻害活性は、免疫複合体形成とポテリジェント技術に加えて、Ｆｃアミノ酸改変を組み合わせることで、顕著に亢進することが明らかとなった（図６Ａ）。
　Ｆｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した＃２７のフコース非結合型は、図６Ａの実験と同様に高い阻害活性を示した。このことから、ＡＤＣＣ反応に対する阻害活性は、Ｆｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）によっても、顕著に亢進することが明らかとなった。
　一方で、Ｆｃアミノ酸改変（Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ）を施した＃４のフコース非結合型では阻害活性の程度は低かった。このことから、抗Ｈｐ抗体のクローンによってその阻害活性が異なることが明らかとなった。実施例１４の結果も併せて考察すると、高い阻害活性を発揮する上で、ヒトＨｐと抗Ｈｐ抗体の免疫複合体に含まれる抗体数が２個以上であることが重要だと考えられた（図６Ｂ）。
［実施例１９］ヒトＨｐと抗Ｈｐ抗体の結合に対する作用
（１）酵素標識抗体の作製
　実施例１１（２）で作製した抗Ｈｐ抗体（＃６、＃１０５及び＃９６－６）及び抗Ｈｐラビットポリクローナル抗体（ロックランド　イムノケミカル社）（以下、抗Ｈｐポリクロ抗体と記す）をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所社）を用い、添付の説明書に基づいて、標識した。各抗Ｈｐ抗体２００μｇの溶媒をＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｔｕｂｅを用いて洗浄用緩衝液に置換した後、ＮＨ２－Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを添加し、３７℃で２時間反応させた。その後、標識抗体の溶媒を洗浄用緩衝液に再度置換した。
（２）ヒトＨｐと取得した抗Ｈｐ抗体の結合に対する作用
　ヒトＨｐと実施例１９（１）で作製した標識抗Ｈｐ抗体（＃６、＃１０５及び＃９６－６）の結合に対する＃２７及び＃１０５の作用を評価した。９６ウェルプレート　（ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ　ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、ヒトＨｐをＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。
　固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬになるように希釈した抗Ｈｐ抗体（＃２７、＃１０５、＃６若しくは＃９６－６）、又は、対照抗体として抗ＤＮＰ抗体（実施例１１（４）で作製）若しくは抗Ｈｐポリクロ抗体を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１０分間静置した。
　その後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した標識抗Ｈｐ抗体（＃６、＃１０５又は＃９６－６）［実施例１９（１）で作製］を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＡＢＴＳを５０μＬ／ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、１％ＳＤＳを５０μＬ／ウェルずつ分注し、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
　結果を表２に示す。表２内の＋及び－は、吸光度が０．５以上であった場合を＋とし、０．５未満であった場合を－として示した。ヒトＨｐと標識抗Ｈｐ抗体（＃６、＃１０５又は＃９６－６）の結合は、抗ＤＮＰ抗体の添加では阻害されなかった一方で、それぞれの未標識体の抗Ｈｐ抗体の添加及び抗Ｈｐポリクロ抗体の添加によって阻害され、本評価系で競合の有無が評価できることを予め確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、ヒトＨｐと標識抗Ｈｐ抗体（＃６、＃１０５又は＃９６－６）の結合は＃２７の添加により阻害されなかった。このことは、＃２７が認識するヒトＨｐのエピトープは、＃６、＃１０５及び＃９６－６のエピトープとは異なることを示唆している。また、ヒトＨｐと＃６又は＃９６－６の結合は＃１０５の添加で阻害されなかった。このことは、＃１０５のエピトープは、＃２７のみならず＃６及び＃９６－６のエピトープとも異なることを示唆している。
（３）ヒトＨｐと市販抗Ｈｐ抗体の結合に対する作用
（ｉ）ヒトＨｐと市販抗Ｈｐ抗体の結合性
　市販の抗Ｈｐマウス抗体３クローンを用いて、ヒトＨｐへの結合性を評価した。まず、実施例１９（２）に記載の方法に準じて、９６ウェルプレートにヒトＨｐを固相化し、ブロッキングした。ブロッキング後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳにより１μｇ／ｍＬに希釈した市販抗Ｈｐ抗体２Ｂ１１（ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）（以下、市販２Ｂ１１抗体と記す）、２Ｆ４（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）（以下、市販２Ｆ４抗体と記す）又はＦ８（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）（以下、市販Ｆ８抗体と記す）、並びに、対照抗体としてマウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体又は標識抗Ｈｐポリクロ抗体［実施例１９（１）で作製］を、それぞれ５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＲａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｄａｋｏ社）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例５に記載の方法に準じて実施した。その結果、市販２Ｂ１１抗体及び市販２Ｆ４抗体はヒトＨｐに対する結合性を示したが、市販Ｆ８抗体はヒトＨｐに対する結合性をほとんど示さなかった。このことから、市販２Ｂ１１抗体及び市販２Ｆ４抗体を用いて他の評価を実施した。
（ｉｉ）ウシＨｐ又はマウスＨｐと市販抗Ｈｐ抗体の結合性
　市販２Ｂ１１抗体及び市販２Ｆ４抗体の、ウシＨｐ（Ｌｉｆｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）及びマウスＨｐに対する結合性を、＃２７及び＃１０５のウシＨｐ及びマウスＨｐに対する結合性と比較した。まず、実施例１９（２）に記載の方法に準じて、９６ウェルプレートにヒトＨｐ、ウシＨｐ又はマウスＨｐを固相化し、ブロッキングした。
　ブロッキング後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳにより１μｇ／ｍＬに希釈した抗Ｈｐ抗体（＃２７若しくは＃１０５）、市販抗Ｈｐ抗体（市販２Ｂ１１抗体若しくは市販２Ｆ４抗体）又は対照抗体（抗ＤＮＰ抗体、マウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体若しくは標識抗Ｈｐポリクロ抗体）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳにより希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ又はＲａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰを５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ社）を５０μＬ／ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、０．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２ＳＯ４（和光純薬社）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
　結果を表３に示す。抗Ｈｐ抗体（＃２７又は＃１０５）を反応させたウェルの吸光度については、抗ＤＮＰ抗体を反応させたウェルの吸光度を引いた値を求めた。また、市販抗Ｈｐ抗体（市販２Ｂ１１抗体又は市販２Ｆ４抗体）を反応させたウェルの吸光度については、マウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体を反応させたウェルの吸光度を引いた値を求めた。その値が１以上であった場合を＋とし、１未満であった場合を－として表内に示した。抗Ｈｐポリクロ抗体とヒトＨｐ、ウシＨｐ及びマウスＨｐの結合から、抗原が固相化されていることを予め確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、＃２７、＃１０５及び市販２Ｆ４抗体はウシＨｐに結合しなかったのに対し、市販２Ｂ１１抗体はウシＨｐにも結合した。このことから、市販２Ｂ１１抗体はヒト－ウシで相同のアミノ酸残基に結合しているのに対し、＃２７、＃１０５及び市販２Ｆ４抗体はヒト－ウシで非相同のアミノ酸残基に結合することが示され、＃２７及び＃１０５は市販２Ｂ１１抗体と異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。
　さらに、＃２７及び＃１０５はマウスＨｐに結合したのに対し、市販２Ｆ４抗体はマウスＨｐに結合しなかった。このことから、＃２７及び＃１０５は、市販２Ｆ４抗体と同様にヒト－ウシで非相同のアミノ酸残基を認識することが明らかとなった。また、＃２７及び＃１０５がヒト－マウスで相同のアミノ酸残基に結合するのに対し、市販２Ｆ４抗体はヒト－マウスで非相同のアミノ酸残基に結合していることが示され、＃２７及び＃１０５は市販２Ｆ４抗体と異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。
（ｉｉｉ）競合ＥＬＩＳＡ
　＃２７及び＃１０５が市販２Ｆ４抗体と異なるエピトープを認識することを別の方法で評価する目的で、ヒトＨｐと市販２Ｆ４抗体の結合に対する＃２７及び＃１０５の作用を評価した。実施例１９（１）に記載の方法に準じて、９６ウェルプレートにヒトＨｐを固相化し、ブロッキングした後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬになるように希釈した抗Ｈｐ抗体（＃２７若しくは＃１０５）又は対照抗体として抗ＤＮＰ抗体若しくは抗Ｈｐポリクロ抗体を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１０分間静置した。
　続いて１％ＢＳＡ－ＰＢＳで５００倍に希釈した市販２Ｆ４抗体を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＲａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＨＲＰ（Ｄａｋｏ社）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例５に記載の方法に準じて実施した。
　結果を表４に示す。表４内の＋及び－は、吸光度が０．５以上であった場合を＋とし、０．５未満であった場合を－とした。ヒトＨｐと市販２Ｆ４抗体の結合は抗ＤＮＰ抗体の添加では阻害されなかった一方で、抗Ｈｐポリクロ抗体の添加によって阻害された。本結果により、本評価系で競合の有無が評価できることを予め確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、ヒトＨｐと市販２Ｆ４抗体の結合は＃２７又は＃１０５の添加で阻害されず、実施例１９（３）（ｉｉ）と同様に＃２７及び＃１０５は市販２Ｆ４抗体とは異なるエピトープを認識することが明らかとなった。
［実施例２０］取得した抗Ｈｐ抗体のエピトープ解析
（１）ヒトＨｐ／ウシＨｐキメラタンパク質の作製
　実施例１３に記載の通り、＃２７及び＃１０５はヒトＨｐのβ鎖を認識していることが示唆されている。＃２７及び＃１０５がヒトＨｐβ鎖のうちのいずれのアミノ酸を認識しているかを明らかにし、市販２Ｆ４抗体のエピトープと比較する目的で、エピトープ解析を行った。
　実施例１９（３）（ｉｉ）に記載の通り、＃２７及び＃１０５はウシＨｐに結合せず、マウスＨｐに結合した。本結果に基づいて、ヒトＨｐβ鎖（配列番号７０）のアミノ酸残基を一部ウシのアミノ酸残基に置換したキメラＨｐβ鎖を複数設計した。具体的には、ヒトＨｐのアミノ酸配列（配列番号６５）、ウシＨｐのアミノ酸配列（配列番号７３）及びマウスＨｐのアミノ酸配列（配列番号７４）を比較し、ヒトＨｐβ鎖（配列番号７０）のうち、ヒト－ウシで非相同かつヒト－マウスで相同のアミノ酸残基を抽出した。さらに、抽出した該残基を対応するウシＨｐのアミノ酸残基に置換した。
　なお、キメラＨｐβ鎖の発現用組換えベクターは、５’末端からヒトＨｐα鎖（配列番号７１）、キメラＨｐβ鎖、ヒスチジンタグの順にコードされるように設計した。これにより、キメラＨｐβ鎖は、Ｃ末端側にヒスチジンタグが結合し、さらにヒトＨｐα鎖がジスルフィド結合で連結した形で発現する（以下キメラＡ～Ｆと表記する）。
　作製したキメラＡ～Ｆにおいて、置換したアミノ酸残基の位置と種類を表５に示す。作製したキメラＡ～Ｆのアミノ酸配列を配列番号７５～８０に、キメラＡ～Ｆのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む合成ＤＮＡ（ファスマック社またはＧＥＮＥＷＩＺ社）の塩基配列を配列番号８１～８６に示す。
　キメラＡ～Ｆの発現用組換え体ベクターは、ｐＣＩベクターの制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩサイトの間に、合成ＤＮＡ（配列番号８１～８６）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて挿入することにより作製した。また、アミノ酸置換を施していないヒトＨｐβ鎖（配列番号７０）についても、キメラタンパク質と同様に発現用組み換えベクターを作製した。
　作製した組換え体ヒトＨｐのアミノ酸配列を配列番号８７に、合成ＤＮＡの配列を配列番号８８に示す。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎ　２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、説明書に従って一過性発現によりキメラＡ～Ｆ及び組換え体ヒトＨｐを作製した。
　宿主細胞にはＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、培養用培地にはＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。回収した培養上清より、ｃＯｍｐｌｅｔｅ　Ｈｉｓ－Ｔａｇ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｉｎ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、添付の説明書に従ってキメラＡ～Ｆ及び組換え体ヒトＨｐを精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）ヒトＨｐ／ウシＨｐキメラタンパク質に対する結合性
　実施例２０（１）で作製したキメラＡ～Ｆに対する＃２７及び＃１０５の結合性を評価した。９６ウェルプレートに、キメラＡ～Ｆ、組換え体ヒトＨｐ及びウシＨｐを実施例５に記載の方法に準じて固相化し、ブロッキングした。ブロッキングした後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳにより希釈した抗Ｈｐ抗体（＃２７若しくは＃１０５）、市販２Ｆ４抗体、又は、対照抗体（抗ＤＮＰ抗体、マウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体若しくは標識抗Ｈｐポリクロ抗体）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。
　このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ又はＲａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰを５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例５に記載の方法に準じて実施した。各抗Ｈｐ抗体と組換え体ヒトＨｐを反応させたウェルの吸光度を１として、サンプル反応ウェルの吸光度から比を算出した。
　結果を表６に示す。表６内の＋及び－は、吸光度の比が、０．５以上であった場合を＋、０．５未満であった場合を－として示した。抗ＤＮＰ抗体及びマウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体はいずれの固相化抗原とも結合しないことを予め確認した。また、抗Ｈｐポリクロ抗体がすべての固相化抗原に対して結合性を示したことにより、抗原が固相化されていることも確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、＃２７のキメラＦに対する結合性が特異的に低下しており、＃１０５のキメラＡに対する結合性も特異的に低下していた。このことから、＃２７はエピトープに少なくともＦ４４及びＥ４９を含むこと、及び＃１０５はエピトープに少なくともＳ１５５、Ｔ１５６及びＶ１５７を含むことが明らかとなった。一方で、市販２Ｆ４抗体はキメラＡ～Ｆのいずれに対しても高い結合性を示したことから、＃２７及び＃１０５のエピトープであるアミノ酸残基が、市販２Ｆ４抗体のエピトープには含まれないことが明らかとなった。
（３）ヒトＨｐ／マウスＨｐキメラタンパク質の作製市販２Ｆ４抗体のエピトープを明らかにし、＃２７及び＃１０５のエピトープと比較する目的で、市販２Ｆ４抗体のエピトープ解析を行った。実施例１９（３）（ｉｉ）に記載の通り、市販２Ｆ４抗体はウシＨｐ及びマウスＨｐに結合しなかった。
　本結果に基づいて、ヒトＨｐβ鎖（配列番号７０）のアミノ酸残基を一部マウスのアミノ酸残基に置換したキメラＨｐβ鎖を複数設計した。具体的には、ヒトＨｐのアミノ酸配列（配列番号６５）、ウシＨｐのアミノ酸配列（配列番号７３）及びマウスＨｐのアミノ酸配列（配列番号７４）を比較し、ヒトＨｐβ鎖（配列番号７０）のうち、ヒト－ウシで非相同かつヒト－マウスでも非相同のアミノ酸残基を抽出した。さらに、抽出した該残基を対応するマウスＨｐのアミノ酸残基に置換した。
　なお、キメラＨｐβ鎖は、実施例２０（１）に記載の方法と同様に、Ｃ末端側にヒスチジンタグを結合し、さらにヒトＨｐα鎖（配列番号７１）がジスルフィド結合で連結した形で発現する（以下キメラＧ～Ｋと表記する）。
　作製したキメラＧ～Ｋにおいて、置換したアミノ酸残基の位置と種類を表７に示す。作製したキメラＧ～Ｋのアミノ酸配列を配列番号８９～９３に、合成ＤＮＡの塩基配列を配列番号９４～９８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（４）ヒトＨｐ／マウスＨｐキメラタンパク質に対する結合性
　実施例２０（２）に記載の方法に準じて、実施例２０（３）で作製したキメラＧ～Ｋに対する市販２Ｆ４抗体の結合性を評価した。結果を表８に示す。各抗Ｈｐ抗体と組換え体ヒトＨｐを反応させたウェルの吸光度を１として、サンプル反応ウェルの吸光度から比を算出した。
　表８内の＋及び－は、吸光度の比が、０．５以上であった場合を＋、０．５未満であった場合を－として示した。抗ＤＮＰ抗体及びマウスＩｇＧ１型アイソタイプコントロール抗体はいずれの固相化抗原とも結合しないことを予め確認した。また、抗Ｈｐポリクロ抗体がすべての固相化抗原に対して結合性を示したことにより、抗原が固相化されていることも確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示すように、市販２Ｆ４抗体のキメラＫに対する結合性が特異的に低下していた。このことから、市販２Ｆ４抗体はエピトープにＱ１４７、Ｉ１４９、Ｒ１５０及びＰ１６３を含むことが明らかとなった。一方で、＃２７及び＃１０５はキメラＧ～Ｋのいずれに対しても高い結合性を示し、市販２Ｆ４抗体のエピトープであるアミノ酸残基が、＃２７及び＃１０５のエピトープには含まれないことが明らかとなった。
　＃２７及び＃１０５のエピトープ［実施例２０（２）で同定］、並びに、市販２Ｆ４抗体のエピトープを表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　以上の結果より、市販２Ｆ４抗体のエピトープは、＃２７及び＃１０５のエピトープと異なることが明らかとなった。
［実施例２１］フコース非結合型かつＣＤ１６ａ／ＣＤ３２ａ高親和性Ｆｃアミノ酸改変型の抗Ｈｐ抗体の作製
　組換え体ベクターは、アミノ酸改変（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ領域遺伝子配列（配列番号７２、以下、ｈＣｇ１　Ｘｅｎ２３６　２３９　３３２と略記する場合もある）の合成ＤＮＡ（ＧＥＮＥＷＩＺ社）を、実施例１１（１）で作製した組換え体ベクターのＡｐａＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入することによって作製した。その後の操作を、実施例１１（３）に記載の方法に準じて行うことによって、フコース非結合型かつＣＤ１６ａ／ＣＤ３２ａ高親和性Ｆｃアミノ酸改変型の抗Ｈｐ抗体を作製した。
［実施例２２］マウス免疫性血小板減少症（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：ＩＴＰ）モデルにおける作用
（１）抗マウス血小板抗体の作製
　組換え体ベクターとしては、マウスＩｇＧ２ｂκの定常領域遺伝子を挿入したｐＣＩベクターを用いた。血小板減少等の全身性の自己免疫疾患症状を呈するＮＺＷ　ｘ　ＢＸＳＢ　Ｆ１マウスからクローニングされた抗マウス血小板抗体クローン６Ａ６［Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993］の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて挿入した。
　大腸菌ＤＨ５　αコンピテントセルに形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、マウスＩｇＧ２ｂ型抗マウス血小板６Ａ６抗体発現用組換え体ベクターを作製した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎ　２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、説明書に従って一過性発現により抗体を作製した。培養上清の回収及び抗体の精製は抗体精製用レジンとしてＡｂ－Ｃａｐｃｈｅｒ（プロテノバ社）を用いて、実施例８及び実施例９に記載の方法に準じて行った。
（２）マウス免疫性血小板減少症（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：ＩＴＰ）モデルにおける作用
　マウスＩＴＰモデルにおける抗血小板抗体による血小板減少に対する、＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）による阻害作用を評価した。マウスＩＴＰモデルの病態惹起は公知の方法［Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993］に準じて実施した。
　雄性Ｃｒｌ：ＣＤ１（Ｉｃｒ）マウス（日本チャールス・リバー社）を購入し、６週齢（体重３０ｇ前後）で用いた。８群（各群ｎ＝５）に群分けしたマウスに、実施例２１で作製した＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）又はＩＶＩＧをＰＢＳで調製したものを、それぞれ０．０８、０．４、２、１０ｍｇ／ｈｅａｄ（＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型）及び１０、４０ｍｇ／ｈｅａｄ（ＩＶＩＧ）の用量にて腹腔内投与した。
　コントロール群にはＰＢＳを投与した。被検体投与の３０分後に実施例２２（１）で作製した抗マウス血小板６Ａ６抗体を１０μｇ／ｈｅａｄの用量にて静脈内投与し、血小板減少を惹起した。惹起しなかった場合の血小板数を把握するための対照群には、抗マウス血小板６Ａ６抗体の代わりにＰＢＳを投与した。抗マウス血小板６Ａ６抗体を投与した２４時間後にイソフルラン麻酔下にて腹大静脈から採血し、ＥＤＴＡ入り採血管に入れ、ＡＤＶＩＡ　１２０　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＩＥＭＥＳ社）を用いて血小板数を測定した。
　その結果、＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）の投与により、用量依存的に抗マウス血小板６Ａ６抗体による血小板減少を抑制した。また、＃１０５のフコース非結合型かつＦｃアミノ酸改変型（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）はＩＶＩＧよりも低い用量で、ＩＶＩＧと同等以上の作用を示した（図７）。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年３月２９日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－０６６８２９）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：ヒトＣＤ１６ａクローニング用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号２：ヒトＣＤ１６ａクローニング用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号３：ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ）の塩基配列
配列番号４：ヒトＣＤ１６ａのアミノ酸配列
配列番号５：可溶性ヒトＣＤ１６ａ組換え体ベクター作製用プライマー　ＦｃｇＲ３－１の塩基配列
配列番号６：ヒスチジンタグ融合可溶性ＣＤ１６ａのアミノ酸配列
配列番号７：プライマーｈｈｉｕ１の塩基配列
配列番号８：プライマーｈｈｉｕ３の塩基配列
配列番号９：プライマーｈｋ２の塩基配列
配列番号１０：プライマーｈｋ５の塩基配列
配列番号１１：＃４－ＶＨの塩基配列
配列番号１２：＃４－ＶＬの塩基配列
配列番号１３：＃６－ＶＨの塩基配列
配列番号１４：＃６－ＶＬの塩基配列
配列番号１５：＃２７－ＶＨの塩基配列
配列番号１６：＃２７－ＶＬの塩基配列
配列番号１７：＃１０５－ＶＨの塩基配列
配列番号１８：＃１０５－ＶＬの塩基配列
配列番号１９：＃９６－６－ＶＨの塩基配列
配列番号２０：＃９６－６－ＶＬの塩基配列
配列番号２１：＃４－ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２２：＃４－ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２３：＃６－ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２４：＃６－ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２５：＃２７－ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２６：＃２７－ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２７：＃１０５－ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２８：＃１０５－ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２９：＃９６－６－ＶＨのアミノ酸配列
配列番号３０：＃９６－６－ＶＬのアミノ酸配列
配列番号３１：＃２７－ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３２：＃２７－ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３３：＃２７－ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３４：＃２７－ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３５：＃２７－ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３６：＃２７－ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３７：＃１０５－ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３８：＃１０５－ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３９：＃１０５－ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４０：＃１０５－ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４１：＃１０５－ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４２：＃１０５－ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４３：＃４－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号４４：＃４－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号４５：＃４－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号４６：＃４－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号４７：＃６－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号４８：＃６－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号４９：＃６－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号５０：＃６－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号５１：＃２７－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号５２：＃２７－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号５３：＃２７－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列配列番号５４：＃２７－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号５５：＃１０５－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号５６：＃１０５－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号５７：＃１０５－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号５８：＃１０５－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号５９：＃９６－６－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号６０：＃９６－６－ＶＨ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号６１：＃９６－６－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲフォワードプライマーの塩基配列
配列番号６２：＃９６－６－ＶＬ　遺伝子増幅用ＰＣＲリバースプライマーの塩基配列
配列番号６３：合成ＤＮＡ（ｈＣｇ１　Ｘｅｎ　２３９　３３２）の塩基配列
配列番号６４：可溶性ＣＤ３２ａのアミノ酸配列
配列番号６５：ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列　多型１（ＮＰ＿００５１３４．１）
配列番号６６：ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列　多型２（ＮＰ＿００１１１９５７４．１）
配列番号６７：ヒトハプトグロビンの遺伝子配列　多型１（ＮＭ＿００５１４３．３）
配列番号６８：ヒトハプトグロビンの遺伝子配列　多型２（ＮＭ＿００１１２６１０２．１）
配列番号６９：シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン　多型１（ＮＰ＿００５１３４．１）α鎖のアミノ酸配列　
配列番号７０：ヒトハプトグロビンβ鎖のアミノ酸配列　
配列番号７１：シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン　多型２（ＮＰ＿００１１１９５７４．１）α鎖のアミノ酸配列　
配列番号７２：合成ＤＮＡ（ｈＣｇ１　Ｘｅｎ　２３６　２３９　３３２）の塩基配列
配列番号７３：ウシハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号７４：マウスハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号７５：キメラＡのアミノ酸配列
配列番号７６：キメラＢのアミノ酸配列
配列番号７７：キメラＣのアミノ酸配列
配列番号７８：キメラＤのアミノ酸配列
配列番号７９：キメラＥのアミノ酸配列
配列番号８０：キメラＦのアミノ酸配列
配列番号８１：キメラＡの塩基配列
配列番号８２：キメラＢの塩基配列
配列番号８３：キメラＣの塩基配列
配列番号８４：キメラＤの塩基配列
配列番号８５：キメラＥの塩基配列
配列番号８６：キメラＦの塩基配列
配列番号８７：組換えヒトＨｐのアミノ酸配列
配列番号８８：組換えヒトＨｐの塩基配列
配列番号８９：キメラＧのアミノ酸配列
配列番号９０：キメラＨのアミノ酸配列
配列番号９１：キメラＩのアミノ酸配列
配列番号９２：キメラＪのアミノ酸配列
配列番号９３：キメラＫのアミノ酸配列
配列番号９４：キメラＧの塩基配列
配列番号９５：キメラＨの塩基配列
配列番号９６：キメラＩの塩基配列
配列番号９７：キメラＪの塩基配列
配列番号９８：キメラＫの塩基配列

Claims (22)

  1. 　配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
  2. 　以下の（ａ）～（ｄ）から選ばれる１の抗体と競合して配列番号７０で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
    （ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４、３５及び３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
    （ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、３８及び３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０、４１及び４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｃ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｄ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
  3. 　以下の（ａ）～（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体。
    （ａ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３４、３５及び３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、３８及び３９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４０、４１及び４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｃ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｄ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
  4. 　配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、４４番目のＰｈｅ及び４９番目のＧｌｕに結合する、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  5. 　配列番号７０で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１５５番目のＳｅｒ、１５６番目のＴｈｒ及び１５７番目のＶａｌに結合する、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  6. 　遺伝子組換え抗体である、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  7. 　ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  8. 　モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ及びヒトＦｃγ受容体Ｉからなる群から選ばれる少なくとも１つのヒトＦｃγ受容体に結合する、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  9. 　モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体２分子及びヒトハプトグロビン１分子を含む、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  10. 　抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合糖鎖の還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  11. 　請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
  12. 　請求項１１に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  13. 　請求項１２に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。　
  14. 　請求項１３に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養物から該抗体を採取することを特徴とする請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
  15. 　請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
  16. 　請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む、自己免疫疾患治療剤。
  17. 　ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤。
  18. 　モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１７に記載の自己免疫疾患治療剤。
  19. 　モノクローナル抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項１８に記載の自己免疫疾患治療剤。
  20. 　モノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体である、請求項１７～請求項１９のいずれか１項に記載の自己免疫疾患治療剤。
  21. 　モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩ、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ及びヒトＦｃγ受容体Ｉからなる群から選ばれる少なくとも１つのヒトＦｃγ受容体に結合する、請求項１７～請求項２０のいずれか１項に記載の自己免疫疾患治療剤。
  22. 　モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体２分子及びヒトハプトグロビン１分子を含む、請求項２０又は請求項２１に記載の自己免疫疾患治療剤。
PCT/JP2017/012736 2016-03-29 2017-03-28 血中でハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤 WO2017170597A1 (ja)

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