JP5830096B2 - 血漿由来インターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）の製造方法 - Google Patents

血漿由来インターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）の製造方法 Download PDF

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Description

出願の相互参照
本出願は２０１０年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／３６７，３３１号への優先権を主張し、その開示内容は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。
宿主細胞系統におけるＤＮＡベクターの組み換え発現を介して生産される他の生物学的製剤とは異なり、血漿由来タンパク質はヒトの血液及び血漿献血から分画される。従って、これらの産物の供給は生産量を単に増大させることにより増大することはできない。そうではなく、市販の血液産物の量は血液及び血漿献血の入手可能な供給量により制限される。この力学は、インターα阻害剤（ＩａＩ）及びプレα阻害剤（ＰａＩ）及びＨ因子のようなインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）を含む低成熟の市場を有する新しい血漿由来血液因子の製造のための原料ヒト血漿の入手可能性の不足をもたらす。
インターαトリプシン阻害剤（ＩａＩ）は敗血症、癌転移及び炎症に関与しているプロテアーゼ阻害剤（インターα阻害タンパク質；ＩａＩｐ）のファミリーに属する血漿タンパク質である（考察に関しては、Salier, J.等、Biochem J 315: 1-9 (1996)（非特許文献１）を参照）。ＩａＩは２２５ｋＤａの概算分子量を有し、そして、硫酸コンドロイチンにより共有結合された２つの重鎖（Ｈ１及びＨ２）及び単一の軽鎖（ビクニン）ポリペプチドよりなる（図１）。プレα阻害剤（ＰａＩ）はやはり硫酸コンドロイチンにより共有結合された１つの重鎖（Ｈ３）及び１つの小鎖（ビクニン）ポリペプチドよりなる関連のインターα阻害剤である（図１）。インターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）は成人血漿中に約６００〜１２００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する（Lim等、J Chromatogr A. (2005) Feb 11;1065(1):39-43（非特許文献２））。
敗血症は、全身炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）として知られている全身炎症、及び、知られた又は疑われる炎症の存在を特徴とする医学的状態である。敗血症で生じる全身炎症は、血流を介して生物全体に蔓延している細菌、ウィルス又はカビの感染に対する免疫系の応答により一般的には誘発される。これらの感染は通常、肺（肺炎）、膀胱及び腎臓（***症）、皮膚（蜂巣炎）、腹部（例えば虫垂炎）、及び他の領域（例えば髄膜炎）において始まる。
敗血症の症例数の顕著な増大は過去２０年間に渡って起こっている。この増大は免疫系を弱化する薬物療法を用いた癌及び臓器移植患者のための治療への依存度の増大に部分的に起因している。平均寿命の延長及び高齢化した世界人口もまた、敗血症の発生率上昇に寄与している。更に又、抗生物質耐性細菌の発生も敗血症の症例数に寄与している。
研究によれば、重度の敗血症を有する患者において血漿中ＩａＩｐレベルの低下と死亡率との間には相関がある（Lim等、J Infect Dis. (2003) Sep 15;188(6):919-26（非特許文献３）及びOpal等、Crit Care Med. (2007) Feb;35(2):387-92（非特許文献４））。更に又、幾つかの研究によれば、ＩａＩｐの投与は敗血症及び敗血症性ショックに関連する死亡率を低下させる（Jourdain等、Am J Respir Crit Care Med. (1997) Dec;156(6):1825-33（非特許文献５）; Yang等、Crit Care Med. (2002) Mar;30(3):617-22（非特許文献６）; Lim等、J Infect Dis. (2003) Sep 15;188(6):919-26（非特許文献３）；及びWu等、Crit Care Med. (2004) Aug;32(8):1747-52（非特許文献７）; これらの開示内容は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＩａＩｐと敗血症の間の関係は特徴付けられているが、この関係に基づいた薬剤はこれまで特定されていない。
免疫グロブリン産物のような血漿由来の血液産物の世界的ニーズが高まっていること、及びその入手可能な供給量が変動することが部分的な原因となって、オーストラリア及び英国を含む数カ国は需要管理プログラムを実施することにより産物不足期間中の需要が最も高い患者に対するこれらの産物の供給を保護している。
例えば、２００７年には血漿２６．５百万リットルが分画され、７５．２メートルトンのＩＶＩＧを作成し、平均生産収率はリットル当たり２．８グラムであった（Robert P.、上出）。この報告の推定によれば、全世界のＩＶＩＧ収率は２０１２年までにはリットル当たり約３．４３グラムにまで増大することが期待される。しかしながら、現在から２０１５年にかけて年約７％〜１３％と算出されているＩＶＩＧの世界的需要の持続的成長のため、全体的ＩＶＩＧ収率の期待される向上にも関わらず、需要に応えるためには免疫グロブリン生成のためにより多くの原料血漿を割り当てなければならなくなる。この必要性は新しい血漿由来血液産物の製造のための血漿の入手可能性を制限することになる。
新しい血漿由来産物の製造のために入手できる血漿の欠乏のために、それらの製造は、免疫グロブリン及びアルブミンのような血漿由来産物のための確立された製造プロセスの既存の枠組みの中に組み込まれなければならない。種々の症状の中でもとりわけ敗血症に対して潜在的な治療薬として考えられているインターα阻害剤は医師の注目を集めている血漿由来血液産物の１つである。しかしながら、例えばＩｇＧガンマグロブリン製造のために傾注された資源のために、既存の製造スキーム内に導入できるＩａＩｐの製造のための方法が必要である。これだけを達成するために幾つかの方法が提案されているが、これらの方法は、ＩＶＩＧのような不可欠な生成物の精製のために高度な需要がある原料物質からのＩａＩｐの吸着に依存している。例えば、Michalski等（Vox Sang. 1994;67(4):329-36（非特許文献８））及びMizon等（J Chromatogr B Biomed Sci Appl.、1997 May 9;692(2):281-91（非特許文献９））は、継続的なアニオン交換濃縮ステップとその後のヘパリン親和性クロマトグラフィーにより脱クリオ（cryo-poor）血漿からＩａＩｐを吸着する方法を記載している。Josic（米国特許出願公開第２００３／０１９０７３２号（特許文献１））はサイズ排除クロマトグラフィー及び任意で吸着ステップにより、未処理の血漿、クリオプレシピテート血漿画分、又は脱クリオ血漿からＩａＩｐを単離する方法を記載している。最後に、Lim等（'３６５;米国特許第７，９３２，３６５号（特許文献２））及びLim等（'６９５;ＷＯ２００９/１５４６９５（特許文献３））はクリオ上澄み又は脱クリオ血漿から固相抽出を介してＩａＩｐを吸着させる方法を記載している（Lim等'３６５（特許文献２）及び'６９５（特許文献３）に関してはそれぞれ図８及図１を参照）。従って、Michalski等、Mizon等、Josic及びLim等（その開示内容は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる）により提供された精製スキームは、貴重な原料物質を消費し、確立された産物に関する新しい法制上の認可を必要とすることになり、及び／又は、確立された産物の特徴の改変をもたらす可能性もある。
そのため、静脈内投与のためのアルブミン及びＩｇＧガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）又は皮下投与のためのアルブミン及びＩｇＧガンマグロブリンのような商業的に重要な血漿由来血液産物のための追加的な原材料血漿の使用、又は、既存の製造プロセスの再設計及び法制上の再認可を必要としないＩａＩｐ組成物を製造する方法の必要性が当該分野において残存している。好都合には本発明は、これら及び他の必要性を、全てを以前には使用されていなかった製造画分に依存するインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）を製造する方法を提供することにより、充足するものである。種々の態様のうち、本発明は又、ＩａＩｐの機能不全又は調節不全に関連する疾患及び障害を治療するための新規なＩａＩｐ組成物及び方法を提供する。最後に本発明は、別様には他の血液因子組成物の製造の間に廃棄される血漿画分からのＩａＩｐ及びＨ因子の同時製造のための方法を提供する。
米国特許出願公開第２００３／０１９０７３２号 米国特許第７，９３２，３６５号 ＷＯ２００９/１５４６９
Salier, J.等、Biochem J 315: 1-9 (1996) Lim等、J Chromatogr A. (2005) Feb 11;1065(1):39-43 Lim等、J Infect Dis. (2003) Sep 15;188(6):919-26 Opal等、Crit Care Med. (2007) Feb;35(2):387-92 Jourdain等、Am J Respir Crit Care Med. (1997) Dec;156(6):1825-33 Yang等、Crit Care Med. (2002) Mar;30(3):617-22 Wu等、Crit Care Med. (2004) Aug;32(8):1747-52 Michalski等, Vox Sang. 1994;67(4):329-36 Mizon等（J Chromatogr B Biomed Sci Appl.、1997 May 9;692(2):281-91
種々の態様の内、本発明は、血漿由来ＩａＩｐの濃縮組成物を調製するための方法を提供する。好都合には、本明細書において提供される方法は、それ以外では、血漿分画による他の商業的に重要な血液産物の調製の間に廃棄される物質からのＩａＩｐ組成物の工業的規模の調製を可能にする。ある特定の実施形態においては、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物は単一のＩａＩｐポリペプチド、例えばＩａＩ又はＰａＩよりなる。他の実施形態において、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物は、２つ以上のインターα阻害タンパク質、例えばＩａＩ及びＰａＩの混合物を含む。本明細書において使用する場合、ＩａＩｐとは、単一のインターα阻害タンパク質及び２つ以上のインターα阻害タンパク質の混合物の両方の組成物を指す。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）脱クリオ血漿画分を供給するステップ；（ｂ）ＩａＩｐ含有沈殿物を形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ；及び、（ｃ）ＩａＩｐ含有沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を形成するステップを含み、ＩａＩｐ沈殿物は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー−ニッチェマン（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）沈殿物Ａ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物Ｂよりなる群から選択される。
１つの態様において、本発明は、懸濁させた画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、懸濁させた画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からのＩａＩｐの吸着及び得られた上澄みからの分離を含む。
第２の態様において、本発明は、沈殿物を得るために血漿試料からＩａＩｐを沈殿させること、及び、沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。ある特定の実施形態においては、沈殿物は画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物である。更に他の実施形態において、血漿の分画の間に形成された複数の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。
第３の態様において、本発明は、血漿分画による他の商業上重要な血液産物の製造の間に、それ以外では廃棄される物質から調製された血漿由来ＩａＩｐの水性組成物を提供する。
第４の態様において、本発明は、血漿分画による他の商業上重要な血液産物の製造の間に、それ以外では廃棄される物質から調製された血漿由来ＩａＩｐの医薬組成物を提供する。
第５の態様において、本発明は、血漿分画による他の商業上重要な血液産物の調製の間に、それ以外では廃棄される物質から調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与することによって、それを必要とする対象においてＩａＩｐの機能不全又は調節不全に関連する疾患、障害又は状態を治療するための方法を提供する。ＩａＩｐ機能不全に関連する疾患及び障害は、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、及び腺維増殖を含むがこれらに限定されない。
第６の態様において、本発明は血漿分画による他の商業上重要な血液産物の調製の間に、それ以外では廃棄される物質から調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与することによって、それを必要とする対象において上皮修復を促進する方法を提供する。
第７の実施形態において、本発明は、ＩａＩｐ及びＨ因子の組成物の同時製造を、血漿分画による他の商業上重要な血液産物の調製の間に、それ以外では廃棄される１つ以上の画分から両方の因子を抽出することにより行う方法を提供する。ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐ及びＨ因子は、画分Ｉ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、沈殿物Ａの沈殿物又は沈殿物Ｂの沈殿物から回収される。
[本発明1001]
血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法であって、
（ａ）脱クリオ（cryo-poor）血漿画分を供給するステップ、
（ｂ）ＩａＩｐ含有沈殿物を形成するために、少なくとも第1のエタノール沈殿反応において該脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、
（ｃ）該ＩａＩｐ含有沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を形成するステップ
を含み、
該ＩａＩｐ沈殿物が、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−1、キストラー−ニッチェマン（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）沈殿物Ａ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物Ｂよりなる群から選択される、
方法。
[本発明1002]
血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法であって、
（ｉ）血漿試料から画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するステップ、
（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を形成するために、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁するステップ、
（ｉｉｉ）該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を固相に接触させて、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液から該ＩａＩｐを除去するステップ、及び、
（ｉｖ）該固相から該ＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、方法。
[本発明1003]
前記固相が超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ 2 ）を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
（ａ）第1の沈殿ステップにおいて、第1の沈殿物及び第1の上澄みを得るために、約7．0〜約7．5のｐＨで約6％〜約10％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ、
（ｂ）第2の沈殿ステップにおいて、第2の沈殿物を形成するために、約6．7〜約7．3のｐＨで約20％〜約25％アルコールを用いて該第1の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、
（ｃ）懸濁液を形成するために該第2の沈殿物を再懸濁するステップ、
（ｄ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ 2 ）をステップ（ｃ）の懸濁液と混合するステップ、
（ｅ）該懸濁液をフィルタープレスで濾過することにより、濾過ケーク及び上澄みを形成するステップ、並びに、
（ｆ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で該濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、本発明1002又は1003の方法。
[本発明1005]
血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法であって、
（ａ）沈殿物を得るために血漿試料からＩａＩｐを沈殿させるステップ、
（ｂ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で該沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含み、
該沈殿物が、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−1、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物である、
方法。
[本発明1006]
画分Ｉ沈殿物を形成するステップが、第1の沈殿ステップにおいて、画分Ｉ沈殿物を得るために、約7．0〜約7．5のｐＨで約6％〜約10％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させることを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
ＩａＩｐを画分ＩＶ−1沈殿物から抽出し、
（ａ）第1の沈殿ステップにおいて、第1の沈殿物及び第1の上澄みを得るために、約7．0〜約7．5のｐＨで約6％〜約10％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ、
（ｂ）第2の沈殿ステップにおいて、第2の沈殿物及び第2の上澄みを形成するために、約6．7〜約7．3のｐＨで約20％〜約25％アルコールを用いて該第1の沈殿物からタンパク質を沈殿させるステップ、
（ｃ）第3の沈殿ステップにおいて、第3の沈殿物及び第3の上澄みを形成するために、約5．0〜約5．5のｐＨで約18％〜約23％アルコールを用いて該第2の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、
（ｄ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で該第3の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
ＩａＩｐを画分ＩＶ−1沈殿物から抽出し、
（ａ）第1の沈殿ステップにおいて、第1の沈殿物及び第1の上澄みを得るために、約6．7〜約7．2のｐＨで約18％〜約23％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ、
（ｂ）第2の沈殿ステップにおいて、第2の沈殿物及び第2の上澄みを形成するために、約5．0〜約5．5のｐＨで約18％〜約25％アルコールを用いて該第1の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、
（ｃ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で該第2の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、本発明1005の方法。
[本発明1009]
ＩａＩｐを複数の沈殿画分から抽出する、本発明1001〜1008の何れかの方法。
[本発明1010]
血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法であって、
（ａ）血漿の単一のアリコートを分画してＩａＩｐ以外の少なくとも2つの血液産物の濃縮組成物を得るステップ、
（ｂ）1つ以上の抽出緩衝液で血漿分画の間に生じた少なくとも2つの異なる廃棄画分からＩａＩｐを抽出するステップ、及び、
（ｃ）抽出されたＩａＩｐ画分をプールすることにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、方法。
[本発明1011]
前記血漿を分画してＩｇＧ免疫グロブリン及びアルブミンの濃縮組成物を得る、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記血漿を分画してＩａＩｐ以外の少なくとも3つの血液産物を得る、本発明1010又は1011の方法。
[本発明1013]
（ｇ）追加の沈殿ステップにおいて、前記濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させることにより、ＩａＩｐを含有する上澄みを形成するステップ
を更に含む、本発明1001〜1012の何れかの方法。
[本発明1014]
前記追加の沈殿ステップが約6．0〜約8．0のｐＨにおける約10％〜約19％アルコールを用いた沈殿を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法であって、
（ａ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−1、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物よりなる群から選択される血漿画分からＩａＩｐを抽出するステップ、及び、
（ｂ）追加の沈殿ステップにおいて、該濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させることにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、方法。
[本発明1016]
（ｈ）追加の沈殿ステップにおいて、ＩａＩｐを沈殿させるステップ
を更に含む、本発明1001〜1015の何れかの方法。
[本発明1017]
約6．0〜約8．0のｐＨで約20％〜約25％アルコールを用いてＩａＩｐを沈殿させる、本発明1016の方法。
[本発明1018]
（ｇ）前記濃縮ＩａＩｐ組成物由来のＩａＩｐをアニオン交換樹脂に結合させるステップ、及び、
（ｈ）溶離緩衝液を用いて該アニオン交換樹脂から該ＩａＩｐを溶離させることにより、ＩａＩｐを含有する第1の溶離液を形成するステップ
を更に含む、本発明1001〜1016の何れかの方法。
[本発明1019]
（ｉ）前記第1の溶離液由来のＩａＩｐをヘパリン親和性樹脂に結合させるステップ、及び、
（ｊ）溶離緩衝液を用いて該ヘパリン親和性樹脂から該ＩａＩｐを溶離することにより、ＩａＩｐを含有する第2の溶離液を形成するステップ
を更に含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記第1の溶離液中又は前記第2の溶離液中に存在するＩａＩｐが更に濃縮される、本発明1018又は1019の方法。
[本発明1021]
前記沈殿ステップのうちの少なくとも1つがアルコールの噴霧添加を含む、本発明1001〜1020の何れかの方法。
[本発明1022]
前記沈殿ステップの全てがアルコールの噴霧添加を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
ｐＨ調整剤の添加により、前記第1の沈殿ステップ、前記第2の沈殿ステップ、又は前記第3の沈殿ステップのうちの少なくとも1つにおいて、アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整する、本発明1001〜1022の何れかの方法。
[本発明1024]
ｐＨ調整剤の添加により、全ての前記沈殿ステップにおいてアルコールの添加の後に前記溶液のｐＨを調整する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
ｐＨ調整剤の添加が、ｐＨ調整溶液の噴霧添加を含む、本発明1023又は1024の方法。
[本発明1026]
アルコール添加の前及びその後に、アルコール添加の間及びその後に、又はアルコール添加の前、その間及びその後に、沈殿ステップのｐＨを調整する、本発明1001〜1025の何れかの方法。
[本発明1027]
沈殿ステップのｐＨが、ｐＨの連続的調節により全沈殿ステップに関して維持される、本発明1001〜1026の何れかの方法。
[本発明1028]
ＩａＩｐを抽出するステップが、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−1、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物よりなる群から選択される血漿画分を含有するフィルタープレスを通してＩａＩｐ抽出緩衝液を再循環させることを含む、本発明1001〜1027の何れかの方法。
[本発明1029]
前記ＩａＩｐ抽出緩衝液を少なくとも約10分間前記フィルタープレスを通して再循環させる、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ＩａＩｐ抽出緩衝液を少なくとも約30分間前記フィルタープレスを通して再循環させる、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記ＩａＩｐ抽出緩衝液が、少なくとも1つのＩａＩｐタンパク質の等電点とは少なくとも約0．3単位異なるｐＨを含み有する、本発明1001〜1030の何れかの方法。
[本発明1032]
血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法であって、
（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、
（ｂ）アニオン交換樹脂に該ＩａＩｐ及び該Ｈ因子を結合させるステップ、
（ｃ）第1の溶離緩衝液で該樹脂から該Ｈ因子を溶離させるステップ、並びに、
（ｄ）第2の溶離緩衝液で該樹脂から該ＩａＩｐを溶離することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、方法。
[本発明1033]
血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法であって、
（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、
（ｂ）アニオン交換樹脂にＨ因子が結合しない条件下で、該アニオン交換樹脂に該ＩａＩｐを結合させるステップ、並びに、
（ｃ）溶離緩衝液で該樹脂から該ＩａＩｐを溶離することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
を含む、方法。
[本発明1034]
（ｅ）前記濃縮ＩａＩｐ組成物中の前記ＩａＩｐをヘパリン親和性カラムに結合させるステップ、及び、
（ｆ）該ヘパリン親和性カラムから該ＩａＩｐを溶離させるステップ
を更に含む、本発明1032又は1033の方法。
[本発明1035]
前記濃縮ＩａＩｐ組成物が少なくとも1つのウィルス不活性化ステップに更に供される、本発明1001〜1034の何れかの方法。
[本発明1036]
前記ウィルス不活性化ステップが溶媒及び／又は洗浄剤による処理、ナノ濾過、熱処理、又は低ｐＨにおけるインキュベーションを含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
単一のインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）種を単離する、本発明1001〜1036の何れかの方法。
[本発明1038]
前記ＩａＩｐ種がインターαトリプシン阻害剤（ＩａＩ）である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記ＩａＩｐ種がプレα阻害剤（ＰａＩ）である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記ＩａＩｐ種が抗体親和性方法により単離される、本発明1037〜1039の何れかの方法。
[本発明1041]
本発明1001〜1040の何れかの方法により調製される、ＩａＩｐの水溶液。
[本発明1042]
前記溶液のタンパク質含有量の少なくとも90％がＩａＩｐである、本発明1041の水溶液。
[本発明1043]
本発明1001〜1040の何れかの方法により調製される、ＩａＩｐの医薬組成物。
[本発明1044]
前記溶液のタンパク質含有量の少なくとも95％がＩａＩｐである、本発明1043の医薬組成物。
[本発明1045]
静脈内投与のために製剤化される、本発明1043又は1044の医薬組成物。
[本発明1046]
ＩａＩｐの凍結乾燥された製剤を含む、本発明1043又は1044の医薬組成物。
[本発明1047]
それを必要とする対象においてＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害を治療するための方法であって、本発明1001〜1040の何れかの方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
[本発明1048]
ＩａＩｐ機能不全に関連する前記疾患又は前記障害が敗血症である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
それを必要とする対象において増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療するための方法であって、本発明1001〜1040の何れかの方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
[本発明1050]
増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する前記疾患又は前記障害が、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症よりなる群から選択される、本発明1049の方法。
インターαトリプシン阻害（ＩａＩ）タンパク質及びプレα阻害（ＰａＩ）タンパク質のサブユニット組成及び構造様式を示す。 例示される血漿分画スキームの概要を示す。採用元はZhuo等、JBC 279 (2004): 38079-38082である。 例示される血漿分画スキームを用いた（Ａ）ＩｇＧガンマグロブリン及び（Ｂ）アルブミンの製造の間に生じた中間的血漿画分のＩａＩｐ含有量のウエスタンブロット分析を示す。 （Ａ）は出発物質として改変した画分ＩＩ＋ＩＩＩの濾過ケークを利用したＩａＩｐ精製プロセスのＤＥＡＥセファロース濃縮ステップのクロマトグラフである。（Ｂ）は抗ビクニン抗体を用いたＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーのウエスタンブロット分析である。 （Ａ）は出発物質として改変した画分ＩＩ＋ＩＩＩの濾過ケークを利用したＩａＩｐ精製プロセスのヘパリンセファロース濃縮ステップのクロマトグラフである。（Ｂ）は抗ビクニン抗体を用いたヘパリンセファロースクロマトグラフィーのウエスタンブロット分析である。 改変した画分ＩＩ＋ＩＩＩの濾過ケークから調製した濃縮ＩａＩｐ組成物のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を示す。レーン１：分子量マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、及び２０ｋＤａのマーカー）；レーン２：１μｌのＩａＩｐ組成物；レーン３：５μｌのＩａＩｐ組成物。 改変した画分ＩＩ＋ＩＩＩの濾過ケークから抽出したＩａＩｐ溶液の段階的溶離により実施したＤＥＡＥクロマトグラフィーの（Ａ）クロマトグラフ、（Ｂ）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析、及び（Ｃ）ウエスタンブロット分析である。レーン１は標準タンパク質分子量マーカーを含有し；レーン２はＤＥＡＥ樹脂上に負荷したＩａＩｐ溶液の試料を含有し；レーン３及び４はＤＥＡＥロードからの素通りの試料を含有し；レーン５は１００ｍＭ溶離ピークの試料を含有し；レーン６は１００ｍＭ溶離ショルダーの試料を含有し；レーン７は１５５ｍＭ溶離ピークの試料を含有し；レーン８は２３０ｍＭ溶離ピークの試料を含有し；そしてレーン９は市販のＨ因子標準物質を含有する。 ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより濃縮されたピークＩａＩｐ画分の段階的溶離により実施したヘパリンセファロースクロマトグラフィーの（Ａ）クロマトグラフ、（Ｂ）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析、及び（Ｃ）ウエスタンブロット分析である。レーン１は標準タンパク質分子量マーカーを含有し；レーン２はヘパリン樹脂上に負荷したＩａＩｐ溶液の試料を含有し；レーン３、４及び５はヘパリンロードからの素通りの試料を含有し；レーン６は８０ｍＭ溶離ピークの試料を含有し；レーン７は８０ｍＭ溶離ショルダーの試料を含有し；そしてレーン８は１０７ｍＭ溶離ピークの試料を含有する。
発明の詳細な説明
１． 序論
ＩａＩｐは、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、及び腺維増殖を含む数種のヒトの病状及び疾患の状態に対する可能性のある治療薬として検討されている。ＩａＩ及びＰａＩのビクニンサブユニットはトリプシン、トロンビン、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、カテプシン、第ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ及びＸＩＩａ因子を含む血液中に認められる多くのセリンプロテアーゼを阻害するセリンプロテアーゼである。従って、多くのＩａＩｐタンパク質のビクニンサブユニットは、感染（特に敗血症）、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症の間に観察されるような、炎症カスケードの促進の間の上記セリンプロテアーゼの活性を調節する機能を有する（Pugia等、Adv Clin Chem. 2007;44:223-45）。特に、重鎖及びビクニンサブユニットの両方を含有するＩａＩｐファミリーメンバーはビクニンサブユニット単独よりも長い血管中半減期を有する。
ＩａＩｐは比較的豊富に存在する血漿タンパク質（０．６〜１．２ｍｇ／ｍＬ血漿）であるが、これらのタンパク質は、ヒト血漿の分画に特化されている種々の製造の操作から現在は廃棄されている。種々の態様のうち、本発明は、種々の分画プロセス、例えばコーン（Ｃｏｈｎ）、オンクレイ（Ｏｎｃｌｅｙ）、コーン−オンクレイ、ドイッチュ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）、ニッチェマン（Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）、キストラー（Ｋｉｓｔｌｅｒ）及び同様の分画プロセスの廃棄画分から、他の血漿由来産物の製造のために使用される血漿の通常又は確立された処理に影響したり、損壊を与えたり、又はこれを改変することなく、ＩａＩｐを単離するための方法を提供する。即ち、１つの態様において、本発明は、敗血症及び他の障害の治療のために有用な医薬の製造のための廃棄血漿画分を使用する。
従って、ある特定の実施形態においては、血漿原料、例えばプールされた血漿からＩａＩｐの水性組成物、凍結乾燥組成物及び医薬組成物を製造する方法を提供することが本発明の目的である。好都合には、本明細書においては、ＩｇＧガンマグロブリン及びアルブミンのような他の血液産物の製造の間に生じる未使用の血漿画分からＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。
１つの実施形態において、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ｉ）血漿試料から画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するステップ；（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を形成するために、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁するステップ；（ｉｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を固相に接触させて画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液からＩａＩｐを除去するステップ；及び、（ｉｖ）固相からＩａＩｐを抽出して濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。特定の実施形態においては、固相は超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む。別の特定の実施形態においては、固相は濾過助剤を含む。
１つの実施形態において、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ；（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；（ｃ）懸濁液を形成するために第２の沈殿物を再懸濁するステップ；（ｄ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｃ）の懸濁液と混合するステップ；（ｅ）懸濁液をフィルタープレスで濾過することにより濾過ケーク及び上澄みを形成するステップ；並びに、（ｆ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
別の実施形態においては、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）沈殿物を得るために血漿試料からＩａＩｐを沈殿させるステップ；（ｂ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含み、沈殿物は画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−Ｉ、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物である。
濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための特定の実施形態においては、画分Ｉの沈殿物を形成するステップは、第１の沈殿ステップにおいて、画分Ｉの沈殿物を得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させることを含む。
ＩａＩｐを画分ＩＶ−１の沈殿物から抽出する濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法の１つの特定の実施形態においては、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ；（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからタンパク質を沈殿させるステップステップ；（ｃ）第３の沈殿ステップにおいて、第３の沈殿物及び第３の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて第２の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに、（ｄ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で第３の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
ＩａＩｐを画分ＩＶ−１の沈殿物から抽出する濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法の別の特定の実施形態においては、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約６．７〜約７．２のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ；（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに、（ｃ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で第２の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法の１つの実施形態においては、ＩａＩｐは複数の血漿画分から抽出される。ある特定の実施形態においては、血漿画分は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物から選択される。１つの実施形態において、方法は、（ａ）血漿の単一のアリコートを分画してＩａＩｐ以外の少なくとも２つの血液産物の濃縮組成物を得るステップ；（ｂ）１つ以上の抽出緩衝液で血漿分画の間に生じた少なくとも２つの異なる廃棄画分からＩａＩｐを抽出するステップ；及び、（ｃ）抽出されたＩａＩｐ画分をプールすることにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。１つの実施形態において、２つの他の血液製剤はＩｇＧガンマグロブリン（例えばＩＶＩＧ）及びアルブミンである。更に他の実施形態において、血漿はＩａＩｐ以外の少なくとも３種の血液製剤を得るために分画される。この方法で得ることができ得る血液製剤の非限定的な例は、ＩｇＧガンマグロブリン（例えばＩＶＩＧ）、アルブミン、第８因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物、抗トロンビンＩＩＩ複合体、第ＶＩＩＩ因子、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、プロトロンビン複合体（第ＶＩＩ因子存在下又は非存在下）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）等を含む。
濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法のいくつかの実施形態においては、ＩａＩｐは抽出されたＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿排除することにより更に濃縮される。１つの実施形態において、不純物は約６．０〜約８．０のｐＨにおいて約１０％〜約１９％アルコール（例えばエタノール）を用いて沈殿させる。他の実施形態において、ＩａＩｐは抽出されたＩａＩｐ組成物からＩａＩｐを沈殿させることにより更に濃縮される。１つの実施形態において、ＩａＩｐは約６．０〜約８．０のｐＨにおいて約２０％〜約２５％アルコールを用いて抽出物から沈殿させる。
濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法のある特定の実施形態において、血漿画分から回収されたＩａＩｐは、濃縮ＩａＩｐ組成物由来のＩａＩｐをアニオン交換樹脂に結合させるステップ；及び、溶離緩衝液を用いてアニオン交換樹脂からＩａＩｐを溶離させることにより、ＩａＩｐを含有する第１の溶離液を形成するステップにより更に精製されてよい。他の実施形態において、血漿画分から回収されたＩａＩｐは、ＩａＩｐをヘパリン親和性樹脂に結合させるステップ；及び溶離緩衝液を用いてヘパリン親和性樹脂からＩａＩｐを溶離させるステップにより更に精製されてよい。更に他の実施形態においては、アニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーの両方によりＩａＩｐを更に濃縮してよい。１つの実施形態において、ＩａＩｐは先ずアニオン交換樹脂に結合させ、そして次にヘパリン親和性樹脂に結合させる。他の実施形態において、ＩａＩｐを先ずヘパリン親和性樹脂に結合させ、そして次にアニオン交換樹脂に結合させる。
更に別の実施形態において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ；（ｂ）アニオン交換樹脂にＩａＩｐ及びＨ因子を結合させるステップ；（ｃ）第１の溶離緩衝液で樹脂からＨ因子を溶離させるステップ；並びに、（ｄ）第２の溶離緩衝液で樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。関連の実施形態において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ；（ｂ）アニオン交換樹脂にＨ因子が結合しない条件下でアニオン交換樹脂にＩａＩｐを結合させるステップ；並びに、（ｃ）溶離緩衝液で樹脂からＩａＩｐを溶離することにより濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐ組成物はヘパリン親和性クロマトグラフィーにより更に濃縮される。
ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐを生産するための方法は、単一のインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）種の単離を含む。１つの実施形態において、ＩａＩｐ種はインターαトリプシン阻害剤（ＩａＩ）である。別の実施形態においては、ＩａＩｐ種はプレα阻害剤（ＰａＩ）である。ある特定の実施形態においては、単一のＩａＩｐ種は親和性ステップ、例えば抗体又はアプタマー親和性方法により単離される。
他の態様においては、本明細書において提供される方法に従って調製される例えばプールされた血漿のような血漿原料からＩａＩｐの水性組成物、凍結乾燥組成物、及び医薬組成物を提供することが、本発明の目的である。
更に別の態様において、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与することによる、低下ＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する障害及び疾患の治療の方法を提供することが、本発明の目的である。１つの実施形態において、低ＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害は敗血症である。
別の態様においては、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与することによる、増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患及び障害の治療の方法を提供することが、本発明の目的である。１つの実施形態において、増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害は、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症から選択される。
ＩＩ．定義
本明細書において使用する場合、「インターα阻害タンパク質」又は「ＩａＩｐ」とは、α−１−マイクログロブリン／ビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ；ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ：２３１９４８、ビクニンポリペプチド）、インターα（グロブリン）阻害Ｈ１遺伝子（ＩＴＩＨ１；ＵｎｉＧｅｎｅＩＤ：２２４１７３、Ｈ１ポリペプチド）、インターα（グロブリン）阻害Ｈ２遺伝子（ＩＴＩＨ２；Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ：１３９７８２、Ｈ２ポリペプチド）、インターα（グロブリン）阻害Ｈ３遺伝子（ＩＴＩＨ３；ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ：１４００１７、Ｈ３ポリペプチド）、又はインターα（グロブリン）阻害Ｈ４（血漿中カリクレイン感受性糖タンパク質、Ｈ４ポリペプチド）遺伝子（ＩＴＩＨ４；ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ：３３２１６１３）の１つ以上によりコードされるポリペプチドよりなる血漿中プロテアーゼ阻害剤のファミリーを指す。例示的なＩａＩｐプロテアーゼ阻害剤は限定しないが、ＩａＩ（ビクニン、Ｈ１及びＨ２ポリペプチド）；ＰａＩ（ビクニン及びＨ３ポリペプチド）、ＩａＬＩ（ビクニン及びＨ２ポリペプチド）、ＩａＩＨ４Ｐ（Ｈ４ポリペプチド）、及びビクニン（Ｓａｌｉｅｒ、Ｊ．等、上出）を含む。
本明細書において使用する場合、「脱クリオ血漿」とは凍結温度付近、例えば約１０℃未満の温度での、血漿又はプールされた血漿の低温沈殿（クリオプレシピテーション）の後に形成される上澄みを指す。本発明の文脈においては、血漿とは、回収された血漿（即ちエクスビボの全血から分離されている血漿）、又は原料血漿（即ち血漿瀉血により収集された血漿）を互換的に指し得る。クリオプレシピテーションは例えば安全性及び品質の問題に関して既にアッセイされている予め凍結されたプール血漿を解凍することにより一般的には実施されるが、新鮮血漿を使用してもよい。ある特定の実施形態においては、解凍は典型的には６℃を超えない温度で実施される。低温における凍結血漿の完全な解凍の後、低温（例えば６℃以下）で遠心分離を行うことにより、液体上澄みから固体のクリオプレシピテートを分離する。或いは、分離は遠心分離ではなくろ過により実施することができる。
本明細書において使用する場合、「コーンプール」とは血漿試料又は血漿試料のプールの分画のために使用される出発物質をさす。コーンプールは予備処理ステップに供されていてもいなくてもよい、全血漿、脱クリオ血漿試料、及び脱クリオ血漿試料のプールを含む。ある特定の実施形態においては、コーンプールは、予備処理ステップ、例えば固相（例えば水酸化アルミニウム、超微粒子状二酸化ケイ素等）への吸着、又は、クロマトグラフィーステップ（例えばイオン交換又はヘパリン親和性クロマトグラフィー）において１つ以上の血液因子が除去されている脱クリオ血漿試料である。種々の血液因子、例えば限定しないが、第８因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物、又は抗トロンビンＩＩＩ複合体を脱クリオ血漿試料から分離することによりコーンプールを形成してよい。
本明細書において使用する場合、「画分ＩＩ+ＩＩＩ濾過ケーク」とは吸着材によるコーン−オンクレイ又は等価な画分ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液の処理の後に回収される固相を指す。一般に、画分ＩＩ+ＩＩＩ懸濁液は、脂質、フィブリノーゲン、アミド分解活性、プレカリクレイン活性及びリポタンパク質のような不純物を除去するために、吸着材、例えば、超微粒子状二酸化ケイ素で処理される。清浄化した画分ＩＩ＋ＩＩＩの上澄みの分離により、回収された固相物質は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークと称される。
本明細書において使用する場合、「超微粒子状二酸化ケイ素」又は「超微粒子状シリカ」とは、自身の表面へのＩａＩｐの吸着を可能にする様式で製造された式ＳｉＯ２を有するケイ素の酸化物を指す。本発明の方法における使用に適する超微粒子状二酸化ケイ素の例示的な形態はヒュームドシリカ、焼成シリカ、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（商標）、コロイド状シリカ、珪藻土などを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態においては、市販の親水性ヒュームドシリカ製品を血漿画分からのＩａＩｐの吸着のために使用する。これらの製品の非限定的な例は、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）の商品名の下にＥｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから販売されているもの（例えばＡｅｒｏｓｉｌ ９０、Ａｅｒｏｓｉｌ １３０、Ａｅｒｏｓｉｌ １５０、Ａｅｒｏｓｉｌ ２００、Ａｅｒｏｓｉｌ ３００、Ａｅｒｏｓｉｌ ３８０、Ａｅｒｏｓｉｌ ＯＸ ５０、Ａｅｒｏｓｉｌ ＥＧ ５０、Ａｅｒｏｓｉｌ ＴＴ ６００、Ａｅｒｏｓｉｌ ２００ ＳＰ、Ａｅｒｏｓｉｌ ３００ ＳＰ及びＡｅｒｏｓｉｌ ３００／３０）を含む。
本明細書において使用する場合、「ＩａＩｐ機能不全又は調節不全に関連する疾患又は障害」とは、対象におけるＩａＩｐ活性の低下したレベルによりもたらされるか、それにより強化されるか、それを特徴とするか、又はそれをもたらす、対象における何れかの疾患、障害、又は状態を指す。いくつかの例においては、ＩａＩｐ機能不全又は調節不全に関連する疾患又は障害はＩａＩｐサブユニットをコードする遺伝子の何れかにおける突然変異及び多形によりもたらされるか又はそれに関連している症状を含む。同様に、「ＩａＩｐ機能に関連する疾患又は障害」とは、対象におけるＩａＩｐ活性の低下したレベルによりもたらされるか、それにより強化されるか、それを特徴とするか、又はそれをもたらす、対象における何れかの疾患、障害、又は状態を指す。ＩａＩｐ機能不全又は低下したＩａＩｐ機能に関連する疾患及び障害は、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、及び腺維増殖を含むがこれらに限定されない。
本明細書において使用する場合、「増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害」とは、血液中で観察されるセリンプロテアーゼ活性の増大によりもたらされるか、それにより強化されるか、それを特徴とするか、又はそれをもたらし、そして、それに対するビクニン又はビクニン含有タンパク質（例えばＩａＩｐタンパク質）の投与が血漿中セリンプロテアーゼ活性の低下をもたらす、対象における何れかの疾患、障害、又は状態を指す。種々のセリンプロテアーゼが増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に寄与している可能性があり、例えばトリプシン、トロンビン、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、カテプシン、第ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ及びＸＩＩａ因子が挙げられるがこれらに限定されない。増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患及び障害は、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症を含むがこれらに限定されない。
本明細書において使用する場合、「限外濾過（ＵＦ）」という用語は、流体静力学的圧力が液体を半透膜に対抗させる種々の膜濾過方法を包含する。高分子量の懸濁固体又は溶質が保持され、そして水及び低分子量の溶質は膜を通過する。この分離プロセスは巨大分子（１０３〜１０６Ｄａ）の溶液、特にタンパク質溶液を精製及び濃縮するために頻繁に使用される。多くの限外濾過膜が、それらが保持する分子のサイズに応じて入手可能である。限外濾過は典型的には１〜１０００ｋＤａの膜孔径及び０．０１〜１０ｂａｒの操作圧力を特徴とし、そして糖類及び塩類のような小型分子からタンパク質のようなコロイド類を分離するために特に有用である。
本明細書において使用する場合、「透析濾過」という用語は限外濾過と同じ膜を用いて実施され、そして接線流濾過である。透析濾過の間、緩衝液をリサイクルタンク内に導入し、その間濾液は装置運転から除去される。生成物が残余分中にある（例えばＨ因子）プロセスにおいては、透析濾過は生成物プールから濾液中に成分を洗い出し、これにより緩衝液を交換し、そして望まない分子種の濃度を低下させる。
本明細書において使用する場合、「約」という用語は特定の値から±１０％の概ねの範囲を指す。例えば「約２０％」という表現は１８〜２２％の範囲を含む。
本明細書において使用する場合、「混合する」という用語は、何れかの形態の攪拌により、溶液又は懸濁液中に２種以上の異なる化合物又は物質の等しい分布をもたらす作業を指す。溶液又は懸濁液中の全ての成分の完全な等しい分布は、用語を本出願において使用する場合の「混合」の結果として必要とされない。
本明細書において使用する場合、「溶媒」という用語は１つ以上の他の物質を溶解又は分散させることができる何れかの液体物質を包含する。溶媒は無機の性質のもの、例えば水であってよいか、又は、それは有機性の液体、例えばエタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテル等であってよい。「溶媒洗浄剤処理」という用語において使用される場合、溶媒とは、溶液中の脂質エンベロープウィルスを不活性化するために使用される溶媒洗浄剤混合物の部分である有機溶媒（例えばトリ−Ｎ−ブチルホスフェート）を指す。
本明細書において使用する場合、「洗浄剤」という用語は「界面活性剤」又は「表面作用剤」という用語と互換的に本出願中で使用する。界面活性剤は典型的には両親媒性、即ち有機溶媒及び水の両方において界面活性剤を可溶性とする、疎水性の基（「テール」）及び親水性の基（「ヘッド」）の両方を含有する有機化合物である。界面活性剤はそのヘッドにおける形式上荷電している基の存在により分類できる。非イオン系界面活性剤はそのヘッドに荷電基を有さず、そしてイオン系界面活性剤はそのヘッド部に実質電荷を担持している。両性イオン系界面活性剤は２つの逆に荷電した基を有するヘッドを含有する。一般的な界面活性剤のいくつかの例は、アニオン系（スルフェート、スルホネート又はカルボキシレートのアニオン系である）：パーフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡ又はＰＦＯ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、及び他のアルキルスルフェート塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、即ちＳＬＥＳとしても知られている）、アルキルベンゼンスルホネート；カチオン系（第４アンモニウムカチオン系）：臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、別名臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、及び他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化タローアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）；長鎖脂肪酸及びその塩：例えば、カプリレート、カプリル酸、ヘプタノエート、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ノナン酸、デカン酸等；両性イオン系（両性）：ドデシルベタイン；コカミドプロピルベタイン；ココアンホグリシネート；ノニオン系：アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）の共重合体（商品名Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ又はＰｏｌｏｘａｍｉｎｅ）、アルキルポリグルコシド、例えばオクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール（例えばセチルアルコール及びオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、等）、トリトン洗浄剤、及びドデシルジメチルアミンオキシドを含む。
本明細書において使用する場合、「治療有効量又は用量」又は「十分／有効量又は用量」という用語は、その投与の目的である作用を生じさせる用量を指す。厳密な用量は治療目的に応じたものとなり、そして知られた手法を用いて当業者が確認できるものである（例えばLieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3、1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999)；及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins参照）。
本出願で用いる場合、「噴霧」という用語は、液体物質の微細液滴又は霧状物の形態における、例えば変性コーン画分Ｉ又はＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのようなアルコール沈殿ステップの間、系内に液体物質を送達する手段を指す。噴霧はスプレーヘッド又はノズルを有し、そして手動又は自動により操作することにより液体から微細きり状物を発生させる、容器（例えば噴霧瓶）のような何れかの加圧装置により達成してよい。典型的には、液体物質を受容している系を連続的に攪拌又は別様に混合することにより系内の液体の急速で等しい分布を確保しつつ噴霧を実施する。
ＩＩＩ．インターα阻害剤（ＩａＩｐ）の製造のための方法
一般に、本発明によるＩａＩｐ調製は何れかの適当な出発物質、例えば回収された血漿又は原料血漿から調製できる。典型的な例においては、血液又は血漿は健常者ドナーより収集される。通常は、ＩａＩｐ調製物を投与する対象と同じ種の動物（典型的には「相同」ＩａＩｐと称される）から血液を収集する。ＩａＩｐは適当な操作法、例えば沈殿（アルコール分画又はポリエチレングリコール分画）、クロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー等）、超遠心分離及び電気液銅による調製等により血液又は血漿から単離される。（例えばCohn等、J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Deutsch等、J. Biol. Chem. 164:109-118; Oncley等、J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Cohn等、J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950); Cohn等、Blood Cells and Plasma Proteins: Their State in Nature (J.L. Tullis, ed), pp. 1-58, Academic Press, NewYork and London (1953); Nischmann等、Helv. Chim. Acta 37:866-873; Kistler and Nischmann, Vox Sang. 7:414-424 (1962); Barundern等、Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet等、Vox Sang. 13:93-102 (1967);米国特許第５，１２２，３７３号及び同第５，１７７，１９４号を参照でき;これらの開示内容は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐは、血漿分画による他の商業的に重要な血液産物の製造の間にそれ以外では廃棄される物質から回収される。例えば、例示される実施形態においては、ＩａＩｐはコーン画分Ｉ又は画分ＩＶ−１の沈殿物（Cohn等(1946)、上出）、コーン−オンクレイ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物（Oncley等、上出）、キストラー及びニッチェマンの沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物（Kistler and Nischmann、上出）から抽出されるか、又はＩｇＧガンマグロブリンの工業的製造の間に形成されるコーン−オンクレイ画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液（Oncley等、上出）から吸着される。好都合には、本明細書に提供される方法によれば、ＩａＩｐの工業規模調製は、追加の投入血漿、又は、他の商業的に重要な血漿由来血液産物、例えば静脈内（ＩＶＩＧ）又は皮下投与のためのＩｇＧガンマグロブリン又はアルブミンに関する既存の製造プロセスの再設計及び法制上の再認可を必要とすることなく、達成することができる。
１つの態様において、本発明は、ＩａＩｐ含有沈殿物を形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップこと；及び（ｃ）ＩａＩｐ含有沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより濃縮ＩａＩｐ組成物を形成することによる、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＩａＩｐ含有沈殿物は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー−ニッチェマン沈殿物Ａ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物Ｂよりなる群から選択される。
特定の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法はアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することにより、ＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、並びに、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップ含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することにより、ＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップ含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、並びに、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物を形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、並びに、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物を形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、並びに、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物Ａを形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物ＡからＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物AからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
特定の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物Ｂを形成するために、少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿又はそれに由来する画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップを含む。１つの実施形態において、方法は、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿４」ステップにおいて）及び沈殿した不純物をＩａＩｐ含有上澄みから分離することによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の実施形態においては、方法は、組成物からＩａＩｐを沈殿させること（即ち「ＩａＩｐ沈殿５」ステップにおいて）によりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。特定の実施形態においては、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。別の特定の実施形態においては、方法は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。１つの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐ組成物を濃縮するステップを更に含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、及び、得られた上澄みからヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、並びに、得られた上澄みからアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
別の実施形態においては、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からアニオン交換クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び、得られた沈殿物からヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの実施形態において、方法は、キストラー−ニッチェマン沈殿物ＢからＩａＩｐを抽出するステップ、組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、得られた上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、並びに、得られた沈殿物からアニオン交換及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを濃縮するステップを含む。
１つの態様において、本発明は、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供する。
特定の実施形態においては、濃縮されたＩａＩｐ組成物は更に、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからの抽出の後に、精製されてよい。ＩａＩｐを更に精製するために種々の方法が使用でき、限定しないが例えば、追加の沈殿ステップ又は分画、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理、ナノ濾過、限外濾過、透析濾過等を含む。
１つの実施形態において、方法は、濃縮されたＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させるステップを更に含む。特定の実施形態においては、このステップは、組成物から少なくとも１つの不純物、例えば脂質又はタンパク質を沈殿させること、そして次にＩａＩｐを含有する上澄みから沈殿物を分離することを含む。任意で、次にＩａＩｐを別の沈殿において上澄みから沈殿させることができる。
好都合には、濃縮組成物からのＩａＩｐの沈殿及びその後の再懸濁は、クロマトグラフィー又はナノ濾過のような追加的な精製ステップの前に体積の減少を可能にする。１つの実施形態において、濃縮ＩａＩｐ組成物は、濃縮組成物からＩａＩｐを沈殿排除することにより、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからの抽出の後に更に精製してよい。特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物は上記の通り組成物から少なくとも１つの不純物を除去するための第１の沈殿ステップ、そして次に、ＩａＩｐを沈殿及び回収するための第２の沈殿ステップに供されてよい。
特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法は、組成物の純度を更に濃縮するために少なくとも１つ、好ましくは２つのクロマトグラフィーステップを更に含む。一般に、何れかの適当なクロマトグラフィー方法を使用して画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出されたＩａＩｐ組成物を更に濃縮してよい。ある特定の実施形態においては、クロマトグラフィー濃縮の前に、抽出されたＩａＩｐ組成物を上記の通り１つ以上の追加の沈殿ステップに供することにより、組成物中に存在する不純物を低減し、クロマトグラフィーのステップのための負荷量を低減し、及び／又は、組成物の緩衝液を交換する。
ある特定の実施形態においては、クロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、疎水***換クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＰ）、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（即ちゲル濾過）、又は他の適当なクロマトグラフィーのステップを含んでよい。クロマトグラフィーステップはバッチ又はカラムモードの何れかで実施してよい。
好ましい実施形態においては、方法はアニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン親和性クロマトグラフィーの使用を含む。
ある特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物の調製のための本明細書において提供される方法は少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つのウィルス不活性化又は除去のステップを更に含む。本明細書において提供される方法と共に使用してよいウィルス不活性化又は除去のステップの非限定的な例は、溶媒洗浄剤処理（Horowitz等、Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28及びKreil等、Transfusion 2003 (43):1023-1028、これら両方は全ての目的のために参照により全体が明示的に本明細書に組み込まれる）、ナノ濾過（Hamamoto等、Vox Sang 1989 (56)230-236 及びYuasa等、J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024、これら両方は全ての目的のために参照により全体が明示的に本明細書に組み込まれる）、高温における低ｐＨインキュベーション（Kempf等、Transfusion 1991 (31)423-427及びLouie 等、Biologicals 1994 (22):13-19）、及び凍結乾燥Ｈ因子組成物の熱処理（Piszkiewicz等、Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz等、Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40）を含む。
１つの実施形態において、本発明は、（ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）画分Ｉ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）沈殿物Ａの沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）沈殿物Ｂの沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、及び（ｉｖ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む、ウィルス的に安全な濃縮ＩａＩｐ組成物を調製する方法を提供する。
１つの態様において、血漿分画により他の商業的に重要な血液産物の製造の間に、それ以外では廃棄される物質から単離されたＩａＩｐ、例えば画分Ｉ、画分ＩＶ−１、又は沈殿物Ｂの沈殿物又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークは、大規模製造プロセスに適合しやすい一連の段階的溶離によるクロマトグラフィーにより更に濃縮されてよい。１つの実施形態において、ＤＥＡＥセファロース及びヘパリンセファロースクロマトグラフィー樹脂を適当な緩衝液系、例えば２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含有するものとともに使用する。
ＩａＩｐ組成物のクロマトグラフィー濃縮はｐＨ８．０におけるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ以外の緩衝液系を使用するように変更することができる。これらのプロセスは生物製剤の製造において一般に使用されている緩衝液及び溶液に対して適応させることができる。一例はｐＨ７．０においてリン酸緩衝液を用いる精製スキームである。精製を良好に行うための重要なパラメーターは所望の化合物の分離を達成するための伝導度又はイオン強度の操作である。緩衝液系のｐＨがｐＨ８．０に維持されている場合、溶離緩衝液の伝導度は本明細書に記載した精製プロセスにマッチさせなければならない。緩衝液計のｐＨが変化する場合、クロマトグラフィープロセスの最適化において使用される標準的手法を用いて行えるイオン強度の何らかの調節が必要となる。
Ａ．アルコール沈殿及びクロマトグラフィー分画の方法
１つの態様において、本発明は、第２の血液因子の製造プロセスの間に、それ以外では廃棄される物質からのＩａＩｐの濃縮組成物の調製のための方法を提供する。例示の実施形態においては、ＩａＩｐは静脈内（即ちＩＶＩＧ）、皮下、及び／又は、筋肉内の投与のために製剤化されるＩｇＧ組成物のような血漿由来ＩｇＧ組成物のための製造方法により生じる画分から回収できる。第２の例示の実施形態においては、ＩａＩｐは血漿由来アルブミンのための製造プロセスにより生じる画分から回収できる。
好ましい実施形態においては、Ｈ因子の濃縮組成物の調製のための方法を提供すし、方法は、（ｉ）画分Ｉの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１の沈殿物、沈殿物Ａの沈殿物、沈殿物Ｂの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液、及び／又は画分ＩＩ＋ＩＩＩの濾過ケークからＨ因子を抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；並びに（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施するステップを含む。
１つの実施形態において、ＩｇＧ又はアルブミンの製造プロセスの間に、それ以外では廃棄される物質からのＩａＩｐの濃縮組成物の調製のための方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含む。
１.脱クリオ血漿の調製
ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐ、Ｈ因子及びＩｇＧ組成物の調製のために使用される出発物質は、一般に、回収された血漿（即ちエクスビボで全血から分離されている血漿）又は原料血漿（即ち血漿瀉血を介して収集された血漿）の何れかよりなる。精製プロセスは典型的には、安全性及び品質の問題に関して既にアッセイされている予め凍結されたプール血漿を解凍することにより開始されるが、新鮮血漿を使用してもよい。ある特定の実施形態においては、解凍は典型的には６℃を超えない又は約６℃を超えない温度で実施される。低温における凍結血漿の完全な解凍の後、低温（例えば６℃以下）で遠心分離を行うことにより、液体上澄みから固体のクリオプレシピテートを分離する。或いは、分離ステップは遠心分離ではなく濾過により実施することができる。液体上澄み（新たに解凍した血漿から遠心分離による低温不溶性タンパク質除去の後は「脱クリオ血漿」とも称される）を次いで、次ステップにおいて処理する。この分岐点において種々の追加的ステップをとることにより、他の血液凝固因子及び阻害剤、例えば第８因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ），第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子又は抗トロンビンＩＩＩ複合体の単離を行うことができる。
２．第１の沈殿ステップ−画分Ｉの沈殿
脱クリオ血漿の調製の後、溶液は典型的には０±１℃又は約０±１℃に冷却され、そしてｐＨは７．０〜７．５又は約７．０〜７．５、好ましくは７．１〜７．３又は７．１〜７．３、最も好ましくは約７．２に調節される。１つの実施形態において、脱クリオ血漿のｐＨは７．１〜７．３又は約７．２のｐＨに調節される。次に血漿を攪拌しながら６％〜１０％又は約６％〜１０％の目標濃度となるまで予冷エタノールを添加する。好ましい実施形態においては、エタノールは７％〜９％又は約７％〜９％の目標濃度となるように添加される。より好ましい実施形態においては、エタノールは８％（ｖ／ｖ）又は約８％（ｖ／ｖ）の目標濃度となるように添加される。同時に、温度を更に低下させて−４℃〜０℃又は約−４℃〜０℃とする。好ましい実施形態においては、温度を−２℃又は約−２℃まで低下させることによりフィブリノーゲンのような成分を沈殿させる。典型的には、沈殿事象は少なくとも１時間または少なくとも約１時間の保持時間を含むが、より短いかまたはより長い保持時間も使用してよい。その後、理想的には脱クリオ血漿中に存在するＩｇＧ含有量の全てを含有している上澄み（上澄みＩ）を次に遠心分離、濾過、又は他の適切な方法により沈殿物（画分Ｉ沈殿物）から分離する。
典型的には、画分Ｉ沈殿ステップはＩｇＧ及びアルブミンのような血漿由来血液因子の製造プロセスにおいて不純物を除去するために実施される。好都合なことに、ＩａＩｐの意味ある画分が製造プロセスの間に通常は廃棄されるこの沈殿物中に存在することがわかった。従って、１つの実施形態において、ＩａＩｐを画分Ｉ沈殿物から抽出する。画分Ｉ沈殿物からのＩａＩｐの抽出のための適当な緩衝液及び方法を本明細書において提供される。
脱クリオ血漿のための第１の分画ステップとして使用される従来の方法（Cohn等、上出; Oncley等、上出）と比較して、本発明は幾つかの実施形態において血漿因子（例えばＩａＩｐ、Ｈ因子、ＩｇＧ、アルブミン等）の向上した収量をもたらす方法を提供する。１つの実施形態において、沈殿用のアルコールは添加時点においてアルコールを細密に分散させるか急速に分散させる様式で添加する。１つの実施形態において、アルコールは噴霧により添加される。第２の実施形態において、アルコールは攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。これらの機序の何れかによるアルコールの添加は、例えば流し込みの時点において生じ、そしてタンパク質の非可逆的変性及び／又は、それ以外では上澄み中に回収されるはずのタンパク質の沈殿をもたらすであろうアルコールの局所的過剰濃度を回避する。
別の実施形態においては、１つ以上のｐＨ調整剤が添加時点においてｐＨ調整剤を細密に分散させるか急速に分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は噴霧により添加される。第２の実施形態において、ｐＨ調整剤は攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。第３の実施形態において、ｐＨ調整剤は脱局所的領域に渡って固体のｐＨ調節剤を散布することにより添加される。
更に別の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加後に調節される。関連の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加の間に調節される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは溶液のｐＨを連続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの時間の間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加後に７．０〜７．５又は約７．０〜７．５に調節される。他の実施形態において、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加後に７．１〜７．３又は約７．１〜７．３に調節される。更に他の実施形態において、溶液のｐＨは、沈殿用アルコールの添加後に７．０又は約７．０、あるいは７．１、７．２、７，３、７．４、又は７．５、又は約７．１、約７．２、約７，３、約７．４、あるいは約７．５に調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加後に７．２又は約７．２に調節される。従って、ある特定の実施形態においては、溶液のｐＨが沈殿用アルコールの後ではなく前に調節される類似の沈殿ステップと比較して、タンパク質変性により第１の沈殿ステップの間に非可逆的に失われる血液因子の量が低減される。
他のある特定の実施形態においては、沈殿用アルコール及び／又はｐＨを調節するために使用する溶液は流し込みによる添加ではなく、噴霧により添加する。したがって、特定の実施形態においては、アルコール及び／又はｐＨ調節用溶液を流し込みにより導入する類似の沈殿ステップと比較して、タンパク質変性による第１の沈殿ステップの間に非可逆的に失われる血液因子の量が低減される。
更に他の実施形態において、溶液のｐＨは、沈殿用アルコールの添加の後、および、流し込みによる添加によるのではなく噴霧により沈殿用アルコール及び／又はｐＨ調節用溶液を添加することにより、調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは、沈殿用アルコールの添加の後、および、流し込みによる添加によるのではなく噴霧により沈殿用アルコール及び／又はｐＨ調節用溶液を添加することにより、７．２又は約７．２に調節される。
３．第２の沈殿ステップ−画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿
画分Ｉの上澄み中に存在する関連の血液因子（例えばＩａＩｐ、Ｈ因子、ＩｇＧ、アルブミン）の含有量及び純度を富化するために、画分上澄みＩを、コーン−オンクレイ画分ＩＩ＋ＩＩＩ分画である第２の沈殿ステップに供する。一般に、溶液のｐＨは６．６〜７．２又は約６．６〜７．２のｐＨに調節される。好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは６．６〜６．８又は約６．６〜６．８に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは６．７又は約６．７のｐＨに調節される。次にアルコール、好ましくはエタノールを、攪拌しながら、２０％〜２５％（ｖ／ｖ）又は約２０％〜２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度となるように溶液に添加することにより、アルブミンの大半を上澄み中に保持しつつ、画分中に存在するＩａＩｐ、Ｈ因子及びＩｇＧを沈殿させる。好ましい実施形態においては、アルコールを終濃度２５％（ｖ／ｖ）又は約２５％（ｖ／ｖ）となるように添加することにより画分中のＩａＩｐ、Ｈ因子及びＩｇＧを沈殿させる。
好都合なことにＩｇＧの大部分は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中に存在するが、アルブミンはこれらの条件下には沈殿しないことが見出された。従って画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物はＩｇＧガンマグロブリンの製造のために処理することができ、一方上澄みはアルブミンの製造のために利用できる。残存するＩａＩｐ血漿の内容物は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物と上澄みとの間に分布しているため、ＩａＩｐ精製プロセスはこのステップにおいて分岐する。第１の経路（本明細書においてはＩｇＧ経路と称する）においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物は、ＩａＩｐが画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液及び／又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから回収できるように処理される。第２の経路（本明細書においてはアルブミン経路と称する）では画分ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みの処理を行い、そして、画分ＩＶ−１沈殿物からのＩａＩｐの回収を可能にする。
画分Ｉ上澄みへのアルコール添加の前又はそれと同時に、溶液を−５℃〜−９℃又は約−５℃〜−９℃まで更に冷却する。好ましい実施形態においては、溶液を−７℃又は約−７℃に冷却する。アルコール添加終了後、即座に溶液のｐＨを６．６〜７．２又は約６．６〜７．２に調節する。好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは６．６〜６．８又は約６．６〜６．８に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは６．９又は約６．９に調節される。典型的には、沈殿事象は少なくとも１０時間又は約１０時間の保持時間を含むが、より短いか長い保持時間も使用してよい。その後、脱クリオ血漿のＩａＩｐ含有分の大画分及びＨ因子とＩｇＧ含有分の大部分を含有する沈殿物（画分ＩＩ＋ＩＩＩ）を、遠心分離、濾過、又は他の適切な方法により上澄みから分離し、収集する。脱クリオ血漿のための第２の分画ステップとして使用されている従来の方法（Cohn等、上出; Oncley等、上出）と比較して、本発明の方法は幾つかの実施形態において修飾された画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の進歩した血液因子収量をもたらす方法を提供する。
脱クリオ血漿のための第２の分画ステップとして使用されている従来の方法（Cohn等、上出; Oncley等、上出）と比較して、本発明の方法は幾つかの実施形態において画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の改善した血液因子収量をもたらす方法を提供する。１つの実施形態において、沈殿用アルコールは添加時点においてアルコールを微細分散させるか、又はアルコールを急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、アルコールは噴霧により添加される。第２の実施形態において、アルコールは攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。
別の実施形態においては、１つ以上のｐＨ調整剤が添加時点においてｐＨ調整剤を微細分散させるか急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は噴霧により添加される。第２の実施形態において、ｐＨ調整剤は攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。第３の実施形態において、ｐＨ調整剤は脱局所的領域に渡って固体のｐＨ調整剤を散布することにより添加される。
更に別の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加後に調節される。関連の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加の間に調節される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
１つの実施形態において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップの温度は−７℃〜−９℃又は約−７℃〜−９℃である。関連の実施形態において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップにおいて使用するアルコール（例えばエタノール）の濃度は２５％（ｖ／ｖ）又は約２５％（ｖ／ｖ）であり、そして温度は−７℃〜−９℃又は約−７℃〜−９℃である。比較すると、Cohn等及びOncley等の両方は−５℃で沈殿を実施し、そしてOncley等は沈殿中の夾雑物のレベルを低減するために２０％アルコールを使用している。好都合には、本明細書において提供される方法は最終産物中の高レベルの夾雑物を伴うことなく最高のＩａＩｐ、Ｈ因子、及び／又はＩｇＧの収量を可能にする。
別の実施形態においては、沈殿ステップは−７℃〜−９℃又は約−７℃〜−９℃の温度で実施される。１つの実施形態において、沈殿ステップは−７℃又は約−７℃の温度で実施される。別の実施形態においては、沈殿ステップは−８℃又は約−８℃の温度で実施される。別の実施形態においては、沈殿ステップは−９℃又は約−９℃の温度で実施される。
特定の実施形態においては、沈殿ステップのアルコール濃度は、２０％又は約２０％〜３０％又は約３０％の間であり、好ましくは２３％又は約２３％〜２７％又は約２７％の間である。好ましい実施形態においては、アルコール濃度は、２４％又は約２４％〜２６％又は約２６％の間である。別の好ましい実施形態においては、アルコール濃度は、２５％又は約２５％である。他の実施形態において、アルコール濃度は、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％あるいは３０％、又は約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％あるいは３０％であってよい。特定の実施形態においては、第２の沈殿ステップは２５％又は約２５％のアルコール濃度で、−７℃又は約−７℃の温度で実施される。１つの実施形態において、アルコールはエタノールである。
沈殿用アルコールの添加の前に約６．９のｐＨに溶液のｐＨを調節する場合、溶液のｐＨは、部分的にはタンパク質沈殿のために、６．９から約７．４〜約７．７にシフトすることを発見した。溶液のｐＨが６．９からシフトして離れるほど、ＩｇＧの沈殿が優先されなくなり、そして特定の夾雑物の沈殿がより優先される。好都合なことに、本発明者等は、沈殿用アルコールの添加後に溶液のｐＨを調節することによりそのような高いパーセンテージのＩｇＧが画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中に回収されることを発見した。１つの実施形態において、溶液のｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の直後又はその間に６．６〜７．２又は約６．６〜７．２に調節される。別の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿インキュベーション期間の間連続的に６．６〜７．２又は約６．６〜７．２に維持される。他の実施形態において、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の直後又はその間に６．８〜７．０又は約６．８〜７．０に、又は沈殿用アルコールの添加の直後又はその間に６．７、６．８、６．９、７．０あるいは７．１、又は約６．７、約６．８、約６．９、約７．０あるいは約７．１のｐＨに調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の直後又はその間に６．９又は約６．９に調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿インキュベーション期間の間連続的に６．８〜７．０又は約６．８〜７．０に、又は沈殿インキュベーション期間の間連続的に６．９又は約６．９のｐＨに維持される。別の実施形態においては、沈殿用アルコール及びｐＨ調節用溶液の両方は流し込みによる添加ではなく、噴霧により添加される。
別の実施形態においては、溶液のｐＨはアルコール及びｐＨ調整剤の何れか又は両方の噴霧添加により、沈殿用アルコールの添加の直後又はその間に６．７〜７．１又は約６．７〜７．１に、あるいは、６．９又は約６．９に調節される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは流し込みによる添加ではなく噴霧により、沈殿用アルコール及び／又はｐＨ調節用溶液の添加により、沈殿インキュベーション期間の間、連続的にｐＨを調節することにより６．７〜７．１又は約６．７〜７．１、あるいは６．９又は約６．９に維持される。別の特定の実施形態において、沈殿ステップは、２３％〜２７％又は約２３％〜２７％、あるいは、２５％又は約２５％のアルコール濃度で、−７℃〜−９℃又は約−７℃〜−９℃、あるいは、−７℃又は約−７℃の温度で実施される。１つの実施形態において、沈殿は噴霧により２５％又は約２５％のエタノールを添加しながら−７℃又は約−７℃の温度で実施され、その場合、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加後に６．９又は約６．９に調節される。更に別の実施形態において、溶液のｐＨは沈殿インキュベーション又は保持時間全体未渡って６．９又は約６．９に維持される。
４．ＩｇＧ経路
（ａ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出
画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のＩａＩｐ、Ｈ因子及びＩｇＧの含有分を可溶化するために、冷温抽出緩衝液を用いて沈殿物１又は約１に対して抽出緩衝液１５の典型的な比において画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁させる。別の態様において、冷温抽出緩衝液を用いて沈殿物１又は約１に対して抽出緩衝液２０の典型的な比において画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁させる。他の適当な再懸濁比、例えば１：４〜１：４０又は約１：４〜１：４０、あるいは１：８〜１：３０又は約１：８〜１：３０、あるいは１：１０〜１：２０又は約１：１０〜１：２０、あるいは１：１２〜１：１８又は約１：１２〜１：１８、あるいは１：１３〜１：１７又は約１：１３〜１：１７、あるいは１：１４〜１：１６又は約１：１４〜１：１６を使用してよい。ある特定の実施形態においては、再懸濁比は、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０もしくはそれ以上、又は約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２１、約１：２２、約１：２３、約１：２４、約１：２５、約１：２６、約１：２７、約１：２８、約１：２９、約１：３０、約１：３１、約１：３２、約１：３３、約１：３４、約１：３５、約１：３６、約１：３７、約１：３８、約１：３９、約１：４０もしくはそれ以上であってよい。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストは沈殿物１又は約１に対して抽出緩衝液１５の比で再懸濁される。別の好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストは沈殿物１又は約１に対して抽出緩衝液２０の比で再懸濁される。
ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出のための適当な溶液は一般的に４．０〜５．５又は約４．０〜５．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態においては、溶液は４．３〜４．７又は約４．３〜４．７のｐＨを有し、別の実施形態においては、抽出溶液は、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４もしくは５．５、又は約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４もしくは５．５のｐＨを有する。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液のｐＨは４．３又は約４．３である。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液のｐＨは４．５又は約４．５である。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液のｐＨは４．７又は約４．７である。一般に、これらのｐＨは、例えばアセテート、シトレート、１塩基性のホスフェート、２塩基性のホスフェート、これらの混合物等から選択される緩衝剤を用いて達成できる。適当な緩衝液濃度は典型的には約２．５〜約１００ｍＭ、又は約５〜約５０ｍＭ、又は約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｍＭの緩衝液の範囲となる。
抽出緩衝液は好ましくは、０．５ｍＳ・ｃｍ−１〜２．０ｍＳ・ｃｍ−１又は約０．５ｍＳ・ｃｍ−１〜２．０ｍＳ・ｃｍ−１の伝導度を有する。例えばある特定の実施形態においては抽出緩衝液の伝導度は、０．５ｍＳ・ｃｍ−１又は約０．５ｍＳ・ｃｍ−１であるか、あるいは０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９であるか、あるいは２．０ｍＳ・ｃｍ−１又は約２．０ｍＳ・ｃｍ−１となる。当業者であれば、適切な伝導度を有する抽出緩衝液を形成するための方法を知っているであろう。
１つの特定の実施形態において、例示される抽出緩衝液は４．５±０．２又は約４．５±０．２のｐＨ及び０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍ又は約０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍの伝導度において、５ｍＭ又は約５ｍＭの１塩基性リン酸ナトリウム及び５ｍＭ又は約５ｍＭのアセテートを含有してよい。
一般に、抽出は０℃〜２０℃又は約０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜８℃又は約２℃〜８℃で実施される。特定の実施形態においては、抽出は０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃又は２０℃又は約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃又は約２０℃で実施してよい。ある特定の実施形態においては、抽出は２℃〜１０℃又は約２℃〜１０℃で実施される。典型的には、抽出プロセスはＩＩ＋ＩＩＩペーストの全ての可溶性成分が溶液となるまで連続的攪拌下で実施される。特定の実施形態においては、抽出は６０〜３００分又は約６０〜３００分、あるいは１２０〜２４０分又は１２０〜２４０分、あるいは１５０〜２１０分又は約１５０〜２１０分進行させ、その間、懸濁液を連続的に攪拌する。特定の実施形態においては、抽出プロセスは６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０分又は約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０分、あるいは３００分又は約３００分進行させる。好ましい実施形態においては、抽出プロセスは連続的に攪拌しながら少なくとも６０分間進行させる。
１つの実施形態において、抽出緩衝液は、５ｍＭ又は約５ｍＭの１塩基性リン酸ナトリウム、５ｍＭのアセテート、及び０．０５１％〜０．０６％の氷酢酸（ｖ／ｖ）を含有する。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物は４．５±０．２又は約４．５±０．２のｐＨにおいて１：１５又は約１：１５のペースト対緩衝液の比で抽出される。
１つの実施形態において、溶液のｐＨは抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは４．１〜４．９又は約４．１〜４．９に抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは４．２〜４．８又は約４．２〜４．８に抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは４．３〜４．７又は約４．３〜４．７に抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは４．４〜４．６又は約４．４〜４．６に抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。更に別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは４．５又は約４．５に抽出プロセスの持続時間に渡り維持される。
（ｂ）前処理及び画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液からのＩａＩｐの回収
好都合なことに、可溶化画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で前処理することにより、ＩｇＧ製造プロセスから、脂質、フィブリノーゲン、アミド溶解活性、プレカリクレイン活性、及びリポタンパク質のような不純物が有意に低下することがわかった。意外にも、本発明者等は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液中に見出されるＩａＩｐの大部分が画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク中に取り込まれることを発見した。例えば、実施例１はＩａＩ及びＰａＩは画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物及び濾過ケーク中に検出することができるが、二酸化ケイ素処理後の清澄化された画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁中には存在しないことを示している（図３）。更に、実施例２はＩａＩｐが二酸化ケイ素処理後に非可逆的に失われる事は無く、そして画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出できることを示している。
従って、１つの実施形態において、ＩａＩｐは画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を超微粒子状二酸化ケイ素（例えばＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標））で処理した後に画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出できる。
ある特定の実施形態においては、適当な溶解緩衝液で抽出されている画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を、懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のグラム当たり５ｍｇ〜１００ｍｇ又は約５ｍｇ〜１００ｍｇの超微粒子状二酸化ケイ素で処理する。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のグラム当たり２０ｍｇ〜８０ｍｇ又は約２０ｍｇ〜８０ｍｇの超微粒子状二酸化ケイ素で処理される。より好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のグラム当たり４０ｍｇ〜６０ｍｇ又は約４０ｍｇ〜６０ｍｇの超微粒子状二酸化ケイ素で処理される。別の好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のグラム当たり５０ｍｇ又は約５０ｍｇの超微粒子状二酸化ケイ素で処理される。特定の実施形態においては、超微粒子状二酸化ケイ素は２０ｇ／ｋｇＩＩ＋ＩＩＩペースト〜１００ｇ／ｋｇ又は約２０ｇ／ｋｇＩＩ＋ＩＩＩペースト〜１００ｇ／ｋｇＩＩ＋ＩＩＩペーストの濃度において添加される（即ち、１：１５の比で抽出される画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の場合、超微粒子状二酸化ケイ素は２０ｇ／１６ｋｇＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液〜１００ｇ／１６ｋｇ又は約２０ｇ／１６ｋｇＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液〜１００ｇ／１６ｋｇＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の濃度において、又は０．１２５％（ｗ／ｗ）〜０．６２５％（ｗ／ｗ）又は約０．１２５％（ｗ／ｗ）〜０．６２５％（ｗ／ｗ）の最終濃度において、添加しなければならない）。特定の実施形態においては、超微粒子状二酸化ケイ素は、５ ｇ／ｋｇ又は約５ ｇ／ｋｇＩＩ＋ＩＩＩペースト、あるいは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｇ／ｋｇ、又は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｇ／ｋｇＩＩ＋ＩＩＩペーストの濃度で添加してよい。１つの特定の実施形態において、超微粒子状二酸化ケイ素は４０ ｇ／１６ ｋｇ又は約４０ ｇ／１６ ｋｇＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の終濃度となるように画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液に添加する。好ましい実施形態においては、使用する超微粒子状二酸化ケイ素はＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標） ３８０又は同等品である。
一般に、超微粒子状二酸化ケイ素処理は０℃〜２０℃又は約０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜８℃又は約２℃〜８℃の温度で実施される。特定の実施形態においては、処理は、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃又は２０℃、あるいは約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃又は２０℃で実施されてよい。典型的には、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は超微粒子状二酸化ケイ素と共に少なくとも１５分間攪拌される。特定の実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は超微粒子状二酸化ケイ素と共に少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０分間、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６時間又はそれ以上、攪拌される。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は超微粒子状二酸化ケイ素と共に３０〜６０分間又は約３０〜６０分間攪拌される。別の好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液は超微粒子状二酸化ケイ素と共に少なくとも３０分間攪拌される。
特定の実施形態においては、濾過助剤、例えばＣｅｌｐｕｒｅ Ｃ３００（Ｃｅｌｐｕｒｅ）又はＨｙｆｌｏ−Ｓｕｐｐｅｒ−Ｃｅｌ（Ｗｏｒｌｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）がデプス濾過を促進するために添加されることになる。濾過助剤は約０．１ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物〜約０．７ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、又は約０．２ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物〜約０．６ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、又は約０．３ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物〜約０．５ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の終濃度で添加されることができる。特定の実施形態においては、濾過助剤は約０．１ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、又は約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６又は０．７ｋｇ／ｋｇ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の終濃度で添加される。
二酸化ケイ素処理後に画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の非可溶化吸着画分（即ち、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク）を除去するために、典型的にはデプス濾過を用いて上澄みを濾過する。本明細書において提供される方法において使用してよいデプスフィルターは金属、ガラス、セラミック、有機物（例えば珪藻土）のデプスフィルター等を含む。適当なフィルターの例はＣｕｎｏ ５０ＳＡ、Ｃｕｎｏ ９０ＳＡ及びＣｕｎｏ ＶＲ０６フィルター（Ｃｕｎｏ）を含むがこれらに限定されない。或いは、分離ステップを濾過ではなく遠心分離により実施することができる。好ましい実施形態においては、超微粒子状二酸化ケイ素処理画分ＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液は、フィルタープレス内に所在するデプスフィルターを通して濾過される。
５．アルブミン経路
（ａ）第３の沈殿ステップ−画分ＩＶ−１の沈殿物
画分ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みからＩａＩｐを回収するために、溶液は典型的には−１℃〜−９℃又は約−１℃〜−９℃に冷却され、ｐＨは５．０〜５．５又は約５．０〜５．５に調節され、そしてアルコール濃度は１８％〜２５％（ｖ／ｖ）又は約１８％〜２５％（ｖ／ｖ）に調節される。次に溶液を少なくとも４時間又は少なくとも約４時間−１℃〜−９℃又は約−１℃〜−９℃に維持することにより、完全な沈殿を可能とする。好ましい実施形態においては、溶液の温度は完全な沈殿のために−３℃〜−７℃又は約−３℃〜−７℃に維持される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に調節される。更に別の好ましい実施形態においては、アルコール濃度は２０％±１％（ｖ／ｖ）又は約２０％±１％（ｖ／ｖ）に調節される。１つの好ましい実施形態においては、沈殿は少なくとも８時間又は少なくとも約８時間進行させる。
１つの実施形態において、画分ＩＶ−１沈殿物は、溶液を−３℃〜−７℃又は約−３℃〜−７℃にまで冷却し、溶液のｐＨを５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に調節し、アルコール濃度を２０％±１％又は約２０％±１％に調節し、そして溶液の温度を少なくとも８時間又は少なくとも約８時間維持することにより形成される。
画分ＩＶ−１上澄み及び沈殿物を次に、遠心分離又は濾過のような適切な方法により分離する。好ましい実施形態においては、画分ＩＶ−１上澄みの温度は分離プロセスの間−１℃〜−７℃又は約−１℃〜−７℃に維持される。沈殿物と上澄みを分離するために濾過を使用する場合は、濾過助剤（例えばＣｅｌｐｕｒｅ３００、Ｃｅｌｉｔｅ５０１、Ｃｅｌｉｔｅ５０５又は同等品）を濾過前に添加することが好ましい。
画分ＶＩ−１沈殿物を形成する従来の方法（Cohn等、上出）と比較して、本発明は、幾つかの実施形態において、改善した血液因子収量をもたらす方法を提供する。１つの実施形態において、沈殿用アルコールは添加時点においてアルコールを微細分散させるか、又はアルコールを急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、アルコールは噴霧により添加される。第２の実施形態において、アルコールは攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。
別の実施形態においては、１つ以上のｐＨ調整剤は添加時点においてｐＨ調整剤を微細分散させるか急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は噴霧により添加される。第２の実施形態において、ｐＨ調整剤は攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。第３の実施形態において、ｐＨ調整剤は脱局所的領域に渡って固体のｐＨ調整剤を散布することにより添加される。
更に別の実施形態において、沈殿用アルコール及びｐＨ調節用溶液の両方は添加時点においてｐＨ調整剤を微細分散させるか急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、沈殿用アルコール及びｐＨ調節用溶液の両方は流し込みによる添加ではなく、噴霧により添加される。
更に別の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加後に調節される。関連の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加の間に調節される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコール濃度の調節の直後又はその間に５．２〜５．３又は約５．２〜５．３とされる。別の実施形態においては、プロセスの改善は沈殿インキュベーション期間の間、連続して溶液のｐＨを５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に維持することにより実現される。他の実施形態において、溶液のｐＨは沈殿用アルコール濃度の調節の直後又はその間に５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に、又は沈殿用アルコール濃度の調節の直後又はその間に４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０又はそれ以上、あるいは約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０又はそれ以上のｐＨに調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコール濃度の調節の直後又はその間に５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコール濃度の調節の間、連続して５．２〜５．３又は約５．２〜５．３に維持される。１つの実施形態において、ｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。１つの実施形態において、アルコールはエタノールである。
（ｂ）代替のアルブミン経路−画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物
或いは、画分ＩＶ−１沈殿物は異なる血漿画分、例えば画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みから形成されてもよい。典型的には、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿は脱クリオ血漿画分のｐＨを約６．５〜７．５に調節すること、画分の温度を−１℃〜−９℃又は約−１℃〜−９℃に調節すること、及び、１５％〜２５％（ｖ／ｖ）又は約１５％〜２５％（ｖ／ｖ）の終濃度までアルコールを添加することにより実施される。好ましい実施形態においては、脱クリオ血漿画分のｐＨは６．７〜７．１又は約６．７〜７．１、あるいは６．９±０．２に調節される。別の好ましい実施形態においては、血漿画分の温度は−３℃〜−７℃又は約−３℃〜−７℃に調節される。更に別の好ましい実施形態においては、アルコール（好ましくはエタノール）は２０％〜２５％（ｖ／ｖ）又は約２０％〜２５％（ｖ／ｖ）の終濃度となるように添加される。特定の実施形態においては、アルコールは２０％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）の終濃度となるように添加される。１つの実施形態において、沈殿を進行させつつ、溶液を少なくとも２時間又は少なくとも約２時間、あるいは少なくとも４、６、８、１０もしくは１２時間、又は少なくとも約４、６、８、１０又は１２時間混合する。好ましい実施形態においては、溶液を２時間又は約２時間混合し、溶液のｐＨを必要に応じて確認し、そしてｐＨの調節後少なくとも１０時間又は約１０時間、沈殿を進行させる。
好ましい実施形態においては、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿は、脱クリオ血漿画分のｐＨを６．７〜７．１又は約６．７〜７．１に調節し、画分の温度を−３℃〜−７℃又は約−３℃〜−７℃に調節し、そしてアルコールを２０％〜２５％（ｖ／ｖ）又は約２０％〜２５％（ｖ／ｖ）の終濃度となるように添加することにより実施する。
画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの上澄み及び沈殿物を次に、遠心分離又は濾過のような適切な方法により分離する。沈殿物と上澄みを分離するために濾過を使用する場合は、濾過助剤（例えばＣｅｌｐｕｒｅ ３００、Ｃｅｌｉｔｅ ５０１、Ｃｅｌｉｔｅ ５０５又は同等品）を濾過前に添加することが好ましい。回収された画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みは、次に例えば画分ＩＶ−１沈殿によりＩａＩｐを回収するために処理される。
画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成する従来の方法（Newman等、J Biol Chem. (1955) Nov;217(1):31-41）と比較して、本発明は幾つかの実施形態において、改善した血液因子収量を与える方法を提供する。１つの実施形態において、沈殿用アルコールは添加時点においてアルコールを微細分散させるか、又はアルコールを急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、アルコールは噴霧により添加される。第２の実施形態において、アルコールは攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。
別の実施形態においては、１つ以上のｐＨ調整剤が添加時点においてｐＨ調整剤を微細分散させるか急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は噴霧により添加される。第２の実施形態において、ｐＨ調整剤は攪拌器具、例えばプロペラの下方又は直接的隣接部から添加される。第３の実施形態において、ｐＨ調整剤は脱局所的領域に渡って固体のｐＨ調整剤を散布することにより添加される。
更に別の実施形態において、沈殿用アルコール及びｐＨ調節用溶液の両方は添加時点においてｐＨ調整剤を微細分散させるか急速分散させる様式で添加される。１つの実施形態において、沈殿用アルコール及びｐＨ調節用溶液の両方は流し込みによる添加ではなく、噴霧により添加される。
更に別の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加後に調節される。関連の実施形態において、溶液のｐＨはアルコールの添加の間に調節される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の後に６．５〜７．５又は約６．５〜７．５に調節される。他の実施形態において、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の後に６.７〜７.１又は約６.７〜７.１に調節される。更に他の実施形態において、溶液のｐＨは、沈殿用アルコールの添加の後に６．５又は約６．５、あるいは６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４もしくは７．５、又は約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４もしくは約７．５に調節される。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは沈殿用アルコールの添加の後に６．９又は約６．９に調節される。従って、ある特定の実施形態においては、溶液のｐＨが沈殿用アルコールの後ではなく前に調節される類似の沈殿ステップと比較して、タンパク質変性により沈殿画分において非可逆的に失われる血液因子の量が低減される。１つの実施形態において、ｐＨは溶液のｐＨを持続的に調節することにより沈殿保持又はインキュベーションの間に所望のｐＨに維持される。好ましい実施形態においては、アルコールはエタノールである。
６．ＩａＩｐの抽出
ＩａＩｐは、上記の画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ及び画分ＩＶ−１沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物A又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークのような適当な血漿分画沈殿物から、１：１〜１：４０又は約１：１〜１：４０（沈殿物１に対する抽出緩衝液）の比で沈殿物又は濾過ケークを再懸濁するために使用できるＩａＩｐ抽出緩衝液の添加により抽出してよい。好ましい実施形態においては、１：２０〜１：３０又は約１：２０〜１：３０の比で抽出緩衝液を添加することによりＩａＩｐを抽出してよい。例えば、１つの好ましい実施形態においては、１：２０又は約１：２０の比で抽出緩衝液を添加することによりＩａＩｐを抽出してよい。第２の好ましい実施形態においては、１：２５又は約１：２５の比で抽出緩衝液を添加することによりＩａＩｐを抽出してよい。更に第３の好ましい実施形態においては、１：３０又は約１：３０の比で抽出緩衝液を添加することによりＩａＩｐを抽出してよい。他の適当な再懸濁の比、例えば１：１又は約１：１あるいは１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０又はそれ以上も使用してよい。
１つの実施形態において、抽出緩衝液中に沈殿物又は濾過ケークを再懸濁することにより沈殿物又は濾過ケークからＩａＩｐを抽出できる。ある特定の実施形態においては、沈殿物又は濾過ケークを、例えば１：２５又は約１：２５あるいは１：３０又は約１：３０において抽出緩衝液の容量中に再懸濁させ、そして沈殿物又は濾過ケークのＩａＩｐ含有分が可溶化するのに十分な時間、懸濁液を攪拌する。
別の実施形態においては、沈殿物又は濾過ケーク又はペレットを通してＩａＩｐ抽出緩衝液を再循環させることにより沈殿物又は濾過ケークからＩａＩｐを抽出できる。沈殿物又は濾過ケークを濾過又はフィルタープレスにより上澄みから分離する好ましい実施形態においては、沈殿物からＩａＩｐを抽出するために十分な時間、フィルタープレスを通過させながら抽出緩衝液を再循環させる。
例えば、１つの実施形態において、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、画分Ｉ沈殿物（例えば、画分Ｉ濾過ケーク又は遠心分離ペレット）を通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、画分Ｉ濾過ケークは抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存する。
別の実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物（例えば、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物濾過ケーク又は遠心分離ペレット）を通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークは、抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存する。
別の実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過ケークを通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークは、抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存することになる。
別の実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、画分ＩＶ−１沈殿物（例えば、画分ＩＶ−１沈殿物濾過ケーク又は遠心分離ペレット）を通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、画分ＩＶ−１濾過ケークは、抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存することになる。
別の実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａの沈殿物（例えば、沈殿物Ａの沈殿物、濾過ケーク又は遠心分離ペレット）を通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、沈殿物Ａの濾過ケークは、抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存することになる。
別の実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、沈殿物１に対して抽出緩衝液３０の比において、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ｂの沈殿物（例えば、沈殿物Ｂの沈殿物、濾過ケーク又は遠心分離ペレット）を通して再懸濁又は再循環させるために使用される。他の適当な再懸濁比も使用してよく、例えば、約１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：２８、１：３９、１：４０等が挙げられる。好ましい実施形態においては、沈殿物Ｂ濾過ケークは、抽出プロセスの間上澄みから沈殿物を濾過するために使用されるフィルタープレス中に残存することになる。
好ましい実施形態においては、濾過ケーク又は沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップは、ＩａＩｐ濾過ケーク又は沈殿物を含有するフィルタープレスを通るＩａＩｐ抽出緩衝液の再循環を含む。１つの実施形態において、濾過ケーク又は沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップは少なくとも１０分間のＩａＩｐ濾過ケークを含有するフィルタープレスを通るＩａＩｐ抽出緩衝液の再循環を含む。他の実施形態において、濾過ケーク又は沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップは１０〜６０分間又は約１０〜６０分間のＩａＩｐ濾過ケークを含有するフィルタープレスを通るＩａＩｐ抽出緩衝液の再循環を含む。好ましい実施形態においては、濾過ケーク又は沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップは２０〜４０分間又は約２０〜４０分間のＩａＩｐ濾過ケークを含有するフィルタープレスを通るＩａＩｐ抽出緩衝液の再循環を含む。更に他の実施形態において、濾過ケーク又は沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップは、１０分間又は少なくとも約１０分間、あるいは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５もしくは９０分又は約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５もしくは９０分、又はそれ以上（例えば少なくとも２、３、４、５もしくは６時間又は約２、３、４、５もしくは６時間）のＩａＩｐ濾過ケークを含有するフィルタープレスを通るＩａＩｐ抽出緩衝液の再循環を含む。
一般に、抽出は、０℃〜２０℃又は約０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜８℃又は約２℃〜８℃において実施される。特定の実施形態においては、抽出は、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃、あるいは約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、８℃、約９℃、又は約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、又は約２０℃において実施してよい。特定の実施形態においては、抽出は２℃〜１０℃又は約２℃〜１０℃で実施される。
何れかの適当な緩衝液を沈殿物又は濾過ケークからのＩａＩｐの抽出のために用いてよい。典型的な抽出緩衝液は少なくとも緩衝剤及び塩を含有する。ある特定の実施形態においては、抽出緩衝液は１０〜２５０ｍＭ又は約１０〜２５０ｍＭの緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態においては、緩衝剤は、１０ｍＭ又は約１０ｍＭ、あるいは２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０ｍＭもしくはそれ以上、又は約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０ｍＭもしくはそれ以上の緩衝剤の濃度で存在する。ある特定の実施形態においては、抽出緩衝液は５〜１００ｍＳ／ｃｍ又は約５〜１００ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。特定の実施形態においては、抽出緩衝液は５０〜５００ｍＭ又は約５０〜５００ｍＭの塩を含有する。ある特定の実施形態においては、塩は５０ｍＭ又は約５０ｍＭ、あるいは７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭもしくはそれ以上、又は約７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭもしくはそれ以上の塩の濃度で存在する。
ＩａＩｐ抽出緩衝液は一般に６．０〜９．０又は約６．０〜９．０のｐＨを有する。特定の実施形態においては、Ｈ因子抽出緩衝液は６．０又は約６．０、あるいは６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０、又は約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９もしくは約９．０のｐＨを有する。好ましい実施形態においては、ＩａＩｐ緩衝液は７．０〜８．０又は約７．０〜８．０のｐＨを有する。特定の実施形態においては、抽出緩衝液は７．０又は約７．０のｐＨを有する。別の特定の実施形態においては、抽出緩衝液は７．５又は約７．５のｐＨを有する。別の特定の実施形態においては、抽出緩衝液は８．０又は約８．０のｐＨを有する。ＩａＩｐ抽出緩衝液の処方のために使用してよい緩衝剤の非限定的な例は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、カコジル酸、イミダゾール、ホウ酸、ビシン、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ−プロパン、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、トリシン、トリエタノールアミン、及びＴｒｉｓを含む。
好ましい実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；２００ｍＭ ＮａＣｌを含むか又はこれよりなる。より好ましい実施形態においては、ＩａＩｐ抽出緩衝液は、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むか又はこれよりなる。
７．第４の沈殿ステップ−不純物の除去
１つの実施形態において、方法は、沈殿物（本明細書においては「ＩａＩｐ沈殿物４」と称する）及び上澄み（本明細書においては「ＩａＩｐ上澄み４」と称する）を形成するために、濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させるステップを更に含む。ある特定の実施形態においては、本ステップは組成物から少なくとも１つの不純物、例えば脂質又はタンパク質を沈殿させること、そして次にＩａＩｐを含有する上澄みから沈殿物を分離することを含む。血漿由来画分から不純物を沈殿させる場合に適する沈殿剤は当該分野で良く知られており、アルコール（例えばエタノール、メタノール等）、水溶性重合体（例えばＰＥＧ,、デキストラン等）、塩類（例えばリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム等）、短鎖脂肪酸（例えばヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、デカン酸等）等を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態においては、沈殿は溶液のｐHを目的成分の等電点に合致させること、即ち等電点沈殿により促進することができる。
好ましい実施形態においては、方法は、ｐH７．０〜９．０又は約７．０〜９．０において１０％〜２０％又は約１０％〜２０％エタノールを用いて濃縮ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップを含む。好ましい実施形態においては、方法は、ｐH７．３〜８．７又は約７．３〜８．７において１２％〜１８％又は約１２％〜１８％エタノールを用いて濃縮ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップを含む。より好ましい実施形態においては、方法は、ｐＨ７．５〜８．５又は約７．５〜８．５において１４％〜１６％又は約１４％〜１６％エタノールを用いて濃縮ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップを含む。より好ましい実施形態においては、方法は、ｐH７．８〜８．２又は約７．８〜８．２において１４％〜１６％又は約１４％〜１６％エタノールを用いて濃縮ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップを含む。最も好ましい実施形態においては、方法は、１５％又は約１５％のエタノール及び８．０又は約８．０のｐHを用いて濃縮ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップを含む。
沈殿剤、例えばエタノールの濃度は、１つ以上の不純物の沈殿を最大限にし、及び／又は、Ｈ因子の沈殿を最小限にするように調節し得る。特定の実施形態においては、沈殿は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％、あるいは約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％又は約２０％エタノールの添加により実施してよい。好ましい実施形態においては、沈殿は１２％〜１８％又は約１２％〜１８％エタノールの添加により実施してよい。より好ましい実施形態においては、沈殿は１３％〜１７％又は約１３％〜１７％エタノールを用いて実施してよい。より好ましい実施形態においては、沈殿は１４％〜１６％又は約１４％〜１６％エタノールを用いて実施してよい。最も好ましい実施形態においては、沈殿は１５％又は約１５％エタノールを用いて実施してよい。
溶液のｐHは、１つ以上の不純物の沈殿を最大限にし、及び／又は、ＩａＩｐの沈殿を最小限にするように調節することができる。特定の実施形態においては、溶液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０、あるいは約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９又は約９．０に調節される。好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．２〜８．８又は約７．２〜８．８に調節される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．３〜８．７又は約７．３〜８．７に調節される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．４〜８．６又は約７．４〜８．６に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．５〜８．５又は約７．５〜８．５に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．６〜８．４又は約７．６〜８．４に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．７〜８．３又は約７．７〜８．３に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．８〜８．２又は約７．８〜８．２に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは７．９〜８．１又は約７．９〜８．１に調節される。最も好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは８．０又は約８．０に調節される。
８．第５の沈殿ステップ−ＩａＩｐ沈殿
１つの実施形態において、濃縮ＩａＩｐ組成物は、沈殿物（本明細書においては「ＩａＩｐ沈殿物５」と称する）及び上澄み（本明細書においては「ＩａＩｐ上澄み５」と称する）を形成するために、画分Ｉ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１沈殿物、沈殿物Ａの沈殿物、沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからの抽出の後に、濃縮組成物からＩａＩｐを沈殿させることにより、更に精製してよい。ある特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物を、上記の通り、少なくとも１つの不純物を組成物から除去するための上記した第３の沈殿ステップに供し、そして次にＩａＩｐを沈殿させ、回収するための第４の沈殿ステップに供してよい。
好ましい実施形態においては、濃縮組成物からのＩａＩｐの沈殿は、ｐＨ５．０〜７．０又は約５．０〜７．０における２０％〜３０％又は約２０％〜３０％エタノールの添加を含む。好ましい実施形態においては、方法はｐＨ５．５〜６．５又は約５．５〜６．５で２２％〜２８％又は約２２％〜２８％エタノールを用いてＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。より好ましい実施形態においては、方法はｐＨ５．８〜６．２又は約５．８〜６．２で２４％〜２６％又は約２４％〜２６％エタノールを用いてＩａＩｐを沈殿させるステップを含む。最も好ましい実施形態においては、方法は２５％又は約２５％エタノール及び６．０又は約６．０のｐＨを用いてＩａＩｐを沈殿させるステップを含む
沈殿剤、例えばエタノールの濃度は、ＩａＩｐ沈殿物を最大限にし、及び／又は、１つ以上の不純物の沈殿を最小限にするように調節することができる。ある特定の実施形態においては、沈殿は、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％又は３０％、あるいは約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％又は約３０％エタノールの添加により実施してよい。好ましい実施形態においては、沈殿は、２２％〜２８％又は約２２％〜２８％エタノールの添加により実施される。より好ましい実施形態においては、沈殿は２３％〜２７％又は約２３％〜２７％エタノールを用いて実施される。より好ましい実施形態では、沈殿は２４％〜２６％又は約２４％〜２６％エタノールを用いて実施される。最も好ましい実施形態においては、沈殿は２５％又は約２５％エタノールを用いて実施される。
溶液のｐＨは、ＩａＩｐ沈殿を最大限にし、及び／又は、１つ以上の不純物の沈殿を最小限にするように調節することができる。ある特定の実施形態においては、溶液のｐＨは、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７．０、あるいは約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、又は約７．０に調節される。好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．２〜６．８又は約５．２〜６．８に調節される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．３〜６．７又は約５．３〜６．７に調節される。別の好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．４〜６．６又は約５．４〜６．６に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．５〜６．５又は約５．５〜６．５に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．６〜６．４又は約５．６〜６．４に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．７〜６．３又は約５．７〜６．３に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．８〜６．２又は約５．８〜６．２に調節される。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは５．９〜６．１又は約５．９〜６．１に調節される。最も好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは約６．０に調節される。
９.クロマトグラフィー法
ある特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法は更に、組成物の純度を更に濃縮するための少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のクロマトグラフィーステップを含む。一般に、何れかの適当なクロマトグラフィー法を用いて、画分Ｉ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１沈殿物、沈殿物Ａの沈殿物、沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出されたＩａＩｐ組成物を更に濃縮してよい。
特定の実施形態においては、クロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、疎水***換クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＰ）、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（即ちゲル濾過）、又は他の適当なクロマトグラフィーステップを含んでよい。クロマトグラフィーステップはバッチ又はカラムモードの何れかで実施してよい。
好ましい実施形態においては、方法は、アニオン交換樹脂にＩａＩｐを結合させるステップ；溶離緩衝駅を用いてアニオン交換樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、ＩａＩｐを含有する第１の溶離液を形成するステップを含む。より好ましい実施形態においては、方法は、アニオン交換溶離液のＩａＩｐをヘパリン親和性樹脂に結合させるステップ；及び溶離緩衝液を用いてヘパリン親和性樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、ＩａＩｐを含有する第２の溶離液を形成するステップを更に含む。ある特定の実施形態においては、クロマトグラフィー法はＩａＩｐの溶離の前にクロマトグラフィー樹脂から弱く結合している不純物を除去するための洗浄ステップを更に含んでよい。特定の実施形態においては、ＩａＩｐは例えば塩勾配を用いた勾配溶離により、又は漸増イオン強度を有する緩衝液を用いた段階的溶離により、クロマトグラフィー樹脂から溶離させてよい。
一般に、ＩａＩｐ溶液の伝導度はクロマトグラフィー樹脂上にＩａＩｐを結合させる前に適切なイオン強度に調節される。イオン強度はＩａＩｐと樹脂の間の相互作用を促進するのに十分低いが、溶液中のタンパク質の安定性を維持するのに十分高いものでなければならない。溶液のイオン強度の必要条件は使用される樹脂が何であるか（例えば強アニオン交換樹脂対弱アニオン交換樹脂）及び溶液の初期純度のような要因に応じて変動する。種々の方法を用いてＩａＩｐ組成物のイオン強度を低減して良く、例えば限定しないが、低イオン強度を有する溶液を用いた組成物の希釈、出発組成物からのＩａＩｐの沈殿及びより低いイオン強度を有する緩衝液中への再懸濁、限外濾過／透析濾過、脱塩及び／又は緩衝液交換クロマトグラフィー、透析等が挙げられる。
（ａ）アニオン交換
何れの適当なアニオン交換樹脂も本明細書において提供される方法において使用してよい。使用に適するアニオン交換樹脂の非限定的な例は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４アミノエチル（ＱＡＥ）及び第４アンモニウム（Ｑ）樹脂を含む。好ましい実施形態においては、使用するアニオン交換樹脂はＤＥＡＥ−セファロース（ジエチルアミノエチルセファロース）である。
好ましい実施形態においては、ＩａＩｐは低イオン強度ローディング緩衝液の存在下にＤＥＡＥセファロース樹脂に結合させる。典型的には、カラムは同じローディング緩衝液又はローディング緩衝液と同じイオン強度を有する適合する緩衝液を用いて平衡化させる。特定の実施形態においては、ローディング及び／又は平衡化緩衝液は１２ｍＳ／ｃｍ未満又は約１２ｍＳ／ｃｍ未満のイオン強度を有する。好ましい実施形態においては、ローディング及び／又は平衡化緩衝液は１０ｍＳ／ｃｍ未満又は約１０ｍＳ／ｃｍ未満のイオン強度を有する。最も好ましい実施形態においては、ローディング及び／又は平衡化緩衝液は９ｍＳ／ｃｍ又は約９ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。好ましい実施形態においては、ローディング及び／又は平衡化緩衝液は１００ｍＭ未満又は約１００ｍＭ未満 ＮａＣｌの塩濃度又は１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液のものよりも低値に相当するイオン強度を有する。より好ましい実施形態においては、ローディング及び／又は平衡化緩衝液は7５ｍＭ未満又は約7５ｍＭ未満のＮａＣｌの塩濃度、又はこれに相当するイオン強度を有する。より好ましい実施形態においては、塩濃度又は相当するイオン強度は３０〜７０ｍＭ又は約３０〜７０ｍＭ ＮａＣｌである。最も好ましい実施形態においては、塩濃度又は相当するイオン強度は５０ｍＭ又は約５０ｍＭ ＮａＣｌである。
任意で、ＩａＩｐを結合させた後、アニオン交換樹脂を、ローディング緩衝液と溶離緩衝液の中間のイオン強度を有する１つ以上の緩衝液で洗浄してもよい。特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は３ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ又は約３ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有してよい。好ましい実施形態においては、洗浄緩衝液は３ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ又は約５ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有してよい。別の好ましい実施形態においては、洗浄緩衝液は１０ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ又は約１０ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有してよい。ある特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は３０〜２００ｍＭ又は約３０〜２００ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。好ましい実施形態においては、洗浄緩衝液は３０〜２００ｍＭ又は約７０〜２００ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。ある特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０又は２２０ｍＭ、あるいは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０又は２２０ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。
１つの実施形態において、アニオン交換樹脂は、樹脂からのＩａＩｐの溶離の前に、樹脂からＨ因子を溶離させるのに十分なイオン強度を有する第１の緩衝液、及び樹脂から補体成分３（Ｃ３）のような不純物を溶離させるのに十分なイオン強度を有する第２の緩衝液で洗浄される。別の実施形態においては、アニオン交換樹脂は、樹脂からのＩａＩｐの溶離の前に、樹脂からＨ因子及び少なくとも第２の不純物、例えばＣ３を溶離させるのに十分なイオン強度を有する少なくとも第１の緩衝液で洗浄される。
特定の実施形態においては、ＩａＩｐは樹脂とＩａＩｐの間の相互作用を妨げるための適当なイオン強度を有する溶離緩衝液を用いてアニオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥセファロース）から溶離させる。一部の実施形態においては、溶離緩衝液は、樹脂と、ＩａＩｐよりも高い親和性で樹脂に結合する夾雑物との間の相互作用を妨げるのに適当なイオン強度を有さない。特定の実施形態においては、溶離緩衝液は少なくとも１８ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約１８ｍＳ／ｃｍ、好ましくは少なくとも２０ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約２０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。１つの実施形態において、溶離緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約２５ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。特定の実施形態においては、溶離緩衝液は少なくとも１５５ｍＭ又は少なくとも約１５５ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。特定の実施形態においては、溶離緩衝液は少なくとも１６０ｍＭ又は少なくとも約１６０ｍＭのＮａＣｌ、あるいは少なくとも約１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００又はそれ以上のＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。
（ｂ）ヘパリン親和性
何れかの適当なヘパリン親和性樹脂を本明細書において提供される方法において使用してよく、例えばヘパリンリガンドにコンジュゲートした樹脂、ヘパリンリガンドの誘導体又はミメティック、又はヘパリン様リガンド（例えば硫酸化グリコサミノグリカン）が挙げられる。好ましい実施形態においては、使用するヘパリン親和性樹脂はヘパリンセファロースである。
１つの実施形態において、ＩａＩｐはヘパリン親和性クロマトグラフィーにより更に精製される。好ましい実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィーステップの溶離液に由来するＩａＩｐは、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、例えば、ヘパリンセファロース樹脂により更に精製される。１つの実施形態において、ＩａＩｐ溶離液のイオン強度は適切な方法、例えば希釈、緩衝液交換、透析等により低減され、そしてＩａＩｐはヘパリン親和性樹脂に結合する。ある特定の実施形態においては、アニオン交換溶離液のイオン強度は１０ｍＳ／ｃｍ未満又は約１０ｍＳ／ｃｍ未満に低減される。好ましい実施形態においては、イオン強度は8ｍＳ／ｃｍ未満又は約8ｍＳ／ｃｍ未満に低減される。別の実施形態においては、イオン強度は6ｍＳ／ｃｍ未満又は約6ｍＳ／ｃｍ未満に低減される。ある特定の実施形態においては、イオン強度は４ｍＳ／ｃｍ未満又は約４ｍＳ／ｃｍ未満、あるいは５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ｍＳ／ｃｍ未満又は約５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ｍＳ／ｃｍ未満に低減されてよい。ある特定の実施形態においては、アニオン交換溶離液の塩濃度、又は相当するイオン強度は８０ｍＭ未満又は約８０ｍＭ未満 ＮａＣｌに低減される。好ましい実施形態においては、塩濃度、又は相当するイオン強度は７０ｍＭ未満又は約７０ｍＭ未満 ＮａＣｌに低減される。より好ましい実施形態においては、塩濃度、又は相当するイオン強度５０ｍＭ未満又は約５０ｍＭ未満 ＮａＣｌに低減される。ある特定の実施形態においては、塩濃度、又は相当するイオン強度は、２０ｍＭ未満又は約２０ｍＭ未満 ＮａＣｌ、あるいは２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０ｍＭ、又は約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０ｍＭ未満 ＮａＣｌに低減される。
任意で、ＩａＩｐ結合の後、ヘパリン親和性樹脂をローディング緩衝液と溶離緩衝液の中間のイオン強度を有する１つ以上の緩衝液で洗浄してよい。特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は４ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍ又は約４ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。好ましい実施形態においては、洗浄緩衝液６ｍＳ／ｃｍ〜８ｍＳ／ｃｍ又は約６ｍＳ／ｃｍ〜８ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有してよい。ある特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は４０〜８０ｍＭ又は約４０〜８０ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。好ましい実施形態においては、洗浄緩衝液は５０〜７０ｍＭ又は約５０〜７０ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。ある特定の実施形態においては、洗浄緩衝液は２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０ｍＭ、あるいは約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。
ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐは樹脂とＩａＩｐの間の相互作用を妨げるための適当なイオン強度を有する溶離緩衝液を用いてヘパリン親和性樹脂（例えばＤＥＡＥセファロース）から溶離させる。いくつかの実施形態においては、溶離緩衝液は、樹脂と、ＩａＩｐよりも高い親和性で樹脂に結合する夾雑物との間の相互作用を妨げるのに適当なイオン強度を有さない。ある特定の実施形態においては、溶離緩衝液は、少なくとも８ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約８ｍＳ／ｃｍ、あるいは少なくとも９ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約９ｍＳ／ｃｍ、あるいは少なくとも１０ｍＳ／ｃｍ又は少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。ある特定の実施形態においては、溶離緩衝液は、少なくとも８０ｍＭ又は少なくとも約８０ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。別の実施形態においては、溶離緩衝液は少なくとも１００ｍＭ又は少なくとも約１００ｍＭ ＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。ある特定の実施形態においては、溶離緩衝液は、少なくとも約７０ｍＭ ＮａＣｌ、あるいは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭもしくはそれ以上、又は少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭもしくはそれ以上のＮａＣｌに相当する塩濃度又はイオン強度を有する。
（ｃ）追加の樹脂
特定の実施形態においては、血漿由来ＩａＩｐを精製するための本明細書において提供される方法は、追加のクロマトグラフィーステップ、例えば限定しないが、カチオンクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーの使用を更に含んでよい。
何れの適当なカチオン交換樹脂も本明細書において提供される方法において使用してよい。使用に適するカチオン交換樹脂の非限定的な例は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）樹脂を含む。
何れの適当なヒドロキシアパタイト又は他のカルシウム系樹脂も本明細書において提供される方法において使用してよい。適当な樹脂の非限定的な例はヒドロキシアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、フルオロヒドロキシアパタイト樹脂等を含む。
何れの適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂も本明細書において提供される方法において使用してよい。適当な樹脂の非限定的な例はフェニル樹脂、メチル樹脂、ブチル樹脂、オクチル樹脂等を含む。
ある特定の実施形態においては、例えば、ＩａＩ又はＰａＩのような１つ以上のＩａＩｐタンパク質に高度に特異的な抗体、アプタマー又は他の結合分子にコンジュゲートされた樹脂を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによりＩａＩｐを更に濃縮してよい。
（ｄ）緩衝系
ある特定の実施形態においては、個々又は全てのクロマトグラフィーステップは、塩濃度のみが平衡、洗浄、及び溶離用の緩衝液の間で変動する共通の緩衝系に依存する。何れの適当な緩衝剤、例えばＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等も使用してよい。１つの実施形態において、ローディング緩衝液のｐＨは６．０〜９．０又は約６．０〜約９．０の範囲となる。好ましい実施形態においては、緩衝液系のｐＨは７．０〜９．０又は約７．０〜約９．０である。より好ましい実施形態においては、緩衝液系のｐＨは７．５〜８．５又は約７．５〜約８．５である。１つの好ましい実施形態においては、緩衝液系のｐＨは８．０又は約８．０となる。
１0．ウィルスの不活性化及び除去
ある特定の実施形態においては、濃縮ＩａＩｐ組成物の調製のための本明細書において提供される方法は少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つのウィルス不活性化又は除去のステップを更に含む。本明細書において提供される方法と共に使用してよいウィルスの不活性化又は除去のステップの非限定的な例は、溶媒洗浄剤処理（Horowitz等、Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28及びKreil等、Transfusion 2003 (43):1023-1028、これらは両方とも全ての目的のために参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれる）、ナノ濾過（Hamamoto等、Vox Sang 1989 (56)230-236 and Yuasa等、J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024、これらは両方とも全ての目的のために参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれる）、及び高温下の低ｐＨインキュベーション（Kempf等、Transfusion 1991 (31)423-427 及びLouie 等、Biologicals 1994 (22):13-19）を含む。
ウィルスの不活性化又は除去のステップは、製造プロセスの間に生じる何れの中間的ＩａＩｐ画分に対しても行ってよい。例えば、１つの実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは、画分Ｉ上澄み、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク抽出物、上澄み３、沈殿物４懸濁液、画分ＩＩ＋ＩＩＩ上澄み、画分ＩＶ−１懸濁液、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ懸濁液、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ｂ懸濁液、アニオン交換溶離液、ヘパリン親和性溶離液等に対して実施してよい。
１つの実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク抽出物に対して実施される。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク抽出物は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第２の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは画分ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みに対して実施される。好ましい実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ上澄みは溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第３の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは画分ＩＶ−１懸濁液に対して実施される。好ましい実施形態においては、画分ＩＶ−１懸濁液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第４の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップはキストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ懸濁液に対して実施される。好ましい実施形態においては、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ懸濁液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第５の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップはキストラー及びニッチェマン沈殿物Ｂ懸濁液に対して実施される。好ましい実施形態においては、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ｂ懸濁液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第６の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは沈殿物３上澄み（上澄み３）に対して実施される。好ましい実施形態においては、沈殿物３上澄みは溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第７の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは沈殿物４懸濁液に対して実施される。好ましい実施形態においては、沈殿物４懸濁液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。
第８の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップはアニオン交換溶離液に対して実施される。好ましい実施形態においては、アニオン交換溶離液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。別の好ましい実施形態においては、アニオン交換溶離液はナノ濾過に供される。
第９の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップはヘパリン親和性溶離液に対して実施される。好ましい実施形態においては、ヘパリン親和性溶離液は溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。別の好ましい実施形態においては、ヘパリン親和性溶離液はナノ濾過に供される。
第１０の実施形態において、ウィルスの不活性化又は除去のステップは濃縮ＩａＩｐバルク溶液に対して実施される。好ましい実施形態においては、濃縮ＩａＩｐバルク溶液はナノ濾過に供される。別の好ましい実施形態においては、濃縮ＩａＩｐバルク溶液は低ｐＨ及び／又は高温におけるインキュベーションに供される。
第１１の実施形態において、凍結乾燥されたＩａＩｐ組成物を熱処理してウィルスを不活性化する。
１つの実施形態において、２つのウィルスの不活性化又は除去のステップを含む血漿由来ＩａＩｐの製造プロセスを提供する。別の実施形態においては、プロセスはウィルス粒子の不活性化及び除去のための溶媒及び洗浄剤による処理及びナノ濾過のステップの両方を含む。更に別の実施形態において、製造プロセスは沈殿物３上澄みをＳ／Ｄ処理に、そしてヘパリン溶離液をナノ濾過に供することを含む。１つの実施形態において、製造プロセスは、沈殿物４懸濁液又はその清澄化された濾液をＳ／Ｄ処理に、そしてヘパリン溶離液をナノ濾過に供することを含む。別の実施形態においては、製造プロセスは、延長された期間、低ｐＨにおいて最終バルクＩａＩｐ組成物をインキュベートすることを含むウィルス不活性化ステップを更に含む。
（ａ）溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理
血漿由来産物中に存在し得る種々のウィルス性夾雑物を不活性化するために、１つ以上のＩａＩｐ中間溶液を溶媒洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供してよい。血漿由来因子の洗浄剤処理のための方法は当該分野で良く知られている（考察に関してはPelletier JP等、Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42を参照のこと）。一般に何れの標準的なＳ／Ｄ処理をも本明細書において提供される方法と組み合わせて使用してよい。例えば、Ｓ／Ｄ処理に関する例示となるプロトコルを以下に示す。
１つの実施形態において、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）をそれぞれ約１．０％、０．３％、及び０．３％の終濃度でＩａＩｐ中間溶液に添加する。次に混合物を少なくとも約１時間約１８℃〜約２５℃の温度で攪拌する。
１つの実施形態において、プロセスの改善は流し込み添加によるのではなく噴霧によりＳ／Ｄ試薬（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴＮＢＰ）を添加することで実現される。他の実施形態において、洗浄剤試薬を固体としてＩａＩｐ中間溶液に添加してよく、その際これはＳ／Ｄ成分の急速な分布を確保するために混合される。ある特定の実施形態においては、流し込み添加の場合のように局所的な過剰濃度が生じないように濾液の脱局所区域に渡って固体を散布することにより固体試薬を添加することが好ましい。別の実施形態においては、プロセスの改善は、ＳＤ試薬が既に濃縮又は希釈された形態で存在しているタンク中にＩａＩｐ含有溶液をポンプで注入することにより実現される。
（ｂ）ナノ濾過及び限外／透析濾過
本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物のウィルス負荷を更に低減するために、ＩａＩｐ画分、例えばヘパリン親和性溶離液を適当なナノ濾過装置を用いてナノ濾過してよい。ある特定の実施形態においては、ナノ濾過装置は１５ｎｍ〜２００ｎｍ又は約１５ｎｍ〜２００ｎｍの平均孔径を有する。この使用に適するナノフィルターの例は、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＰ、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ及び７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、ナノフィルターは、１５ｎｍ〜７２ｎｍ又は約１５ｎｍ〜７２ｎｍ、あるいは１９ｎｍ〜３５ｎｍ又は約１９ｎｍ〜３５ｎｍ、あるいは１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍもしくは７２ｎｍ、又は約１５ｎｍ、約１９ｎｍ、約３５ｎｍもしくは約７２ｎｍの平均孔径を有してよい。好ましい実施形態においては、ナノフィルターはＡｓａｈｉＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎフィルター又は同等品のように３５ｎｍ又は約３５ｎｍの平均孔径を有する。
任意で、限外濾過／透析濾過はナノ濾液を更に濃縮することにより実施される。１つの実施形態においては、生産プロセスの終了時付近で特に設計された後洗浄及び製剤と共にオープンチャンネルの膜を使用することにより高濃度のＩａＩｐ組成物を得る。
濾過の後、限外濾過により濾液を更に濃縮してよく、及び／又は緩衝液組成を透析濾過により調節してよい。１つの実施形態において、ナノ濾液は０．５％〜１０％（ｗ／ｖ）又は約０．５％〜１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度まで限外濾過により濃縮することができる。ある特定の実施形態においては、限外濾過は、オープンチャンネルのスクリーンを有するカセット中で実施され、そして限外濾過膜は１５０ｋＤａ未満又は約１５０ｋＤａ未満、あるいは１４０、１３０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａもしくはそれ以下、又は約１４０、約１３０、約１２０、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０ｋＤａもしくはそれ以下の名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。１つの実施形態において、限外濾過膜は５０ｋＤａを超えないＮＭＷＣＯを有する。
限外濾過ステップの終了時に、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、又は他の適切な投与のために適する溶液に対する透析濾過により、緩衝液交換を実施してよい。ある特定の実施形態においては、透析濾過溶液は安定化及び／又は緩衝剤、例えば塩類、糖類及び／又は非イオン系洗浄剤（例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）を含んでよい。
典型的には、最小交換体積は元の濃縮液の体積の少なくとも約３倍、又は、元の濃縮液の容量の少なくとも４、５、６、７、８、９倍又は少なくとも約４、５、６、７、８、９倍、あるいはそれ以上である。ＩａＩｐ溶液は、０．５％〜２５％（ｗ／ｖ）又は約０．５％〜２５％（ｗ／ｖ）、あるいは１％〜２５％（ｗ／ｖ）又は約１％〜２５％（ｗ／ｖ）、あるいは２％〜２０％（ｗ／ｖ）又は約２％〜２０％（ｗ／ｖ）、あるいは３％〜１５％（ｗ／ｖ）又は約３％〜１５％（ｗ／ｖ）、あるいは５％〜１０％（ｗ／ｖ）又は約５％〜１０％（ｗ／ｖ）、あるいは９％〜１２％又は約９％〜１２％、あるいは３％〜７％（ｗ／ｖ）又は約３％〜７％（ｗ／ｖ）、あるいは８％〜１４％（ｗ／ｖ）又は約８％〜１４％（ｗ／ｖ）、あるいは４％〜６％又は約４％〜６％、の最終タンパク質濃度まで、あるいは０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又は６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、もしくはそれ以上、又は約０．１％、約０．２５％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、もしくは約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、もしくはそれ以上の最終濃度まで濃縮してよい。
（ｃ）低ｐＨにおけるインキュベーション
特定の実施形態においては、ＩａＩｐ含有溶液を組成物のウィルス負荷を低減又は不活性化するために処理してよい。１つの実施形態において、これは組成物のｐＨを低ｐＨ、例えば６．０未満又は約６．０未満に調節すること、及び組成物の放出前少なくとも約１週間インキュベートすることにより達成される。好ましい実施形態においては、バルク溶液のｐＨをインキュベーションの前に５．５未満又は約５．５未満に調節する。より好ましい実施形態においては、溶液のｐＨはインキュベーション前に５．０未満又は約５．０未満にまで低下させる。特定の実施形態においては、インキュベーションの前に溶液のｐＨを、６．０未満又は約６．０未満、あるいは５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０もしくはそれ未満、又は約５．９、約５．８、約５．７、約５．６、約５．５、約５．４、約５．３、約５．２、約５．１、約５．０、約４．９、約４．８、約４．７、約４．６、約４．５、約４．４、約４．３、約４．２、約４．１、約４．０もしくはそれ未満にまで低下させる。
特定の実施形態においては、次に溶液を少なくとも１週間又は少なくとも約１週間、あるいは少なくとも２、３、４週もしくはそれ以上又は少なくとも約２、３、４週もしくはそれ以上、あるいは少なくとも約１、２、３ヶ月もしくはそれ以上、又は少なくとも約１、２、３ヶ月もしくはそれ以上インキュベートする。好ましい実施形態においては、組成物を約２０℃より高温、あるいは２５℃より高温又は約２５℃より高温、あるい」は約３０℃より高温又は約３０℃より高温でインキュベートする。特定の実施形態においては、組成物は、２０℃又は約２０℃、あるいは２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、もしくはそれ以上、又は約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、もしくはそれ以上の温度でインキュベートされる。
（ｄ）凍結乾燥及び熱処理
更に他の実施形態において、本発明は凍結乾燥されたＩａＩｐ組成物を提供する。Ｓ／Ｄ処理又はナノ濾過のような別のウィルス不活性化又は除去のステップに以前に供されている場合があるこれらの凍結乾燥組成物のウィルス活性は、凍結乾燥組成物（即ちＨ因子リオケーク）の熱処理により更に低減され得る。血液因子のウィルス負荷の不活性化のための熱処理は当該分野で良く知られている（例えばPiszkiewicz等、Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz等、Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40を参照のこと）。
１１．製剤
ＩａＩｐ濃縮プロセスの終了時、例えば最終透析濾過ステップの後に、溶液のタンパク質濃度を、緩衝液、例えば透析濾過緩衝液を用いて、０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）又は約０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）、あるいは１％〜２５％（ｗ／ｖ）又は約１％〜２５％（ｗ／ｖ）、あるいは２％〜２０％（ｗ／ｖ）又は約２％〜２０％（ｗ／ｖ）、あるいは３％〜１５％（ｗ／ｖ）又は約３％〜１５％（ｗ／ｖ）、あるいは５％〜１０％（ｗ／ｖ）又は約５％〜１０％（ｗ／ｖ）、あるいは９％〜１２％又は約９％〜１２％、あるいは３％〜７％（ｗ／ｖ）又は約３％〜７％（ｗ／ｖ）、あるいは８％〜１４％（ｗ／ｖ）又は約８％〜１４％（ｗ／ｖ）、あるいは４％〜６％又は約４％〜６％の終濃度に、あるいは０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％もしくはそれ以上、又は約０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％もしくはそれ以上の終濃度に調節する。
ある特定の実施形態においては、製剤化されたバルク溶液を、０．２２マイクロメートルより大きくないか又は約０．２２マイクロメートルより大きくない、例えば０．１もしくは０．２マイクロメートル又は約０．１あるいは０．２マイクロメートルの絶対孔径を有するメンブレンフィルターを通して濾過することにより更に滅菌してよい。ある特定の実施形態においては、溶液は、試験用に採取された試料と共に、適切な密封のための最終容器内に無菌的に分注してよい。
Ｂ．アルコール添加
好都合には、血漿由来の血液産物（例えばＩａＩｐ、Ｈ因子、ＩｇＧ、アルブミン）を分画する目的のためには、添加の時点においてアルコールを微細分散させるか又は急速分散させる方法によるアルコールの添加がＩｇＧ収量の損失を減少させることが見出された。理論に制約されるものではないが、血漿画分の流し込みによる添加の間、流体侵入部におけるアルコールの一過性の局所的過剰濃度が、血液因子が上澄み中に残存すべきであるステップの間に、タンパク質の変性及び非可逆的損失及び／又は血液因子の沈殿をもたらし得る。更に又、これらの作用は、少なくとも１００Ｌのプール血漿の分画を行う工業的規模の精製の場合のように、大容量のアルコールを添加する必要がある場合に、増幅される可能性がある。
１つの実施形態において、アルコールは、脱局所的領域に渡ってアルコールを微細分散させる方法により１つ以上の沈殿ステップにおいて添加される。例えば血漿画分を含有する器又はタンクの表面上に噴霧することにより、アルコールを分画ステップに添加することができる。従って本明細書において提供される方法の１つの態様において、１つ以上の沈殿ステップをアルコールの噴霧添加により実施する。ある特定の実施形態においては、スプレーヘッド又はノズルを有し、そして手動又は自動的に液体から微細霧状物を発生させる容器（例えばスプレーボトル）のような何れかの加圧装置を用いて噴霧添加を実施してよい。ある特定の実施形態においては、噴霧添加は、系内の液体の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的に攪拌又は別様に混合している間に、実施される。
別の実施形態においては、アルコールは、添加の時点においてアルコールを急速に分散させる方法により１つ以上の沈殿ステップにおいて添加される。例えば、攪拌器具（例えばプロペラ）に直ぐ隣接する血漿画分を含有する器又はタンクの下方からアルコールを添加することができる。特定の実施形態においては、攪拌器具に直接隣接する進入部における流し込み添加は、系内の液体の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的攪拌又は別様に混合しつつ、実施される。
Ｃ．ｐＨの調節
血漿画分のタンパク質沈殿プロファイルは、血漿タンパク質を沈殿させる溶液のｐＨに高度に依存している。この事実はそれぞれ１９４６年及び１９４９年のＣｏｈｎ及びＯｎｃｌｅｙの方法の導入以来、血漿タンパク質を分画している研究者により利用されている。伝統的には血漿画分のｐＨは目的の成分に関わる最も高い回収率を向上させるためにアルコールの添加の前に調節される。好都合なことに、今回、アルコールの添加の直後、又はアルコール添加と同時に溶液のｐＨを調節することにより、より画定され再現性のある沈殿が可能となることがわかった。血漿画分へのエタノールの添加は、一般的には溶液のｐＨを上昇させることにより溶液のｐＨの変動をもたらすことが解った。従って、アルコールの添加後ではなく前に、血漿画分のｐＨを予め決まったｐＨに調節することにより、沈殿反応が非最適ｐＨにおいて起こる。
同様に、血漿画分からのタンパク質の沈殿は、静電気的環境に影響することになり、そしてこのため溶液のｐＨを改変する。従って、沈殿事象が進行するに従い、溶液のｐＨは、目的のタンパク質物質種の最大回収を可能にする所定ｐＨから偏位し始める。このことはタンパク質の大画分が沈殿し始める沈殿事象、高いアルコール含有量を使用する事象、及び長いインキュベーション期間を必要とする沈殿事象に特に当てはまる。
従って、本明細書において提供される方法の１つの態様において、血漿画分のｐＨアルコール添加の直後に調節される。関連の実施形態において、ｐＨは、アルコール添加の前及びその後に、又はアルコール添加の間及びその後に、又はアルコール添加の前、その間及びその後に調節してよい。関連の実施形態において、溶液のｐＨは、１つ以上のアルコール沈殿事象又はインキュベーションの間に連続的に調節される。ある特定の実施形態においては、溶液のｐＨは、系内のｐＨ調節剤の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的に攪拌又は別様に混合しつつ、連続的に調節又は維持される。
流し込みによるアルコールの添加の場合と同様に、大容量のｐＨ調節剤の流し込み添加は一過性の局所的なｐＨ変動をもたらす場合があり、これにより望ましくないタンパク質の変性又は沈殿が起こることが今回わかった。従って、本明細書において提供される方法の１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は、添加の時点においてアルコールを微細分散させるか又は急速分散させる方法により、１つ以上の血漿分画ステップに導入され得る。
１つの実施形態において、ｐＨ調整剤は、脱局所的領域に渡ってｐＨ調整剤を微細分散させる方法により１つ以上のステップにおいて添加される。例えば、ｐＨ調整剤は、血漿画分の入った器又はタンクの表面上に噴霧することにより、あるステップに対して添加することができる。本明細書において提供される方法の別の実施形態においては、血漿画分又は沈殿ステップのｐＨはｐＨ調節剤の噴霧添加により調節されてよい。ある特定の実施形態においては、スプレーヘッド又はノズルを有し、そして手動又は自動的に液体から微細霧状物を発生させる容器（例えばスプレーボトル）のような何れかの加圧装置を用いて噴霧添加を実施してよい。ある特定の実施形態においては、噴霧添加は系内の液体の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的に攪拌又は別様に混合しつつ、実施される。
別の実施形態においては、ｐＨ調節剤は、添加の時点においてｐＨ調節剤を急速に分散させる方法により１つ以上の沈殿ステップにおいて添加される。例えば、攪拌器具（例えばプロペラ）に直ぐ隣接する血漿画分を含有する器又はタンクの下方からｐＨ調整剤を添加することができる。特定の実施形態においては、攪拌器具に直接隣接する進入部における流し込み添加は、系内の液体の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的に攪拌又は別様に混合しつつ、実施される。
更に別の実施形態において、ｐＨ調整剤は、血漿画分の表面上に、脱局所的領域に渡って固体のｐＨ調整剤を散布することにより１つ以上のステップにおいて添加される。ある特定の実施形態においては、この手段による添加は、系内のｐＨ調節剤の急速及び等しい分布が確保されるように系を連続的に攪拌又は別様に混合している間に、実施される。
ＩＶ．インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載した方法に従って調製されたＩａＩｐ組成物を提供する。１つの実施形態において、ＩａＩｐ例えばＩｇＧ又はアルブミンのような商業的な血漿由来血液産物の製造の間に、それ以外では廃棄される物質から調製される。１つの実施形態において、ＩａＩｐが画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出されるＩａＩｐ組成物が提供される。
本明細書において記載されるＩａＩｐは治療用途のための医薬調製物に製剤化されることができる。精製されたタンパク質を、任意で、医薬用賦形剤を添加してよい従来の生理学的に適合する水性緩衝溶液中に溶解することにより医薬調製物を得てよい。
そのような医薬用の単体及び賦形剤、並びに適当な医薬製剤は当該分野で良く知られている（例えば"Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer等、Taylor & Francis (2000)又は"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe等、Pharmaceutical Press (2000)を参照のこと）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は凍結乾燥された、又は安定な可溶性形態において製剤化されてよい。ポリペプチド変異体は当該分野で知られている種々の操作法により凍結乾燥されてよい。凍結乾燥された製剤は注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水のような医薬的に許容しうる１つ以上の希釈剤の添加により使用前に戻される。
組成物の製剤は、何れかの薬学的に適する投与手段により個体に送達される。種々の送達系が知られており、そして何れかの好都合な経路により組成物を投与するために使用できる。１つの実施形態において、本発明の組成物は全身投与される。全身使用のためには、本発明のＩａＩｐを、従来の方法に従って、非経腸（例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内又は鼻内）又は経腸（例えば経口、経膣又は経肛門）の送達のために製剤化する。１つの実施形態において、ＩａＩｐは皮下蓄積送達のために製剤化される。更に他の実施形態において、ＩａＩｐは鼻内投与又は吸入による投与のために製剤化される。製剤は、注入により連続的に、又は瞬時注射により投与できる。いくつかの製剤は緩徐放出系を包含する。投与の好ましい経路は治療、維持、又は防止すべき適応症に応じて変動する。例えば、ＩａＩｐを敗血症の治療のために投与する１つの実施形態においては、好ましい投与経路は非経腸となる。ＩａＩｐを敗血症の治療のために投与する特定の実施形態においては、投与経路は静脈内となる。当業者であれば、治療、維持又は防止すべき特定の苦痛に対する好ましい投与経路を容易に決定できる。
Ａ．水性組成物
１つの態様において、本発明は血漿分画による他の商業的に重要な血液産物の製造中に、それ以外では廃棄される物質から調製された血漿由来ＩａＩｐの水性組成物を提供する。本明細書において提供される方法により調製された水性ＩａＩＰ組成物は高いＩａＩｐ含有量及び純度を有する。例えば、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物は、少なくとも約３％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度及び約９０％純度超のＩａＩｐ含有量を有し得る。
１つの実施形態において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）任意で、少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、水性ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ；（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；（ｃ）懸濁液を形成するために第２の沈殿物を再懸濁するステップ；（ｄ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｃ）の懸濁液と混合するステップ；（ｅ）懸濁液をフィルタープレスで濾過することにより、濾過ケーク及び上澄みを形成するステップ；並びに、（ｆ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの水性組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
ある特定の実施形態においては、濾過ケークを含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより濾過ケークからＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は、約５分〜約２時間、濾過ケークを通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、濾過ケークを通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、濾過ケークを通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、濾過ケークを通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上濾過ケークを通して再循環される。
別の実施形態においては、画分Ｉ沈殿物から調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分Ｉ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、水性ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、画分Ｉ沈殿物から調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。特に好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに、（ｂ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの水性組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
ある特定の実施形態においては、画分Ｉ沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分Ｉ沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。
別の実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物から調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、水性ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物から調製したＩａＩｐの水性組成物が提供される。特に好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の沈殿物からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｃ）第３の沈殿ステップにおいて、第３の沈殿物及び第３の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて第２の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに、（ｄ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて第３の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの水性組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
ある特定の実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。
１つの実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物から調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、水性ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに（ｃ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて第２の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの水性組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
特定の実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。
１つの実施形態において、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又はＢの沈殿物から調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）沈殿物Ａ又はＢの沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）任意で、少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、水性ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩＰの水性組成物が提供される。
特定の実施形態においては、沈殿１に対して抽出緩衝液約２５〜約３０の比で画分Ｉ、画分ＩＶ−１、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを再懸濁するために使用できるＩａＩｐ抽出緩衝液の添加により、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出する。他の実施形態において、再懸濁比は１：４〜約１：４０又は約１：４〜約１：４０、又は約１：８〜約１：３０、又は約１：１０〜約１：２０、又は約１：１２〜約１：１８、又は約１：１３〜約１：１７、又は約１：１４〜約１：１６である。特定の実施形態においては、比は約１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、又はそれ以上であってよい。好ましい実施形態においては、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを含有するフィルター又はフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることによりＩａＩｐを抽出する。
ある特定の実施形態においては、添加の時点において溶液を微細分散させるか又は急速分散させる方法により、それ以外では流し込み添加により血漿画分に導入されるであろう１つ以上の溶液の添加を含む、本明細書に記載した精製方法を用いてＩａＩｐ組成物を調製するＩａＩｐの水性組成物が提供される。例えば、ある特定の実施形態においては、方法は噴霧による血漿画分中へのアルコール（例えばエタノール）の導入を含む。他の実施形態において、噴霧により血漿画分に添加してよい溶液は、ｐＨ調整溶液、溶媒溶液、洗浄剤溶液、希釈緩衝液、伝導度調整溶液等を含むがこれらに限定されない。１つの実施形態において、噴霧による血漿画分へのアルコールの添加により、１つ以上のアルコール沈殿ステップを実施する。第２の好ましい実施形態においては、噴霧による血漿画分へのｐＨ調整溶液の添加により、１つ以上のｐＨ調節ステップを実施する。
ある特定の実施形態においては、本明細書に記載する精製方法により調製される水性ＩａＩｐ組成物が提供され、方法は、沈殿剤（例えばアルコール又はポリエチレングリコール）の添加の後及び／又はそれと同時に沈殿される血漿画分のｐＨを調節するステップを含む。いくつかの実施形態においては、能動的に沈殿される血漿画分のｐＨはｐＨの連続的なモニタリング及び調節により全ての沈殿インキュベーション又は保持ステップを通して維持される。１つの実施形態においては、ｐＨ調整溶液の噴霧添加により溶液のｐＨの調節を実施する。
１つの実施形態において、本発明は約０．１ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を含む水性ＩａＩｐ組成物を提供する。ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐ組成物のタンパク質濃度は約０．１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、又は約０．５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、又は約５０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌ、又は約７０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌ、又は約３０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ又はこれらの範囲内の何れかの適当な濃度、例えば約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、又は約１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１５５ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１６５ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２０５ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２１５ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２３５ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２４５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、又はそれ以上である。好ましい実施形態においては、高いタンパク質濃度を有するＩａＩｐ組成物は高いレベルの純度も有する。１つの実施形態において、組成物中のタンパク質の少なくとも９０％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、組成物中のタンパク質の少なくとも９５％がＩａＩｐとなる。
本明細書において提供される方法は、極めて高いレベルの純度を有するＩａＩｐ組成物の調製を可能とする。１つの実施形態において、本明細書において提供される組成物における総タンパク質の少なくとも約９０％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、本明細書において提供される組成物における総タンパク質の少なくとも約９５％がＩａＩｐとなる。他の実施形態において、組成物の総タンパク質の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上がＩａＩｐとなる。１つの好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９６％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９７％がＩａＩｐとなる。別の好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９８％がＩａＩｐとなる。別の好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９９％がＩａＩｐとなる。
Ｂ．医薬組成物
１つの態様において、本発明は、血漿分画による他の商業的に重要な血液産物の製造中に、それ以外では廃棄される物質から調製された血漿由来ＩａＩｐの医薬組成物を提供する。本明細書において提供される方法により調製される医薬ＩａＩｐ組成物は高いＩａＩｐ含有量及び純度を有する。例えば、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物は少なくとも約１％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度、及び、約９０％純度より高いＩａＩｐ含有量を有し得る。このような高純度のＩａＩｐ医薬組成物及び製剤は治療投与に適している。ある特定の実施形態においては、本明細書において提供される医薬組成物は治療投与のために製剤化されたＩａＩｐの水性製剤よりなるものとなる。他の実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、注射用水（ＷＦＩ）又は生物学的に適合する液体、例えば食塩水又は緩衝溶液を用いて戻した後の治療投与のために製剤化されたＩａＩｐの凍結乾燥された製剤よりなるものとなる。
１つの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供される方法を用いて単離された水性ＩａＩｐ組成物を製剤化することにより調製される。一般に、製剤化された組成物への製造経路は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つのウィルス不活性化又は除去のステップを含む。本明細書において提供される方法と共に使用してよいウィルスの不活性化又は除去のステップの非限定的な例は、溶媒洗浄剤処理（Horowitz等、Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28及びKreil等、Transfusion 2003 (43):1023-1028、これらは両方とも全ての目的のために参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれる）、ナノ濾過（Hamamoto等、Vox Sang 1989 (56)230-236及びYuasa等、J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024、これらは両方とも全ての目的のために参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれる）、及び高温下の低ｐＨインキュベーション（Kempf等、Transfusion 1991 (31)423-427及び Louie等、Biologicals 1994 (22):13-19）を含む。
１つの実施形態において、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから調製されるＩａＩｐの医薬組成物が提供される。１つの実施形態において、 (ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ;（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施するステップ；及び（ｖｉｉ）任意で、ＩａＩｐ組成物を凍結乾燥することにより、ＩａＩｐ医薬組成物を調製するステップを含む方法により調製されるＩａＩｐの医薬組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ;（ｃ）懸濁液を形成するために第２の沈殿物を再懸濁するステップ；（ｄ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｃ）の懸濁液と混合するステップ；（ｅ）フィルタープレスで懸濁液を濾過することにより濾過ケーク及び上澄みを形成するステップ（ｆ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で濾過ケークからＩａＩｐを抽出するステップ；（ｇ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施するステップ；並びに（ｈ）任意で、組成物を凍結乾燥することによりＩａＩｐの医薬組成物を調製するステップ含む方法により調製された医薬ＩａＩｐ組成物が提供される。
特定の実施形態においては、濾過ケークを含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより濾過ケークからＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、濾過ケークを通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、濾過ケークを通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、濾過ケークを通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、濾過ケークを通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上濾過ケークを通して再循環される。
別の実施形態においては、画分Ｉ沈殿物から調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分Ｉ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施して、ＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施するステップ；及び（ｖｉｉ）任意で、ＩａＩｐ組成物を凍結乾燥することにより、ＩａＩｐ医薬組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、画分Ｉ沈殿物から調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに（ｂ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ；並びに（ｃ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ＩａＩｐの医薬組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
特定の実施形態においては、画分Ｉ沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分Ｉ沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分Ｉ沈殿物を通して再循環される。
別の実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物から調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、ＩａＩｐ医薬組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物から調製したＩａＩｐの医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、
第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の沈殿物からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｃ）第３の沈殿ステップにおいて、第３の沈殿物及び第３の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて第２の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；及び、（ｄ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて第３の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの医薬組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
特定の実施形態においては、画分ＩＶ−１沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分ＩＶ−１沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分ＩＶ−１沈殿物を通して再循環される。
１つの実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物から調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、医薬ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。
好ましい実施形態においては、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；並びに（ｃ）ＩａＩｐ抽出緩衝液を用いて第２の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、ＩａＩｐの水性組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐ組成物が提供される。
特定の実施形態においては、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を含有するフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることにより画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物からＩａＩｐを抽出する。一般的に、抽出緩衝液は約５分〜約２時間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約１０分間〜約６０分間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。より好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約２０分間〜約４０分間、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。別の好ましい実施形態においては、抽出緩衝液は約３０分間約、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。他の実施形態において、抽出緩衝液は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分間、又はそれ以上画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を通して再循環される。
１つの実施形態において、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又はＢの沈殿物から調製されたＩａＩｐの医薬組成物が提供される。１つの実施形態において、（ｉ）沈殿物Ａ又はＢの沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ、（ｉｉ）任意で、第１の沈殿ステップを実施してＩａＩｐ組成物から少なくとも１つの不純物を沈殿させるステップ、（ｉｉｉ）任意で、第２の沈殿ステップを実施して組成物からＩａＩｐを沈殿させるステップ、（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップ、（ｖ）任意で、少なくとも１つヘパリン親和性クロマトグラフィーステップを実施するステップ；及び（ｖｉ）任意で、少なくとも１つのウィルス不活性化又は除去のステップを実施することにより、医薬ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む方法により調製されたＩａＩｐの水性組成物が提供される。
ある特定の実施形態においては、沈殿物１に対して抽出緩衝液約２５〜約３０の典型的な比で画分Ｉ、画分ＩＶ−１、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを再懸濁するために使用できるＨ因子抽出緩衝液の添加により、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、又は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出する。他の実施形態において、再懸濁比は１：４〜約１：４０又は約１：４〜約１：４０、あるいは約１：８〜約１：３０、あるいは約１：１０〜約１：２０、あるいは約１：１２〜約１：１８、あるいは約１：１３〜約１：１７、あるいは約１：１４〜約１：１６である。ある特定の実施形態においては、比は約１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、又はそれ以上であってよい。好ましい実施形態においては、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを含有するフィルター又はフィルタープレスを通して抽出緩衝液を再循環させることによりＩａＩｐを抽出する。好ましい実施形態においては、ＩａＩｐは、画分Ｉ、画分ＩＶ−１、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、キストラー及びニッチェマン沈殿物Ａ又は沈殿物Ｂの沈殿物、又は画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを含有するフィルター又はフィルタープレスを通した抽出緩衝液の再循環により抽出される。
ある特定の実施形態においては、添加の時点において溶液を微細分散させるか又は急速分散させる方法により、それ以外では流し込み添加により血漿画分に導入される１つ以上の溶液の添加を含む、本明細書に記載した精製方法を用いてＩａＩｐ組成物を調製するＩａＩｐの医薬組成物が提供される。例えば、ある特定の実施形態においては、方法は噴霧による血漿画分中へのアルコール（例えばエタノール）の導入を含む。他の実施形態において、噴霧により血漿画分に添加してよい溶液は、ｐＨ調整溶液、溶媒溶液、洗浄剤溶液、希釈緩衝液、伝導度調整溶液等を含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、噴霧による血漿画分へのアルコールの添加により、１つ以上のアルコール沈殿ステップを実施する。第２の好ましい実施形態においては、噴霧による血漿画分へのｐＨ調節溶液の添加により、１つ以上のｐＨ調節ステップを実施する。
ある特定の実施形態においては、本明細書に記載する精製方法により調製されるＩａＩｐの医薬組成物が提供され、方法は、沈殿剤（例えばアルコール又はポリエチレングリコール）の添加の後及び／又はそれと同時に沈殿される血漿画分のｐＨを調節するステップを含む。いくつかの実施形態においては、能動的に沈殿される血漿画分のｐＨはｐＨの連続的なモニタリング及び調節により全ての沈殿インキュベーション又は保持ステップを通して維持される。１つの実施形態においては、ｐＨ調整溶液の噴霧添加により溶液のｐＨの調節を実施する。
１つの実施形態において、本発明は約１０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を含む医薬ＩａＩｐ組成物を提供する。ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐ組成物のタンパク質濃度は、約５０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌ、又は約７０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌ、又は約３０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、又はこれらの範囲内の何れかの適当な濃度、例えば約１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１５５ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１６５ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２０５ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２１５ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２３５ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２４５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、又はそれ以上である。好ましい実施形態においては、高いタンパク質濃度を有するＩａＩｐ組成物は高いレベルの純度も有する。１つの実施形態において、組成物中のタンパク質の少なくとも９０％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、組成物中のタンパク質の少なくとも９５％がＩａＩｐとなる。
本明細書において提供される方法は極めて高いレベルの純度を有するＩａＩｐ組成物の調製を可能とする。１つの実施形態において、本明細書において提供される組成物における総タンパク質の少なくとも約９０％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、本明細書において提供される組成物における総タンパク質の少なくとも約９５％がＩａＩｐとなる。他の実施形態において、組成物の総タンパク質の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上がＩａＩｐとなる。１つの好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９６％がＩａＩｐとなる。好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９７％がＩａＩｐとなる。別の好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９８％がＩａＩｐとなる。別の好ましい実施形態においては、組成物の総タンパク質の少なくとも９９％がＩａＩｐとなる。
本明細書において提供される医薬組成物は典型的には静脈内、皮下及び／又は筋肉内投与に適する１つ以上の緩衝剤又はｐＨ安定化剤を含む。本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物を製剤化するために適する緩衝剤の非限定的な例は、グリシン、ヒスチジン、又は他のアミノ酸、塩類、例えば、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、炭酸塩、又は適切なｐＨに調節されたこれらの何れかの組み合わせを含む。一般的に緩衝剤は長期間製剤中で安定なｐＨを維持するのに十分なものとなる。
いくつかの実施形態においては、製剤中の緩衝剤の濃度は約５ｍＭ〜約５００ｍＭとなる。製剤中の緩衝剤の濃度は約５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００ｍＭ、又はそれ以上となる。
ある特定の実施形態においては、製剤のｐＨは約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０となる。
いくつかの実施形態においては、本明細書において提供される医薬組成物は任意で、組成物の浸透圧を調節するための剤を更に含んでよい。浸透圧調節剤の非限定的な例は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、スクロース、グルコース、デキストロース、レブロース、フラクトース、ラクトース、ポリエチレングリコール、ホスフェート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコノグルコヘプトン酸カルシウム、ジメチルスルホン等を含む。
いくつかの実施形態においては、本明細書において提供される製剤は、生理浸透圧と同程度の浸透圧、すなわち約２８５〜２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇを有する（Lacy等、Drug Information Handbook−Lexi-Comp 1999:1254）。ある特定の実施形態においては、製剤の浸透圧は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０〜約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇとなる。特定の実施形態においては、製剤の浸透圧は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、又は２１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、又は３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇとなる。更に他の実施形態において、製剤の浸透圧はより高値、例えば約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、又は約４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、５５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、６００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、６５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、７５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、８５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、９００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、９５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、１０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、又はそれ以上となる。
本明細書において提供されるＩａＩｐ製剤は一般的に長期間に渡り液体形態において安定である。ある特定の実施形態においては、製剤は、室温で少なくとも約３ヶ月、又は室温で少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月、又はそれ以上安定である。製剤は又、一般的に、冷蔵条件下（典型的には約２℃〜約８℃）で少なくとも約１８ヶ月、又は冷蔵条件下で少なくとも約２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０ヶ月、又はそれ以上安定である。
他の実施形態において、本明細書において提供されるＩａＩｐ製剤は一般に長期間に渡り凍結乾燥された形態で安定である。ある特定の実施形態においては、製剤は、室温で少なくとも約３ヶ月、又は室温で少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８ヶ月安定である。製剤は又、一般に、冷蔵条件下（典型的には約２℃〜約８℃）で少なくとも約１８ヶ月、又は冷蔵条件下で少なくとも約２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、又は６０ヶ月安定である。
１つの態様において、本発明は本発明に従って精製されたＩａＩｐを含有する組成物に関し、全身又は局所眼内投与のための医薬的に許容しうる担体を、それを必要とする哺乳類に投与する。組成物は、敗血症の治療において有用であり得る追加の治療用化合物、例えば抗生物質を更に含んでよい。治療用組成物は所望の投与の特定の経路に関して当該分野で知られている方法に従って製剤化される。
本発明の方法によれば、本明細書に記載した方法に従って精製されたＩａＩｐ、及び全身又は局所投与用の医薬的に許容しうる担体を含む組成物を、それを必要とする哺乳類に投与する。
Ｖ．治療の方法
更に別の態様において、本発明の目的は、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与することにより、低下したＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する障害及び疾患を治療するための方法を提供することである。１つの実施形態において、低下したＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害は敗血症である。
１つの実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において低下したＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害を治療するための方法における使用のための本明細書に開示した方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を提供する。１つの実施形態において、低下したＩａＩｐ機能又はＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害は敗血症である。
別の態様において、本発明の目的は、本明細書において提供されるＩａＩｐの治療有効量を投与することによる増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患及び障害を治療するための方法を提供することである。１つの実施形態において、増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患及び障害は敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症から選択される。
１つの実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療するための方法における使用のための本明細書に開示した方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を提供する。１つの実施形態において、増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害は敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症から選択される。
Ａ．投与
本発明によれば、治療の行程を完了するために必要な時間は医師により決定されることができ、そして１日もの短期から１ヶ月超までの範囲となり得る。ある特定の実施形態においては、治療の行程は１〜６ヶ月であることができる。
ＩａＩｐ調製物の有効量を疾患又は障害を治療するための何れかの適当な手段により対象に投与する。例えば、ある特定の実施形態においては、ＩａＩｐを静脈内、皮下及び／又は筋肉内の手段で投与してよい。好ましい実施形態においては、患者へのＩａＩｐ組成物の静脈内（ＩＶ）投与を含む、それを必要とする患者において敗血症を治療するための方法が提供される。
特定の実施形態においては、本明細書において提供されるＩａＩｐ組成物は全身投与又は局所投与できる。全身投与は経口、真皮下、腹腔内、皮下、経鼻、舌下、又は肛門経路の投与を含む。局所投与は、表面投与、皮下、筋肉内、及び腹腔内の経路の投与を含む。
ある特定の実施形態において、「有効量」という用語は対象における疾患又は状態の改善又は緩和をもたらすＩａＩｐ調製物の量を指す。対象に投与すべき有効量は、年齢、体重、治療すべき疾患又は状態、疾患の重症度及び治療への応答における個体差を考慮しながら医師により決定される。ある特定の実施形態においては、投与当たり、約５ｍｇ／キログラム〜約２０００ｍｇ／キログラムの用量で対象にＩａＩｐ調製物を投与することができる。特定の実施形態においては、用量は、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ、１７００ｍｇ／ｋｇ、１８００ｍｇ／ｋｇ、１９００ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇであってよい。ＩａＩｐ治療の用量及び頻度は、種々の要因のうち、とりわけ、治療すべき疾患又は状態及び患者における疾患又は状態の重症度に依存する。
ＶＩ．特定の実施形態
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）ＩａＩｐ含有沈殿物を形成するために、脱クリオ血漿画分を供給するステップ；（ｂ）少なくとも第１のエタノール沈殿反応において脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させるステップ；及び、（ｃ）ＩａＩｐ含有沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を形成するステップを含み、ＩａＩｐ沈殿物は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー−ニッチェマン沈殿物Ａ、及びキストラー−ニッチェマン沈殿物Ｂよりなる群から選択される。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ｉ）血漿試料から画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するステップ；（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を形成するために、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁するステップ；（ｉｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を固相に接触させて、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液からＩａＩｐを除去するステップ；及び、（ｉｖ）固相からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、固相は超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物を形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ;（ｃ）懸濁液を形成するために第２の沈殿物を再懸濁するステップ；（ｄ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｃ）の懸濁液と混合するステップ；（ｅ）懸濁液をフィルタープレスで濾過することにより、濾過ケーク及び上澄みを形成するステップ；及び、（ｆ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）沈殿物を得るために血漿試料からＩａＩｐを沈殿させるステップ；（ｂ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含み、沈殿物は、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物である。
上で提供される方法の１つの実施形態において、画分Ｉ沈殿物を形成するステップは、第１の沈殿ステップにおいて、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からＩａＩｐを沈殿させることにより画分Ｉ沈殿物を得ることを含む。
ＩａＩｐを画分ＩＶ−１沈殿物から抽出する、上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約７．０〜約７．５のｐＨで約６％〜約１０％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約６．７〜約７．３のｐＨで約２０％〜約２５％アルコールを用いて第１の沈殿物からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｃ）第３の沈殿ステップにおいて、第３の沈殿物及び第３の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて第２の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ、；及び、（ｄ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で第３の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
ＩａＩｐを画分ＩＶ−１沈殿物から抽出する上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、約６．７〜約７．２のｐＨで約１８％〜約２３％アルコールを用いて脱クリオ血漿画分からタンパク質を沈殿させるステップ;（ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、第２の沈殿物及び第２の上澄みを形成するために、約５．０〜約５．５のｐＨで約１８％〜約２５％アルコールを用いて第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させるステップ；及び、（ｃ）ＩａＩｐ抽出緩衝液で第２の沈殿物からＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐは複数の沈殿画分から抽出される。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）血漿の単一のアリコートを分画してＩａＩｐ以外の少なくとも２つの血液産物の濃縮組成物を得るステップ;（ｂ）１つ以上の抽出緩衝液で血漿分画の間に生じた少なくとも２つの異なる廃棄画分からＩａＩｐを抽出すステップ；及び、（ｃ）抽出されたＩａＩｐ画分をプールすることにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、血漿を分画することによりＩｇＧ免疫グロブリン及びアルブミンの濃縮組成物を得る。
上で提供される方法の１つの実施形態において、血漿を分画することによりＩａＩｐ以外の少なくとも３種の血液産物を得る。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ｇ）追加の沈殿ステップにおいて濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させることにより、ＩａＩｐを含有する上澄みを形成するステップを更に含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、追加の沈殿ステップが、約６．０〜約８．０のｐＨにおける約１０％〜約１９％アルコールを用いた沈殿を含む。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、画分ＩＶ−１沈殿物、沈殿物Ａの沈殿物、又は沈殿物Ｂの沈殿物よりなる群から選択される血漿画分からＩａＩｐを抽出するステップ；及び（ｂ）追加の沈殿ステップにおいて、濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させることにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ｈ）追加の沈殿ステップにおいて、ＩａＩｐを沈殿させるステップを更に含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、約６．０〜約８．０のｐＨにおいて約２０％〜約２５％アルコールを用いてＩａＩｐを沈殿させる。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ｇ）濃縮ＩａＩｐ組成物由来のＩａＩｐをアニオン交換樹脂に結合させるステップ；及び、（ｈ）溶離緩衝液を用いてアニオン交換樹脂からＩａＩｐを溶離させることにより、ＩａＩｐを含有する第１の溶離液を形成するステップを更に含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ｉ）第１の溶離液由来のＩａＩｐをヘパリン親和性樹脂に結合させるステップ；及び、（ｊ）溶離緩衝液を用いてヘパリン親和性樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、ＩａＩｐを含有する第２の溶離液を形成するステップを更に含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、第１又は第２の溶離液中の何れかに存在するＩａＩｐを更に濃縮する。
上で提供される方法の１つの実施形態において、沈殿ステップの少なくとも１つはアルコールの噴霧添加を含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、沈殿ステップの全てがアルコールの噴霧添加を含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、溶液のｐＨは、ｐＨ調整剤の添加により、第１の沈殿ステップ、第２の沈殿ステップ、又は第３の沈殿ステップの少なくとも１つにおいて、アルコールの添加の後に調整される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、溶液のｐＨは、ｐＨ調整剤の添加により、全ての沈殿ステップにおいて、アルコールの添加の後に調整される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ｐＨ調整剤の添加はｐＨ調整溶液の噴霧添加を含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、沈殿ステップのｐＨは、アルコール添加の前及びその後に、又はアルコール添加の間及びその後に、又はアルコール添加の前、その間及びその後に調節される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、沈殿ステップのｐＨはｐＨの連続的調節により全沈殿ステップに渡って維持される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐを抽出するステップは、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク、画分Ｉ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、沈殿物Ａ、又は沈殿物Ｂの沈殿物よりなる群から選択される血漿画分を含有するフィルタープレスを通してＩａＩｐ抽出緩衝液を再循環させることを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ抽出緩衝液は少なくとも約１０分間フィルタープレスを通して再循環される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ抽出緩衝液は少なくとも約３０分間フィルタープレスを通して再循環される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ抽出緩衝液は少なくとも１つのＩａＩｐタンパク質の等電点とは少なくとも約０．３単位異なるｐＨを含み有する。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ;（ｂ）アニオン交換樹脂にＩａＩｐ及びＨ因子を結合させるステップ;（ｃ）第１の溶離緩衝液で樹脂からＨ因子を溶離させるステップ；並びに、（ｄ）第２の溶離緩衝液で樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
１つの態様において、本発明は、血漿から濃縮インターα阻害剤（ＩａＩｐ）組成物を調製するための方法を提供し、方法は、（ａ）抽出物がＩａＩｐ及びＨ因子を含有する、脱クリオ血漿の分画の間に形成した沈殿物からＩａＩｐを抽出するステップ;（ｂ）アニオン交換樹脂にＨ因子が結合しない条件下でアニオン交換樹脂にＩａＩｐを結合させるステップ；並びに、（ｃ）溶離緩衝液で樹脂からＩａＩｐを溶離することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、方法は、（ｅ）濃縮ＩａＩｐ組成物中のＩａＩｐをヘパリン親和性カラムに結合させるステップ；及び、（ｆ）ヘパリン親和性カラムからＩａＩｐを溶離させるステップを更に含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、濃縮ＩａＩｐ組成物は更に、少なくとも１つのウィルス不活性化ステップに供される。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ウィルス不活性化ステップは溶媒及び／又は洗浄剤による処理、ナノ濾過、熱処理、又は低ｐＨにおけるインキュベーションを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、単一のインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）種を単離する。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ種はインターαトリプシン阻害剤（ＩａＩ）である。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ種はプレα阻害剤（ＰａＩ）である。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ種は抗体親和性方法により単離される。
１つの態様において、本発明は請求項１〜４０の何れか１項に記載の方法により調製されるＩａＩｐの水溶液を提供する。
上で提供されるＩａＩｐ溶液の１つの実施形態において、溶液のタンパク質含有分の少なくとも９０％がＩａＩｐである。
１つの態様において、本発明は請求項１〜４０の何れか１項に記載の方法により調製されるＩａＩｐの医薬組成物を提供する。
上で提供されるＩａＩｐ医薬組成物の１つの実施形態において、溶液のタンパク質含有分の少なくとも９５％がＩａＩｐである。
上で提供されるＩａＩｐ医薬組成物の１つの実施形態において、組成物は静脈内投与のために製剤化される。
上で提供されるＩａＩｐ医薬組成物の１つの実施形態において、組成物はＩａＩｐの凍結乾燥された製剤を含む。
１つの態様において、本発明は、それを必要とする対象において、ＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害を治療するための方法を提供し、方法は、請求項１〜４０の何れか１項に記載の方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、ＩａＩｐ機能不全に関連する疾患又は障害は敗血症である。
１つの態様において、本発明は、それを必要とする対象において増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療するための方法を提供し、方法は、請求項１〜４０の何れか１項に記載の方法により調製されたＩａＩｐ組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
上で提供される方法の１つの実施形態において、増大した血漿中セリンプロテアーゼ活性に関連する疾患又は障害は敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、汎発性血管内凝固症、腺維増殖、炭疽中毒、癌転移、術中組織傷害、腎臓疾患、血管疾患、凝固、糖尿病、及び全身性炎症よりなる群から選択される。
以下の実施例は、説明の手段としてのみ提示しており、限定の手段としてではない。当業者であれば、本質的に同じか同様の結果をもたらすために変更又は修正できる重要ではない種々のパラメーターを容易に認識する。
同じ血漿試料からの追加的な血液因子の回収を可能にする血漿試料からのインターα阻害剤（ＩａＩｐ）の製造のための経済的に有利なスキームを決定するために、多くのプールされたヒト血漿を、図２に示すフローダイアグラムに概説したスキームに従って工業的分画に供した。工業的分画プロセスにおけるＩａＩｐの運命は、小型サブユニットビクニンに対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロットにより追跡した。ＩａＩとＰａＩとの間のサイズの相違により、抗ビクニン抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の自身の移動に基づいて識別できる分画プロセス中の両方のタンパク質の特定を可能にした（図３）。
図３から解るとおり、プールされた血漿試料中に存在するＩａＩｐの大部分が３つの主要画分、即ち画分Ｉ沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物濾過ケーク、及び画分ＩＶ−１沈殿物中に分画された。好都合には、これらの画分の３つ全てが典型的にはＩｇＧ（画分Ｉ沈殿物及び画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク)及びアルブミン（画分Ｉ及び画分ＩＶ−１沈殿物）の製造の間に廃棄される。従って、ＩｇＧ及びアルブミンの製造プロセスを修正することなくこれらの画分からＩａＩ及びＰａＩを精製でき得ることが想定された。
本実施例は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークからＩａＩｐを抽出することの実現可能性を調べるために実施した実験を記載するものである。手短に言えば、実施例１において実施した血漿分画で得られた画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークをＩａＩｐ抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；２００ｍＭ ＮａＣｌ）中に２５：１の比（ｍＬ緩衝液：ｇ濾過ケーク）で溶解した。溶解したタンパク質溶液を遠心分離及び０．４５μｍフィルターを通して濾過することにより清澄化した。次に得られた懸濁液の伝導度を低塩抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて３：１に溶液を希釈することにより調節した。
清澄化された画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケーク懸濁液を次に低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）で平衡化されたＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーカラム上に負荷した。次に５０ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣｌ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）の直線勾配を用いてＩａＩｐをＤＥＡＥセファロースカラムから溶離し、その溶離液を図４Ａのクロマトグラフに示す通り分画収集した。溶離液画分の試料をウエスタンブロット分析（図４Ｂ及び４Ｃ）により分析することによって、３つの主要ピークの３つ目においてアニオン交換カラムからＩａＩｐが溶離されたことを判定した。
ＩａＩｐを含有するＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー溶離で得られた３つ目の溶離ピークを、実施したクロマトグラフィー及びゲル分析に基づいてプールし、濃縮し、そして緩衝液交換により伝導度を低下させた。次にＩａＩｐ溶液を、低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化させたヘパリン−セファロースクロマトグラフィーカラム上に負荷した。次に５０ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣｌ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＣｌ）の直線勾配を用いてＩａＩｐをＤＥＡＥセファロースカラムから溶離し、その溶離液を図５Ａのクロマトグラフに示す通り分画収集した。溶離液画分の試料をウエスタンブロット分析により分析した。図５Ｂから明らかな通り、ＩａＩｐは単一のピークとしてヘパリン−セファロースカラムから溶離し、これは純粋なＩａＩｐ組成物を与えている。
抽出後のＩａＩｐ精製に関する工業的スケールアップを促進するために、クロマトグラフィーカラムの塩勾配溶離を、大規模製造プロセスにより適合した一連の段階的溶離と置き換えた代替精製スキームを考案した。手短に言えば、実施例２に記載の通り画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークから抽出したＩａＩｐ組成物を低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；６５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）で平衡化させたＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーカラム上に負荷した。負荷物の伝導度は平衡化緩衝液のものと同様であった（約９ｍＳ／ｃｍ）。負荷後、カラムを５カラム容量（ＣＶ）分６５ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄することにより未結合のタンパク質不純物を除去した。素通り画分は、図７Ｃに示すウエスタンブロットの結果により解るとおり、ＩａＩｐを殆ど含有していない。
第１段階溶離において、緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＣｌ）の塩濃度を５ＣＶ分１００ｍＭ ＮａＣｌ（伝導度１２．６ｍＳ／ｃｍ）まで増加させることによりカラムに結合しているＨ因子を溶離させた。次に緩衝液の塩濃度を６ＣＶ分１５５ｍＭ ＮａＣｌ（伝導度１８ｍＳ／ｃｍ）にまで増加させることによりカラムから結合タンパク質不純物を溶離させた。ウエスタンブロット分析によればこの中間洗浄画分は殆どＩａＩｐを含有していない（図７Ｃ）。次にカラムの塩濃度を２３０ｍＭ ＮａＣｌ（伝導度約２５ｍＳ／ｃｍ）まで増加させることによりカラムからＩａＩｐを溶離させた。ＩａＩｐは、図７Ａに示すクロマトグラフにおいて観察される通り鋭いピークと、その後のショルダーとしてカラムから排出された。対応するクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図７Ｂ）及びウエスタンブロット（図７Ｃ）によれば、Ｈ因子の大部分はピーク中にある。２３０ｍＭ ＮａＣｌ溶離の主要ＩａＩｐ画分をまとめてプールした。
プールされたＩａＩｐ画分の塩濃度を低減するために、試料を低塩緩衝液に対して透析することにより伝導度を約８ｍＳ／ｃｍ（約５０ｍＭ ＮａＣｌ）まで低下させた。次に試料を０．４５μｍフィルターを通過させて、存在する粒状物を除去した。次に濾過された試料を、低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ ＥＤＴＡ；５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化させたヘパリン−セファロースクロマトグラフィーカラム上に負荷した。負荷後、カラムを５カラム容量（ＣＶ）分５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄することにより未結合のタンパク質不純物を除去した。素通り画分は、図８Ｃに示すウエスタンブロットの結果により解るとおり、ＩａＩｐを殆ど含有していない。
第１段階溶離において、緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）の塩濃度を８０ｍＭ ＮａＣｌにまで増加させることによりカラムからＩａＩｐを溶離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８Ｂ）及びウエスタンブロット（図８Ｃ）分析によれば、得られたＩａＩｐプールは、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、及び当該分野で良く知られている他の方法により除去され得る低分子量不純物を幾らか含有している。第２溶離段階は、１０７ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液を用いて実施し、そしてＩａＩｐピークをカラムから溶離させた。この画分は如何なる検出不純物も有していなかった。この方法はプロセスを最適化するために変更できる。１つの実施形態において、ＩａＩｐの全てが、例えば８０ｍＭ超のＮａＣｌを含有する緩衝液を用いた単一の溶離により単一段階で溶離され得る。負荷及び洗浄はなお５０ｍＭ ＮａＣｌで実施してよく、そしてＨ因子溶離は例えば１０７ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液を用いて行ってよい。ＩａＩｐプールからより弱く結合している不純物を除去しようとする場合は５０ｍＭ ＮａＣｌにおける、又は８０ｍＭ未満 ＮａＣｌの塩濃度における延長された洗浄を負荷後に追加してよい。
上記のクロマトグラフィーステップは、ｐＨ８のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ以外の緩衝液系を使用するように変更できる。これらのプロセスは、生物製剤の製造において一般的に使用される緩衝液及び溶液に対して適合させることができる。一例はｐＨ７のリン酸緩衝液を使用する精製スキームである。精製を良好に行うための重要なパラメーターは、所望の化合物の分離を達成するための伝導度又はイオン強度の操作である。緩衝液系のｐＨをｐＨ８に維持する場合、溶離緩衝液の伝導度は本明細書に記載した精製プロセスに合わせなければならない。緩衝液系のｐＨを変える場合、クロマトグラフィープロセスの最適化において使用される標準的な手法を用いて行うことができるイオン強度の何らかの調節が必要になる。
本明細書に記載した実施例及び実施形態は説明のみを目的としており、それを鑑みながら、種々の修正又は変更が当業者には示唆され、それらは本出願の精神及び領域及び添付請求項の範囲の内に包含されることが理解される。本明細書において引用した全ての公報、特許、及び特許出願は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (27)

  1. 血漿から濃縮インターα阻害タンパク質（Inter-alpha-Inhibitor protein（ＩａＩｐ））組成物を調製するための方法であって、
    （ｉ）以下により血漿試料から画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するステップ：
    （ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、７．０〜７．５のｐＨで６％〜１０％アルコールを用いてコーン（Ｃｏｈｎ）プールからタンパク質を沈殿させること、及び
    （ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、６．６〜７．２のｐＨで２０％〜２５％アルコールを用いて該第１の上澄みからタンパク質を沈殿させることにより、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成すること、
    （ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を形成するために、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を、４．０〜５．５のｐＨおよび０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する懸濁緩衝液で懸濁するステップ、
    （ｉｉｉ）該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）に接触させて、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液から該超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）に該ＩａＩｐを吸着させるステップ、並びに、
    （ｉｖ）該超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）から、６．０〜９．０のｐＨおよび５０ｍＭ〜５００ｍＭの塩濃度を有するＩａＩｐ抽出緩衝液で該ＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製するステップ
    を含む、方法。
  2. （ｉ）以下により血漿試料から画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するステップ：
    （ａ）第１の沈殿ステップにおいて、第１の沈殿物及び第１の上澄みを得るために、７．０〜７．５のｐＨで６％〜１０％アルコールを用いてコーンプールからタンパク質を沈殿させること、
    （ｂ）第２の沈殿ステップにおいて、６．６〜７．２のｐＨで２０％〜２５％アルコールを用いて該第１の上澄みからＩａＩｐを沈殿させることにより、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成すること、
    （ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を形成するために、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を、４．０〜５．５のｐＨおよび０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する懸濁緩衝液で懸濁するステップ、
    （ｉｉｉ）以下により該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）に接触させて、該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液から該超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）に該ＩａＩｐを吸着させるステップ：
    （ｃ）超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｉｉ）の該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液と混合すること、
    （ｄ）該画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液をフィルタープレスで濾過することにより、濾過ケーク及び上澄みを形成すること、
    並びに
    （ｉｖ）以下により該超微粒子状二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）から該ＩａＩｐを抽出するステップ：
    （ｅ）６．０〜９．０のｐＨおよび５０ｍＭ〜５００ｍＭの塩濃度を有するＩａＩｐ抽出緩衝液で該濾過ケークからＩａＩｐを抽出することにより、濃縮ＩａＩｐ組成物を調製すること
    を含む、請求項１記載の方法。
  3. 追加の沈殿ステップにおいて、前記濃縮ＩａＩｐ組成物から不純物を沈殿させることにより、抽出ステップ（ｉｖ）の終了段階にＩａＩｐを含有する上澄みを形成するステップ
    を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記追加の沈殿ステップが６．０〜８．０のｐＨにおける１０％〜１９％アルコールを用いた沈殿を含む、請求項３記載の方法。
  5. ５．０〜７．０のｐＨで２０％〜３０％アルコールを用いて、抽出ステップ（ｉｖ）の終了段階に、ＩａＩｐを沈殿させるステップ
    を更に含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
  6. ５．５〜６．５のｐＨで２２％〜２８％アルコールを用いてＩａＩｐを沈殿させる、請求項５記載の方法。
  7. 前記濃縮ＩａＩｐ組成物由来のＩａＩｐをアニオン交換樹脂に結合させるステップ、及び、
    溶離緩衝液を用いて該アニオン交換樹脂から該ＩａＩｐを溶離させることにより、ＩａＩｐを含有する第１の溶離液を形成するステップ
    を更に含み、
    該追加の段階が、抽出ステップ（ｉｖ）の終了段階に実施される、
    請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
  8. 前記第１の溶離液由来のＩａＩｐをヘパリン親和性樹脂に結合させるステップ、及び、
    溶離緩衝液を用いて該ヘパリン親和性樹脂から該ＩａＩｐを溶離することにより、ＩａＩｐを含有する第２の溶離液を形成するステップ
    を更に含み、
    該追加の段階が、抽出ステップ（ｉｖ）の終了段階に実施される、
    請求項７記載の方法。
  9. 前記第１の溶離液中又は前記第２の溶離液中に存在するＩａＩｐが更に濃縮される、請求項７又は８記載の方法。
  10. 前記沈殿ステップのうちの少なくとも１つがアルコールの噴霧添加を含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
  11. 前記沈殿ステップの全てがアルコールの噴霧添加を含む、請求項１０記載の方法。
  12. ｐＨ調整剤の添加により、前記第１の沈殿ステップ、又は前記第２の沈殿ステップのうちの少なくとも１つにおいて、アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整する、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
  13. ｐＨ調整剤の添加により、全ての前記沈殿ステップにおいてアルコールの添加の後に前記溶液のｐＨを調整する、請求項１２記載の方法。
  14. ｐＨ調整剤の添加が、ｐＨ調整溶液の噴霧添加を含む、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. アルコール添加の前及びその後に、アルコール添加の間及びその後に、又はアルコール添加の前、その間及びその後に、沈殿ステップのｐＨを調整する、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
  16. 沈殿ステップのｐＨが、ｐＨの連続的調節により全沈殿ステップに関して維持される、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
  17. 前記ＩａＩｐを抽出するステップが、画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過ケークを含有するフィルタープレスを通してＩａＩｐ抽出緩衝液を再循環させることを含む、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
  18. 前記ＩａＩｐ抽出緩衝液を少なくとも１０分間前記フィルタープレスを通して再循環させる、請求項１７記載の方法。
  19. 前記ＩａＩｐ抽出緩衝液を少なくとも３０分間前記フィルタープレスを通して再循環させる、請求項１７記載の方法。
  20. 前記ＩａＩｐ抽出緩衝液のｐＨが、少なくとも１つのＩａＩｐタンパク質の等電点とは少なくとも０．３単位異なる、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
  21. 前記濃縮ＩａＩｐ組成物が少なくとも１つのウィルス不活性化ステップに更に供される、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
  22. 前記ウィルス不活性化ステップが溶媒及び／もしくは洗浄剤による処理、ナノ濾過、熱処理、又は低ｐＨにおけるインキュベーションを含む、請求項２１記載の方法。
  23. 抽出ステップ（ｉｖ）の終了段階に、単一のインターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）種を単離する、請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
  24. 前記ＩａＩｐ種がインターαトリプシン阻害剤（ＩａＩ）である、請求項２３記載の方法。
  25. 前記ＩａＩｐ種がプレα阻害剤（ＰａＩ）である、請求項２３記載の方法。
  26. 前記ＩａＩｐ種が抗体親和性方法により単離される、請求項２３〜２５の何れか１項に記載の方法。
  27. 超微粒子状二酸化ケイ素がヒュームドシリカである、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
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