JP6370792B2 - Protein purification method - Google Patents

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Description

本発明は一般的に、タンパク質の精製方法に関する。より詳細には、本発明は、同じ開始材料からのハプトグロビンおよびヘモペキシンの精製方法ならびにそれらの使用に関する。   The present invention relates generally to methods for protein purification. More particularly, the present invention relates to methods for purifying haptoglobin and hemopexin from the same starting materials and their use.

溶血は、赤血球細胞の破壊を特徴とし、酵素欠損、ヘモグロビン異常症、遺伝性球状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症および棘細胞性貧血などの赤血球細胞異常、ならびに脾腫、自己免疫疾患（例えば、新生児溶血性疾患）、遺伝性障害（例えば、鎌状赤血球症またはＧ６ＰＤ欠損症）、微小血管症性溶血、グラム陽性菌感染（例えば、ストレプトコッカス、エンテロコッカスおよびスタフィロコッカス）、寄生生物感染（例えば、マラリア原虫）、毒素および外傷（例えば、熱傷）などの外因子に関連した貧血障害の指標である。溶血はまた、輸血、特に大量輸血および体外心肺補助を使用する患者における一般的な障害である。   Hemolysis is characterized by destruction of red blood cells, enzyme deficiencies, hemoglobin abnormalities, hereditary spherocytosis, red blood cell abnormalities such as paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and spinal cell anemia, and splenomegaly, autoimmune diseases (eg Neonatal hemolytic disease), hereditary disorders (eg sickle cell disease or G6PD deficiency), microangiopathic hemolysis, Gram-positive bacterial infections (eg streptococcus, enterococcus and staphylococcus), parasitic infections (eg It is an indicator of anemia disorders related to external factors such as malaria parasites, toxins and trauma (eg, burns). Hemolysis is also a common disorder in patients who use blood transfusions, especially massive blood transfusions and extracorporeal cardiopulmonary assistance.

溶血に関連した症状を有する患者に見られる有害作用は、主として赤血球細胞からの鉄ならびにヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘムなどの鉄含有化合物の放出に起因する。生理学的条件下では、放出されたヘモグロビンは、ハプトグロビンなどの可溶性タンパク質に結合し、マクロファージおよび肝細胞に輸送される。しかし、溶血の頻度が加速し、病的な状態になると、ハプトグロビンの緩衝能力は完全に消失する。結果として、ヘモグロビンは迅速にフェリヘモグロビンに酸化され、次々に遊離ヘム（プロトポルフィリンＩＸおよび鉄を含む）を放出する。ヘムは数々の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすが（例えば、ヘモグロビンおよびミオグロビンなどの必須タンパク質の一部として）、遊離ヘムは毒性が高い。遊離ヘムは、脂質膜、タンパク質および核酸に損傷を与える毒性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する酸化還元活性鉄の原料である。ヘムの毒性はさらに、脂質膜に入り込む能力によって増大し、膜成分の酸化を引き起こし、細胞溶解および死を促進する。   The adverse effects seen in patients with symptoms related to hemolysis are primarily due to the release of iron and red iron-containing compounds such as hemoglobin (Hb) and heme. Under physiological conditions, released hemoglobin binds to soluble proteins such as haptoglobin and is transported to macrophages and hepatocytes. However, as the frequency of hemolysis accelerates and the disease becomes morbid, the buffer capacity of haptoglobin is completely lost. As a result, hemoglobin is rapidly oxidized to ferrihemoglobin, which in turn releases free heme (including protoporphyrin IX and iron). Although heme plays an important role in many biological processes (eg, as part of essential proteins such as hemoglobin and myoglobin), free heme is highly toxic. Free heme is a source of redox-active iron that produces highly toxic reactive oxygen species (ROS) that damage lipid membranes, proteins and nucleic acids. Heme toxicity is further increased by its ability to penetrate lipid membranes, causing oxidation of membrane components and promoting cell lysis and death.

低レベルの細胞外Ｈｂ／ヘムに継続的に曝露することによる進化的圧力によって、生理学的定常状態においておよび軽度溶血の間に遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用を制御する代償機構が導かれた。これらの系には、Ｈｂ捕捉ハプトグロビン（Ｈｐ）およびヘム捕捉タンパク質ヘモペキシン（Ｈｘ）およびα１−ミクログロブリンを含むＨｂまたはヘムに結合する血漿タンパク質の一群の放出が含まれる。しかし、内在性ＨｐおよびＨｘは、生理学的定常状態における遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用は制御するが、溶血に関連した症状などの病態生理学的状態においては、Ｈｂ／ヘムの定常状態レベルを維持することにはほとんど効果がない。   Evolutionary pressure through continuous exposure to low levels of extracellular Hb / heme has led to a compensatory mechanism that controls the adverse effects of free Hb / heme at physiological steady state and during mild hemolysis. These systems include the release of a group of plasma proteins that bind to Hb or heme, including Hb capture haptoglobin (Hp) and heme capture proteins hemopexin (Hx) and α1-microglobulin. However, endogenous Hp and Hx control the adverse effects of free Hb / heme in physiological steady state, but maintain steady state levels of Hb / heme in pathophysiological conditions such as hemolysis-related symptoms. It has little effect.

本発明は、同じ開始材料からＨｐおよびＨｘを精製する方法を提供する。精製したタンパク質は、溶血に関連した症状および異常なＨｂ／ヘムレベルを治療するための組成物において使用することができる。   The present invention provides a method for purifying Hp and Hx from the same starting material. The purified protein can be used in compositions for treating symptoms associated with hemolysis and abnormal Hb / heme levels.

本発明の一態様では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって、
（ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
（ｉｉ）該溶液に硫酸アンモニウムを添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
（ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
（ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することを含む方法を提供する。 In one aspect of the invention, a method for purifying haptoglobin and hemopexin from a solution containing both proteins comprising:
(I) providing a solution containing both haptoglobin and hemopexin;
(Ii) precipitating haptoglobin from the solution by adding ammonium sulfate to the solution;
(Iii) separating the precipitated haptoglobin from the solution containing hemopexin; and (iv) separately purifying haptoglobin and / or hemopexin in one or more steps.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンを含む組成物を提供する。   In another aspect of the invention, a composition comprising haptoglobin recovered by the methods disclosed herein is provided.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。   In another aspect of the present invention, a composition comprising hemopexin recovered by the methods disclosed herein is provided.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む組成物を提供する。   In another aspect of the invention, a composition comprising transferrin recovered by the methods disclosed herein is provided.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンおよび本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。   In another aspect of the invention, a composition comprising haptoglobin recovered by the method disclosed herein and hemopexin recovered by the method disclosed herein is provided.

本発明の別の態様では、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシン含量が全タンパク質の少なくとも８０％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシンおよびハプトグロビンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％である組成物を提供する。   In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the haptoglobin content is at least 95% of the total protein. In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the hemopexin content is at least 80% of the total protein. In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the combined content of hemopexin and haptoglobin is at least 80% of the total protein.

本発明の別の態様では、本明細書で開示したように、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む製剤を提供する。   In another aspect of the invention, there is provided a formulation comprising a composition of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier as disclosed herein.

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する方法であって、本明細書で開示したように、本発明の組成物または製剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。   In another aspect of the invention, a method of treating a symptom associated with hemolysis comprising administering a composition or formulation of the invention to a subject in need thereof, as disclosed herein. A method of including is provided.

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する医薬品の製造における、本明細書で開示したような本発明の組成物または製剤の使用を提供する。   In another aspect of the present invention, there is provided the use of a composition or formulation of the present invention as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating symptoms associated with hemolysis.

コーン分画法の流れ図を示した図である。当業者であれば、図１に記載した方法のパラメータ（例えば、ｐＨ、エタノール濃度、温度など）の変動もコーン画分を生成するために使用できることを認識する。It is the figure which showed the flowchart of the cone fraction method. Those skilled in the art will recognize that variations in the parameters of the method described in FIG. 1 (eg, pH, ethanol concentration, temperature, etc.) can also be used to generate the corn fraction. 硫酸アンモニウム２．０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍおよび４．０Ｍの存在下での沈殿後の残存濾液中におけるトランスフェリン（ＴＲＦ）、アルブミン（Ａｌｂ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）およびハプトグロビン（ＨＡＰ）の回収を示した図である。Transferrin (TRF), albumin (Alb), hemopexin (HPX) and haptoglobin (HAP) in the remaining filtrate after precipitation in the presence of ammonium sulfate 2.0M, 2.5M, 3.0M, 3.5M and 4.0M FIG. 実験計画法（ＤＯＥ）の望ましさのプロット（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を示した図で、溶液中にヘモペキシンを維持しながら血漿画分からハプトグロビンを沈殿させる望ましい条件を示す。ＤＯＥは、ハプトグロビンからヘモペキシンを分離する能力に対するｐＨおよび硫酸アンモニウム濃度の影響を評価するために使用した一連の制御実験である。要因数学的設計（Ａ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｄｅｓｉｇｎ）を使用してデータを設計し、分析した。図３で示した望ましさのプロットは、ヘモペキシンおよびハプトグロビン両方の最良の分離および回収をもたらす最も望ましい条件を決定するためにこの数学的設計を使用した。FIG. 5 shows a desirability plot of design of experiment (DOE) showing the desired conditions for precipitating haptoglobin from the plasma fraction while maintaining hemopexin in solution. DOE is a series of control experiments used to evaluate the effect of pH and ammonium sulfate concentration on the ability to separate hemopexin from haptoglobin. Data was designed and analyzed using A factorial mathematical design. The desirability plot shown in FIG. 3 used this mathematical design to determine the most desirable conditions that resulted in the best separation and recovery of both hemopexin and haptoglobin. 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後に回収されたヘモペキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予め形成した１０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ、ＥＣ６０７５）を使用して実施した。試料は全て、トリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液（ＬＣ２６７６）中０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、各試料２０μＬをゲルのサンプルウェルに添加した。泳動時間および電圧は、ゲル製造者の推奨（１２５Ｖ一定）に設定した。各ゲルは、クーマシーブリリアントブルー染色溶液の種類（Ｎｏｖｅｘ、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ、ＬＣ６０６５）を使用して容易に染色した。レーン１（ＬＭＷＳ）はＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ非染色タンパク質標準物ＬＣ５８０１を含有する。FIG. 3 shows SDS-PAGE electrophoresis of hemopexin recovered after various steps in the purification method disclosed herein. SDS-PAGE analysis was performed using a preformed 10% Tris-Glycine gel (Novex, EC6075). All samples were diluted to a concentration of 0.1 mg / mL in Tris-Glycine SDS sample buffer (LC2676) and 20 μL of each sample was added to the sample well of the gel. The run time and voltage were set as recommended by the gel manufacturer (constant 125V). Each gel was easily stained using Coomassie Brilliant Blue staining solution type (Novex, Simply Blue Safestain, LC6065). Lane 1 (LMWS) contains Novex Sharp unstained protein standard LC5801. 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後に回収されたハプトグロビン中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である（図４で前述した方法を使用）。レーン２のハプトグロビン標準物はＢｅｎｅｓｉｓ（Ｔ０４３ＨＰＸ）から入手した。FIG. 5 is a diagram showing SDS-PAGE electrophoresis of haptoglobin intermediates recovered after various steps in the purification method disclosed herein (using the method described above in FIG. 4). The haptoglobin standard in lane 2 was obtained from Benesis (T043HPX). １０％トリス−グリシン非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルでのＣａｐｔｏ Ｑ溶出液のウェスタンブロットを示した図である（図４で記載した方法を使用）。分離されたタンパク質は、次にニトロセルロース膜に移し、抗体のいかなる非特異的結合も防ぐために膜をブロックする。次に、ニトロセルロース膜をヒトハプトグロビンに対する抗体（ウサギ抗ヒトハプトグロビン、Ｓｉｇｍａ Ｈ８６３６）を含有する溶液でインキュベートする。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した２次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ Ａ６１５４）でニトロセルロース膜をインキュベートした。その後、ニトロセルロースを、過酸化物を含有する溶液で発色させ、それによってヒトハプトグロビンを特異的に含有するタンパク質バンドのみを視覚化する。レーンは、異なる濃度のＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液（Ｔ０２０９００１）を含有する（レーン２−１：１０希釈、０．１ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ添加；レーン３−１：２０；レーン４−１：４０；レーン５−１：８０；レーン６−１：１６０；レーン７−１：３２０；レーン８−１：６４０；レーン９ １：１２８０；およびレーン１０−１：２５６０）。ウェスタンブロットは、Ｃａｐｔｏ Ｑ溶出液中に存在するバンドのほとんどがハプトグロビンであることを示唆している。It is the figure which showed the Western blot of Capto Q eluate in a 10% tris-glycine non-reduction SDS-PAGE electrophoresis gel (using the method described in FIG. 4). The separated protein is then transferred to a nitrocellulose membrane, blocking the membrane to prevent any non-specific binding of antibodies. The nitrocellulose membrane is then incubated with a solution containing an antibody against human haptoglobin (rabbit anti-human haptoglobin, Sigma H8636). The nitrocellulose membrane was then incubated with a secondary antibody (goat anti-rabbit HRP, Sigma A6154) conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Nitrocellulose is then developed with a solution containing peroxide, thereby visualizing only the protein band specifically containing human haptoglobin. Lanes contain different concentrations of Capto Q ImpRes eluate (T0209001) (lane 2-1: 10 dilution, 0.1 mg / mL, 20 μL addition; lanes 3-1: 20; lanes 4-1: 40; lanes 5-1: 80; lane 6-1: 160; lane 7-1: 320; lane 8-1: 640; lane 9 1: 1280; and lane 10-1: 2560). Western blots suggest that most of the bands present in the Capto Q eluate are haptoglobin. 本明細書で開示した精製方法における様々な工程後にイオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ）から回収されたトランスフェリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示した図である（図４で前述した方法を使用）。ピーク１（レーン４）は大量に添加されているが、純粋なトランスフェリンのように見える（レーン２、ヒトトランスフェリン、Ｓｉｇｍａ Ｔ８１５８と比較）。これは、オクチルセファロース洗浄画分からトランスフェリンを精製することが可能であることを示しており、同じ開始材料からヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを精製することが可能であることも意味する。FIG. 5 shows SDS-PAGE electrophoresis of transferrin recovered from ion exchange chromatography (Capto DEAE) after various steps in the purification method disclosed herein (using the method described above in FIG. 4). Peak 1 (lane 4) is added in large amounts, but looks like pure transferrin (compare lane 2, human transferrin, Sigma T8158). This indicates that transferrin can be purified from the octyl sepharose wash fraction, which also means that hemopexin, haptoglobin and transferrin can be purified from the same starting material. 本明細書で開示した精製方法におけるイオン交換クロマトグラフィーカラムからのトランスフェリン直線勾配のクロマトグラムを示した図である。１から４で標識したピークは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。It is the figure which showed the chromatogram of the transferrin linear gradient from the ion exchange chromatography column in the purification method disclosed by this specification. Peaks labeled with 1 to 4 were analyzed by SDS-PAGE in FIG. 本明細書で開示した１実施形態によるヘモペキシンの精製方法の流れ図である。2 is a flow diagram of a hemopexin purification method according to one embodiment disclosed herein. 本明細書で開示した１実施形態によるハプトグロビンの精製方法の流れ図である。2 is a flow diagram of a method for purifying haptoglobin according to one embodiment disclosed herein. 本明細書で開示した１実施形態によるハプトグロビン／ヘモペキシン／トランスフェリンを一緒に精製する方法の流れ図である。2 is a flow diagram of a method for purifying haptoglobin / hemopexin / transferrin together according to one embodiment disclosed herein.

本明細書を通じて、文脈で特に必要とされない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｍｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を含むが、いかなるその他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群も排除しないことを意味するものと理解されたい。   Throughout this specification, unless the context requires otherwise, variations such as the phrases “comprise” or “comprises” or “comprising” are used to describe the described element or integer or element. Alternatively, it should be understood to include a group of integers but not to exclude any other element or integer or group of elements or integers.

本明細書は、いかなる先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知のいかなる事項も参照するが、このような参照は、先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知の事項が、本明細書が関与する開発分野において共通の一般的知識の一部を構成するということを認識または承認または何らかの形態で示唆すると捉えられるものではなく、かつ捉えられるべきではない。   This specification refers to any prior publications (or information obtained from prior publications) or any known matter, but such references are referred to by prior publications (or information obtained from prior publications) or publicly known. Is not, and should not be construed, to be recognized or acknowledged or imply in any way that it constitutes part of common general knowledge in the field of development to which this description pertains.

本明細書で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確に記載していなければ、複数の態様を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「樹脂（ａ ｒｅｓｉｎ）」というと単一の樹脂、ならびに２種以上の樹脂を含み；「組成物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」というと単一の組成物ならびに２種以上の組成物を含む、などである。   It should be noted that as used herein, the singular forms “a”, “an”, and “the” include plural aspects unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a resin” includes a single resin, as well as two or more resins; “the composition” includes a single composition and two or more compositions. Including.

反対を示すものがない場合は、本明細書を通じて「％」含量という場合、％ｗ／ｗ（重量／重量）を意味するものと捉えられるべきである。例えば、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％である溶液は、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも９５％ｗ／ｗである組成物を意味するものと捉えられる。   If there is nothing to indicate the opposite, references to “%” content throughout this specification should be taken to mean% w / w (weight / weight). For example, a solution with a haptoglobin content of at least 95% of the total protein is taken to mean a composition with a haptoglobin content of at least 95% w / w of the total protein.

本発明は、少なくとも部分的には、ハプトグロビンおよびヘモペキシンは同じ開始材料から精製することができるという発見に基づいている。したがって、本発明の一態様では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって、
（ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
（ｉｉ）該溶液に硫酸アンモニウムを添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
（ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
（ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することを含む方法を提供する。 The present invention is based, at least in part, on the discovery that haptoglobin and hemopexin can be purified from the same starting material. Thus, in one aspect of the present invention, a method for purifying haptoglobin and hemopexin from a solution containing both proteins comprising:
(I) providing a solution containing both haptoglobin and hemopexin;
(Ii) precipitating haptoglobin from the solution by adding ammonium sulfate to the solution;
(Iii) separating the precipitated haptoglobin from the solution containing hemopexin; and (iv) separately purifying haptoglobin and / or hemopexin in one or more steps.

ハプトグロビン（Ｈｐ）は、成人肝臓によって合成され、血漿中に分泌されるテトラ鎖（α２β２）糖タンパク質である。Ｈｐのプロペプチドは、蛋白質分解によってα鎖およびβ鎖に切断される。Ｈｐタンパク質の２個のαサブユニットおよび２個のβサブユニットは次に、鎖間ジスルフィド結合によって結合して成熟ペプチドを形成し、（αβ）二量体または（αβ）多量体のいずれかになることができる。ヘモペキシン（Ｈｘ）は、４３９アミノ酸長の１本のペプチド鎖を含む６０−ｋＤ血漿β−１Ｂ−糖タンパク質で、ドメイン間リンカーによって結合した２個のドメインを形成する。いかなる特徴付けられたヘム結合タンパク質のヘムに対しても、知る限り最も高い親和性を有し（Ｋｄ＜１ｐＭ）、ドメイン間リンカーによって形成されたポケット内において、Ｈｘの２個のドメインの間で当モル比でヘムに結合する。 Haptoglobin (Hp) is a tetra-chain (α 2 β 2 ) glycoprotein that is synthesized by the adult liver and secreted into the plasma. The Hp propeptide is cleaved into α and β chains by proteolysis. The two α subunits and two β subunits of the Hp protein are then joined by interchain disulfide bonds to form a mature peptide, either as an (αβ) dimer or (αβ) multimer. Can be. Hemopexin (Hx) is a 60-kD plasma β-1B-glycoprotein containing a single peptide chain 439 amino acids long, forming two domains joined by an interdomain linker. It has the highest affinity known to any heme of any characterized heme-binding protein (Kd <1 pM), and within the pocket formed by the interdomain linker, between the two domains of Hx Binds to heme at an equimolar ratio.

本発明者らは、約２．０Ｍから約２．５Ｍの範囲、好ましくは約２．２Ｍから約２．５Ｍの範囲、より好ましくは約２．４Ｍの硫酸アンモニウム濃度が、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを発見した。したがって、一実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．０Ｍから約２．５Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。別の実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．２Ｍから約２．５Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、溶液に硫酸アンモニウム約２．４Ｍを添加することによって、溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。特定の実施形態では、硫酸アンモニウム濃度は、２．０Ｍまたは２．１Ｍまたは２．２Ｍまたは２．３Ｍまたは２．４Ｍまたは２．５Ｍである。   We have an ammonium sulfate concentration in the range of about 2.0M to about 2.5M, preferably in the range of about 2.2M to about 2.5M, more preferably about 2.4M, both proteins from the same starting material. Found to be optimal for isolating. Thus, in one embodiment, the method includes precipitating haptoglobin from the solution by adding from about 2.0 M to about 2.5 M ammonium sulfate to the solution. In another embodiment, the method comprises precipitating haptoglobin from the solution by adding about 2.2M to about 2.5M ammonium sulfate to the solution. In yet another embodiment, the method includes precipitating haptoglobin from the solution by adding about 2.4 M ammonium sulfate to the solution. In certain embodiments, the ammonium sulfate concentration is 2.0M or 2.1M or 2.2M or 2.3M or 2.4M or 2.5M.

本発明者らはまた、約８以下の範囲、好ましくは約６から約８、より好ましくは約７で維持されたｐＨが、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを示した。したがって、一実施形態では、この方法は、８以下のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。別の実施形態では、この方法は、約６から約８の範囲のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。さらに別の実施形態では、この方法は、約７のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。特定の実施形態では、この方法は、６．０から８．０、または６．２５から７．７５、または６．５から８．０、または６．５から７．７５、または６．５から７．５、または６．７５から７．２５、または６．７５から７．５の範囲のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む。ｐＨは典型的に、ハプトグロビンおよびヘモペキシン溶液において、次いで硫酸アンモニウム添加中およびハプトグロビンの沈殿中に測定する。必要ならば、ｐＨは調節することができる（典型的に、ｐＨの調節に使用した酸（例えば、ＨＣｌ）または塩基（例えば、ＮａＯＨ）の濃度は０．０５Ｍから０．６Ｍの範囲である）。   We have also shown that a pH maintained in the range of about 8 or less, preferably about 6 to about 8, more preferably about 7, is optimal for separating both proteins from the same starting material. It was. Thus, in one embodiment, the method includes precipitating haptoglobin from the solution at a pH of 8 or less. In another embodiment, the method comprises precipitating haptoglobin from the solution at a pH in the range of about 6 to about 8. In yet another embodiment, the method comprises precipitating haptoglobin from the solution at a pH of about 7. In certain embodiments, the method is from 6.0 to 8.0, or 6.25 to 7.75, or 6.5 to 8.0, or 6.5 to 7.75, or 6.5. Precipitating haptoglobin from the solution at a pH in the range of 7.5, or 6.75 to 7.25, or 6.75 to 7.5. The pH is typically measured in a haptoglobin and hemopexin solution, then during ammonium sulfate addition and during haptoglobin precipitation. If necessary, the pH can be adjusted (typically the concentration of acid (eg, HCl) or base (eg, NaOH) used to adjust the pH ranges from 0.05M to 0.6M). .

本明細書で開示した方法では、開始材料のハプトグロビンの大部分は、硫酸アンモニウム沈殿物内に見いだされ、開始材料からのヘモペキシンの大部分は残存する溶液（懸濁液とも呼ぶ）中に見いだされる。しかし、当業者であれば、沈殿物がいくらかのヘモペキシン（例えば、微量のＨｘ）を含むこともあり、残存する溶液（または懸濁液）がいくらかのハプトグロビン（例えば、微量のＨｐ）を含むこともあることを理解する。微量のＨｐおよびＨｘが懸濁液および沈殿物中それぞれに存在する場合、本明細書で開示した方法に従って、１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製することによってこれらを除去することが望ましい。しかし、当業者であれば、懸濁液および沈殿物中それぞれに存在し得る微量のＨｐおよびＨｘは、例えば、両タンパク質を結局同じ組成物中に入れる場合、許容することができることも理解する。   In the methods disclosed herein, most of the starting material haptoglobin is found in the ammonium sulfate precipitate, and most of the hemopexin from the starting material is found in the remaining solution (also called suspension). However, one of ordinary skill in the art will appreciate that the precipitate may contain some hemopexin (eg, trace Hx) and the remaining solution (or suspension) will contain some haptoglobin (eg, trace Hp). I understand that there are also. If traces of Hp and Hx are present in the suspension and precipitate, respectively, remove them by purifying haptoglobin and / or hemopexin separately in one or more steps according to the methods disclosed herein. It is desirable to do. However, those skilled in the art will also understand that traces of Hp and Hx that may be present in suspension and precipitate, respectively, can be tolerated, for example, if both proteins are eventually put into the same composition.

ハプトグロビンおよびヘモペキシン両方を含むいかなる溶液も、本明細書で開示した本発明の方法において開始材料として使用することができる。特定の実施形態では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液はさらに、トランスフェリンを含む。適切な開始材料は当業者には公知で、その例にはエタノール分画法から得られた様々な上清および沈殿物などの血漿画分が含まれる。このようなエタノール分画法の例には、コーン分画およびキストラーニッチェマン（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）分画が含まれる。適切な血漿画分の例には、コーン画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ＋ＩＩＩ、Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ（図１参照）または沈殿物ＡまたはＢなどのキストラーニッチェマン画分から得られた画分が含まれる。一実施形態では、溶液はヒト血漿画分である。別の実施形態では、溶液はコーン画分ＩＶである。さらに別の実施形態では、溶液はコーン画分ＩＶ４である。特定の実施形態では、コーン画分ＩＶ４はコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩまたはコーン画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩから得られる。特に好ましい実施形態では、溶液は画分ＩＶ４沈殿物から得られる。 Any solution containing both haptoglobin and hemopexin can be used as the starting material in the methods of the invention disclosed herein. In certain embodiments, the solution containing both haptoglobin and hemopexin further comprises transferrin. Suitable starting materials are known to those skilled in the art and examples include plasma fractions such as various supernatants and precipitates obtained from the ethanol fractionation method. Examples of such ethanol fractionation methods include corn fractionation and Kistler-Nitschmann fractionation. Examples of suitable plasma fractions include fractions obtained from corn fractions I, II, III, II + III, I + II + III, IV and V (see FIG. 1) or a Kistran Nichemann fraction such as precipitate A or B. Is included. In one embodiment, the solution is a human plasma fraction. In another embodiment, the solution is corn fraction IV. In yet another embodiment, the solution is Cohn fraction IV 4. In certain embodiments, corn fraction IV 4 is obtained from corn fraction II + III or corn fraction I + II + III. In a particularly preferred embodiment, the solution is obtained from fraction IV 4 precipitate.

開始材料が沈殿物（例えば、画分ＩＶ４沈殿物）として提供される場合、最初に沈殿物を再溶解して、本発明の方法のために適切な開始溶液を形成する必要があることがわかる。沈殿物を再溶解するために使用した緩衝剤は、ｐＨ約７で緩衝能力を有する任意の薬剤または薬剤の組み合わせであってもよい（例には、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＲＩＳを含めることができる）。典型的に、緩衝剤は、約５ｍＭから約１００ｍＭの濃度である。一実施形態では、再溶解緩衝液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７である。いくつかの実施形態では、再溶解緩衝液は、開始材料のグラム当たり約５から約３０グラムで添加することができる。特定の実施形態では、再溶解緩衝液は、開始材料のグラム当たり５から１０グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり１０から１５グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり１５から２０グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり２０から２５グラムで添加するか、または開始材料のグラム当たり２５から３０グラムで添加する。 If the starting material is provided as a precipitate (eg, fraction IV 4 precipitate), it may be necessary to first redissolve the precipitate to form a suitable starting solution for the method of the invention. Recognize. The buffer used to redissolve the precipitate may be any drug or combination of drugs having a buffer capacity at about pH 7 (for example, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, MOPS, BES , TRIS can be included). Typically, the buffering agent is at a concentration of about 5 mM to about 100 mM. In one embodiment, the redissolving buffer is 50 mM Tris, pH 7. In some embodiments, the redissolving buffer can be added at about 5 to about 30 grams per gram of starting material. In certain embodiments, the redissolution buffer is added at 5 to 10 grams per gram of starting material, or is added at 10 to 15 grams per gram of starting material, or 15 to 20 per gram of starting material. Add in grams, or add at 20 to 25 grams per gram of starting material, or add at 25 to 30 grams per gram of starting material.

本発明の方法は、ヘモペキシン、ハプトグロビン、場合によりトランスフェリンの商用／産業規模の精製のために適している。例えば、開始材料として血漿画分を使用する場合、本発明の方法を商用／産業規模で使用するには、少なくとも約５００ｋｇの血漿から得られた血漿画分を使用することが必要となり得る。より好ましくは、血漿画分は、バッチ当たり少なくとも約５，０００ｋｇ、７，５００ｋｇ、１０，０００ｋｇおよび／または１５，０００ｋｇの血漿から得られる。   The method of the present invention is suitable for commercial / industrial scale purification of hemopexin, haptoglobin and optionally transferrin. For example, when using a plasma fraction as the starting material, it may be necessary to use a plasma fraction obtained from at least about 500 kg of plasma to use the method of the present invention on a commercial / industrial scale. More preferably, the plasma fraction is obtained from at least about 5,000 kg, 7,500 kg, 10,000 kg and / or 15,000 kg plasma per batch.

当業者であれば、分画のための血漿は、抗凝固剤を含有する容器に収集した血液から細胞要素を分離した後残存する、またはアフェレーシス手法において抗凝固剤処理した血液の連続濾過または遠心など当業者に公知のその他の任意の適切な手段によって分離した血液の液体部分である。   A person skilled in the art is able to continuously filter or centrifuge blood for fractionation after separation of cellular components from blood collected in a container containing anticoagulant or anticoagulant-treated blood in an apheresis procedure. A liquid portion of blood separated by any other suitable means known to those skilled in the art.

一実施形態では、沈殿したハプトグロビンおよびヘモペキシンを含有する溶液を回収し、本発明によって、１回または複数の工程でハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを別々に精製する前に別々に保存する。別の実施形態では、沈殿したハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンを含有する溶液を回収し、すぐに本発明の方法によって；すなわち、１回または複数の工程におけるハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンの別々の精製によって、さらに精製工程を行う。   In one embodiment, a solution containing precipitated haptoglobin and hemopexin is collected and stored separately according to the present invention prior to separate purification of haptoglobin and / or hemopexin in one or more steps. In another embodiment, the solution containing precipitated haptoglobin and / or hemopexin is recovered and immediately by the method of the invention; i.e., by separate purification of haptoglobin and / or hemopexin in one or more steps. Perform the purification step.

したがって、一実施形態では、方法にはさらに：
（ｉ）ハプトグロビン溶液を得るために、沈殿したハプトグロビンを緩衝液に溶解すること；
（ｉｉ）ハプトグロビンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、ハプトグロビン溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉｉ）該樹脂からハプトグロビンを溶出すること；および
（ｉｖ）溶出したハプトグロビンを回収することが含まれる。 Thus, in one embodiment, the method further includes:
(I) dissolving the precipitated haptoglobin in a buffer to obtain a haptoglobin solution;
(Ii) passing a haptoglobin solution through the resin under conditions such that the haptoglobin binds to the anion exchange chromatography resin;
(Iii) eluting haptoglobin from the resin; and (iv) recovering the eluted haptoglobin.

特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。その他の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。   In certain embodiments, the anion exchange chromatography resin of step (ii) is a strong anion exchange chromatography resin. In other embodiments, the anion exchange chromatography resin of step (ii) is a weak anion exchange chromatography resin.

クロマトグラフィーによるタンパク質の精製は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＢｉｏ−Ｒａｄから市販されているものなどの軸流カラムを使用するか、またはＰｒｏｘｃｙｓもしくはＳｅｐｒａｇｅｎから市販されているものなどの放射流カラムを使用して実施することができる。クロマトグラフィーはまた、当業者に公知の膨張層技術を使用して実施することができる。   Chromatographic protein purification uses axial flow columns such as those commercially available from GE Healthcare, Pall Corporation, Millipore and Bio-Rad, or radial flow columns such as those commercially available from Proxcys or Sepragen. Can be used. Chromatography can also be performed using expanded bed techniques known to those skilled in the art.

ほとんどのクロマトグラフィー法は、本明細書では樹脂またはマトリクスと同義に称される固相支持体を使用する。適切な固相支持体は、当業者にはよく知られており、選択は精製する生成物の種類に左右される。適切な固相支持体の例には、ガラスおよびシリカゲルなどの無機担体、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、二機能性アクリル酸のビニルコポリマーおよび様々なヒドロキシル化単体などの合成もしくは天然に生じる有機担体などが含まれる。市販の担体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）、Ｃａｐｔｏ（商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）、ＧｉｇａＣａｐ（商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（商標）、Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標）、Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ（商標）およびＸＡＤ（商標）樹脂の名称で販売されている。   Most chromatographic methods use a solid support, referred to herein as synonymous with resin or matrix. Suitable solid supports are well known to those skilled in the art, and the choice depends on the type of product to be purified. Examples of suitable solid supports include synthetic or naturally occurring inorganic supports such as glass and silica gel, agarose, cellulose, dextran, polyamide, polyacrylamide, vinyl copolymers of bifunctional acrylic acid and various hydroxylated monomers. The resulting organic carrier and the like are included. Commercially available carriers are Sephadex (TM), Sepharose (TM), Hypercel (TM), Capto (TM), Fractogel (TM), MacroPrep (TM), Unosphere (TM), GigaCap (TM), Triacryl (TM), It is sold under the names Ultragel ™, Dynaspheres ™, Macrosorb ™ and XAD ™ resin.

クロマトグラフィー工程は一般的に、非変性条件下で、約−１０℃から＋３０℃の範囲の都合のよい温度で、より一般的にはおよそ周囲温度で実施する。クロマトグラフィー工程は、都合がよければ、バッチワイズまたは連続的に実施することができる。カラム、遠心、濾過、傾瀉などの都合のよい分離方法を使用することができる。   Chromatographic steps are generally performed under non-denaturing conditions at a convenient temperature in the range of about −10 ° C. to + 30 ° C., more typically at about ambient temperature. Chromatographic steps can be performed batchwise or continuously, if convenient. Any convenient separation method such as column, centrifugation, filtration, decanting can be used.

ハプトグロビン沈殿物を溶解するために適切な緩衝液は、当業者にはよく知られており、クロマトグラフィー精製工程を実施するために必要な条件に左右され得る。典型的に、緩衝液の緩衝剤（すなわち、トリス）の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭである。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭである。当業者はまた、緩衝液が複数の緩衝剤を含んでもよいことを認識する。適切な緩衝液の例は、ｐＨ範囲５．５から９．０の酢酸ナトリウムおよびトリスである。特定の実施形態では、７．５から９．０のｐＨを利用する。いくつかの実施形態では、ハプトグロビン沈殿物を溶解するために使用した緩衝液のｐＨは、ｐＨ７．５から９．０、またはｐＨ７．７５から９．０、またはｐＨ８．０から９．０、またはｐＨ８．２５から９．０、またはｐＨ８．４から８．６である。好ましい実施形態では、緩衝液はｐＨ約８．４からｐＨ約８．６のｐＨのトリス約５０ｍＭである。   Suitable buffers for dissolving the haptoglobin precipitate are well known to those skilled in the art and may depend on the conditions necessary to perform the chromatographic purification step. Typically, the buffer concentration (ie, Tris) in the buffer is about 5 mM to about 100 mM. In certain embodiments, the buffering agent is about 10 mM to about 60 mM. One skilled in the art will also recognize that the buffer may include multiple buffers. Examples of suitable buffers are sodium acetate and Tris in the pH range 5.5 to 9.0. Certain embodiments utilize a pH of 7.5 to 9.0. In some embodiments, the pH of the buffer used to dissolve the haptoglobin precipitate is pH 7.5 to 9.0, or pH 7.75 to 9.0, or pH 8.0 to 9.0, or pH 8.25 to 9.0, or pH 8.4 to 8.6. In a preferred embodiment, the buffer is about 50 mM Tris at a pH of about 8.4 to about 8.6.

実施形態では、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物（すなわち、ハプトグロビン溶液）の脂質含量は、脂質を脂質除去剤に結合させる条件下で、脂質除去剤に曝露させることによって低下する。このような脂質除去剤の例には、エアロジルなどのフュームドシリカが含まれる。一実施形態では、脂質除去剤はフュームドシリカである。一実施形態では、フュームドシリカはエアロジル（例えば、エアロジル３８０）である。実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、血漿同等物１リットル当たりハプトグロビン約０．５ｇから約４ｇを含む沈殿抽出物に添加することができる。特定の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１から２ｇで添加する。別の実施形態では、フュームドシリカ（例えば、エアロジル）などの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む抽出した沈殿物に血漿同等物１リットル当たり１．６から１．８ｇで添加する。別の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１．８から２．０ｇで添加する。別の実施形態では、エアロジルなどの脂質除去剤は、ハプトグロビンを含む沈殿抽出物に血漿同等物１リットル当たり１．６ｇで添加する。脂質除去は、特定のｐＨ範囲で最も効果的であることが測定された。ｐＨ範囲５．５から９．０が、エアロジルと併用して効果的であることが見いだされた。いくつかの実施形態では、ｐＨ範囲は６．５から８．６である。その他の実施形態では、脂質除去工程中のｐＨは、ｐＨ５．５から９．０、またはｐＨ５．７５から９．０、またはｐＨ６．０から９．０、またはｐＨ６．２５から９．０、またはｐＨ６．５から９．０、またはｐＨ６．７５から９．０、またはｐＨ７．０から９．０、またはｐＨ７．２５から９．０、またはｐＨ７．５から９．０、またはｐＨ７．７５から９．０、またはｐＨ８．０から９．０、またはｐＨ８．２５から９．０、またはｐＨ８．４から９．０、またはｐＨ８．６から９．０である。好ましい実施形態では、ｐＨ範囲８．４から８．６を利用する。   In embodiments, the lipid content of a precipitated extract containing haptoglobin (ie, a haptoglobin solution) is reduced by exposure to the lipid removal agent under conditions that allow the lipid to bind to the lipid removal agent. Examples of such lipid removal agents include fumed silica such as aerosil. In one embodiment, the lipid removal agent is fumed silica. In one embodiment, the fumed silica is aerosil (eg, Aerosil 380). In an embodiment, a lipid removal agent such as Aerosil can be added to a precipitated extract containing from about 0.5 g to about 4 g of haptoglobin per liter of plasma equivalent. In certain embodiments, a lipid removal agent such as aerosil is added to the precipitated extract containing haptoglobin at 1 to 2 g per liter of plasma equivalent. In another embodiment, a lipid removal agent such as fumed silica (eg, Aerosil) is added to the extracted precipitate containing haptoglobin at 1.6 to 1.8 g per liter of plasma equivalent. In another embodiment, a lipid removal agent such as Aerosil is added to the precipitated extract containing haptoglobin at 1.8 to 2.0 g per liter of plasma equivalent. In another embodiment, a lipid removal agent such as Aerosil is added to the precipitated extract containing haptoglobin at 1.6 g per liter of plasma equivalent. Lipid removal has been determined to be most effective over a specific pH range. A pH range of 5.5 to 9.0 has been found to be effective in combination with Aerosil. In some embodiments, the pH range is 6.5 to 8.6. In other embodiments, the pH during the lipid removal step is from pH 5.5 to 9.0, or pH 5.75 to 9.0, or pH 6.0 to 9.0, or pH 6.25 to 9.0, or pH 6.5 to 9.0, or pH 6.75 to 9.0, or pH 7.0 to 9.0, or pH 7.25 to 9.0, or pH 7.5 to 9.0, or pH 7.75 to 9 0.0, or pH 8.0 to 9.0, or pH 8.25 to 9.0, or pH 8.4 to 9.0, or pH 8.6 to 9.0. A preferred embodiment utilizes a pH range of 8.4 to 8.6.

脂質除去剤は、濾過およびまたは遠心などの方法を使用して除去することができる。特定の実施形態では、脂質除去剤は、深層濾過によって除去する。本出願で使用するための深層フィルターの一例は、Ｃｕｎｏ ７０ＣＡフィルター、または類似のもしくはより小さい粒径保持能力のフィルターである。   The lipid removal agent can be removed using methods such as filtration and / or centrifugation. In certain embodiments, the lipid removal agent is removed by depth filtration. An example of a depth filter for use in the present application is a Cuno 70CA filter, or a filter with similar or smaller particle size retention capability.

当業者であれば、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、溶液中のいくらかの不純物は樹脂を通過させる一方、ハプトグロビンがクロマトグラフィー樹脂に結合できる限り、ハプトグロビン溶液からハプトグロビンを別々に精製するために使用することができることを理解する。特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換樹脂である。その他の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換樹脂である。当業者であればまた、抽出緩衝液のイオン強度および添加溶液のその後のｐＨ調節によって、ハプトグロビンを樹脂に結合させるために、希釈、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィーによる脱塩、または緩衝液交換／イオン強度低下のその他の方法が必要となることを決定する。適切な樹脂は、当業者には公知である。適切な陰イオン交換樹脂の例は、機能的４級アミン基（Ｑ）および／またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含む樹脂である。一実施形態では、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、機能的４級アミン基（例えば、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（商標））が含まれる。   A person skilled in the art uses anion exchange chromatography resins to purify haptoglobin separately from a haptoglobin solution as long as some impurities in the solution can pass through the resin while haptoglobin can bind to the chromatography resin. Understand that you can. In certain embodiments, the anion exchange chromatography resin is a strong anion exchange resin. In other embodiments, the anion exchange chromatography resin is a weak anion exchange resin. One skilled in the art can also use dilution, diafiltration, desalting by chromatography, or buffer exchange / to bind the haptoglobin to the resin by ionic strength of the extraction buffer and subsequent pH adjustment of the added solution. Determine that other methods of ionic strength reduction are required. Suitable resins are known to those skilled in the art. Examples of suitable anion exchange resins are resins that contain functional quaternary amine groups (Q) and / or diethylaminopropyl groups (ANX). In one embodiment, the strong anion exchange chromatography resin includes a functional quaternary amine group (eg, Capto Q ImpRes ™).

クロマトグラフィー媒体の平衡化に適切な溶液（平衡化緩衝液と呼ばれることも多い）の緩衝剤の濃度は通常、約５ｍＭから約１００ｍＭである。平衡化緩衝液のｐＨは通例、約５から約９の範囲で、伝導率は典型的に約９ｍＳ／ｃｍ未満である。これらの条件は一般的に、ハプトグロビンを陰イオン交換媒体に結合させる。特定の実施形態では、緩衝剤の濃度範囲は、約１０ｍＭから約６０ｍＭである。特定の実施形態での平衡化緩衝液のｐＨは、約５．０から約９．０のｐＨ範囲である。いくつかの実施形態では、ｐＨは約５．０から約７．０、または約５．０から約６．０、または約５．３から約５．７の範囲である。特定の実施形態では、平衡化緩衝液のｐＨは、ｐＨ５．３±０．１、またはｐＨ５．４±０．１、またはｐＨ５．５±０．１、またはｐＨ５．６±０．１、またはｐＨ５．７±０．１、またはｐＨ５．８±０．１である。いくつかの実施形態での平衡化緩衝液の伝導率は、約７．０ｍＳ／ｃｍ未満である。特定の実施形態では、平衡化緩衝液の伝導率は、６．０ｍＳ／ｃｍ未満または５．０ｍＳ／ｃｍ未満である。平衡化緩衝液のための緩衝剤の一例は、酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０、伝導率６．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態は、ｐＨ約５から約６の酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。特定の実施形態では、平衡化緩衝液には、ｐＨ範囲ｐＨ５．３からｐＨ５．７、伝導率５．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭが含まれる。   The concentration of the buffer in a solution suitable for equilibration of the chromatographic medium (sometimes referred to as equilibration buffer) is typically about 5 mM to about 100 mM. The pH of the equilibration buffer is typically in the range of about 5 to about 9, and the conductivity is typically less than about 9 mS / cm. These conditions generally cause haptoglobin to bind to the anion exchange medium. In certain embodiments, the buffer concentration range is from about 10 mM to about 60 mM. The pH of the equilibration buffer in certain embodiments is in the pH range of about 5.0 to about 9.0. In some embodiments, the pH ranges from about 5.0 to about 7.0, or from about 5.0 to about 6.0, or from about 5.3 to about 5.7. In certain embodiments, the pH of the equilibration buffer is pH 5.3 ± 0.1, or pH 5.4 ± 0.1, or pH 5.5 ± 0.1, or pH 5.6 ± 0.1, or The pH is 5.7 ± 0.1 or pH 5.8 ± 0.1. The conductivity of the equilibration buffer in some embodiments is less than about 7.0 mS / cm. In certain embodiments, the conductivity of the equilibration buffer is less than 6.0 mS / cm or less than 5.0 mS / cm. An example of a buffer for the equilibration buffer is sodium acetate. Certain embodiments utilize 50 mM sodium acetate having a pH range of 5.0 to 6.0 and a conductivity of less than 6.0 mS / cm. Other embodiments utilize about 10 to about 40 mM sodium acetate at a pH of about 5 to about 6. In a particular embodiment, the equilibration buffer comprises 50 mM sodium acetate with a pH range of pH 5.3 to pH 5.7 and a conductivity of less than 5.0 mS / cm.

陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過するハプトグロビン溶液は、樹脂に結合させるために、イオン強度を低下させるため、最初に緩衝液の交換、脱塩または希釈を必要とすることがある。緩衝液の交換、脱塩または希釈のために適切な溶液には、約５ｍから約１００ｍＭの濃度の緩衝剤を有する溶液が含まれる。これらの溶液のｐＨ範囲は、典型的にｐＨ約５から約９の範囲である。一方、伝導率は通常、約８．０ｍＳ／ｃｍ未満である。特定の実施形態では、緩衝液の交換、脱塩または希釈のための溶液には、ｐＨ範囲約５から約９で、伝導率約７．０ｍＳ／ｃｍ未満の約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲の緩衝剤が含まれる。緩衝液の交換、脱塩または希釈のための溶液の一例は、酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０、伝導率６．０ｍＳ／ｃｍ未満の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態は、ｐＨ約５から約６の酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。   A haptoglobin solution that passes through an anion exchange chromatography resin may require an initial buffer exchange, desalting or dilution to reduce ionic strength in order to bind to the resin. Suitable solutions for buffer exchange, desalting or dilution include solutions having a buffering agent concentration of about 5 m to about 100 mM. The pH range of these solutions is typically in the range of about pH 5 to about 9. On the other hand, the conductivity is usually less than about 8.0 mS / cm. In certain embodiments, the solution for buffer exchange, desalting or dilution includes a buffer in the range of about 10 mM to about 60 mM with a pH range of about 5 to about 9 and a conductivity of less than about 7.0 mS / cm. Agent is included. An example of a solution for buffer exchange, desalting or dilution is sodium acetate. Certain embodiments utilize 50 mM sodium acetate having a pH range of 5.0 to 6.0 and a conductivity of less than 6.0 mS / cm. Other embodiments utilize about 10 to about 40 mM sodium acetate at a pH of about 5 to about 6.

その他の実施形態には、イオン強度を低下させるために水（注射用水（ＷＦＩ）など）を添加することによるハプトグロビン添加溶液の希釈が含まれる。例えば、ＷＦＩによって１：４から１：５に希釈すると、ｐＨ５．３〜５．７の酢酸ナトリウム５０ｍＭを含むハプトグロビン溶液の最終的な酢酸ナトリウム濃度は約１０〜１３ｍＭ、ｐＨは５．３から５．７、伝導率は５．０ｍＳ／ｃｍ未満である。これは一般的に、ハプトグロビンを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させる。   Other embodiments include diluting the haptoglobin added solution by adding water (such as water for injection (WFI)) to reduce ionic strength. For example, when diluted from 1: 4 to 1: 5 by WFI, the final sodium acetate concentration of a haptoglobin solution containing 50 mM sodium acetate at pH 5.3-5.7 is about 10-13 mM and the pH is 5.3-5. .7, conductivity is less than 5.0 mS / cm. This generally binds haptoglobin to an anion exchange chromatography resin.

ハプトグロビン溶液において緩衝剤（複数）の緩衝範囲を超えるｐＨ調節が必要な場合、緩衝剤をさらにハプトグロビン溶液に添加することができる。添加する緩衝剤は典型的に、濃度が約５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ範囲が約５から約９である。特定の実施形態では、添加する緩衝剤は約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲で、ｐＨ範囲は約５から約９である。添加する緩衝剤の一例は酢酸ナトリウムである。特定の実施形態では、ｐＨ範囲５．０から６．０の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。好ましい実施形態では、緩衝液はｐＨ５．３からｐＨ５．７の範囲のｐＨの酢酸ナトリウム５０ｍＭである。   If pH adjustment beyond the buffering range of the buffer (s) is required in the haptoglobin solution, the buffer can be further added to the haptoglobin solution. The added buffer typically has a concentration of about 5 mM to about 100 mM and a pH range of about 5 to about 9. In certain embodiments, the buffering agent added is in the range of about 10 mM to about 60 mM and the pH range is about 5 to about 9. An example of a buffer added is sodium acetate. Certain embodiments utilize 50 mM sodium acetate in the pH range 5.0 to 6.0. In a preferred embodiment, the buffer is 50 mM sodium acetate at a pH ranging from pH 5.3 to pH 5.7.

樹脂からハプトグロビンを溶出するために適切な緩衝液はまた、当業者には公知である。特定の実施形態では、適切な緩衝剤の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭの範囲である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲である。一例には酢酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、ｐＨ５．０から６．０の酢酸ナトリウム５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、約５．０から約６．０のｐＨの酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。好ましい実施形態では、緩衝液は約ｐＨ５．３から約ｐＨ５．７のｐＨの酢酸ナトリウム約５０ｍＭである。   Suitable buffers for eluting haptoglobin from the resin are also known to those skilled in the art. In certain embodiments, suitable buffering agent concentrations range from about 5 mM to about 100 mM. In certain embodiments, the buffering agent ranges from about 10 mM to about 60 mM. An example includes sodium acetate. In certain embodiments, 50 mM sodium acetate at pH 5.0 to 6.0 is utilized. Other embodiments utilize about 10 to about 40 mM sodium acetate at a pH of about 5.0 to about 6.0. In a preferred embodiment, the buffer is about 50 mM sodium acetate at a pH of about pH 5.3 to about pH 5.7.

さらなる実施形態では、ハプトグロビンはＮａＣｌ約１００ｍＭから約２００ｍＭを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出する。これは、伝導率範囲約１０ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌ １００ｍＭ）から約１８ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌ ２００ｍＭ）の溶出緩衝液と同等と見なされる。特定の実施形態では、ハプトグロビンは、ＮａＣｌ約１５０ｍＭから約１７０ｍＭの存在下で溶出する。好ましい実施形態では、ハプトグロビンは、ＮａＣｌ約１６０ｍＭの存在下で溶出する。しかし、当業者であれば、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度はカラムに加えたタンパク質添加に左右され、樹脂から溶出したハプトグロビンの必要な回収率および純度を実現するためには、記載した限界を超える調節が必要とされ得ることを知っている。   In a further embodiment, the haptoglobin is eluted from the anion exchange resin with an elution buffer comprising about 100 mM to about 200 mM NaCl. This is considered equivalent to an elution buffer with a conductivity range of about 10 mS / cm (NaCl 100 mM) to about 18 mS / cm (NaCl 200 mM). In certain embodiments, haptoglobin elutes in the presence of about 150 mM to about 170 mM NaCl. In a preferred embodiment, haptoglobin elutes in the presence of about 160 mM NaCl. However, those skilled in the art will appreciate that the NaCl concentration of the elution buffer depends on the addition of protein added to the column, and in order to achieve the required recovery and purity of haptoglobin eluted from the resin, adjustments that exceed the stated limits. Know that you can get needed.

一実施形態では、溶出したハプトグロビンを回収し、将来使用するために別々に保存する。別の実施形態では、溶出したハプトグロビンは、必要ならば、例えば、溶出したハプトグロビンの限外濾過膜による濃縮およびダイアフィルトレーション、ならびに／または濃縮および／もしくはダイアフィルトレーションしたハプトグロビンの滅菌濾過によって、さらに精製する。   In one embodiment, the eluted haptoglobin is collected and stored separately for future use. In another embodiment, the eluted haptoglobin is obtained, if necessary, by, for example, concentration and diafiltration of the eluted haptoglobin with an ultrafiltration membrane and / or sterile filtration of the concentrated and / or diafiltered haptoglobin. Further purification.

一実施形態では、本発明はさらに：
（ｉ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からの流出画分を収集すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）の後、および／または工程（ｉｉｉ）の後で該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
（ｖ）溶出したヘモペキシンを回収することを含む。 In one embodiment, the present invention further includes:
(I) passing a solution containing hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the hydrophobic interaction chromatography resin;
(Ii) collecting the effluent fraction from step (i);
(Iii) optionally washing the resin after step (ii) and collecting the effluent wash fraction;
(Iv) eluting hemopexin from the resin after step (ii) and / or after step (iii); and (v) recovering the eluted hemopexin.

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、定常相と分離するタンパク質との間の疎水性相互作用に基づいて、タンパク質を分離するためにしばしば使用されるクロマトグラフィー技術である。標的タンパク質の疎水性のレベルによって、使用するＨＩＣ樹脂の種類が決まることが多い。ＨＩＣの間、典型的に大量の塩を溶液に添加して、標的タンパク質の溶解性を低下させ、したがって標的タンパク質と適切な疎水性基（例えば、フェニル、ブチルおよびオクタデシル基）で機能化したＨＩＣ樹脂との間の相互作用を増加させる。適切な塩には典型的に、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウムおよびチオシアン酸ナトリウムが含まれる。適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、当業者にはよく知られている。例には、オクチルセファロースおよびカプトオクチルクロマトグラフィー樹脂が含まれる。ヘモペキシンを樹脂に結合させる条件は、当業者には公知で、例えば、使用する樹脂の種類および標的タンパク質（すなわち、ヘモペキシン）の疎水性によって決まる。   Hydrophobic interaction chromatography (HIC) is a chromatographic technique often used to separate proteins based on hydrophobic interactions between the stationary phase and the separating protein. The type of HIC resin used is often determined by the level of hydrophobicity of the target protein. During HIC, typically a large amount of salt is added to the solution to reduce the solubility of the target protein and thus functionalized with the target protein and appropriate hydrophobic groups (eg, phenyl, butyl and octadecyl groups) Increase the interaction between the resins. Suitable salts typically include sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium chloride, sodium bromide and sodium thiocyanate. Suitable hydrophobic interaction chromatography resins are well known to those skilled in the art. Examples include octyl sepharose and captooctyl chromatography resins. Conditions for binding hemopexin to the resin are known to those skilled in the art and depend, for example, on the type of resin used and the hydrophobicity of the target protein (ie, hemopexin).

ヘモペキシン添加溶液は、硫酸アンモニウムを含有し、したがってカラムの平衡化に適切な緩衝液には、ｐＨを約６から約８に維持し、硫酸アンモニウム約２から２．５Ｍを含有する約５ｍＭから約１００ｍＭの濃度の緩衝剤が含まれる。これらの条件によって、ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体に結合させる。別の実施形態では、硫酸アンモニウム濃度２．２から２．５Ｍ、ｐＨ７．０から８．０を利用する。特定の実施形態では、緩衝溶液は硫酸アンモニウム２．５Ｍを含有し、ｐＨ７．４のトリス５０ｍＭである。   The hemopexin addition solution contains ammonium sulfate, and therefore a buffer suitable for equilibration of the column maintains a pH of about 6 to about 8 and contains about 2 to 2.5 M ammonium sulfate about 5 mM to about 100 mM. Concentration buffer is included. These conditions allow hemopexin to bind to the hydrophobic interaction chromatography media. In another embodiment, an ammonium sulfate concentration of 2.2 to 2.5M, pH 7.0 to 8.0 is utilized. In a particular embodiment, the buffer solution contains 2.5 M ammonium sulfate and is 50 mM Tris pH 7.4.

ヘモペキシン添加溶液は典型的に、ｐＨ約６から約８に緩衝された硫酸アンモニウム約２．０から約２．５Ｍを含有する。これらの条件によって、ヘモペキシンを疎水性相互作用媒体に結合させる。別の実施形態では、ヘモペキシン添加溶液は、ｐＨ７．０から８．０に緩衝された硫酸アンモニウム２．２Ｍから２．５Ｍを含有した。特定の実施形態では、ヘモペキシン添加溶液は、緩衝剤としてトリス５０ｍＭ、および硫酸アンモニウム２．５Ｍを含有し、ｐＨ７．４である。   The hemopexin addition solution typically contains about 2.0 to about 2.5 M ammonium sulfate buffered to a pH of about 6 to about 8. These conditions allow hemopexin to bind to the hydrophobic interaction medium. In another embodiment, the hemopexin addition solution contained 2.2M to 2.5M ammonium sulfate buffered to pH 7.0 to 8.0. In a specific embodiment, the hemopexin addition solution contains Tris 50 mM as a buffer and 2.5 M ammonium sulfate and has a pH of 7.4.

ヘモペキシンを含有する溶液が一旦疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を通過したら、本明細書で開示したように、流出画分を収集し、将来使用するために保存することができる。   Once the solution containing hemopexin has passed through a hydrophobic interaction chromatography (HIC) resin, the effluent fraction can be collected and stored for future use as disclosed herein.

結合したヘモペキシンは、当業者に公知の手段によって樹脂から溶出することができる。樹脂からヘモペキシンを溶出する前に、樹脂を適切な洗浄液または緩衝液で、樹脂に結合したヘモペキシンを保持する条件下で場合により洗浄することができる。適切な洗浄液および条件は、当業者には公知である。洗浄液濃度は、ある程度カラム添加に左右されるが、典型的な洗浄液は、ｐＨ約６から約８で緩衝効果を有し、さらに硫酸アンモニウム約０．８Ｍから１．５Ｍを含有する。別の実施形態では、洗浄液は、ｐＨ７．０から８．０で硫酸アンモニウム０．９Ｍから１．３Ｍを含有する。特定の実施形態では、洗浄液は、緩衝剤としてトリス５０ｍＭ、および硫酸アンモニウム１．１３Ｍを含有し、ｐＨ７．４である。必要ならば、流出洗浄画分も収集し、将来使用するために保存することができる。   Bound hemopexin can be eluted from the resin by means known to those skilled in the art. Prior to eluting hemopexin from the resin, the resin can optionally be washed with a suitable wash or buffer under conditions that retain the hemopexin bound to the resin. Appropriate cleaning solutions and conditions are known to those skilled in the art. Wash solution concentration depends to some extent on column addition, but typical wash solutions have a buffering effect at a pH of about 6 to about 8 and further contain about 0.8M to 1.5M ammonium sulfate. In another embodiment, the wash solution contains 0.9M to 1.3M ammonium sulfate at pH 7.0 to 8.0. In certain embodiments, the wash solution contains Tris 50 mM as a buffer, and ammonium sulfate 1.13 M, and has a pH of 7.4. If necessary, the effluent wash fraction can also be collected and stored for future use.

樹脂から回収した溶出ヘモペキシンは、将来使用するために保存することができる。溶出したヘモペキシンはまた、溶出液中のいかなる不純物も除去するために、さらに精製を行ってもよい。したがって、一実施形態では、方法にはさらに：
（ｉ）ヘモペキシンを金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、溶出ヘモペキシンを該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
（ｉｉｉ）溶出したヘモペキシンを回収することが含まれる。 The eluted hemopexin recovered from the resin can be stored for future use. The eluted hemopexin may also be further purified to remove any impurities in the eluate. Thus, in one embodiment, the method further includes:
(I) passing the eluted hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the metal ion affinity chromatography resin;
(Ii) eluting hemopexin from the resin; and (iii) recovering the eluted hemopexin.

固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、アミノ酸（例えば、ヒスチジン）の金属への共有結合に基づいており、金属イオンに親和性を有するタンパク質を亜鉛、コバルト、ニッケルまたは銅などの固定された金属イオンを含有するカラムに保持させる。適切な金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。一実施形態では、金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂はＮｉ−セファロースである。   Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is based on the covalent binding of an amino acid (eg, histidine) to a metal, and a protein having an affinity for the metal ion is immobilized, such as zinc, cobalt, nickel or copper. Is held in a column containing the formed metal ions. Suitable metal ion affinity chromatography resins are known to those skilled in the art. In one embodiment, the metal ion affinity chromatography resin is Ni-Sepharose.

平衡化および結合のために適切な緩衝液は、クロマトグラフィー媒体への非特異的結合を防御するように設計し、混入タンパク質の結合を最小限に抑えながらヘモペキシンへの親和性を促進するために最適化する。平衡化および結合のために使用した緩衝液は全般的に、約６から約９のｐＨ範囲内であり、少量（すなわち、１から５０ｍＭ）のヒスチジンまたはイミダゾールの添加と共に塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍの添加を含む。ある種の実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム０．５ｍＭから１００ｍＭ、ｐＨ約７から約８、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約１ｍＭから約５０ｍＭからなる。特定の実施形態では、平衡化および結合緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。添加溶液（オクチル溶出液）は、所望する固形賦形剤を添加するか、または濃縮した溶液を添加することによって、これらの濃度に調節することができる。   Appropriate buffers for equilibration and binding are designed to protect against non-specific binding to chromatographic media and to promote affinity for hemopexin while minimizing the binding of contaminating proteins Optimize. The buffers used for equilibration and binding are generally in the pH range of about 6 to about 9, and from about 0.5 M sodium chloride with the addition of a small amount (ie 1 to 50 mM) histidine or imidazole. Contains about 1.0M addition. In certain embodiments, the buffer consists of sodium phosphate 0.5 mM to 100 mM, pH about 7 to about 8, sodium chloride about 0.5 M to about 1.0 M, and imidazole about 1 mM to about 50 mM. In certain embodiments, the equilibration and binding buffer consists of sodium phosphate 20 mM, NaCl 0.5 M and imidazole 30 mM, pH 7.4. The additive solution (octyl eluate) can be adjusted to these concentrations by adding the desired solid excipient or by adding a concentrated solution.

一旦、ヘモペキシンが金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂に結合したら、樹脂に結合したヘモペキシンを保持する条件下で、残存する未結合のまたは弱く結合した不純物を除去するために樹脂を洗浄することができる。洗浄工程に適切な緩衝液は、６．０から９．０のｐＨ範囲内であり、少量（すなわち、１から５０ｍＭ）のヒスチジンまたはイミダゾールの添加と共に塩化ナトリウム０．５Ｍから１．０Ｍの添加を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ約７からｐＨ約８、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約１ｍＭから約８０ｍＭからなる。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。   Once hemopexin is bound to the metal ion affinity chromatography (IMAC) resin, the resin is washed to remove any remaining unbound or weakly bound impurities under conditions that retain the hemopexin bound to the resin. Can do. Suitable buffers for the washing step are in the pH range of 6.0 to 9.0, with addition of 0.5M to 1.0M sodium chloride with the addition of a small amount (ie 1 to 50 mM) histidine or imidazole. Including. In some embodiments, the buffer comprises sodium phosphate from about 0.5 mM to about 100 mM, pH from about 7 to pH about 8, sodium chloride from about 0.5 M to about 1.0 M, and imidazole from about 1 mM to about 80 mM. . In a particular embodiment, the wash buffer consists of 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, and 30 mM imidazole, pH 7.4.

結合したヘモペキシンは、当業者に公知の手段によって樹脂から溶出することができる。溶出に適切な緩衝液は、約６から約９のｐＨ範囲内であり、溶出を容易にするために十分高い濃度のヒスチジンまたはイミダゾールと共に塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍの添加を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ約７．０から約ｐＨ８．０、塩化ナトリウム約０．５Ｍから約１．０Ｍおよびイミダゾール約８０ｍＭ未満からなる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍおよびイミダゾール１００ｍＭ、ｐＨ７．４からなる。あるいは、結合したヘモペキシンは、ｐＨ約４．０からｐＨ約６．０の間の低ｐＨ緩衝液を加えることによって溶出することができる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液として、ＮａＣｌ約０．５Ｍから約１．０Ｍを含み、ｐＨが約４．０から約ｐＨ６．０の間の約５ｍＭから約１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を利用する。溶出したヘモペキシンは、必要ならば、例えば、限外濾過膜によるヘモペキシンの濃縮およびダイアフィルトレーションならびに／または濃縮および／またはダイアフィルトレーションしたヘモペキシンの滅菌濾過によって、さらに精製することができる。   Bound hemopexin can be eluted from the resin by means known to those skilled in the art. Suitable buffers for elution are in the pH range of about 6 to about 9, including the addition of about 0.5M to about 1.0M sodium chloride with a sufficiently high concentration of histidine or imidazole to facilitate elution. . In some embodiments, the elution buffer is about 0.5 mM to about 100 mM sodium phosphate, pH about 7.0 to about pH 8.0, about 0.5 M to about 1.0 M sodium chloride and less than about 80 mM imidazole. Consists of. In a specific embodiment, the elution buffer consists of 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, and 100 mM imidazole, pH 7.4. Alternatively, bound hemopexin can be eluted by adding a low pH buffer solution between pH about 4.0 and pH about 6.0. In some embodiments, the elution buffer comprises about 5 mM to about 100 mM sodium acetate buffer comprising about 0.5 M to about 1.0 M NaCl and having a pH between about 4.0 to about pH 6.0. Use. The eluted hemopexin can be further purified if necessary, for example, by concentration and diafiltration of hemopexin through an ultrafiltration membrane and / or sterile filtration of the concentrated and / or diafiltered hemopexin.

本発明者らはまた、開始材料中に存在することがあるトランスフェリンが、硫酸アンモニウムの存在下でのハプトグロビンの沈殿後に、溶液中（すなわち、ヘモペキシンを含む溶液中）に残存することを見いだした。したがって、本明細書で開示した本発明の方法はまた、同じ開始材料からトランスフェリンを精製するために使用することができる。したがって、３種類のタンパク質（Ｈｐ、Ｈｘおよびトランスフェリン）全てを同じ開始材料から精製するために最適な条件を提供する。したがって、一実施形態では、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方（例えば、開始材料）を含有する溶液はさらに、トランスフェリンを含む。   We have also found that transferrin, which may be present in the starting material, remains in solution (ie, in a solution containing hemopexin) after precipitation of haptoglobin in the presence of ammonium sulfate. Thus, the inventive methods disclosed herein can also be used to purify transferrin from the same starting material. Thus, it provides optimal conditions for purifying all three proteins (Hp, Hx and transferrin) from the same starting material. Thus, in one embodiment, the solution containing both haptoglobin and hemopexin (eg, starting material) further comprises transferrin.

一実施形態では、本発明はさらに：
（ａ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｂ）工程（ａ）からの流出画分を収集すること；
（ｃ）工程（ｂ）の後で場合により樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
（ｄ）トランスフェリンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、工程（ｂ）からの流出画分および／または工程（ｃ）からの流出洗浄画分を該樹脂に通過させること；ならびに
（ｅ）該樹脂からトランスフェリンを回収することを含む。 In one embodiment, the present invention further includes:
(A) passing the solution containing hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the hydrophobic interaction chromatography resin;
(B) collecting the effluent fraction from step (a);
(C) optionally washing the resin after step (b) and collecting the effluent wash fraction;
(D) passing the effluent fraction from step (b) and / or the effluent wash fraction from step (c) through the resin under conditions such that transferrin binds to the anion exchange chromatography resin; And (e) recovering transferrin from the resin.

特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。その他の特定の実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。   In certain embodiments, the anion exchange chromatography resin of step (ii) is a strong anion exchange chromatography resin. In other specific embodiments, the anion exchange chromatography resin of step (ii) is a weak anion exchange chromatography resin.

適切な強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。適切な陰イオン交換樹脂の例は、機能的４級アミン基（Ｑ）および／またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含む樹脂である。一実施形態では、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、４級アミン官能基（例えば、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（商標））が含まれる。   Suitable strong anion exchange chromatography resins are known to those skilled in the art. Examples of suitable anion exchange resins are resins that contain functional quaternary amine groups (Q) and / or diethylaminopropyl groups (ANX). In one embodiment, the strong anion exchange chromatography resin includes a quaternary amine functional group (eg, Capto Q ImpRes ™).

適切な弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、当業者には公知である。例には、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）などの３級または２級アミン官能基を含む樹脂が含まれる。   Suitable weak anion exchange chromatography resins are known to those skilled in the art. Examples include resins containing tertiary or secondary amine functional groups such as DEAE (diethylaminoethyl).

当業者であればまた、ＨＩＣ洗浄画分のイオン強度によって；トランスフェリンを陰イオン交換樹脂に結合させるために、希釈、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィーによる脱塩、または緩衝液交換／イオン強度低下のその他の方法が必要であることを決定する。クロマトグラフィーによる脱塩のこのような１方法には、硫酸アンモニウム約０．８Ｍから約１．５Ｍを含有するＨＩＣ洗浄画分（トランスフェリン）を、フェニルまたはブチルカラムなどのより強い疎水性リガンドに直接結合させることが含まれる。一旦結合したら、トランスフェリンは、ＷＦＩまたは陰イオン交換クロマトグラフィー用に調製した低イオン強度緩衝液で溶出することができる。   The person skilled in the art can also determine the ionic strength of the HIC wash fraction; dilution, diafiltration, chromatographic desalting, or buffer exchange / decrease in ionic strength to bind transferrin to the anion exchange resin Determine that other methods are needed. One such method of chromatographic desalting involves directly binding a HIC wash fraction (transferrin) containing about 0.8 M to about 1.5 M ammonium sulfate to a stronger hydrophobic ligand such as a phenyl or butyl column. It is included. Once bound, transferrin can be eluted with a low ionic strength buffer prepared for WFI or anion exchange chromatography.

陰イオン交換クロマトグラフィー平衡化および結合に適切な緩衝液は、トランスフェリンを陰イオン交換媒体に結合させて、クロマトグラフィーによるトランスフェリンのその他の不純物からの分離を促進する。クロマトグラフィー媒体の平衡化に適切な緩衝液の濃度は約５ｍＭから約１００ｍＭ、ｐＨ範囲は約６から約９、伝導率は約９．０ｍＳ／ｃｍ未満である。これらの条件は、トランスフェリンを陰イオン交換媒体に結合させる。特定の実施形態では、緩衝剤は約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲で、ｐＨ範囲は約６から約９、伝導率は約７．０ｍＳ／ｃｍ未満である。適切な緩衝剤の例には、トリスおよびリン酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、ｐＨ範囲が約７から約９の範囲、伝導率約６．０ｍＳ／ｃｍ未満のトリス５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、７．０から９．０のｐＨ、伝導率約５．０ｍＳ／ｃｍ未満の約１０ｍＭから約４０ｍＭトリス緩衝液を利用する。   A buffer suitable for anion exchange chromatography equilibration and binding binds transferrin to the anion exchange medium to facilitate chromatographic separation of transferrin from other impurities. A suitable buffer concentration for equilibration of the chromatographic medium is about 5 mM to about 100 mM, the pH range is about 6 to about 9, and the conductivity is less than about 9.0 mS / cm. These conditions cause transferrin to bind to the anion exchange medium. In certain embodiments, the buffer is in the range of about 10 mM to about 60 mM, the pH range is about 6 to about 9, and the conductivity is less than about 7.0 mS / cm. Examples of suitable buffering agents include Tris and sodium phosphate. Certain embodiments utilize 50 mM Tris having a pH range of about 7 to about 9 and a conductivity of less than about 6.0 mS / cm. Other embodiments utilize about 10 mM to about 40 mM Tris buffer with a pH of 7.0 to 9.0 and a conductivity of less than about 5.0 mS / cm.

樹脂からトランスフェリンを溶出するために適切な緩衝液はまた、当業者には公知である。特定の実施形態では、適切な緩衝剤の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭの範囲である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭから約６０ｍＭの範囲である。適切な緩衝剤の例には、トリスまたはリン酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、約７から約９の範囲のｐＨのトリス５０ｍＭを利用する。その他の実施形態では、約７から約９のｐＨの酢酸ナトリウム約１０から約４０ｍＭを利用する。当業者であれば、溶出緩衝液ＮａＣｌ濃度はクロマトグラフィー樹脂に加えるタンパク質添加の範囲に左右されることはわかる。溶出方法は、緩衝液のＮａＣｌ濃度がトランスフェリンを溶出するためにステップワイズ型で増加する段階勾配、または緩衝液のＮａＣｌが直線状にゆっくり増加する直線勾配の使用によることからなり、トランスフェリンの収集を確認するためにカラム溶出液をモニターする。   Suitable buffers for eluting transferrin from the resin are also known to those skilled in the art. In certain embodiments, suitable buffering agent concentrations range from about 5 mM to about 100 mM. In certain embodiments, the buffering agent ranges from about 10 mM to about 60 mM. Examples of suitable buffering agents include tris or sodium phosphate. In certain embodiments, Tris 50 mM at a pH in the range of about 7 to about 9 is utilized. Other embodiments utilize about 10 to about 40 mM sodium acetate at a pH of about 7 to about 9. One skilled in the art knows that the elution buffer NaCl concentration depends on the extent of protein addition to the chromatography resin. The elution method consists of using a step gradient in which the NaCl concentration of the buffer increases stepwise to elute transferrin, or the use of a linear gradient in which the buffer NaCl increases slowly in a linear fashion. Monitor column eluate for confirmation.

一旦トランスフェリンを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から回収すると、必要ならば、例えば、限外濾過膜によるトランスフェリンの濃縮およびダイアフィルトレーションならびに／または濃縮および／またはダイアフィルトレーションしたトランスフェリンの滅菌濾過によって、さらに精製することができる。   Once transferrin is recovered from the anion exchange chromatography resin, if necessary, for example, by concentration and diafiltration of transferrin with an ultrafiltration membrane and / or sterile filtration of the concentrated and / or diafiltered transferrin. Further purification is possible.

ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液を、臨床または獣医学的適用のため（例えば、溶血に関連した症状を有する対象に投与するため）に使用する場合、当業者であれば、溶液中の活性のあるウイルス含量（ウイルス力価）およびその他の可能性のある感染因子（例えば、プリオン）のレベルを低下させることが所望され得ることを理解する。これは特に、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料（すなわち、開始材料）が血漿から得られる場合、所望され得る。溶液中のウイルス力価を低下させる方法は当業者には公知である。例には、低温殺菌（例えば、グリシン（例えば、２．７５Ｍ）およびスクロース（例えば、５０％）などの高濃度の安定化剤および／またはその他の選択された賦形剤または塩の存在下で溶液を６０℃で１０時間インキュベートする）、乾熱処理、ウイルス濾過（溶液をナノフィルター；例えば、２０ｎｍカットオフに通過させる）および／または溶液を適切な有機溶媒および界面活性剤で、溶液中のウイルスを不活性化する期間および条件下で処理することが含まれる。溶媒界面活性剤は、特に血漿由来生成物中のエンベロープウイルスを不活性化するために、２０年に亘って使用されてきた。したがって、当業界で公知の様々な試薬および方法を使用して実施することができる（例えば、本明細書に参照によって組み入れた米国特許第４５４０５７３号および米国特許第４７６４３６９号を参照のこと）。適切な溶媒には、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）およびエーテル、特にＴｎＢＰ（典型的に約０．３％）が含まれる。適切な界面活性剤には、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０およびトリトンＸ−１００（典型的に約０．３％）が含まれる。溶媒および界面活性剤濃度を含む処理条件の選択は、一部には原料の特性に左右され、純度が低い原料は一般的に高濃度の試薬およびより極端な反応条件を必要とする。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０で、特に好ましい組み合わせはポリソルベート８０およびＴｎＢＰである。原料は、存在する可能性があるいかなるエンベロープウイルスも不活性化するのに十分な温度および時間で、溶媒および界面活性剤試薬と撹拌することができる。例えば、溶媒界面活性剤処理は、２５℃で約４時間実施することができる。溶媒界面活性剤化学物質はその後、例えば、Ｃ−１８疎水性樹脂などのクロマトグラフィー媒体への吸着か、または関心のあるタンパク質を吸着する条件下でのイオン交換樹脂のドロップスルー（ｄｒｏｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分への溶出によって除去する。   When using a solution containing haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin for clinical or veterinary applications (eg, for administration to a subject having symptoms related to hemolysis) It will be appreciated that it may be desirable to reduce the level of active virus content (virus titer) and other possible infectious agents (eg prions) in it. This may be desirable especially when the raw material (ie starting material) comprising haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin is obtained from plasma. Methods for reducing the virus titer in solution are known to those skilled in the art. Examples include pasteurization (eg, in the presence of high concentrations of stabilizers such as glycine (eg, 2.75M) and sucrose (eg, 50%) and / or other selected excipients or salts. Incubate the solution for 10 hours at 60 ° C.), dry heat treatment, virus filtration (solution is passed through a nanofilter; eg, 20 nm cut-off) and / or virus in solution with a suitable organic solvent and detergent Treatment under conditions and conditions that inactivate. Solvent surfactants have been used for over 20 years, especially to inactivate enveloped viruses in plasma-derived products. Accordingly, it can be performed using various reagents and methods known in the art (see, eg, US Pat. No. 4,540,573 and US Pat. No. 4,764,369, incorporated herein by reference). Suitable solvents include tri-n-butyl phosphate (TnBP) and ethers, particularly TnBP (typically about 0.3%). Suitable surfactants include polysorbate (Tween) 80, polysorbate (Tween) 20, and Triton X-100 (typically about 0.3%). The choice of processing conditions, including solvent and surfactant concentrations, depends in part on the properties of the raw materials, and raw materials with lower purity generally require higher concentrations of reagents and more extreme reaction conditions. A preferred surfactant is polysorbate 80, and a particularly preferred combination is polysorbate 80 and TnBP. The feed can be agitated with the solvent and detergent reagent at a temperature and time sufficient to inactivate any enveloped virus that may be present. For example, the solvent surfactant treatment can be performed at 25 ° C. for about 4 hours. The solvent surfactant chemical is then adsorbed onto a chromatographic medium such as, for example, a C-18 hydrophobic resin, or drop-through of an ion exchange resin under conditions that adsorb the protein of interest. Remove by elution into fractions.

ウイルス不活性工程は、本明細書で開示した方法の任意の適切な段階で実施することができる。一実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料に、最初に記載した態様の工程（ｉｉ）の前にウイルス不活性化工程を行う。別の実施形態では、硫酸アンモニウム沈殿工程（すなわち、工程（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ））から回収したハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液にウイルス不活性化工程を行う。その他の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、工程ｉｉｉ）の後で実施する。   The virus inactivation step can be performed at any suitable stage of the methods disclosed herein. In one embodiment, the raw material comprising haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin is subjected to a virus inactivation step prior to step (ii) of the first described aspect. In another embodiment, a virus inactivation step is performed on the solution containing haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin recovered from the ammonium sulfate precipitation step (ie, step (ii) and / or (iii)). In other embodiments, the virus inactivation step is performed after step iii).

本明細書で開示した一実施形態では、ウイルス不活性化工程には、低温殺菌および／または有機溶媒および界面活性剤による処理が含まれる。一実施形態では、本発明の方法はさらに、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンのいずれかを含む溶液を５５℃から６１℃で約３０分から約１２時間加熱することを含む。特定の実施形態では、溶液は、約１０から約１０．５時間加熱する。本明細書で開示した別の一実施形態では、ウイルス不活性化工程は、ウイルス濾過を含む。特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む溶液を孔径１５ｎｍから３５ｎｍの範囲のウイルスフィルターに通すことを含む。ウイルス濾過を使用する場合、本発明者らは、濾過工程前に遊離アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加すると、フィルターからのハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの流動速度および回収を顕著に改善することができることを見いだした。このような方法の一例は、米国特許第７９１９５９２号に記載されている。   In one embodiment disclosed herein, the virus inactivation step includes pasteurization and / or treatment with an organic solvent and a surfactant. In one embodiment, the method of the invention further comprises heating a solution comprising either haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin at 55-61 ° C. for about 30 minutes to about 12 hours. In certain embodiments, the solution is heated for about 10 to about 10.5 hours. In another embodiment disclosed herein, the virus inactivation step comprises virus filtration. In certain embodiments, the methods of the invention further comprise passing a solution comprising hemopexin and / or transferrin through a viral filter having a pore size ranging from 15 nm to 35 nm. When using viral filtration, we significantly improve the flow rate and recovery of haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin from the filter by adding a free amino acid (eg, arginine) prior to the filtration step. I found that I could do it. An example of such a method is described in US Pat. No. 7,919,592.

本明細書で開示した一実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む原料または溶液に、クロマトグラフィー樹脂に通過させる前にウイルス不活性化工程を行う。処理した溶液または原料を陰イオン交換樹脂などのクロマトグラフィー樹脂に通過させる前に溶媒界面活性剤処理などのウイルス不活性化工程を使用する利点は、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの樹脂への結合ならびに流出（ドロップスルー）画分による有機溶媒および界面活性剤の除去を促進する条件を利用することによって、有機溶媒および界面活性剤を処理した溶液から除去することを可能にすることである。   In one embodiment disclosed herein, a virus inactivation step is performed on a raw material or solution containing haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin before passing it through the chromatography resin. The advantage of using a virus inactivation step such as solvent detergent treatment before passing the treated solution or raw material through a chromatographic resin such as an anion exchange resin is the advantage to haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin resin It is possible to remove organic solvents and surfactants from the treated solution by utilizing conditions that promote the removal of organic solvents and surfactants by binding and spilling (drop-through) fractions. .

低温殺菌は、タンパク質凝集および重合体を生成し得る。したがって、場合によっては、低温殺菌した溶液中の凝集／重合体のレベルを低下させることが所望され得る。これは、当業者に公知の任意の手段によって実現することができるが、さらなるクロマトグラフィー精製によって便利に実現することができる。本明細書で開示した一実施形態では、低温殺菌した溶液または原料は、いかなる凝集または重合体も流出（ドロップスルー）画分で除去されるように、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンに関してはポジティブモードで陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる。   Pasteurization can produce protein aggregation and polymers. Thus, in some cases it may be desirable to reduce the level of agglomeration / polymer in a pasteurized solution. This can be achieved by any means known to those skilled in the art, but can be conveniently achieved by further chromatographic purification. In one embodiment disclosed herein, the pasteurized solution or raw material is not related to haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin so that any aggregates or polymers are removed in the effluent (drop-through) fraction. Pass through anion exchange chromatography resin in positive mode.

特定の実施形態では、明らかに記載されていない限り、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを精製する方法は一般的に、約１８℃から約２６℃の温度範囲で実施する。   In certain embodiments, unless explicitly stated, methods for purifying haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin are generally performed at a temperature range of about 18 ° C. to about 26 ° C.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンを含む組成物を提供する。一態様では、組成物のハプトグロビン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、少なくとも９５％である。さらに別の態様では、組成物のハプトグロビン含量は、少なくとも９８％である。特定の実施形態では、ハプトグロビンを含む組成物は、免疫比濁法によって測定すると、ハプトグロビン１ｍｇ当たりＩｇＡ０．０３ｍｇ未満を含む。特定の実施形態では、ハプトグロビンを含む組成物は、ハプトグロビン濃度が２６ｍｇ／ｍＬのとき、ＩｇＧ ０．０６７ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＭ ０．０４２ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−酸糖タンパク質０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、プレアルブミン０．０１８ｍｇ／ｍＬ未満、セルロプラスミン０．０２１ｍｇ／ｍＬ未満、ヘモペキシン０．０５１ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ ０．０５３ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ｂ ０．２２７ｍｇ／ｍＬ未満、アンチトロンビンＩＩＩ ０．０３１ｍｇ／ｍＬ未満、トランスフェリン０．１ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−アンチトリプシン０．０７ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−２−マクログロブリン０．１ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＡ ０．７ｍｇ／ｍＬ未満およびアルブミン０．１５ｍｇ／ｍＬ未満（免疫比濁法によって測定）を含有する。   In another aspect of the invention, a composition comprising haptoglobin recovered by the methods disclosed herein is provided. In one aspect, the haptoglobin content of the composition is at least 80% of the total protein. In another aspect, the haptoglobin content of the composition is at least 90% of the total protein. In another aspect, the haptoglobin content of the composition is at least 95%. In yet another aspect, the haptoglobin content of the composition is at least 98%. In certain embodiments, a composition comprising haptoglobin comprises less than 0.03 mg IgA / mg haptoglobin as measured by immunoturbidimetry. In certain embodiments, the composition comprising haptoglobin has an IgG less than 0.067 mg / mL, IgM less than 0.042 mg / mL, alpha-1-acid glycoprotein 0.050 mg / mL when the haptoglobin concentration is 26 mg / mL. Less, prealbumin less than 0.018 mg / mL, ceruloplasmin less than 0.021 mg / mL, hemopexin less than 0.051 mg / mL, apolipoprotein AI less than 0.053 mg / mL, apolipoprotein B less than 0.227 mg / mL, Antithrombin III <0.031 mg / mL, transferrin <0.1 mg / mL, alpha-1-antitrypsin <0.07 mg / mL, alpha-2-macroglobulin <0.1 mg / mL, IgA 0.7 mg / mL Less than and Albumi Less than 0.15 mg / mL containing (measured by immunoturbidimetric assay).

本発明の別の態様では、本明細書で開示された方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の態様では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９５％である。別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９７％である。さらに別の実施形態では、組成物のヘモペキシン含量は、少なくとも９８％である。   In another aspect of the invention, a composition comprising hemopexin recovered by the methods disclosed herein is provided. In one embodiment, the hemopexin content of the composition is at least 80% of the total protein. In another embodiment, the hemopexin content of the composition is at least 90% of the total protein. In another aspect, the hemopexin content of the composition is at least 95%. In another embodiment, the hemopexin content of the composition is at least 97%. In yet another embodiment, the hemopexin content of the composition is at least 98%.

特定の実施形態では、ヘモペキシンを含む組成物は、少なくとも９８％純粋で、ＩｇＧ ０．０６７ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＡ ０．０６６ｍｇ／ｍＬ未満、ＩｇＭ ０．０４２ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−アンチトリプシン０．０４８ｍｇ／ｍＬ未満、トランスフェリン０．０９０ｍｇ／ｍＬ未満、アルファ−１−酸糖タンパク質０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、プレアルブミン０．０１８ｍｇ／ｍＬ未満、セルロプラスミン０．０２１ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ ０．０５３ｍｇ／ｍＬ未満、アポリポタンパク質Ｂ ０．２２７ｍｇ／ｍＬ未満、アンチトロンビンＩＩＩ ０．０３１ｍｇ／ｍＬ未満、ハプトグロビン０．１７ｍｇ／ｍＬ未満およびアルブミン０．０４５ｍｇ／ｍＬ未満（免疫比濁法によって測定）を含む。   In certain embodiments, the composition comprising hemopexin is at least 98% pure, IgG less than 0.067 mg / mL, IgA less than 0.066 mg / mL, IgM less than 0.042 mg / mL, alpha-1-antitrypsin 0 Less than 0.048 mg / mL, transferrin less than 0.090 mg / mL, alpha-1-acid glycoprotein less than 0.050 mg / mL, prealbumin less than 0.018 mg / mL, ceruloplasmin less than 0.021 mg / mL, apolipoprotein A- I <0.053 mg / mL, apolipoprotein B <0.227 mg / mL, antithrombin III <0.031 mg / mL, haptoglobin <0.17 mg / mL and albumin <0.045 mg / mL (measured by immunoturbidimetry) )including.

特定の実施形態では、ヘモペキシンを含む組成物は少なくとも９７％純粋で、免疫比濁法によって測定すると、ハプトグロビン１．７％未満、トランスフェリン０．４％未満、アルブミン０．２％未満およびアルファ−２ マクログロブリン０．１％未満を含有する。   In certain embodiments, the composition comprising hemopexin is at least 97% pure, as measured by immunoturbidimetry, less than 1.7% haptoglobin, less than 0.4% transferrin, less than 0.2% albumin and alpha-2. Contains less than 0.1% macroglobulin.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のトランスフェリン含量は、少なくとも９８％である。   In another aspect of the invention, a composition comprising transferrin recovered by the methods disclosed herein is provided. In one embodiment, the transferrin content of the composition is at least 80% of the total protein. In another embodiment, the transferrin content of the composition is at least 90% of the total protein. In another embodiment, the transferrin content of the composition is at least 95%. In yet another embodiment, the transferrin content of the composition is at least 98%.

本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したハプトグロビンおよび本明細書で開示した方法によって回収したヘモペキシンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のハプトグロビンおよびヘモペキシンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９８％である。   In another aspect of the invention, a composition comprising haptoglobin recovered by the method disclosed herein and hemopexin recovered by the method disclosed herein is provided. In one embodiment, the combined haptoglobin and hemopexin content of the composition is at least 80% of the total protein. In another embodiment, the combined haptoglobin and hemopexin content of the composition is at least 90% of the total protein. In another embodiment, the combined haptoglobin and hemopexin content of the composition is at least 95% of the total protein. In yet another embodiment, the combined haptoglobin and hemopexin content of the composition is at least 98% of the total protein.

一実施形態では、組成物はさらに、本明細書で開示した方法によって回収したトランスフェリンを含む。一実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも８０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９０％である。別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９５％である。さらに別の実施形態では、組成物のハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンを一緒にした含量は、全タンパク質の少なくとも９８％である。   In one embodiment, the composition further comprises transferrin recovered by the methods disclosed herein. In one embodiment, the combined content of haptoglobin, hemopexin and transferrin in the composition is at least 80% of the total protein. In another embodiment, the combined content of haptoglobin, hemopexin and transferrin in the composition is at least 90% of the total protein. In another embodiment, the combined content of haptoglobin, hemopexin and transferrin in the composition is at least 95% of the total protein. In yet another embodiment, the combined content of haptoglobin, hemopexin and transferrin in the composition is at least 98% of the total protein.

本発明の別の態様では、ハプトグロビン含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシン含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明の別の態様では、ヘモペキシンおよびハプトグロビンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。本発明のさらに別の態様では、ヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを一緒にした含量が全タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％である組成物を提供する。   In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the haptoglobin content is at least 80%, 90%, 95% or 98% of the total protein. In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the hemopexin content is at least 80%, 90%, 95% or 98% of the total protein. In another aspect of the invention, a composition is provided wherein the combined content of hemopexin and haptoglobin is at least 80%, 90%, 95% or 98% of the total protein. In yet another aspect of the invention, a composition is provided wherein the combined content of hemopexin, haptoglobin and transferrin is at least 80%, 90%, 95% or 98% of the total protein.

本明細書で開示した本発明の方法によって回収したハプトグロビン、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む組成物は、通常関連するその他の成分（例えば、その他の血漿由来タンパク質）を実質的に含まない。したがって、一実施形態では、ハプトグロビン、ヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含む組成物は、通常関連するその他の成分（すなわち、不純物）を全タンパク質の２０％未満、好ましくは全タンパク質の１０％未満、より好ましくは全タンパク質の５％未満含む。当業者であれば、本発明の組成物中に存在する不純物のレベルは、組成物の企図される使用に左右され得ることを理解する。例えば、組成物をそれらを必要とするヒト対象に投与する場合（すなわち、臨床使用では）、組成物に含まれる不純物は（全タンパク質の）５％未満であることが所望される。反対に、タンパク質をインビトロで使用する場合、組成物が（全タンパク質の）５％を上回る不純物を含んでいても許容され得る。   Compositions comprising haptoglobin, hemopexin and / or transferrin recovered by the methods of the invention disclosed herein are substantially free of other components normally associated (eg, other plasma-derived proteins). Thus, in one embodiment, a composition comprising haptoglobin, hemopexin, and / or transferrin has less than 20% of the total protein, preferably less than 10% of the total protein, and more preferably other components (ie, impurities) that are usually relevant. Contains less than 5% of the total protein. One skilled in the art will appreciate that the level of impurities present in the compositions of the present invention can depend on the intended use of the composition. For example, when the compositions are administered to a human subject in need thereof (ie, for clinical use), it is desirable that the impurities contained in the composition be less than 5% (of total protein). Conversely, if the protein is used in vitro, it may be acceptable if the composition contains more than 5% impurities (of total protein).

本発明の別の態様では、本明細書で開示したように、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む製剤を提供する。   In another aspect of the invention, there is provided a formulation comprising a composition of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier as disclosed herein.

適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤は、当業者には公知である。例には、溶媒、分散媒、抗真菌剤および抗菌剤、表面活性剤、等張剤および吸収剤などが含まれる。   Suitable pharmaceutically acceptable carriers, diluents and / or excipients are known to those skilled in the art. Examples include solvents, dispersion media, antifungal and antibacterial agents, surfactants, isotonic and absorbent agents and the like.

医薬製剤はまた、適切な安定化剤、例えば、アミノ酸、炭水化物、塩および界面活性剤を添加（または組み合わせ）することによって製剤化することができる。特定の実施形態では、安定化剤には、糖アルコールおよびアミノ酸の混合物が含まれる。安定化剤は、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）およびアミノ酸（例えば、プロリン、グリシンおよびアルギニン）の混合物を含むことができる。好ましい実施形態では、製剤は、アルギニンなどのアミノ酸を含む。その他の実施形態では、製剤は、最高１００ｍＭの濃度の２価金属イオンおよび米国特許第７０４５６０１号に記載されたような複合体形成剤を含む。実施形態では、ｐＨは、好ましくは約６．５から７．５であり、浸透圧は少なくとも２４０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである。   The pharmaceutical formulation can also be formulated by adding (or combining) appropriate stabilizers such as amino acids, carbohydrates, salts and surfactants. In certain embodiments, the stabilizer includes a mixture of sugar alcohols and amino acids. Stabilizers can include a mixture of sugars (eg sucrose or trehalose), sugar alcohols (eg mannitol or sorbitol) and amino acids (eg proline, glycine and arginine). In a preferred embodiment, the formulation comprises an amino acid such as arginine. In other embodiments, the formulation comprises a divalent metal ion at a concentration of up to 100 mM and a complexing agent as described in US Pat. No. 7,045,601. In an embodiment, the pH is preferably about 6.5 to 7.5 and the osmotic pressure is at least 240 mosmol / kg.

医薬製剤はまた、分注および長期貯蔵前に濾過によって滅菌してもよい。好ましくは、製剤は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６ヵ月またはそれ以上の月数、元々の安定特性を実質的に保持する。例えば、２−８℃または２５℃で保存した製剤は典型的に、６ヵ月以上保存しても、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定すると、実質的に同じ分子サイズ分布を保持することができる。医薬製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または室温で保存したとき、少なくとも６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月、３６ヵ月またはそれ以上であっても、商用の薬学的使用のために安定であり、適切であることができる。   The pharmaceutical formulation may also be sterilized by filtration prior to dispensing and prolonged storage. Preferably, the formulation substantially retains its original stability characteristics for at least 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36 months or longer. For example, formulations stored at 2-8 ° C. or 25 ° C. can typically retain substantially the same molecular size distribution as measured by HPLC-SEC even after storage for 6 months or longer. Certain embodiments of the pharmaceutical formulation can be used for commercial pharmaceutical use even when stored at 2-8 ° C. and / or at room temperature, even at least 6 months, 12 months, 18 months, 24 months, 36 months or longer Can be stable and appropriate.

本明細書で記載した組成物は、注射製剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。製剤およびその後の投与（投薬）は、当業者の範囲内である。投薬は、治療する対象の応答性に左右されるが、所望する効果（例えば、遊離Ｈｂ／ヘムレベルの低下）が望まれる限り一定して継続する。当業者は、最適な投薬量、投与方法および反復数を容易に決定することができる。   The compositions described herein can be formulated into any of a number of possible dosage forms, such as injectable formulations. Formulation and subsequent administration (dosing) is within the skill of the artisan. Dosing will depend on the responsiveness of the subject being treated, but will continue as long as the desired effect (eg, reduction in free Hb / heme levels) is desired. Persons of ordinary skill can easily determine optimum dosages, dosing methodologies and repetition rates.

本明細書で開示した一実施形態では、本発明の医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬ含む溶液である。別の実施形態では、医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、容量が少なくとも５ｍＬで、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを約２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬまたは２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。別の態様では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンの濃度が少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、安定した薬学的に許容されるハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリン溶液の少なくとも５ｍＬを含有する容器を提供する。   In one embodiment disclosed herein, the pharmaceutical formulation of the invention is a solution having a volume of at least 5 mL and comprising at least 5 mg / mL haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin. In another embodiment, the pharmaceutical formulation has a volume of at least 5 mL and comprises at least 20 mg / mL haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin. In certain embodiments, the pharmaceutical formulation has a volume of at least 5 mL and about 20 mg / mL, 25 mg / mL, 30 mg / mL, 35 mg / mL, 40 mg / mL, 45 mg / mL of haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin. , 50 mg / mL, 55 mg / mL, 60 mg / mL, 65 mg / mL, 70 mg / mL, 75 mg / mL, 80 mg / mL, 90 mg / mL, 100 mg / mL, 150 mg / mL or 200 mg / mL. In another aspect, a container containing a stable pharmaceutically acceptable haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin solution, wherein the concentration of haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin is at least 20 mg / mL. provide.

本発明の別の実施形態では、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンをふくむ医薬製剤を凍結乾燥する。糖（例えば、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）およびアミノ酸（例えば、グリシンもしくはプロリン）またはそれらの組み合わせのような凍結乾燥安定化剤が存在するため、凍結乾燥によって長期保存期間を有する安定した粉末が得られる。医薬製剤を形成するために、この粉末を保存し、直接もしくは保存後粉末として使用するか、または再水和してから使用することができる。本発明の凍結乾燥した医薬製剤は、限定はしないが、凍結乾燥を含む、当業界で公知の任意の凍結乾燥方法を使用して、すなわち、ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリンを含有する製剤を凍結後、減圧エバポレーションして、形成することができる。提供された凍結乾燥製剤は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６ヵ月またはそれ以上の月数、元々の安定特性を実質的に保持することができる。例えば、２〜８℃または２５℃で保存した凍結乾燥製剤は典型的に、６ヵ月以上保存しても、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定すると、実質的に同じ分子サイズ分布を保持することができる。ハプトグロビンおよび／またはヘモペキシンおよび／またはトランスフェリン医薬製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または室温で保存したとき、少なくとも６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月、３６ヵ月またはそれ以上であっても、商用の薬学的使用のために安定であり、適切であることができる。特定の実施形態では、凍結乾燥した医薬製剤はヘモペキシンを含む。本発明は、凍結乾燥した医薬製剤を大規模生産するために使用することができる。凍結乾燥製品は、大量調製のために製造することができ、あるいは、凍結乾燥前に、小さな容器（例えば、単回用量単位）に配分してもよく、このような小さな単位は、滅菌単位投与形態として使用することができる。凍結乾燥した製剤は、タンパク質の溶液または懸濁液を得るために、再構成することができる。凍結乾燥した粉末は、水性溶液で適切な容量に再水和する。好ましい水性溶液は、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水または生理学的食塩水である。混合物を撹拌して、再水和を促進する。好ましくは、再構成工程は、室温で実施する。   In another embodiment of the invention, the pharmaceutical formulation comprising haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin is lyophilized. Due to the presence of freeze-dried stabilizers such as sugars (eg sucrose), sugar alcohols (eg mannitol) and amino acids (eg glycine or proline) or combinations thereof, stable with long shelf life by lyophilization A powder is obtained. This powder can be stored and used directly or after storage as a powder, or rehydrated to form a pharmaceutical formulation. The lyophilized pharmaceutical formulation of the present invention uses any lyophilization method known in the art, including but not limited to lyophilization, ie, a formulation containing haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin. Can be formed by freezing and evaporation under reduced pressure. The provided lyophilized formulation can substantially retain its original stability characteristics for at least 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36 months or more. For example, lyophilized formulations stored at 2-8 ° C. or 25 ° C. can typically retain substantially the same molecular size distribution as measured by HPLC-SEC even after storage for 6 months or longer. Certain embodiments of the haptoglobin and / or hemopexin and / or transferrin pharmaceutical formulations are at least 6 months, 12 months, 18 months, 24 months, 36 months or more when stored at 2-8 ° C. and / or room temperature. Even so, it can be stable and suitable for commercial pharmaceutical use. In certain embodiments, the lyophilized pharmaceutical formulation comprises hemopexin. The present invention can be used for large-scale production of lyophilized pharmaceutical formulations. The lyophilized product can be manufactured for mass preparation or can be distributed into small containers (eg, a single dose unit) prior to lyophilization, such small units being administered as a sterile unit Can be used as a form. The lyophilized formulation can be reconstituted to obtain a protein solution or suspension. The lyophilized powder is rehydrated to an appropriate volume with an aqueous solution. Preferred aqueous solutions are water for injection (WFI), phosphate buffered saline or physiological saline. The mixture is stirred to promote rehydration. Preferably, the reconstitution step is performed at room temperature.

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療する方法であって、本明細書で開示したように、本発明の組成物または製剤をそれらを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。   In another aspect of the present invention, a method of treating a symptom associated with hemolysis, comprising administering a composition or formulation of the present invention to a subject in need thereof, as disclosed herein. Provide a method.

本明細書で使用した「対象」という用語は、霊長類（低級または高級霊長類）を含む動物を意味する。高級霊長類には、ヒトが含まれる。本発明は、ヒトにおける症状の標的化に特に適用されるが、非ヒト動物も本明細書で開示した組成物および方法から利益を得ることができることを当業者であれば理解する。したがって、本発明はヒトおよび動物の両方に適用されることは当業者であればわかる。便宜上、「動物」には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ、ロバ、イヌおよびネコなどの家畜および伴侶動物が含まれる。ウマに関しては、これらには、レース業界で使用されるウマならびに娯楽または畜産業のために使用されるウマが含まれる。   As used herein, the term “subject” refers to animals including primates (lower or higher primates). Higher primates include humans. Although the present invention is particularly applicable to symptom targeting in humans, those of skill in the art will appreciate that non-human animals can also benefit from the compositions and methods disclosed herein. Thus, those skilled in the art will appreciate that the present invention applies to both humans and animals. For convenience, “animal” includes livestock and companion animals such as cows, horses, sheep, pigs, camels, goats, donkeys, dogs and cats. With respect to horses, these include horses used in the racing industry as well as those used for the entertainment or livestock industry.

本発明の組成物または製剤は、いくつかの方法で対象に投与することができる。適切な投与経路の例には、静脈内、皮下、動脈内または注入が含まれる。一実施形態では、分子は静脈内投与される。   A composition or formulation of the invention can be administered to a subject in several ways. Examples of suitable routes of administration include intravenous, subcutaneous, intraarterial or infusion. In one embodiment, the molecule is administered intravenously.

必要ならば、本発明の方法はさらに、第２の治療薬の投与を含んでもよい。第２の治療用化合物は、対象に連続的に（本明細書で開示した組成物または製剤の投与の前後）または同時に一緒に投与することができる。一実施形態では、第２の治療薬は、鉄キレート剤（例えば、デスフェリオキサミンまたはデフェリプロン）である。   If necessary, the method of the present invention may further comprise administration of a second therapeutic agent. The second therapeutic compound can be administered to the subject sequentially (before and after administration of the composition or formulation disclosed herein) or simultaneously together. In one embodiment, the second therapeutic agent is an iron chelator (eg, desferrioxamine or deferiprone).

本発明の別の態様では、溶血に関連した症状を治療するための医薬品の製造における、本明細書で開示したような本発明の組成物または製剤の使用を提供する。このような組成物または製剤は、好ましくはヒト患者で使用するために適切である。   In another aspect of the invention, there is provided the use of a composition or formulation of the invention as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating symptoms associated with hemolysis. Such a composition or formulation is preferably suitable for use in human patients.

溶血に関連し、ヘモグロビン／ヘムによって媒介される毒性の危険性がある症状は、当業界では公知である。一実施形態では、症状は、急性溶血性疾患および／または慢性溶血性疾患から選択される。一実施形態では、症状は、溶血性貧血、輸血誘発溶血、溶血性***症候群、自己免疫疾患、マラリア感染、外傷、輸血、心肺バイパスを使用した直視下心臓手術および熱傷からなる群から選択され、熱傷後の溶血に関連したヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿の治療が含まれる。一実施形態では、症状は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。   Symptoms associated with hemolysis and at risk of toxicity mediated by hemoglobin / heme are known in the art. In one embodiment, the symptom is selected from acute hemolytic disease and / or chronic hemolytic disease. In one embodiment, the symptoms are selected from the group consisting of hemolytic anemia, transfusion-induced hemolysis, hemolytic uremic syndrome, autoimmune disease, malaria infection, trauma, blood transfusion, open heart surgery with cardiopulmonary bypass and burns Treatment of hemoglobinemia or hemoglobinuria associated with post-burn hemolysis. In one embodiment, the symptoms consist of sickle cell anemia, hereditary spherocytosis, hereditary elliptic erythrocytosis, thalassemia, congenital erythrocytic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, systemic lupus erythematosus, and chronic lymphocytic leukemia Selected from the group.

当業者であれば、本明細書で記載した本発明は、特に記載したもの以外の変更および改変を受け入れることができることがわかる。本発明には、精神および範囲内に入るこのような変更および改変が全て含まれることを理解されたい。本発明はまた、本明細書で述べるかまたは示した工程、特徴、組成物および化合物全てを、個別にまたは集合的に含み、前記工程または特徴の任意の２種以上のありとあらゆる組み合わせも含む。   Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein is susceptible to variations and modifications other than those specifically described. It is to be understood that the invention includes all such changes and modifications that fall within the spirit and scope. The present invention also includes all of the steps, features, compositions and compounds described or shown herein, individually or collectively, including any and all combinations of any two or more of the steps or features.

本発明のある特定の実施形態について、ここで以下の実施例を参照して記載するが、実施例は単に例示することを目的とするものであって、前述した概説の範囲を限定するものではない。   Certain specific embodiments of the present invention will now be described with reference to the following examples, which are intended for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the above-described overview. Absent.

〔実施例１〕
開始材料：ハプトグロビン、ヘモペキシンおよびトランスフェリンの精製のための開始材料として、コーン画分ＩＶ４沈殿物を使用した。（図１参照）。 [Example 1]
Starting material: Corn fraction IV 4 precipitate was used as starting material for the purification of haptoglobin, hemopexin and transferrin. (See FIG. 1).

沈殿物の抽出：沈殿物の抽出は、画分ＩＶ４沈殿物１グラム当たり抽出緩衝液２０グラムを導入することによって実施した（２０×抽出比）。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。抽出緩衝液は、濃ＨＣｌでｐＨ７．０に調節したトリス５０ｍＭから構成された。抽出緩衝液は、２０〜２５℃の温度で調製した。沈殿物抽出も２０〜２５℃の温度で実施した。抽出中のｐＨは、１時間の抽出時間中７．０から８．０の間（好ましくは７．０）に維持した。 Precipitate extraction: Precipitate extraction was performed by introducing 20 grams of extraction buffer per gram of fraction IV 4 precipitate (20 × extraction ratio). Buffer and precipitate were mixed for a minimum of 1 hour. The extraction buffer consisted of 50 mM Tris adjusted to pH 7.0 with concentrated HCl. The extraction buffer was prepared at a temperature of 20-25 ° C. Precipitation extraction was also performed at a temperature of 20-25 ° C. The pH during extraction was maintained between 7.0 and 8.0 (preferably 7.0) during the 1 hour extraction time.

硫酸アンモニウム沈殿：最終濃度２．０から２．５Ｍ（好ましくは２．４Ｍ）を実現するために、固形の硫酸アンモニウムを画分ＩＶ４抽出物に添加した。撹拌しながら、硫酸アンモニウムをゆっくり抽出物に添加し、最低限１時間継続的に混合した。硫酸アンモニウム沈殿は、２０〜２５℃の温度で実施した。 Ammonium sulfate precipitation: Solid ammonium sulfate was added to the fraction IV 4 extract to achieve a final concentration of 2.0 to 2.5M (preferably 2.4M). While stirring, ammonium sulfate was slowly added to the extract and mixed continuously for a minimum of 1 hour. Ammonium sulfate precipitation was performed at a temperature of 20-25 ° C.

ヘモペキシンおよびトランスフェリンの可溶性を維持しながら脂質を沈殿させ、画分ＩＶ４抽出物を清澄化するために、硫酸アンモニウム濃度２．５Ｍを利用した。同時に、この硫酸アンモニウム濃度は、画分ＩＶ４抽出物中に存在するハプトグロビンの大部分の沈殿を引き起こした（図２参照）。ヘモペキシンを可溶性に維持しながら、硫酸アンモニウム２．２Ｍから２．５Ｍでハプトグロビンが沈殿することは、同じ開始画分からのヘモペキシンおよびハプトグロビンの同時精製を可能にする。 Ammonium sulfate concentration of 2.5M was utilized to precipitate lipids while maintaining the solubility of hemopexin and transferrin and to clarify the fraction IV 4 extract. At the same time, this ammonium sulfate concentration caused the precipitation of most of the haptoglobin present in the fraction IV 4 extract (see FIG. 2). Precipitation of haptoglobin at 2.2M to 2.5M ammonium sulfate while keeping hemopexin soluble allows simultaneous purification of hemopexin and haptoglobin from the same starting fraction.

許容される硫酸アンモニウム濃度範囲をさらに狭めるために、ｐＨおよび硫酸アンモニウム濃度の影響を検討する実験計画法（ＤＯＥ）を実施した。図３は、ＤＯＥの望ましさのプロット（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を示す。このプロットは、ほとんどのヘモペキシンを可溶性に維持しながら、ほとんどのハプトグロビンを沈殿させる最も望ましい条件を示す。望ましさのプロットは、ｐＨを７〜８の間（好ましくは７．０）に、硫酸アンモニウム濃度を２．２Ｍと２．５Ｍの間（好ましくは２．４Ｍ）に維持することが、同じ開始材料から両タンパク質を分離するために最適であることを示している。さらに、トランスフェリンは、２．５Ｍを上回る濃度で可溶性を維持するので、これらの条件は、同じ開始材料から３種類のタンパク質全てを精製するために最適であった。   In order to further narrow the allowable ammonium sulfate concentration range, an experimental design (DOE) was conducted to study the effects of pH and ammonium sulfate concentration. FIG. 3 shows a desirability plot of DOE. This plot shows the most desirable conditions for precipitating most haptoglobin while keeping most hemopexin soluble. The desirability plot shows that maintaining the pH between 7-8 (preferably 7.0) and the ammonium sulfate concentration between 2.2M and 2.5M (preferably 2.4M) is the same starting material. It is shown to be optimal for separating both proteins from Furthermore, since transferrin remains soluble at concentrations above 2.5 M, these conditions were optimal for purifying all three proteins from the same starting material.

濾過：硫酸アンモニウム処理抽出物を濾過用に調製するために、バッチで利用するための血漿同等物１リットル当たりＣ１０００濾過助剤１０グラムを添加した。濾過を遂行する前に、Ｃ１０００濾過助剤を最低限１５分間混合させた。ハプトグロビンの豊富な沈殿物の収集を可能にするために、濾過用にプレートフレームフィルタープレスを利用した。プレートフレームフィルタープレスは、３Ｍ（Ｃｕｎｏ）７０ＣＡ深層濾過フィルターシートの前面に１７５型フィルター紙のシートを組み合わせた。バッチに投入した血漿同等物３Ｌ毎に、沈殿収集物領域０．１９３ｍＬが必要であった（３Ｌ血漿／４”Ｅｒｔｅｌ ４Ｓフィルターフレーム）。硫酸アンモニウム処理した抽出物を次に、ダブルダイアグラム加圧エア作動型ポンプを使用して、フィルタープレスに送り込んだ。   Filtration: To prepare the ammonium sulfate treated extract for filtration, 10 grams of C1000 filter aid was added per liter of plasma equivalent for use in batch. C1000 filter aid was mixed for a minimum of 15 minutes before performing the filtration. A plate frame filter press was utilized for filtration to allow collection of haptoglobin-rich precipitates. In the plate frame filter press, a sheet of 175 type filter paper was combined with the front surface of a 3M (Cuno) 70CA depth filtration filter sheet. For every 3 L of plasma equivalent put into the batch, a precipitation collection area of 0.193 mL was required (3 L plasma / 4 "Ertel 4S filter frame). The ammonium sulfate treated extract was then double-diagram pressurized air operated A mold pump was used to feed the filter press.

Ｃ１０００混合時間完了後、処理した抽出物をフィルタープレスに送り込み、フィルタープレスを１回通過させた後の濾液を収集した。次に、フィルタープレスを、１から２プレス量のｐＨ７．０に調節した硫酸アンモニウム２．４Ｍ、トリス５０ｍＭで後洗浄した。濾過行程は、２０〜２５℃の温度で実施した。得られた濾液はヘモペキシンを含有し、さらに精製を実施するまで、２〜８℃で保存することができる。得られた沈殿物はハプトグロビンを含有し、さらに精製を実施するまで、−２０℃以下で保存することができる。   After completion of the C1000 mixing time, the treated extract was fed into a filter press and the filtrate after one pass through the filter press was collected. Next, the filter press was post-washed with ammonium sulfate 2.4M, Tris 50mM adjusted to a press amount of 1 to 2 presses. The filtration process was performed at a temperature of 20-25 ° C. The resulting filtrate contains hemopexin and can be stored at 2-8 ° C. until further purification. The resulting precipitate contains haptoglobin and can be stored at -20 ° C or lower until further purification.

濾過画分からのヘモペキシン（Ｈｘ）の精製：
Ｈｘ処理計画を図９に表示する。 Purification of hemopexin (Hx) from the filtered fraction:
The Hx processing plan is displayed in FIG.

（ａ）オクチルセファロースクロマトグラフィー（ＨＩＣ）：画分ＩＶ４沈殿物の抽出および硫酸アンモニウム処理から得られた濾液はさらに、０．２２μｍフィルターを使用して清澄化した。次に、３カラム体積の硫酸アンモニウム２．５Ｍ、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ７．４で平衡化したオクチルセファロースカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に濾液を添加した。あるいは、カプトオクチルカラムを次工程のために使用することができる。８から１２カラム体積（目標＝１０）の濾液をオクチルセファロースカラムに添加した。不純物およびいかなる未結合タンパク質も、３カラム体積の硫酸アンモニウム０．９Ｍから１．２Ｍ（目標１．１３Ｍ）、トリス５０ｍＭ、ｐＨ７．４（洗浄用）によってカラムから洗浄した。洗浄画分はトランスフェリンを含有し、さらに精製するために保存することができる。次に、ヘモペキシンを含有する画分（溶出液）を３カラム体積の水（ＷＦＩ）でカラムから溶出させた。その後、さらなるトランスフェリン精製に使用するまで、溶出液は２〜８℃で保存した。オクチルセファロース（ＨＩＣ）精製は、２０〜２５℃の温度で実施した。 (A) Octyl Sepharose Chromatography (HIC): Fraction IV 4 The precipitate obtained from the precipitation and ammonium sulfate treatment was further clarified using a 0.22 μm filter. Next, the filtrate was added to an octyl sepharose column (GE Lifesciences) equilibrated with 3 column volumes of ammonium sulfate 2.5 M, Tris 50 mM, pH 7.4. Alternatively, a captooctyl column can be used for the next step. 8-12 column volumes (target = 10) of the filtrate was added to the octyl sepharose column. Impurities and any unbound protein were washed from the column with 3 column volumes of ammonium sulfate 0.9 M to 1.2 M (target 1.13 M), Tris 50 mM, pH 7.4 (for washing). The washed fraction contains transferrin and can be stored for further purification. Next, the fraction (eluent) containing hemopexin was eluted from the column with 3 column volumes of water (WFI). The eluate was then stored at 2-8 ° C. until used for further transferrin purification. Octyl sepharose (HIC) purification was performed at a temperature of 20-25 ° C.

（ｂ）Ｎｉ−セファロースクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）：リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール３０ｍＭをオクチルセファロース溶出液に添加した。一旦添加したら、オクチルセファロース溶出液のｐＨを７．４に調節した。次に、３カラム体積のオクチルセファロース溶出液を、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、場合によりイミダゾール３０ｍＭを含有し、ｐＨ７．４に調節した緩衝液で平衡化したＮｉ−セファロース（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに添加した。イミダゾールをオクチルセファロース溶出液（添加液）に添加することによって、ヘモペキシンに対する結合親和性を維持しながら、Ｎｉ−セファロースのアルブミンおよびその他の不純物に対する親和性を低下させる。したがって、添加工程の間に、不純物はカラムから流出し、一方、ヘモペキシンは樹脂に結合した。添加完了後、カラムを２カラム体積のリン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール３０ｍＭ、ｐＨ７．４で洗浄し、いかなる未結合不純部物も除去した。次に、ヘモペキシンをリン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭおよびイミダゾール１００ｍＭ、ｐＨ７．４を使用してカラムから溶出した。Ｎｉ−セファロース溶出液中に存在するヘモペキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を上回ることが推定された（図４参照）。Ｎｉ−セファロースクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）方法は、２０〜２５℃で実施し、得られた溶出液は使用するまで−２０℃以下で保存した。   (B) Ni-Sepharose chromatography (IMAC): 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride and 30 mM imidazole were added to the octyl sepharose eluate. Once added, the pH of the octyl sepharose eluate was adjusted to 7.4. Next, a 3 column volume of octyl sepharose eluate containing 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, optionally 30 mM imidazole, and equilibrated with a buffer adjusted to pH 7.4 (GE Lifesciences) column. Added to. By adding imidazole to the octyl sepharose eluate (additive), the affinity of Ni-Sepharose for albumin and other impurities is reduced while maintaining the binding affinity for hemopexin. Thus, during the addition process, impurities flowed out of the column while hemopexin bound to the resin. After the addition was complete, the column was washed with 2 column volumes of 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride and 30 mM imidazole, pH 7.4 to remove any unbound impurities. The hemopexin was then eluted from the column using 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride and 100 mM imidazole, pH 7.4. It was estimated that hemopexin present in the Ni-Sepharose eluate exceeded 95% by SDS-PAGE (see FIG. 4). The Ni-Sepharose chromatography (IMAC) method was performed at 20-25 ° C. and the resulting eluate was stored at −20 ° C. or lower until use.

（ｃ）濃縮／ダイアフィルトレーション：Ｎｉ−セファロース溶出液を所望する濃度まで濃縮し（１〜２０％ｗ／ｖ）、次に濃縮物体積当たりリン酸緩衝生理食塩水１０体積でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。一旦ダイアフィルトレーションが完了し濃縮物が所望する濃度になったら、ヘモペキシンに場合により糖およびまたはアミノ酸を配合し、滅菌濾過して、−２０℃以下で保存した。精製したヘモペキシンは、この形態で前臨床動物実験および細胞実験で使用することができる。   (C) Concentration / diafiltration: Ni-Sepharose eluate is concentrated to the desired concentration (1-20% w / v) and then diafiltered with 10 volumes of phosphate buffered saline per concentrate volume. I did. Concentration and diafiltration were performed using a 30 kD ultrafiltration membrane. Once diafiltration was complete and the concentrate had the desired concentration, hemopexin was optionally blended with sugars and / or amino acids, sterile filtered, and stored at -20 ° C or lower. Purified hemopexin can be used in this form in preclinical animal and cell experiments.

方法から回収したヘモペキシンの最終収率は、約０．１５１ｇ／Ｌ血漿と推定された。   The final yield of hemopexin recovered from the method was estimated to be about 0.151 g / L plasma.

濃縮したヘモペキシン調製物（約２．３％ｗ／ｖ）の特徴は、免疫比濁法によって調べた。ＩｇＧ（検出限界、ＬＯＤ＝＜０．０６７ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＡ（ＬＯＤ＝＜０．０６６ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＭ（ＬＯＤ＝＜０．０４２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−アンチトリプシン（ＬＯＤ＝０．０４８ｍｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（ＬＯＤ＝＜０．０９０ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−酸糖タンパク質（ＬＯＤ＝０．０５０ｍｇ／ｍＬ）、プレアルブミン（ＬＯＤ＝０．０１８ｍｇ／ｍＬ）、セルロプラスミン（ＬＯＤ＝０．０２１ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＬＯＤ＝＜０．０５３ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＬＯＤ＝＜０．２２７ｍｇ／ｍＬ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＬＯＤ＝０．０３１ｍｇ／ｍＬ）などの血漿タンパク質は検出レベルを下回った。ハプトグロビン（０．１６５ｍｇ／ｍＬ）およびアルブミン（０．０３８ｍｇ／ｍＬ）などのその他の血漿タンパク質はほんの微量検出された。これらの結果は、Ｈｘが調製物中の全タンパク質の少なくとも９９％を占めることを示唆する。   The characteristics of the concentrated hemopexin preparation (approximately 2.3% w / v) were examined by immunoturbidimetry. IgG (detection limit, LOD = <0.067 mg / mL), IgA (LOD = <0.066 mg / mL), IgM (LOD = <0.042 mg / mL), alpha-1-antitrypsin (LOD = 0.0. 048 mg / mL), transferrin (LOD = <0.090 mg / mL), alpha-1-acid glycoprotein (LOD = 0.050 mg / mL), prealbumin (LOD = 0.018 mg / mL), ceruloplasmin (LOD) = 0.021 mg / mL), apolipoprotein AI (LOD = <0.053 mg / mL), apolipoprotein B (LOD = <0.227 mg / mL) and antithrombin III (LOD = 0.031 mg / mL) Plasma proteins such as were below detection levels. Only trace amounts of other plasma proteins such as haptoglobin (0.165 mg / mL) and albumin (0.038 mg / mL) were detected. These results suggest that Hx accounts for at least 99% of the total protein in the preparation.

ヘモペキシンの他のバッチは、前述した方法によって処理した。バッチは、３５ｍｇ／ｍＬタンパク質まで濃縮した。免疫比濁法によってバッチを分析すると、ヘモペキシンの純度は約９８％で、ハプトグロビン１．６％、トランスフェリン０．３％、アルブミン０．２％およびアルファ−２ マクログロブリン０．１％を含む不純物が含まれることが示された。   Other batches of hemopexin were processed by the method described above. The batch was concentrated to 35 mg / mL protein. When the batch is analyzed by immunoturbidimetry, the purity of hemopexin is about 98% and impurities including haptoglobin 1.6%, transferrin 0.3%, albumin 0.2% and alpha-2 macroglobulin 0.1%. It was shown to be included.

硫酸アンモニウム２．５Ｍ沈殿物からのハプトグロビン（Ｈｐ）の精製
Ｈｐ処理計画を図１０に表示する。 Purification of haptoglobin (Hp) from ammonium sulfate 2.5M precipitate The Hp treatment scheme is displayed in FIG.

（ａ）沈殿物の抽出および濾過：ハプトグロビンは、抽出緩衝液２０グラム／グラム沈殿物（２０×比）を導入することによって沈殿物から抽出した。抽出緩衝液はｐＨ５．５に調節した酢酸ナトリウム５０ｍＭから構成された。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。１５分後、ｐＨを５．４から５．６の範囲内に調節した。その後のクロマトグラフィー工程において低ｐＨを利用する間、低ｐＨ抽出緩衝液を利用して、脂質の抽出を低下させた。残存する濾過助剤および不溶性タンパク質および脂質を除去するため、次に、抽出物をＣｕｎｏ ７０ＣＡフィルターまたは同等の深層フィルターに通過させた。その後、濾液は０．２μｍフィルターを使用することによって清澄化した。得られた濾液は、その後のクロマトグラフィー工程のために準備した。抽出緩衝液調製、抽出方法および濾過方法は全て、２０〜２５℃で実施した。   (A) Extraction and filtration of the precipitate: Haptoglobin was extracted from the precipitate by introducing an extraction buffer 20 grams / gram precipitate (20 × ratio). The extraction buffer consisted of 50 mM sodium acetate adjusted to pH 5.5. Buffer and precipitate were mixed for a minimum of 1 hour. After 15 minutes, the pH was adjusted within the range of 5.4 to 5.6. Lipid extraction was reduced using a low pH extraction buffer while utilizing low pH in subsequent chromatographic steps. The extract was then passed through a Cuno 70CA filter or equivalent depth filter to remove residual filter aid and insoluble protein and lipid. The filtrate was then clarified by using a 0.2 μm filter. The resulting filtrate was prepared for subsequent chromatography steps. The extraction buffer preparation, extraction method and filtration method were all carried out at 20-25 ° C.

別の実施形態では、ハプトグロビンは、抽出緩衝液２０グラム／グラム沈殿物（２０×比）を導入することによって沈殿物から抽出した。抽出緩衝液はｐＨ８．５に調節したトリス５０ｍＭから構成された。緩衝液および沈殿物を最低１時間混合した。１５分後、ｐＨを８．４から８．６の範囲内に調節した。脂質含量を低下させ、抽出した沈殿物の清澄化を助長するために、脂質吸着剤、エアロジル（フュームドシリカ）を血漿同等物１リットル当たり約１．６から約１．８グラムで添加した。次に、エアロジル処理した抽出物を最低限１時間混合した。残存する濾過助剤およびいかなる不溶性タンパク質および脂質も除去するために、抽出物をＣｕｎｏ ７０ＣＡフィルターまたはその他の類似の深層フィルターに通過させた。その後、濾液は０．２μｍフィルターを使用することによって清澄化した。得られた濾液は、その後のクロマトグラフィー工程のために準備した。抽出緩衝液調製、抽出方法および濾過方法は全て、２０〜２５℃で実施した。   In another embodiment, haptoglobin was extracted from the precipitate by introducing an extraction buffer 20 grams / gram precipitate (20 × ratio). The extraction buffer consisted of Tris 50 mM adjusted to pH 8.5. Buffer and precipitate were mixed for a minimum of 1 hour. After 15 minutes, the pH was adjusted within the range of 8.4 to 8.6. A lipid adsorbent, Aerosil (fumed silica), was added at about 1.6 to about 1.8 grams per liter of plasma equivalent to reduce lipid content and help clarify the extracted precipitate. The aerosil treated extract was then mixed for a minimum of 1 hour. The extract was passed through a Cuno 70CA filter or other similar depth filter to remove residual filter aid and any insoluble proteins and lipids. The filtrate was then clarified by using a 0.2 μm filter. The resulting filtrate was prepared for subsequent chromatography steps. The extraction buffer preparation, extraction method and filtration method were all carried out at 20-25 ° C.

（ｂ）Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィー工程：酢酸ナトリウムを、前記工程から得られた濾液に最終濃度５０ｍＭまで添加して、氷酢酸を使用して濾液のｐＨをｐＨ５．５に調節した。次に、ｐＨ調節した濾液を冷水（ＷＦＩ）で１：４から１：５に希釈し、酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ５．５で平衡化したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーカラムに約２〜８℃の温度で添加した。添加は、低ｐＨ緩衝液として酢酸ナトリウムを必要とし、ハプトグロビンがカラムに結合するように添加物の伝導率を低下させるために水で希釈することが必要である。添加完了後、カラムを２カラム体積の酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ５．５で洗浄し、いかなる未結合混入タンパク質も除去した。次に、ハプトグロビンを４カラム体積の酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ１００〜２００ｍＭ（好ましくは１６２ｍＭ）、ｐＨ５．５で溶出した。溶出条件が利用した添加体積に一部左右されるので、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度は広範囲であることが必要である。溶出液は、濃縮／ダイアフィルトレーションまで、短期間の場合２〜８℃で、長期間の場合、−２０℃以下で保存することができる。Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液のハプトグロビン含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を上回ることが推定された（図５および６参照）。クロマトグラフィー緩衝液およびクロマトグラフィー工程は全て、２０〜２５℃で実施した。   (B) Capto Q ImpRes chromatography step: Sodium acetate was added to the filtrate obtained from the previous step to a final concentration of 50 mM and the pH of the filtrate was adjusted to pH 5.5 using glacial acetic acid. Next, the pH adjusted filtrate was diluted 1: 4 to 1: 5 with cold water (WFI) and equilibrated with sodium acetate 50 mM, pH 5.5 on a GE Healthcare Capto Q ImpRes chromatography column at about 2-8 ° C. Added at temperature. The addition requires sodium acetate as a low pH buffer and needs to be diluted with water to reduce the conductivity of the additive so that haptoglobin binds to the column. After the addition was complete, the column was washed with 2 column volumes of sodium acetate 50 mM, pH 5.5 to remove any unbound contaminating protein. The haptoglobin was then eluted with 4 column volumes of sodium acetate 50 mM, NaCl 100-200 mM (preferably 162 mM), pH 5.5. Since the elution conditions depend in part on the added volume utilized, the NaCl concentration of the elution buffer must be in a wide range. The eluate can be stored at 2-8 ° C. for short periods and −20 ° C. or lower for long periods until concentration / diafiltration. The haptoglobin content of the Capto Q ImpRes eluate was estimated to be over 95% by SDS-PAGE (see FIGS. 5 and 6). All chromatography buffers and chromatography steps were performed at 20-25 ° C.

（ｃ）濃縮／ダイアフィルトレーション：Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ溶出液を特定の濃度まで濃縮し、次に濃縮物体積当たりリン酸緩衝生理食塩水１０体積でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。一旦ダイアフィルトレーションが完了し濃縮物が所望する濃度になったら、精製したハプトグロビン溶液を滅菌濾過して、−２０℃以下で保存した。   (C) Concentration / Diafiltration: Capto Q ImpRes eluate was concentrated to a specific concentration and then diafiltered with 10 volumes of phosphate buffered saline per volume of concentrate. Concentration and diafiltration were performed using a 30 kD ultrafiltration membrane. Once diafiltration was complete and the concentrate had the desired concentration, the purified haptoglobin solution was sterile filtered and stored at -20 ° C or lower.

場合により、脂質吸着工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程前後または濃縮／ダイアフィルトレーション工程後に実施することができる。適切な脂質吸着剤の一例は、エアロジルのようなフュームドシリカ（例えば、エアロジル３８０）である。   Optionally, the lipid adsorption step can be performed before or after the anion exchange chromatography step or after the concentration / diafiltration step. An example of a suitable lipid adsorbent is fumed silica such as Aerosil (eg Aerosil 380).

方法から回収したハプトグロビンの最終収率は、約０．２８５ｇ／Ｌ投入血漿と推定された。   The final yield of haptoglobin recovered from the method was estimated to be about 0.285 g / L input plasma.

濃縮したハプトグロビン調製物（約２．６％ｗ／ｖ）の特徴は、免疫比濁法によって調べた。ＩｇＧ（検出限界、ＬＯＤ＝＜０．０６７ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＭ（ＬＯＤ＝＜０．０４２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−酸糖タンパク質（ＬＯＤ＝＜０．０５０ｍｇ／ｍＬ）、プレアルブミン（ＬＯＤ＝＜０．０１８ｍｇ／ｍＬ）、セルロプラスミン（ＬＯＤ＝＜０．０２１ｍｇ／ｍＬ）、ヘモペキシン（ＬＯＤ＝＜０．０５１ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＬＯＤ＝＜０．０５３ｍｇ／ｍＬ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＬＯＤ＝＜０．２２７ｍｇ／ｍＬ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＬＯＤ＝＜０．０３１ｍｇ／ｍＬ）などの血漿タンパク質は検出レベルを下回り、トランスフェリン（０．０９９ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−１−アンチトリプシン（０．０６２ｍｇ／ｍＬ）、アルファ−２−マクログロブリン（０．０８６ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＡ（０．６５ｍｇ／ｍＬ）およびアルブミン（０．１２３ｍｇ／ｍＬ）などのその他の血漿タンパク質はほんの微量検出された。これらの結果は、Ｈｐが調製物中の全タンパク質の少なくとも９６％を占めることを示す。   The characteristics of the concentrated haptoglobin preparation (approximately 2.6% w / v) were examined by immunoturbidimetry. IgG (limit of detection, LOD = <0.067 mg / mL), IgM (LOD = <0.042 mg / mL), alpha-1-acid glycoprotein (LOD = <0.050 mg / mL), prealbumin (LOD = <0.018 mg / mL), ceruloplasmin (LOD = <0.021 mg / mL), hemopexin (LOD = <0.051 mg / mL), apolipoprotein AI (LOD = <0.053 mg / mL), apolipo Plasma proteins such as protein B (LOD = <0.227 mg / mL) and antithrombin III (LOD = <0.031 mg / mL) are below detection levels, transferrin (0.099 mg / mL), alpha-1-anti Trypsin (0.062 mg / mL), alpha-2-macroglobulin (0.086 g / mL), IgA (0.65mg / mL) and Albumin (0.123mg / mL) other plasma proteins, such it was only trace detection. These results indicate that Hp accounts for at least 96% of the total protein in the preparation.

オクチル１．１３Ｍ硫酸アンモニウム洗浄画分からのトランスフェリンの精製：
オクチル洗浄画分にイオン交換クロマトグラフィーを実施する前に、硫酸アンモニウムをダイアフィルトレーションして、低イオン強度の緩衝液に交換した。このために、オクチル溶出液を濃縮し、溶出液体積当たり１０体積のトリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０でダイアフィルトレーションした。濃縮およびダイアフィルトレーションは、３０ｋＤ限外濾過膜を使用して実施した。 Purification of transferrin from octyl 1.13M ammonium sulfate wash fraction:
Prior to ion exchange chromatography on the octyl wash fraction, ammonium sulfate was diafiltered and replaced with a low ionic strength buffer. For this, the octyl eluate was concentrated and diafiltered with 10 volumes of Tris 50 mM, pH 7.0 per eluate volume. Concentration and diafiltration were performed using a 30 kD ultrafiltration membrane.

次に、ダイアフィルトレーションした洗浄画分を、トリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０で平衡化したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥカラムに添加した。この画分から純粋なトランスフェリンを得ることが実行可能かどうかを決定するために、開始緩衝液としてトリス５０ｍＭ、ｐＨ７．０および終了緩衝液としてトリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ７．０を使用して、１０カラム体積の直線勾配を実施した（図８参照）。クロマトグラムの各ピークに対応する画分を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ピークの１つが純粋なトランスフェリンを含有するかどうかを決定するために実施した。図７に示したように、ピークには大量に添加されているが、純粋なトランスフェリンのように見える。これは、オクチルセファロース洗浄画分からトランスフェリンを精製することが可能であることを示しており、同じ開始材料からヘモペキシン、ハプトグロビンおよびトランスフェリンを精製することが可能であることも意味している（図１１も参照）。   The diafiltered wash fraction was then applied to a GE Healthcare Capto DEAE column equilibrated with Tris 50 mM, pH 7.0. To determine if it is feasible to obtain pure transferrin from this fraction, using Tris 50 mM, pH 7.0 as the start buffer and Tris 50 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.0 as the end buffer, A 10 column volume linear gradient was performed (see FIG. 8). Fractions corresponding to each peak of the chromatogram were collected. SDS-PAGE analysis was performed to determine if one of the peaks contained pure transferrin. As shown in FIG. 7, the peak is added in a large amount, but looks like pure transferrin. This indicates that transferrin can be purified from the octyl sepharose wash fraction, which also means that hemopexin, haptoglobin and transferrin can be purified from the same starting material (also FIG. 11). reference).

Claims (12)

ハプトグロビンおよびヘモペキシンを、両タンパク質を含有する溶液から精製する方法であって：
（ｉ）ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液を準備すること；
（ｉｉ）硫酸アンモニウムを該溶液に添加することによって該溶液からハプトグロビンを沈殿させること；
（ｉｉｉ）沈殿したハプトグロビンをヘモペキシンを含む該溶液から分離すること；および
（ｉｖ）１つまたは複数の工程でハプトグロビンおよびヘモペキシンを別々に精製することを含み、
ハプトグロビンを６から８の範囲内のｐＨで、溶液に硫酸アンモニウム２．３Ｍから２．５Ｍを添加することによって、該溶液から沈殿させることを特徴とする、
前記方法。 A method for purifying haptoglobin and hemopexin from a solution containing both proteins comprising:
(I) providing a solution containing both haptoglobin and hemopexin;
(Ii) precipitating haptoglobin from the solution by adding ammonium sulfate to the solution;
Look including purifying separately haptoglobin and f Mopekishin in and (iv) 1 or more steps,; (iii) be separated from the solution containing the hemopexin the precipitated haptoglobin
Haptoglobin is precipitated from the solution by adding 2.3 to 2.5M ammonium sulfate to the solution at a pH in the range of 6 to 8,
Said method. 溶液に硫酸アンモニウム２．４Ｍを添加することによって、該溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む、請求項１に記載の方法。 Sulfuric acid to a solution of ammonium arm 2. By adding 4M, comprising precipitating the haptoglobin from the solution, The method of claim 1. ７のｐＨで溶液からハプトグロビンを沈殿させることを含む、請求項１または２に記載の方法。 3. A method according to claim 1 or 2 , comprising precipitating haptoglobin from the solution at a pH of 7 . ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方を含有する溶液がさらにトランスフェリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the solution containing both haptoglobin and hemopexin further comprises transferrin. 溶液がヒト血漿画分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the solution is a human plasma fraction. 溶液がコーン画分ＩＶである、請求項５に記載の方法。 6. The method of claim 5 , wherein the solution is corn fraction IV. 溶液がコーン画分ＩＶ4である、請求項６に記載の方法。 The solution is Cohn fraction IV 4, The method of claim 6. （ｉ）ハプトグロビン溶液を得るために、沈殿したハプトグロビンを緩衝液に溶解する
こと；
（ｉｉ）ハプトグロビンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、ハプトグロビン溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉｉ）該樹脂からハプトグロビンを溶出すること；および
（ｉｖ）溶出したハプトグロビンを回収することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 (I) dissolving the precipitated haptoglobin in a buffer to obtain a haptoglobin solution;
(Ii) passing a haptoglobin solution through the resin under conditions such that the haptoglobin binds to the anion exchange chromatography resin;
The method according to any one of claims 1 to 7 , further comprising (iii) eluting haptoglobin from the resin; and (iv) recovering the eluted haptoglobin. 脂質を脂質除去剤に結合させる条件下で、ハプトグロビン溶液を該脂質除去剤に曝露する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。 9. The method of claim 8 , further comprising exposing the haptoglobin solution to the lipid removal agent under conditions that allow the lipid to bind to the lipid removal agent. （ｉ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）工程（ｉ）の流出画分を収集すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉ）の後および／または工程（ｉｉｉ）の後で該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；ならびに
（ｖ）溶出したヘモペキシンを回収することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 (I) passing a solution containing hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the hydrophobic interaction chromatography resin;
(Ii) collecting the effluent fraction of step (i);
(Iii) optionally washing the resin after step (ii) and collecting the effluent wash fraction; and (iv) from the resin after step (ii) and / or after step (iii) The method according to any one of claims 1 to 9 , further comprising eluting hemopexin; and (v) recovering the eluted hemopexin. （ｉ）ヘモペキシンを金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、溶出したヘモペキシンを該樹脂に通過させること；
（ｉｉ）該樹脂からヘモペキシンを溶出すること；および
（ｉｉｉ）溶出したヘモペキシンを回収することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。 (I) passing the eluted hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the metal ion affinity chromatography resin;
Further comprising the method of claim 1 0 recovering the and (iii) eluted hemopexin; (ii) it is eluted hemopexin from the resin. （ａ）ヘモペキシンを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる条件下で、ヘモペキシンを含有する溶液を該樹脂に通過させること；
（ｂ）工程（ａ）の流出画分を収集すること；
（ｃ）工程（ｂ）の後で場合により該樹脂を洗浄し、流出洗浄画分を収集すること；
（ｄ）トランスフェリンが陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するような条件下で、工程（ｂ）の流出画分および／または工程（ｃ）の流出洗浄画分を該樹脂に通過させること；ならびに
（ｅ）該樹脂からトランスフェリンを回収することをさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。 (A) passing the solution containing hemopexin through the resin under conditions that allow the hemopexin to bind to the hydrophobic interaction chromatography resin;
(B) collecting the effluent fraction of step (a);
(C) optionally washing the resin after step (b) and collecting the effluent wash fraction;
(D) passing the effluent fraction of step (b) and / or the effluent wash fraction of step (c) through the resin under conditions such that transferrin binds to the anion exchange chromatography resin; The method according to any one of claims 4 to 11, further comprising e) recovering transferrin from the resin.
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