JP6100803B2 - 改良された表面プラズモン共鳴方法 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴効果の検出に関し、特に、抗体／抗原の結合事象などに起因した、導電性表面における屈折率変化の検出に関する。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象は、例えば、金属で被覆された表面などの導電性表面の近傍で何らかの事象が生じた場合に、導電層表面における微小な屈折率変化を検出するために用いることができる。特に、抗原（ターゲット）と表面に固定された抗体（プローブ）との間の反応を量的に決めることに用いられうる。表面プラズモン共鳴は、金属境界に存在し、入射光線の光子を吸収する時間変化する電界によって誘起される自由電子の振動に起因する。このような振動は、金属表面に近接する材料の屈折率による影響を受ける。センサー機構の原理を形成するのは、これである。

最も一般的なＳＰＲの形態の一つは、例えば金属で被覆された表面において、幅広い入射角で導電層に入射する偏向した単色光源（例えば、ダイオードレーザ）の使用を伴う。この形態では、測定されるべき事象が発生する時間にわたって反射光線の光強度を角度の関数として計測し、光強度が極小となる角度の変化を時間の関数として検出する。

実用的な用途として、ＳＰＲ検出デバイスは、特性を明らかにすべき液体試料を有するカートリッジをしばしば含む。多くの用途においてカートリッジは可動であり、特にいくつかの用途において、カートリッジはＳＰＲ測定が行われる間回転しうる。ＳＰＲ測定は、液体試料中の極めて小さな変化（例えば、対応するプローブに結合する血液マーカの低い濃度）を検出しうるが、外部影響（例えば、温度、カートリッジの傾きおよび位置、バルク効果）にも非常に敏感でありうる。後者は、信号対雑音比の顕著な低下を招き、ＳＰＲデバイスの応用範囲を限定しうる。

したがって、従来のデバイスと比べて改善された信号対雑音比を提供するＳＰＲデバイスを有することが望まれるであろう。さらに、ＳＰＲデバイスが可動カートリッジを含む場合において、出力データの品質を確保するために自己参照および品質管理のための機構を有することが有益であろう。

本明細書における具体的な記載は、検出領域に入射する偏向した二重の単色光源に関する。二重の単色光源は、二つのほぼ同一の入射角にて表面プラズモン共鳴を誘起するのに十分な程度にほぼ同一な二つの波長を有する。その結果、双方の波長にてＳＰＲが生じる角度に対し、実用的な角度範囲内で光を捕捉できる。二つの表面プラズモンのそれぞれは所定の臨界入射角の範囲にわたって同時に発生し、これらの効果が混合されて光吸収効果の増大を招くと考えられる。有利なことに、本明細書に記載される臨界入射角の範囲における光反射の測定は、従来知られている表面プラズモン共鳴デバイスと比べて、液体試料中で生じる事象に対してより大きい感度を示す。さらに本明細書では、品質テストおよびフィードバックシステムに用いられる二重の表面プラズモン共鳴測定に関連する自己整合性テストが記載される。

第１の態様は、独立請求項１に記載されるように、表面プラズモン共鳴信号を分析する方法である。

いくつかの実施の形態は、ＳＰＲが生じる導電層から得られる光強度を示す第１および第２の信号を、当該層における入射、反射または回折（入射光線を記録する検出器によって、導電層からの反射または透過のいずれが得られるかによる）の角度の関数として処理するステップを含む。第１および第２の信号のそれぞれは、二つの凹みと二つの凹みの間に位置するピークを有し、二つの凹みは各波長にて表面プラズモン共鳴が生じるそれぞれの角度における光の各波長に対応する。処理するステップは、ピークの領域における信号の大きさを示す量である第１および第２の値を導出するステップを含む。この方法は、第１および第２の値を比較し、その結果、第１の信号の取得後、第２の信号の取得前における導電層の屈折率の変化を検出するステップを提供する。好ましくは、変化を検出するステップが変化の大きさを導出するステップを含む。

有利なことに、この方法は、例えば温度、カートリッジの傾きや位置、バルク効果などの外部影響に対する感度がより低く、その結果、改善された信号対雑音比を提供できる。

屈折率の変化を検出すること（変化の大きさを取得することや、単に変化が生じること）への言及が、それがはっきりと算出または検出されなくても、ＳＰＲにより検出可能な基本的な信号として暗にそうすることを含むことが理解されよう。例えば、この方法は、層の上に固定されるプローブに結合するターゲットといった導電層の液体試料中の組成変化や濃度変化、温度変化、または、ＳＰＲに影響を与えるいかなる他の変化を示す結果を生成してもよい。さらに、この方法は、入射光が検出器に到達するために層によって透過するか反射するかにかかわらず同じように適用可能であってもよいし、光路が液体に接触する試料を通過するか否かに関わりがなくてもよい（例えば、層の表面からの反射により、試料に接しない）。この方法は、信号が収集される間に信号が処理され変化が検出されるオンラインの方法としても、また、後処理のために信号が保存されるオフラインの方法としても、同様に適用可能である。

いくつかの実施の形態において、第１の信号は試料を層に接触させる前に記録され、第２の信号は試料を層に接触させた後に記録される。このようにして、この方法によりユーザが液体試料に起因する導電層における屈折率の小さな変化を検出できるようになることが理解されよう。好ましくは、層上のプローブに結合する（さらに、分離洗浄の後に残留する）ターゲットに起因して屈折率の変化が生じるように、プローブは層の上に固定され、試料はターゲットを含む。血液試料、血漿試料または他の液体中に存在する少量のターゲットを検出するためにこの方法を用いることができるため、これは特に有利である。

いくつかの実施の形態において、照明は両方の波長にて同時に提供され、さらに、信号は両方の波長にて同時に取得されてもよい。両方の波長で同時に信号を取得することにより、上述の処理に必要な信号を、例えば、面積検出器、ＣＣＤアレイまたは適切に配置された光増倍管を用いた簡易かつ効果的な方法で、取得できる。さらに、同時照明に起因してＳＰＲ効果が改善されると考えられる。

ピークの領域における信号の大きさを示す量はピークの高さであってもよく、および／または、ピークと閾値強度レベルの間であって信号より下の面積であってもよい。この閾値強度レベルは、二つのＳＰＲの凹みの間の強度差および既定の乗数または付加定数を規定することにより決定されてもよい。ピークの高さまたは面積の変化を考慮する方法を提供することにより、この方法は、共鳴角度における角度シフトや特定の角度位置に固定された強度の大きさを考慮する従来の方法と比較した場合に、より大きな感度およびより増大した信号対雑音比を提供しうる。測定される量は、既定の角度位置を指標としたり角度測定を当てにしたりするのではなく、カーブの形状に直接的に基づく。

有利なことに、この方法は、第１および第２の信号の間の整合性を確認することを追加的に提供してもよい。これは、第１の信号の各凹みにおける量および角度の少なくとも二つの値と、第２の信号の同じ少なくとも二つの値とを比較し、第１および第２の信号の間のそれぞれの変化が一定であるかを確認することで行うことができる。このような自己整合チェックは、従来の表面プラズモン共鳴技術には利用できないか、そもそも不可能かもしれない。自己整合チェックを提供することにより、この方法により得られる結果が信頼できることを保証する品質保証を提供できる。さらに、この方法により結果が一定でないことが分かると、不整合の原因を修正するための調整にフィードバック制御を用いることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、この方法は、整合性を確保するために導電層の向きを調整することを可能とする。

いくつかの実施の形態において、導電層は、カートリッジに接して設けられる。有利なことに、これは導電層を容易に交換することを可能にし、それによって表面プラズモン共鳴デバイスを使用する間の中断時間を最小化する。カートリッジは、導電層と接触する液体試料を保持するための液体保持構造を備えてもよい。カートリッジは、液体の流れを生じさせるために回転可能であってもよい。層は、格子形状を備えてもよい。

導電層は、ＳＰＲの運動量結合を実現するために適切な回折格子として構成されてもよく、または、全反射による運動量結合を実現するためにプリズム構造が用いられてもよい。

いくつかの実施の形態において、この方法は、信号対雑音比を改善するために、波長の一方または双方（または、それらの差）を調整するステップを含んでもよい。この調整は、各波長を出力する二つのレーザダイオードの間に配置される冷却または加熱（または両方）の要素を用いることであってもよく、温度制御により波長を制御するためにレーザ発振動作を変化させることであってもよい。ダイオードは、本質的に同じ波長を出力してもよく（波長差は温度差によって既定される）、または、異なる波長を出力してもよい（この場合であっても、温度を用いて波長差が調整される）。

第２の態様は、独立請求項１４に記載されるように、屈折率の変化を検出する方法である。

いくつかの実施の形態は、二つの波長の光で導電層を同時に照明するステップと、一方の波長にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第１の強度極小値となる角度および他方の波長にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第２の強度極小値となる角度の間にわたる角度で、導電層の表面から返る光の強度を測定するステップと、測定した強度の変化を検出することにより屈折率の変化を検出するステップと、を備える。

いくつかの実施の形態において、変化を検出するステップは、測定した強度の変化に基づいて導電層の表面に付着した試料中のターゲット分子の濃度を定量化することを含む。同時照明は、ビームスプリッタを用いて（場合によっては、適切なフィルタリングも用いて）混合される、二つのレーザ、レーザダイオードまたはＬＥＤなどの別個の単色光源により提供されてもよい。適切なスペクトル線を有する単一光源を代わりに用いてもよい。

第３および第４の態様は、独立請求項１９および２９に記載されるように、上述した方法を実現するように構成されるシステムである。

実施の形態は、添付の図面を参照しながら、本開示の態様および本質を例示的に説明することのみを目的として以下に記載される。

モータ（５０）および光学モジュール（６０）に取り付けられる回転可能カートリッジ（１０）を備え、モータ（５０）および光学モジュール（６０）の双方がベース（７０）に取り付けられるデバイス（１）を示す図である。光学モジュール（６０）は、互いに直交して配置される二つのレーザダイオード（６２）および（６３）と、二つのレーザダイオードの光線を混合可能なビームスプリッタ（６４）と、を備える。 図１に示すデバイス（１）の光学検出器（８０）を用いて、光学検出器（８０）における入射角の関数として検出される二つの出力光強度信号を示す図である。 デバイス（１）の動作手順を示す図である。

図１は、取り外し可能にモータ（５０）に取付可能な回転可能カートリッジ（１０）を備えるデバイス（１）を示す。デバイス（１）は、光学モジュール（６０）をさらに備える。モータ（５０）および光学モジュール（６０）の双方は、好ましくはベース（７０）に取り付けられる。光学モジュール（６０）は、二つのレーザダイオード（６２）および（６３）を備え、これらは好ましくは互いに直交して配置される。好ましくは、光学モジュール（６０）は、レーザダイオード光線の混合に適切なビームスプリッタ（６４）を備える。

ビームスプリッタ（６４）からの光線（１００）は、カートリッジ（１０）の検出領域（３０）に集光される。薄い金属層で被覆された既定の格子形状を有する格子誘電体で構成される格子表面（４０）は、カートリッジ（１０）の上に設けられ、表面プラズモン共鳴効果を発生するための検出面として機能する導電層を提供しうる。光線（１００）は、次にレンズなどの光学要素（９０）に入射し、つづいて光学検出器（８０）に入射する。

好ましくは、検出領域（３０）は、デバイス（１）によって量的に測定されるべき特定の生物学的要素を含む試料液体を収容してもよい。好ましくは、カートリッジ（１０）は、互いに接着された二つのプラスチック部品（１１）および（１２）を備える。カートリッジ（１０）は、モータ（５０）の動作によりそれが回転している間、光学検出器（８０）によって光線（１００）を検出できるように配置される。

図２は、図１について上述したデバイス（１）の光学検出器（８０）を用いて、光学検出器（８０）の入射角の関数として検出される二つの出力光強度信号を示す。図２に示されるように、第１の光強度出力信号（２００）は、光源（６２）および（６３）のそれぞれの表面プラズモン共鳴に対応する二つの凹み（２０１）および（２０２）を備える。好ましくは、デバイス（１）は、一連のパラメータを調整できるように構成可能である。この一連のパラメータは、格子形状（すなわち、格子周期、格子高さおよび外形状）、入射角の範囲、二つの単色光源（６２）および（６３）の波長差を含むが、これらに限定されるものではない。図２に示されるように、二つの表面プラズモン共鳴の凹み（２０１）および（２０２）の間には、光強度ピーク（２１０）がある。二つの単色光源の波長差に起因して、二つの凹み（２０１）および（２０２）は異なる光強度値を有する。

分析デバイス（１）は、少なくとも一つの検出領域（３０）に配置または流入される液体試料中の事象または要素の調査もしくは定量化に用いられてもよく、測定は時間の関数として実行されてもよい。好ましくは、デバイス（１）はセンサグラム（sensorgram）を決定し、これにより表面プラズモン共鳴に影響を与える少なくとも一つのパラメータの経時的な変動を提供する。

センサグラムは、光強度出力信号の表面プラズモン共鳴の凹み（２０１）の極小値に対応する入射角を経時的な角度（例えば入射角）の関数として示してもよい。

図２の詳細な説明を続けると、カーブ（３００）は、カーブ（２００）の信号が検出される期間の後に光学検出器（８０）にて検出される光強度出力信号を表す。ある事象、例えば格子表面（４０）の薄い金属層の上に被覆された特定の抗体と血液マーカとの結合（および好ましくは、余分な試料を除去する後続の洗浄）が液体試料中で生じると、その事象に関連した格子表面（４０）の屈折率の変化により、凹み（３０１）および（３０２）の極小値の角度位置がカーブ（２００）と比べて変化する。従来の方法は、一方の波長におけるｍ１ｉおよびｍ１ｆの角度距離および他方の波長におけるｍ２ｉおよびｍ２ｆの距離により表される、このシフトの定量化に関する。

本明細書に記載される方法は、二つの表面プラズモン共鳴の凹みの間に位置する出力光信号の光強度ピークの（２１０）から（３１０）への変化を探求する。これは、表面プラズモン共鳴の凹みのそれぞれの変化と比べて、ピーク（２１０）からピーク（３１０）へのより際立った変化を示す図２から分かるであろう。

デバイス（１）により算出される変化の信号を高めるために、単色光源（６２、６３）の一つにそれぞれ由来する表面プラズモン共鳴の凹みの双方が顕著に異なる極小強度値を有するという観察される事実をさらに探求してもよい。図２のｓ１およびｓ２で定義される各凹み（２０１）および（２０２）の強度差δを測定することにより、デバイス（１）は、閾値レベル（４００）を決定し、その閾値より上のピークの総面積を算出する。この閾値は、いくつかの実施の形態において、差δの数倍の因数として計算される。

デバイス（１）によって検出されるべき事象が発生する間に、面積Ａｉは面積Ａｆへと変化する。この面積の変化の検出は、従来の方法により用いられる唯一の情報であるｍ２ｉからｍ２ｆへの角度シフトと比べ、数桁大きな感度でなされうる。

本明細書に記載される分析方法は、二波長の強度信号での表面プラズモン共鳴のそれぞれの非対称な変化に関連した、この新しい効果を探求する。

本明細書に記載される方法の追加的な優位性は、請求項に係る方法が暗闇の測定よりも容易な光を測定するという事実に基づく。これにより、信号対雑音比をさらに増大させることができる。

本明細書では、デバイス（１）により提供され、従来の表面プラズモン共鳴デバイスにて生じる品質管理問題を克服するための自己整合性を検査する方法がさらに記載される。表面プラズモン共鳴分析デバイスに関連する重要な態様の一つは、整合性および品質管理に関する。

デバイス（１）は、出力信号中に検出され図３に示される特徴間の既知の相関を調査することにより、組み込みの自己整合性検査に用いられてもよい。この検査は、特定の検出領域からの不整合な出力信号を有する測定を合格または不合格とするための合否判定基準を有してもよい。自己整合性検査のために用いられる相関の一つの例では、凹みｍ２のシフトまたは変化がｍ１のシフトまたは変化よりも顕著に小さい場合または大きい場合に、測定は自己整合でないとみなされる。別の例では、ｍ１およびｍ２のシフトの双方が整合していたとしても、ｍ１およびｍ２のシフトとの相関から得られる期待されるシフトと比べた場合にピーク強度Ｌのシフトが顕著に小さい場合または大きい場合にも、測定は自己整合でないとみなされる。

図３は、デバイス（１）の動作手順を示す。

各出力パラメータの不整合は、異なる影響から生じうる。例えば、光学モジュール（６０）に対するカートリッジ（１０）の向きや位置に応じて、特に許容しうる範囲外にそれが位置する場合に、変動が生じうる。本明細書に記載されるデバイス（１）は、光学モジュール（６０）に対するカートリッジ（１０）の相対的な位置および／または向きを決定するために、出力データの相関するパラメータの測定を用いることができるよう動作してもよく、これにより、測定されたシフトに対する修正アルゴリズムの適用を可能にする。さらに、カートリッジ（１０）の位置および向きを決定することにより、デバイス（１）は、機械的アクチュエータによるフィードバック修正動作を誘導するように構成されてもよい。

一つの具体的なデバイスおよび方法の実施の形態が記載される。

カートリッジ（１０）は、０．６ｍｍ厚の二つのディスク形状のポリカーボネート部品を互いに接着したもので構成され、モータ（５０）の回転軸を中心にして１２０ｍｍの外直径および１５ｍｍの内直径を有する。カートリッジは、上側カートリッジ部品（１１）に０．０２ｍｍの深さでそれぞれが彫り込まれた３０個の検出領域（３０）を含み、回転軸から５０ｍｍの平均半径を有し、０．２μＬの血液を保持する能力を有する。カートリッジはディスク形状として提供される必要はなく、本明細書に記載されるカートリッジの大きさや材料は単なる例示であることは理解されよう。

カートリッジが回転する間、希釈された血漿からなる液体試料は、それぞれの検出領域（３０）を通過して上流チャンバから下流チャンバへと流れる。好ましくは、カートリッジは約２５Ｈｚで回転する。カートリッジ（１０）の下側部品（１２）は、検出領域（３０）において格子を含み、いくつかの実施の形態において正弦台形状（sine-trapezoidal shape）である。より具体的には、いくつかの実施の形態において、格子は９５０ｎｍの格子周期と５０ｎｍの格子高さを有する。格子は、ポリカーボネート部品（１２）に刻みこまれ、抗体が付着する１００ｎｍの金で被覆されてもよい。抗体が付着可能となる他の適切な被覆が提供されてもよいことは理解されよう。

光学モジュール（６０）は、いくつかの実施の形態において、二つのダイオードレーザ（６２）および（６３）を含む。実施例では、ダイオードレーザは７８５ｎｍおよび８０８ｎｍで出力し、直交して配置される。ビームスプリッタは、０．１ｍｍ厚のガラス板と１５ｎｍの反射金属層からなり、〜８００ｎｍの波長において〜５０％の光透過性を有するように調整された厚さを有する。アクリル円柱（６５）は、光線（１００）を検出領域（３０）の格子表面（４０）に好ましく集光させる。１次の反射回折光は偏光子（９０）を通過し、光学検出器、好ましくはＣＭＯＳカメラ（８０）に入射する。カメラは、格子表面（４０）の平面に対して〜５５度を中心に〜３度の角度範囲にわたって出力光信号を検出できる。ダイオードレーザ、ビームスプリッタおよび光学検出器の他の適切な仕様および構成が提供されてもよいことは理解されよう。

モータ（５０）は、標準的なＢＬＤＣモータであってよく、５Ｈｚから１５０Ｈｚの間で回転速度が制御できる。モータ（５０）および光学モジュール（６０）の双方は、ベース（７０）に取り付けることができ、システム全体は外部の構成要素により温度制御されることが好ましい。

一実施の形態において２５Ｈｚでモータが回転するとき、この例においてＰＢＳ１Ｘ（または他のいかなる適切な緩衝剤）からなる第１の緩衝液は、概ね一定の流量で検出領域（３０）を通過して流れることができる。得られる信号は、図２のカーブ（２００）で示される。その後、希釈された血漿試料が検出領域を通過して流れ、好ましくは最終的にＰＢＳ１Ｘからなる緩衝液が再び検出領域（３０）を通過して流れ、洗浄され、図２のカーブ（３００）で示される最終的な基準となる信号が形成される。

観察される変化は、検出領域（３０）の格子表面上に固定される抗体との結合を有する検体の濃度に実質的に比例する。

凹みおよびピークの強度および角度位置は、上述のように、自己整合性のためにさらに分析されてもよく、測定結果は、観察された値および基準に基づいて合格または不合格の判定がされてもよい。

いくつかの実施の形態において、二つの表面プラズモン共鳴の凹みは、個別の角度、例えば５４．５度および５５．５度を中心にして生じることが期待される。数々の実験的な影響は、二つの表面プラズモン共鳴の凹みを異なる値に導きうる。カートリッジの曲がりや向き、システムの温度、液体試料の濃度、生物的な被覆などの影響である。一実施の形態において、システムは、角度公差として例えば±０．１度の合格基準で定義される。これは、測定された凹みの角度が個別の角度公差、例えば１度±０．１度に一致する差を有する場合にのみ測定が合格となることを意味する。さらに別の例においては、合格基準は、追加または代替で、絶対的な角度基準を含み、例えば角度の間隔が１度±０．１度であり、かつ、それぞれの凹みの中心が特定の角度、例えばそれぞれ５４．５度と５５．５度であることを求める。後者の場合において、仮に二つの凹みの間隔が１度±０．１度であっても、中心がそれぞれ５４．５度および５５．５度近辺に位置しない場合、測定は不合格となるであろう。これは、例えば、カートリッジが予期される向きに対して傾いた向きを有する場合に、実際に生じるであろう。

具体的な実施の形態において、特定の角度値（例えば５度）に傾いたカートリッジの向きは、導電層／検出面の傾きに起因して、双方のＳＰＲの凹みが同等にシフト（例えば同じ５度）することにつながるであろう。この傾いた向きは、二つのＳＰＲの凹みの最初の角度位置を観察することにより容易に決定できるであろう。したがって、この傾いた向きは、いくつかの実施の形態において、凹みの相対的な角度位置が整合していれば、測定品質に無関係と考えられる。他の実施の形態において、双方のＳＰＲの凹みが許容できる角度範囲内で相互に間隔をあけて観察される場合であっても、カートリッジの傾いた向きは測定を合格とするために重要と考えられる。特定の合格基準を定義して実行することにより、結果的に測定を不合格とすることができる。

さらに、特定の実施の形態において、フィードバックループは、カートリッジ（したがって、導電層／検出面）の向きを修正するために、コマンドを適用して機械的アクチュエータを動作させる。例えば、フィードバック機構は、いくつかの実施の形態において、次のように実行される。（ｉ）二つのＳＰＲの凹みが許容可能な範囲内の間隔であるかを確認し、（ｉｉ）予期される位置からの凹みの中心位置の角度ずれ（例えば２度）を発見し、（ｉｉ）二つのＳＰＲの凹みにもたらされた予期される角度位置に対する決定されたずれの分だけ光学モジュール（６０）を傾け、（ｉｖ）上述の実施の形態に係るさらなる測定を実行する。

品質管理が可能となる数々の相関は、表面プラズモン共鳴検出システムの用途およびそれぞれの具体的な実施に応じて導き出されてもよい。相関は、ほぼ同じであるが少しだけ異なる二つの表面プラズモン共鳴の凹みに起因する光学信号の予期される一般的な形状を頼りにする。自己整合性のパラメータは、実施の形態のような特定の測定を合格とするために観察する必要がある。

ある具体的な実施の形態において、ＳＰＲの凹みは、試料が通過する前の最初のＳＰＲ測定に対して所定の角度位置の範囲内（例えば、第１のＳＰＲの凹みでは５４．５度±０．１度、第２のＳＰＲの凹みでは５５．５度±０．１度）である必要があり、かつ、二つのＳＰＲの凹みの相互の間隔が別の所定の角度範囲内（例えば、１度±０．１度）である必要がある。この場合、これらが合格基準に適合しない場合、測定は不合格となる。

別の具体的な実施例において、追加的または代替的に、二つのＳＰＲの凹みの間に位置する初期ピークの強度レベルＡｉは、最大測定光強度に対して既定の割合、例えば、最大測定光強度の７０％±１％である必要がある。

いくつかの実施の形態において、適用可能な全て合格基準を満たしていない場合、測定は不合格となる。

他の具体的な実施例において、例えば、測定の合格にさらなる追加的な合格基準が必要とされる場合には、別のまたは追加的な基準がより望ましいかもしれない。追加的な関連する合格基準は、二つのＳＰＲの凹みの光強度の相対的な差、初期ピークＡｉと二つのＳＰＲの凹みｍ１ｉおよびｍ２ｉの間の相対的な角度の間隔、二つのＳＰＲの凹みそれぞれのシフトの相対的な差などを含んでもよいが、これらに限られるものではない。

いくつかの実施の形態において、ダイオードレーザ（６２）および（６３）は、同一または本質的に同じ波長を出力してもよい。さらに、これらの実施の形態において、追加的なペルチェ熱電モジュールが二つのレーザダイオードの間に配置され、ダイオード（６２）および（６３）の間の温度差を誘起するように動作してもよい。この温度差は、レーザ発振波長の温度に対する既知の従属性を考慮すると、顕著に異なるレーザ発振波長につながる。要素（６２）および（６３）の間の温度差を変化させることにより、上述の二重表面プラズモン共鳴効果の最大化を目的として、誘起される温度差が調整されてもよい。同じ構成は、本質的に同じ周波数で出力する二つのレーザダイオードの波長差を調整するためにも用いられてよい。

いくつかの実施の形態において、検出面は、正弦台形状の代わりに、正弦関数形状、台形状または三角形状の格子表面を有してもよい。格子表面の具体的な各形状は、それぞれのＳＲＰの凹みについて、特に期待されるＳＰＲの凹みの幅および対称性について、異なった特徴的な形状をもたらすであろう。したがって、上述したような品質管理またはフィードバック制御を用いる場合、合格基準のパラメータは、具体的な格子の実施のそれぞれに応じて調整される。

代替的に、いくつかの実施の形態において、検出システムは、平坦な導電層を有する検出面を有し、ＳＰＲの発生に求められる運動量結合を実現するプリズム構成を用いる。後者の場合、ＳＰＲの凹みは、既知のあらかじめ定義された形状を有する。また、品質管理およびフィードバック制御を用いる場合、合格基準は、この具体的な実施のために調整される必要がある。

本発明は、いかなる具体的な種類のカートリッジの容量、構造または材料に限定されず、また、具体的な数の検出領域に限定されないことが理解されよう。

疑義を避けるために、本明細書において「微小流体（microfluidic）」の語は、少なくとも１ｍｍ未満の寸法を有する容器またはチャネルのような流体要素を有するデバイスを意味すると見なされる。

本発明は、具体的に記載された実施の形態または実施例により限定されることを意図しないことが理解されよう。さらなる実施の形態は、以下の項目により開示される。

１．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の検出方法であって、
ＳＰＲをサポートするセンサ面を備えるＳＰＲセンサを提供するステップと、
前記センサ面に分析されるべき試料を接触させ、前記センサ面に二つのＳＰＲ励起光線を変化する入射角で照明することにより前記ＳＰＲをサポートするセンサ面における少なくとも二つの共鳴条件を観測し、反射されたテスト光線を検知するステップと、
前記反射されたまたは透過したテスト光線の少なくとも一つの特性を決定するステップと、を備え、
ほぼ同一であるが同一でない波長の二つの光線で前記センサ面を照明するステップと、
二つの光線に由来する二つのＳＰＲの凹みの同時測定を実行するステップと、
二つのＳＰＲの凹みのそれぞれの強度レベルを決定するステップと、
二つのＳＰＲの凹みの強度差と既定の定数との積により定義される閾値レベルを決定するステップと、
二つのＳＰＲの凹みの間であって算出された閾値より上側に存在し、入射角の関数として積分された光強度を決定するステップと、を備えることを特徴とする方法。

２．センサ面は、格子形状を有する、項目１に記載の方法。

３．絶対強度もしくは重心法、または、入射角の関数として光強度極小値を決定可能な他のいかなる方法により、二つのＳＰＲの凹みのそれぞれの角度位置の決定がさらに実行される、項目１または２に記載の方法。

４．センサ面は、回転により動作するカートリッジの中に含まれる、項目１から３に記載の方法。

５．ＳＰＲの凹みのそれぞれにおけるいくつかの生物学的な事象のためにシフトが算出され、ＳＰＲの凹みの双方に関して追加の自己整合性テストが実施され、既定の合否判定基準との比較が実行され、その後、比較結果にしたがって測定が合格または不合格となる、項目１から４に記載の方法。

６．ＳＰＲの凹みのそれぞれにおけるいくつかの生物学的な事象のためにシフトが算出され、センサ面を含むカートリッジの位置および向きの情報がＳＰＲの凹みの双方の結果から取得され、決定されたカートリッジの位置および向きの情報に基づいて修正シフト関数が適用され、さらに機械的アクチュエータに対するフィードバックの実行がなされる、項目１から４に記載の方法。

Claims (33)

1. 表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）信号の分析方法であって、
   ＳＰＲが生じる導電層から得られる光強度を示す第１の信号を、前記層における入射、反射または回折の角度の関数として処理するステップであって、前記第１の信号は、各波長にて表面プラズモン共鳴が生じるそれぞれの角度における光の各波長にそれぞれが対応する二つの凹みと、前記二つの凹みの間に位置する一つのピークとを有し、当該ステップが前記ピークの領域における信号の大きさを示す量である第１の値を導出することを含むステップと、
   ＳＰＲが生じる導電層から得られる光強度を示す第２の信号を、前記層における入射、反射または回折の角度の関数として処理するステップであって、前記第２の信号は、各波長にて表面プラズモン共鳴が生じるそれぞれの角度における光の各波長に対応するそれぞれが二つの凹みと、前記二つの凹みの間に位置する一つのピークとを有し、当該ステップが前記ピークの領域における信号の大きさを示す量である第２の値を導出することを含むステップと、
   前記第１および第２の値を比較し、前記第１の信号の取得後、前記第２の信号の取得前における前記導電層の屈折率の変化を検出するステップと、を備える方法。
2. 前記変化を検出するステップは、前記変化の大きさを導出することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の信号は、試料を前記層と接触させる前に記録され、前記第２の信号は、前記試料を前記層と接触させた後に記録される、請求項２に記載の方法。
4. 屈折率の前記変化が前記層の上のプローブに結合するターゲットに起因するように、プローブが前記層の上で固定され、前記試料がターゲットを備える、請求項３に記載の方法。
5. 両方の波長で同時に照明を提供するステップと、
   両方の波長で同時に前記信号を取得するステップと、をさらに備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ピークの領域における信号の大きさを示す量は、前記ピークと閾値強度レベルの間であって前記信号より下側の面積を備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記閾値強度レベルは、前記凹みにおける各信号の大きさの差に比例する、請求項６に記載の方法。
8. 前記ピークの領域における信号の大きさを示す量は、前記ピークの高さを備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１の信号の各凹みにおける前記量および前記角度の少なくとも二つの値と、前記第２の信号の同じ少なくとも二つの値とを比較することにより、前記第１および第２の信号の間の整合性を確認するステップをさらに備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１の信号、前記第２の信号またはその両方から計測される一以上のパラメータの各値を、前記一以上のパラメータの期待される各値と比較するステップをさらに備え、
    好ましくは、前記各値が整合しない場合に前記信号を不合格とするステップをさらに備え、
    追加的または代替的に、前記各値が整合するように前記導電層の向きを調整するステップをさらに備える、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記導電層は、当該導電層に試料を接触させるための液体保持構造を備えるカートリッジに接して設けられる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記カートリッジは、当該カートリッジ内で液体の流れを生じさせるために回転可能である請求項１１に記載の方法。
13. 前記導電層は、格子形状を備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 屈折率の変化を検出する方法であって、
    二つの波長の光を導電層に同時に照明するステップと、
    前記波長の一方にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第１の強度極小値となる角度および前記波長の他方にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第２の強度極小値となる角度の間にわたる角度で、前記導電層の表面から返る光の強度を測定するステップと、
    前記測定した強度の変化を検出することにより前記導電層における屈折率の変化を検出するステップと、を備える方法。
15. 前記変化を検出するステップは、前記測定した強度の変化に基づいて前記導電層の表面に付着した試料中のターゲット分子の濃度を定量化することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）信号を分析するためのシステムであって、
    ＳＰＲが生じる導電層から得られる光強度を示す第１の信号を、前記層における入射、反射または回折の角度の関数として処理する手段であって、前記第１の信号は、各波長にて表面プラズモン共鳴が生じるそれぞれの角度における光の各波長にそれぞれが対応する二つの凹みと、前記二つの凹みの間に位置する一つのピークとを有し、当該第１の信号を処理する手段が前記ピークの領域における信号の大きさを示す量である第１の値を導出するように構成される手段と、
    ＳＰＲが生じる導電層から得られる光強度を示す第２の信号を、前記層における入射、反射または回折の角度の関数として処理する手段であって、前記第２の信号は、各波長にて表面プラズモン共鳴が生じるそれぞれの角度における光の各波長にそれぞれが対応する二つの凹みと、前記二つの凹みの間に位置する一つのピークとを有し、当該第２の信号を処理する手段が前記ピークの領域における信号の大きさを示す量である第２の値を導出するように構成される手段と、
    前記第１および第２の値を比較し、前記第１の信号の取得後、前記第２の信号の取得前における前記導電層の屈折率の変化を検出する手段と、を備えるシステム。
17. 前記第１および第２の値を比較して変化を検出する手段は、前記変化の大きさを導出するように構成される、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記第１の信号を処理する手段は、試料を前記層と接触させる前に前記第１の信号を記録するように構成され、
    前記第２の信号を処理する手段は、前記試料を前記層と接触させた後に前記第２の信号を記録するように構成される、請求項１７に記載のシステム。
19. 屈折率の前記変化が前記層の上のプローブに結合するターゲットに起因するように、プローブが前記層の上で固定され、前記試料がターゲットを備える、請求項１８に記載のシステム。
20. 両方の波長で同時に照明を提供する手段と、
    両方の波長で同時に前記信号を取得する手段と、をさらに備える、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のシステム。
21. 前記第１および第２の信号を処理する手段は、前記ピークと閾値強度レベルの間であって前記信号より下側の面積に基づいて、前記ピークの領域における信号の大きさを示す量を導出するように構成される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のシステム。
22. 前記閾値強度レベルは、前記凹みにおける各信号の大きさの差に比例する、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記第１および第２の信号を処理する手段は、前記ピークの高さに基づいて、前記ピークの領域における信号の大きさを示す量を導出する、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のシステム。
24. 前記第１の信号の各凹みにおける前記量および前記角度の少なくとも二つの値と、前記第２の信号の同じ少なくとも二つの値とを比較することにより、前記第１および第２の信号の間の整合性を確認する手段をさらに備える、請求項１６から２３のいずれか一項に記載のシステム。
25. 前記第１の信号、前記第２の信号またはその両方から計測される一以上のパラメータの各値を、前記一以上のパラメータの期待される各値と比較する手段をさらに備え、
    好ましくは、前記各値が整合しない場合に前記信号を不合格とする手段と、前記各値が整合するように前記導電層の向きを調整する手段との一方または双方をさらに備える、請求項１６から２４のいずれか一項に記載のシステム。
26. 前記導電層は、当該導電層に試料を接触させるための液体保持構造を備えるカートリッジに接して設けられる、請求項１６から２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. 前記カートリッジは、当該カートリッジ内で液体の流れを生じさせるために回転可能である請求項２６に記載のシステム。
28. 前記導電層は、格子形状を備える、請求項１６から２７のいずれか一項に記載のシステム。
29. 屈折率の変化を検出するためのシステムであって、
    二つの波長の光を導電層に同時に照明する光源配置と、
    前記波長の一方にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第１の強度極小値となる角度および前記波長の他方にて生じる表面プラズモン共鳴に起因して第２の強度極小値となる角度の間にわたる角度で、前記導電層の表面から返る光の強度を測定する検出器配置と、
    前記測定した強度の変化を検出することにより前記導電層における屈折率の変化を検出するプロセッサと、を備えるシステム。
30. 前記プロセッサは、請求項１から１３のいずれか一項に記載される方法を実行するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
31. 前記検出する手段または前記プロセッサは、前記測定した強度の変化に基づいて前記導電層の表面に付着した試料中のターゲット分子の濃度を定量化するように構成される、請求項１６から３０のいずれか一項に記載のシステム。
32. 前記光源配置は、二つのレーザダイオードと、前記二つのレーザダイオードから出力される光を混合する手段と、各レーザダイオードから出力される波長を調整する手段と、を備える、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のシステム。
33. 前記調整する手段は、レーザダイオードの間に配置される、または、レーザダイオードの一方に接する冷却または加熱要素を備える、請求項３２に記載のシステム。

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