JP6039828B2 - モノクローナル抗体の精製方法 - Google Patents
モノクローナル抗体の精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6039828B2 JP6039828B2 JP2015563045A JP2015563045A JP6039828B2 JP 6039828 B2 JP6039828 B2 JP 6039828B2 JP 2015563045 A JP2015563045 A JP 2015563045A JP 2015563045 A JP2015563045 A JP 2015563045A JP 6039828 B2 JP6039828 B2 JP 6039828B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- column
- wash
- chromatography
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 55
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 31
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 claims description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 20
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 7
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 229950003269 bectumomab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 28
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 17
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
Description
本発明は、細胞培養液からのモノクローナル抗体の精製のための改良方法を提供する。所望のモノクローナル抗体の精製方法には、アフィニティー、疎水性相互作用及び場合によってイオン交換カラムクロマトグラフィーが含まれる。それによって、所望のモノクローナル抗体の99%を超える純度が得られる。
細胞培養培地からの医薬品グレードのモノクローナル抗体タンパク質の精製には、採取/清澄に次いで、膜限外ろ過及びダイアフィルトレーションを組み合わせた一連のカラムクロマトグラフィー工程を用いた精製が含まれる。精製後、所望の抗体調製物が適切に処方され、適切な条件下で保存される。しかしながら、これらの工程によっては、その医薬用途として必要な望ましいレベルの純度及び品質の抗体が提供されないことが度々ある。時には、方法に関連した及び生成物に関連した不純物が、カラム精製の間に所望の抗体とともに共溶出されることが観察される。従って、所望の調製物からそのような不純物を減少させる又は除去することが重要である。更に、タンパク質凝集は、モノクローナル抗体(mAb)生産の間の主要な懸念事項である。凝集体が存在すると、モノクローナル抗体の治療効果が減少する可能性があり、ヒトにおいて免疫原性反応を引き起こすことが知られている。従って、精製の下流段階の間に、主にカラムクロマトグラフィーによって、所望のモノクローナル抗体の調製物から凝集体を除去する必要がある。この問題を解決する目的で、本発明は、特定の様式で一連のカラムクロマトグラフィーを用い、目的の抗体を含む無細胞培養培地から高分子量凝集体とともに関連及び生成物関連の不純物を所望のレベルまで除去することに役立つ、抗体精製の新規の方法を提供する。本発明において、抗体精製の該方法は、80%を超える回収率で高度に精製された抗体調製物を産生するよく制御された直接的な精製方法を実証する。本発明において、高度に精製された抗体調製物とは、方法関連及び生成物関連の不純物が実質的に無く、本質的にタンパク質の高分子量凝集体が欠如した少なくとも99%の純度の抗体調製物を意味する。更に、本発明は、高度に拡張性が有り、再現性のある、モノクローナル抗体の精製方法を提供する。記載される新規の精製方法は、プロセス経済及び産業的バイアビリティーの観点で、治療用途のための様々な抗体の精製のための共通のプラットフォームを提供する。
そのような技術のいくつかは、下記の特許文献に開示されている:
米国特許第6417335号は、抗体及び混入物を含む組成物から抗体を精製するための方法を開示しており、その方法には:(a)組成物を陽イオン交換樹脂に添加する工程であって、陽イオン交換樹脂に添加する抗体の量が陽イオン交換樹脂1mLあたり約20mgから約35mgの抗体である工程;及び(b)抗体を陽イオン交換樹脂から溶出する工程が含まれる。
米国特許第7863426号は、イオン交換分離工程を含む、抗体及び少なくとも1つの宿主細胞タンパク質(host cell protein; HCP)を含む混合物からHCP低減抗体調製物を産生する方法であって、前記混合物は、HCP低減抗体調製物が得られるように、第1イオン交換材料に供される方法を記載している。
本発明分野の他の関連特許は、米国特許第6489447号、欧州特許第1075488号;欧州特許第1308455号;欧州特許第1308456B号などである。それらの各々はその全体が引用として取り込まれる。
本発明は、従来のカラムクロマトグラフィー技術を独自の様式で用いて、高度に精製された所望の抗体調製物を得る一方で、方法及び生成物関連不純物、特にタンパク質凝集体を除去することにより、新規の抗体の精製方法を提供する。本発明者らは本明細書においてそのような精製方法を開示する。
本発明は、細胞培養液由来の未精製混合物からモノクローナル抗体を精製するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、一連のクロマトグラフィー及び限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程を含む、未精製混合物からのモノクローナル抗体の精製方法を提供する。
別の態様において、本発明は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー工程の使用を含む、未精製混合物からのモノクローナル抗体の精製方法を提供する。プロテインG又はプロテインLは、アフィニティークロマトグラフィー工程においてカラムマトリックスとして使用可能である。
更なる態様において、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程には、所望の抗体を含む未精製混合物を適切なpH及び/又は結合の伝導性でカラムに添加する工程が含まれ、その後、単一ピークの形態での所望の抗体の溶出の前のカラム洗浄が続く。
別の態様において、本発明に記載の方法には、3つのカラム洗浄工程が含まれ、それは(i)平衡化バッファーでの第1洗浄、(ii)同じpH及び/又は第1洗浄バッファーよりも高い伝導度での第2洗浄(iii)第2洗浄よりも低いpH及び/又は伝導度での第3洗浄(iv)第3洗浄よりも低いpH及び/又は高い伝導度での抗体の溶出である。
別の態様において、本発明に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーは下方勾配塩濃度で行われる。
更なる態様において、本発明は、プロテインAクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む、未精製混合物からのモノクローナル抗体の精製方法を提供する。
更に別の態様において、本発明は、タンパク質溶液のリコンディショニングのための限外ろ過-ダイアフィルトレーションを組み合わせた、プロテインAクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む、未精製混合物からのモノクローナル抗体の精製方法を提供する。タンパク質溶液とは、ここでは本明細書に記載の方法によって得られた混入タンパク質と所望の抗体の混合物又は比較的純粋な所望の抗体調製物いずれかのことを称した。
更なる態様において、本発明に記載のイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される。
好ましい実施態様において、本発明は下記の工程を含む、モノクローナル抗体の精製方法を提供する:
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.疎水性相互作用クロマトグラフィー
3.陰イオン交換クロマトグラフィー
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.疎水性相互作用クロマトグラフィー
3.陰イオン交換クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程は任意の順序で実行してもよい。
プロテインAカラム工程は未精製混合物からモノクローナル抗体を捕獲し、結合-溶出モードにおいて所望のモノクローナル抗体を高レベルの純度でカラムから溶出するために有用である。疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、結合-溶出モードにおいて方法及び生成物関連不純物の更なる除去のために使用される。陰イオン交換クロマトグラフィーは、フロースルーモードにおいて方法関連不純物を更に除去するために利用される。
1つの態様において、本発明に記載の精製できる抗体には、抗HER2抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52、抗RANKL、抗IgE抗体などが含まれる。
更なる態様において、本発明は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程後に5%以下の凝集体の量の抗体調製物を提供する。
別の態様において、本発明は、1%以下、より好ましくは0.5%以下の凝集体の量の抗体調製物を提供する。
本明細書において使用される略称は下記に定義されるとおりである:
プロテインA:アガロースカラムに架橋結合させたプロテインA。
HIC:疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー。
AEX:陰イオン交換カラムクロマトグラフィー。
HP-SEC:高速サイズ排除クロマトグラフィー。
MWCO:分子量カットオフ。
NaCl:塩化ナトリウム。
WFI:注入水。
プロテインA:アガロースカラムに架橋結合させたプロテインA。
HIC:疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー。
AEX:陰イオン交換カラムクロマトグラフィー。
HP-SEC:高速サイズ排除クロマトグラフィー。
MWCO:分子量カットオフ。
NaCl:塩化ナトリウム。
WFI:注入水。
本発明は限外ろ過及びダイアフィルトレーションを組み合わせたアフィニティーカラム、疎水性相互作用カラム及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む一連のカラムクロマトグラフィー工程を使用した、細胞培養液由来のモノクローナル抗体の精製方法を記載する。
1つの実施態様において、本発明はプロテインAカラムクロマトグラフィーを使用して、最初は捕獲し、継いでタンパク質をカラムから高レベルの純度、低いpHで、場合によって添加物/塩の存在下で溶出することによる、未精製混合物からの細胞培養液由来のモノクローナル抗体の精製方法を提供する。未精製混合物は、目的のタンパク質のものに加えて、宿主細胞由来の混入タンパク質、生成物関連物質及び他の不純物を含んでいてもよい。プロテインG又はプロテインLをアフィニティークロマトグラフィー工程におけるカラムマトリックスとして使用することができる。
別の実施態様において、本発明に記載の方法として、3つのカラム洗浄工程が含まれ、それは(i)平衡化バッファーでの第1洗浄、(ii)同じpH及び/又は第1洗浄バッファーよりも高い伝導度での第2洗浄(iii)第2洗浄よりも低いpH及び/又は伝導度での第3洗浄(iv)第3洗浄よりも低いpH及び/又は高い伝導度での抗体の溶出である。
好ましい実施態様において、本発明に記載のカラム洗浄工程は:(i)約pH7.4及び/又は約20mS/cm、好ましくは1mS/cmから30mS/cmの範囲の伝導度での平衡化バッファーでの第1洗浄(ii)約pH7.4及び/又は20mS/cmを超える伝導度での第2洗浄(iii)pH7.4よりも低いpH、好ましくはpH5からpH6.5の範囲、及び/又は20mS/cm未満、好ましくは1mS/cmから5mS/cmの範囲の伝導度での第3洗浄(iv)約pH3.5及び/又は5mS/cmより高い伝導度での抗体の溶出を含んでいる。
1つの実施態様において、プロテインAクロマトグラフィー精製工程のためのバッファー成分は、Tris、酢酸及びクエン酸バッファーから選択される。
好ましい実施態様において、本発明に記載の抗体の溶出は、約pH3.5から4、好ましくは3.5から3.7の範囲のpHにおいて行われる。
1つの実施態様において、本発明に記載の方法は、塩化ナトリウム、アルギニン、グリシン、好ましくは塩化ナトリウムから選択される添加物/塩を含む。
本発明はまた、塩存在下、低バッファーpH条件において最大の回収率でカラムから目的のタンパク質を溶出する一方で、プロテインAカラムクロマトグラフィーによる宿主細胞混入タンパク質の大部分の除去を実証する。
1つの実施態様において、本発明はまた、酸性pH条件下でのプロテインAカラムからの溶出後に所望のモノクローナル抗体の分子整合性が、分析HP-SECにより評価した場合に、少なくとも約1時間の間、変化せずに保たれることを実証する。
別の実施態様において、本発明は、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーを結合-溶出モードにおいて使用することによる、所望のタンパク質画分からの残留した方法関連及び生成物関連不純物の除去を提供する。所望のタンパク質の溶出は下方勾配塩濃度で、主要ピークの形態で行われる。
更なる実施態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーのためのカラムマトリックスは、フェニルセファロース、ブチルセファロース、オクチルセファロース、好ましくは、フェニルセファロースから選択される。
更なる実施態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程での所望のタンパク質の溶出のための塩は、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、好ましくは、硫酸アンモニウムから選択される。
別の実施態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーはpH5からpH7の範囲のpHで、及び/又は100mS/cmを超える伝導度で行われる。
1つの実施態様において、本発明に記載のイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される。
別の実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー工程のためのカラムマトリックスは、DEAEセファロース、Mono Q及びQセファロースXL、好ましくはQセファロースから選択される。
1つの実施態様において、本発明はまた、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによるフロースルー及び洗浄モードでの又は陽イオン交換クロマトグラフィーによる結合-溶出モードでの所望のモノクローナル抗体の精製を説明する。
好ましい実施態様において、細胞培養液由来の所望のモノクローナル抗体の精製は、下記のように実行される:
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.疎水性相互作用クロマトグラフィー
3.陰イオン交換クロマトグラフィー
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.疎水性相互作用クロマトグラフィー
3.陰イオン交換クロマトグラフィー
疎水性及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、プロテインAカラムクロマトグラフィー工程の後で、任意の順序で行うことができる。
好ましい実施態様において、細胞培養液由来の所望のモノクローナル抗体の精製は下記のように行われる:
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.低pHインキュベーション
3.中性化及びリコンディショニング
4.疎水性相互作用クロマトグラフィー
5.限外ろ過-ダイアフィルトレーション
6.陰イオン交換クロマトグラフィー
7.ナノろ過
8.限外ろ過-ダイアフィルトレーション
1.プロテインAクロマトグラフィー
2.低pHインキュベーション
3.中性化及びリコンディショニング
4.疎水性相互作用クロマトグラフィー
5.限外ろ過-ダイアフィルトレーション
6.陰イオン交換クロマトグラフィー
7.ナノろ過
8.限外ろ過-ダイアフィルトレーション
ここで、疎水クロマトグラフィー、限外ろ過-ダイアフィルトレーション及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、プロテインAクロマトグラフィー工程の後で、任意の順序で行うことができる。
更なる実施態様において、ダイアフィルトレーション媒体は、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、コハク酸エステルバッファー、酢酸バッファー及びそれらの組み合わせから選択される。
1つの実施態様において、本発明に記載の抗体のカラムからの回収は、塩化ナトリウム、アルギニン、グリシン、好ましくは塩化ナトリウムから選択される添加物/塩とともに行われる。
1つの実施態様において、本発明に記載の抗体の全体の回収は、最初の量の50%以上、好ましくは70%以上の範囲、より好ましくは、85%から90%の範囲である。
好ましい実施態様において、抗体は、抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗RANKL抗体、抗IgE抗体などから選択される。
より好ましい実施態様において、抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ベクツモマブ(bectumomab)、エプラツズマブなどから選択される。
更なる実施態様において、本発明は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程の後で、5%以下、好ましくは2%以下の凝集体の量の精製した抗体調製物を提供する。
別の実施態様において、本発明は、1%以下、より好ましくは0.5%以下の凝集体の量の抗体調製物を提供する。
所望のモノクローナル抗体の精製方法には下記の工程が含まれる:
- 遠心分離法及び深層ろ過、次いでリコンディショニングによる細胞分離及び培養液上清の清澄
- プロテインAカラムクロマトグラフィー
- 低pHインキュベーション
- 中性化及びリコンディショニング
- 疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー
- 限外ろ過-ダイアフィルトレーション
- 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
- ナノろ過
- 限外ろ過-ダイアフィルトレーション
- マイクロフィルター法
- 遠心分離法及び深層ろ過、次いでリコンディショニングによる細胞分離及び培養液上清の清澄
- プロテインAカラムクロマトグラフィー
- 低pHインキュベーション
- 中性化及びリコンディショニング
- 疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー
- 限外ろ過-ダイアフィルトレーション
- 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
- ナノろ過
- 限外ろ過-ダイアフィルトレーション
- マイクロフィルター法
本発明に記載の精製工程は、更なる詳細について下記に記載される。
I)プロテインAカラムクロマトグラフィー:
所望のモノクローナル抗体及び他の混入物を含む細胞培養液由来の清澄した上清を、中性近くのpHに適切なバッファーで平衡化させたプロテインAカラムに添加する。所望のモノクローナル抗体はアフィニティーマトリックスに結合するが、混入物の大部分はカラムからフロースルーへ通り抜ける。所望のタンパク質の溶出に先立って、カラムは複数の洗浄工程により洗浄される。第1洗浄は、カラム添加の完了の後、同じ平衡化バッファーで行われる。第2洗浄は、第1洗浄バッファーのものよりも高い伝導度を持つ同じpHのバッファーで行う。第3洗浄は第1及び第2洗浄工程のものとは異なるpH及び伝導度のバッファーで実行する。所望のタンパク質の溶出は、第3洗浄工程のものよりも低いpHであるがより高い伝導性で実行する。最後にカラム浄化はアルカリ溶液で行われる。
所望のモノクローナル抗体及び他の混入物を含む細胞培養液由来の清澄した上清を、中性近くのpHに適切なバッファーで平衡化させたプロテインAカラムに添加する。所望のモノクローナル抗体はアフィニティーマトリックスに結合するが、混入物の大部分はカラムからフロースルーへ通り抜ける。所望のタンパク質の溶出に先立って、カラムは複数の洗浄工程により洗浄される。第1洗浄は、カラム添加の完了の後、同じ平衡化バッファーで行われる。第2洗浄は、第1洗浄バッファーのものよりも高い伝導度を持つ同じpHのバッファーで行う。第3洗浄は第1及び第2洗浄工程のものとは異なるpH及び伝導度のバッファーで実行する。所望のタンパク質の溶出は、第3洗浄工程のものよりも低いpHであるがより高い伝導性で実行する。最後にカラム浄化はアルカリ溶液で行われる。
II)疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー:
少なくとも1つの望まれない混入物を含む混合物からの所望のモノクローナル抗体タンパク質の精製は、結合-溶出モードにおいての疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーにより実施される。カラムへのタンパク質添加の完了の後、所望のモノクローナル抗体は、下方勾配塩濃度、つまり、平衡化バッファーの伝導度のものと比較して減少した伝導度でカラムから溶出する。所望のモノクローナル抗体タンパク質の溶出は単一のブロードなピークの形態で起こる。溶出したタンパク質は画分として回収し、所望のレベルの純度を含む画分をまとめてプールされる。
少なくとも1つの望まれない混入物を含む混合物からの所望のモノクローナル抗体タンパク質の精製は、結合-溶出モードにおいての疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーにより実施される。カラムへのタンパク質添加の完了の後、所望のモノクローナル抗体は、下方勾配塩濃度、つまり、平衡化バッファーの伝導度のものと比較して減少した伝導度でカラムから溶出する。所望のモノクローナル抗体タンパク質の溶出は単一のブロードなピークの形態で起こる。溶出したタンパク質は画分として回収し、所望のレベルの純度を含む画分をまとめてプールされる。
III)陰イオン交換カラムクロマトグラフィー:
所望のモノクローナル抗体を含むタンパク質溶液は、陰イオン交換カラム平衡化条件のpH及び伝導度に合わせるように実質的にリコンディショニングされる。カラムはpH約6.5のバッファーで平衡化される。所望のタンパク質は、カラムからフロースルー及び洗浄画分に回収される。本発明に記載の陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するために使用することもできる他の陰イオン交換体は、DEAEセファロース、Mono Q、QセファロースXLなどから選択される。陰イオン交換体Qセファロースが本発明において使用されている。
所望のモノクローナル抗体を含むタンパク質溶液は、陰イオン交換カラム平衡化条件のpH及び伝導度に合わせるように実質的にリコンディショニングされる。カラムはpH約6.5のバッファーで平衡化される。所望のタンパク質は、カラムからフロースルー及び洗浄画分に回収される。本発明に記載の陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するために使用することもできる他の陰イオン交換体は、DEAEセファロース、Mono Q、QセファロースXLなどから選択される。陰イオン交換体Qセファロースが本発明において使用されている。
分析技術:300mM NaClの存在下でpH6.8のリン酸ナトリウムバッファーで平衡化したTSK-3000カラムを用いて、分析サイズ排除クロマトグラフィー(HP-SEC)を行われる。タンパク質は0.5mL/分でのアイソクラチックモードにおいて溶出される。
ここで、以下の非限定的な例で本発明を説明するが、それはいかなる状況においても発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない:
(実施例1)
アダリムマブの精製(抗TNFα抗体)
工程1:細胞分離/清澄/リコンディショニング
バッチを採取した後、目的のタンパク質を他の可溶性混入物とともに含む澄んだ上清を得るために、細胞は、最初は遠心分離法により、次いで深層ろ過により培養ブロスから分離した。遠心分離は10000g×30分で実行した。深層ろ過は0.45→0.22μmメンブレンを用いて行われた。清澄した上清は、pH及び伝導性について、プロテインAカラム平衡化バッファー条件に調整するためにリコンディショニングさせた。
アダリムマブの精製(抗TNFα抗体)
工程1:細胞分離/清澄/リコンディショニング
バッチを採取した後、目的のタンパク質を他の可溶性混入物とともに含む澄んだ上清を得るために、細胞は、最初は遠心分離法により、次いで深層ろ過により培養ブロスから分離した。遠心分離は10000g×30分で実行した。深層ろ過は0.45→0.22μmメンブレンを用いて行われた。清澄した上清は、pH及び伝導性について、プロテインAカラム平衡化バッファー条件に調整するためにリコンディショニングさせた。
工程2:プロテインAカラムクロマトグラフィー
リコンディショニング後の清澄させた上清は、プロテインAアフィニティーカラムに通してアフィニティーマトリックスによりアダリムマブを捕獲し、次いで低pHでカラムから溶出させた。添加に先立って、カラムはpH7.4、10〜25mS/cmの範囲の伝導性の適切なバッファーで平衡化させた。添加に続いて、カラムは同じバッファーで洗浄した(第1洗浄)。第1洗浄工程に次いで、カラムはpH7.4であるがより高い伝導性(>25mS/cm)の同じバッファーで洗浄した。第3洗浄工程は、1〜5mS/cmの範囲の伝導性を有するpH5.5の適切なバッファーにより行った。第3洗浄、所望のタンパク質の溶出工程の後、アダリムマブは、図1に示すように、pH3.5〜3.7、5mS/cmを超える伝導性の適切なバッファーにより実施された。この工程の後に溶出されたアダリムマブは、分析HP-SECで分析した場合、図2に示したように、少なくとも98%の純度を示した。
リコンディショニング後の清澄させた上清は、プロテインAアフィニティーカラムに通してアフィニティーマトリックスによりアダリムマブを捕獲し、次いで低pHでカラムから溶出させた。添加に先立って、カラムはpH7.4、10〜25mS/cmの範囲の伝導性の適切なバッファーで平衡化させた。添加に続いて、カラムは同じバッファーで洗浄した(第1洗浄)。第1洗浄工程に次いで、カラムはpH7.4であるがより高い伝導性(>25mS/cm)の同じバッファーで洗浄した。第3洗浄工程は、1〜5mS/cmの範囲の伝導性を有するpH5.5の適切なバッファーにより行った。第3洗浄、所望のタンパク質の溶出工程の後、アダリムマブは、図1に示すように、pH3.5〜3.7、5mS/cmを超える伝導性の適切なバッファーにより実施された。この工程の後に溶出されたアダリムマブは、分析HP-SECで分析した場合、図2に示したように、少なくとも98%の純度を示した。
工程3:低pHインキュベーション
プロテインAカラムから溶出された所望のタンパク質画分は、同じ溶出pH条件で約45〜0分間、室温条件下でウイルス不活性化のためにインキュベートし、その後、タンパク質溶液は0.22μmフィルターを通した。
プロテインAカラムから溶出された所望のタンパク質画分は、同じ溶出pH条件で約45〜0分間、室温条件下でウイルス不活性化のためにインキュベートし、その後、タンパク質溶液は0.22μmフィルターを通した。
工程4:中性化及びリコンディショニング
低pH処理に次いで、中性化工程を、制御した様式のアルカリ溶液の添加により行った。タンパク質溶液は、次のカラム平衡化条件に合わせるように30kDa MWCOメンブレンフィルターを用いたUF/DFによりpH及び伝導性の調節とともにリコンディショニングさせた。伝導性の調節のために、濃縮した硫酸アンモニウム溶液をタンパク質溶液に加えた。リコンディショニングの後に、タンパク質溶液は0.22μmメンブレンフィルターを通し、疎水性相互作用カラムに添加した。
低pH処理に次いで、中性化工程を、制御した様式のアルカリ溶液の添加により行った。タンパク質溶液は、次のカラム平衡化条件に合わせるように30kDa MWCOメンブレンフィルターを用いたUF/DFによりpH及び伝導性の調節とともにリコンディショニングさせた。伝導性の調節のために、濃縮した硫酸アンモニウム溶液をタンパク質溶液に加えた。リコンディショニングの後に、タンパク質溶液は0.22μmメンブレンフィルターを通し、疎水性相互作用カラムに添加した。
工程5:疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー
リコンディショニングの後、アダリムマブを含むタンパク質溶液は、更なる結合-溶出モードにおける精製のために、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、フェニルセファロースを通した。カラムは90mS/cmを超える伝導性を有するpH約6.5からpH7.0の適切なバッファーで平衡化させた。カラムマトリックスへの結合の後、アダリムマブは、図3に示すように下方への塩勾配を有する同じバッファー内でカラムから溶出させた。図4に示したHP-SECにより評価したように、このカラム工程の後、99%を超える純度のアダリムマブが達成された。
リコンディショニングの後、アダリムマブを含むタンパク質溶液は、更なる結合-溶出モードにおける精製のために、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、フェニルセファロースを通した。カラムは90mS/cmを超える伝導性を有するpH約6.5からpH7.0の適切なバッファーで平衡化させた。カラムマトリックスへの結合の後、アダリムマブは、図3に示すように下方への塩勾配を有する同じバッファー内でカラムから溶出させた。図4に示したHP-SECにより評価したように、このカラム工程の後、99%を超える純度のアダリムマブが達成された。
工程6:限外ろ過-ダイアフィルトレーション(UF/DF)
疎水性カラムから溶出したプール画分は、次のカラム(Qカラム)工程の平衡化バッファー条件(例えば、pH及び伝導性)に合わせるために、30kDa MWCOメンブレンフィルターを用いたUF/DFにより、pH6.5の低イオン強度クエン酸ナトリウムバッファー溶液に対して、実質的に、リコンディショニングさせた。ダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液は0.22μmフィルターに通して、Qカラムに添加した。
疎水性カラムから溶出したプール画分は、次のカラム(Qカラム)工程の平衡化バッファー条件(例えば、pH及び伝導性)に合わせるために、30kDa MWCOメンブレンフィルターを用いたUF/DFにより、pH6.5の低イオン強度クエン酸ナトリウムバッファー溶液に対して、実質的に、リコンディショニングさせた。ダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液は0.22μmフィルターに通して、Qカラムに添加した。
工程7:陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
所望のモノクローナル抗体を含むダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液は、図5に示したように、フロースルー及び洗浄モードにおいてpH6.5、10mS/cmより低い伝導性の適切なバッファーとともに、Qセファロースカラムを通した。Qカラム工程の後、図6に示したHP-SECで評価したように、アダリムマブの純度は>99%であることを観察した。
所望のモノクローナル抗体を含むダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液は、図5に示したように、フロースルー及び洗浄モードにおいてpH6.5、10mS/cmより低い伝導性の適切なバッファーとともに、Qセファロースカラムを通した。Qカラム工程の後、図6に示したHP-SECで評価したように、アダリムマブの純度は>99%であることを観察した。
工程8:ナノろ過
Qカラム工程の後、所望のモノクローナル抗体を含むタンパク質溶液はナノろ過工程を行った。ナノろ過の後、アダリムマブの純度は99%を超えたままであることを観察した。
Qカラム工程の後、所望のモノクローナル抗体を含むタンパク質溶液はナノろ過工程を行った。ナノろ過の後、アダリムマブの純度は99%を超えたままであることを観察した。
工程9:限外ろ過-ダイアフィルトレーション
ナノろ過の後、タンパク質溶液は、バルク薬剤物質の調製のために所望の媒体でダイアフィルトレーションした。
ナノろ過の後、タンパク質溶液は、バルク薬剤物質の調製のために所望の媒体でダイアフィルトレーションした。
工程10:マイクロフィルター法
最後に、所望のモノクローナル抗体を含む精製した調製物は、無菌的に、0.22μmメンブレンフィルターを通し、保存のために、液体形態、低温条件下又は凍結条件下のいずれかにて保存した。最終調製物におけるタンパク質の濃度は、1mg/mLから60mg/mLまで変化してもよい。最終的に精製されたモノクローナル抗体アダリムマブは、図7に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
最後に、所望のモノクローナル抗体を含む精製した調製物は、無菌的に、0.22μmメンブレンフィルターを通し、保存のために、液体形態、低温条件下又は凍結条件下のいずれかにて保存した。最終調製物におけるタンパク質の濃度は、1mg/mLから60mg/mLまで変化してもよい。最終的に精製されたモノクローナル抗体アダリムマブは、図7に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
(実施例2)
リツキシマブ(抗CD20抗体)の精製
抗CD20抗体、リツキシマブのための精製方法は、例1に記載されたような様式で実行された。最終的に精製されたモノクローナル抗体は、図8に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
リツキシマブ(抗CD20抗体)の精製
抗CD20抗体、リツキシマブのための精製方法は、例1に記載されたような様式で実行された。最終的に精製されたモノクローナル抗体は、図8に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
(実施例3)
トラスツズマブ(抗HER2抗体)の精製
抗HER2抗体、トラスツズマブのための精製方法は、例1に記載されたような様式で実行された。最終的に精製されたモノクローナル抗体は、図9に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
トラスツズマブ(抗HER2抗体)の精製
抗HER2抗体、トラスツズマブのための精製方法は、例1に記載されたような様式で実行された。最終的に精製されたモノクローナル抗体は、図9に示したHP-SECにより評価されるように、99%を超える純度を示した。
精製された調製物は、その後、ヒトへの使用のための医薬的物質として使用するために、適切に処方されてもよい。
Claims (32)
- 以下の逐次的な工程
(a)アフィニティークロマトグラフィー
(b)疎水性相互作用クロマトグラフィー、場合によって次いで他の適切な精製工程
を含む、細胞培養液からモノクローナル抗体を精製するための方法であって、
工程(a)が、結合のための適切なpH及び/又は伝導性での、所望の抗体を含む未精製混合物のカラムへの添加、次いで単一ピークの形態での所望の抗体の溶出に先立つ、カラム洗浄を含み、
カラム洗浄が:
(i)適切なpH及び/又は伝導度での平衡化バッファーでの第1洗浄
(ii)第1洗浄バッファーと同じpH及び/又は第1洗浄バッファーよりも高い伝導度での第2洗浄
(iii)第2洗浄バッファーよりも低いpH及び/又は伝導度での第3洗浄
(iv)第3洗浄バッファーよりも低いpH及び/又は高い伝導度での抗体の溶出
を含む、方法。 - アフィニティークロマトグラフィーマトリックスがプロテインA、プロテインG及びプロテインLから選択される、請求項1に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーマトリックスがプロテインAである、請求項1に記載の方法。
- カラム洗浄が:
(i)pH7.4及び/又は1mS/cmから30mS/cmの範囲の伝導度の平衡化バッファーでの第1洗浄
(ii)pH7.4及び/又は30mS/cmを超える伝導度の第2洗浄
(iii)pH5からpH6.5の範囲のpH及び/又は1mS/cmから5mS/cmの範囲の伝導度での第3洗浄
(iv)pH3.5及び/又は5mS/cmより高い伝導度での抗体の溶出
を含む、請求項1に記載の方法。 - バッファー成分がTris、酢酸及びクエン酸バッファーから選択される、請求項1に記載の方法。
- 抗体の溶出がpH3.5からpH4の範囲のpHで行われる、請求項1に記載の方法。
- 溶出を、バッファー内における塩化ナトリウム、アルギニン、グリシン等の添加物で行う、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の後の抗体調製物における凝集体の量が、5%以下である、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)がpH5からpH7の範囲のpH及び/又は100mS/cmを超える伝導度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、抗体が下方勾配塩濃度でカラムから溶出される、請求項1に記載の方法。
- 塩が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム及び硫酸ナトリウムから選択される、請求項10に記載の方法。
- 疎水性カラムマトリックスが、フェニルセファロース、ブチルセファロース、オクチルセファロースから選択される、請求項1に記載の方法。
- (a)プロテインAアフィニティークロマトグラフィー
(b)疎水性相互作用クロマトグラフィー
(c)イオン交換クロマトグラフィー
の工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 工程(a)が、請求項2から8のいずれか一項における工程(a)に基づいて実行される、請求項13に記載の方法。
- 工程(b)が、請求項9から11のいずれか一項における工程(b)に基づいて実行される、請求項13に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される、請求項13に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項16に記載の方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィーのためのカラムマトリックスがDEAEセファロース、Mono Q及びQセファロースXLから選択される、請求項13に記載の方法。
- カラムマトリックスがQセファロースである、請求項18に記載の方法。
- 工程(c)での抗体の溶出が、フロースルー及び洗浄モード又は結合-溶出モードで行われる、請求項13に記載の方法。
- a)細胞分離
b)プロテインAクロマトグラフィー
c)低pHインキュベーション
d)中性化及びリコンディショニング
e)疎水性相互作用クロマトグラフィー
f)限外ろ過-ダイアフィルトレーション
g)陰イオン交換クロマトグラフィー
h)ナノろ過
i)限外ろ過-ダイアフィルトレーション
j)マイクロフィルター法
からなる、請求項1に記載の方法。 - 工程(a)が請求項2から7のいずれか一項における工程(a)に基づいて実行される、請求項21に記載の方法。
- 工程(b)が請求項8から10のいずれか一項における工程(b)に基づいて実行される、請求項21に記載の方法。
- ダイアフィルトレーション媒体がリン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸及びその組み合わせから選択される、請求項21に記載の方法。
- 抗体が、クエン酸、酢酸、リン酸から選択されるバッファー成分でカラムから回収される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、塩化ナトリウム、アルギニン、グリシンから選択される添加物でカラムから回収される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体の溶出が、pH5からpH7の範囲のpHで行われる、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体の全体の回収率が、最初の量の50%以上の範囲である、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 精製した抗体調製物が1%以下の凝集体を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗RANKL、抗IgE抗体から選択される、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ベクツモマブ(bectumomab)、エプラツズマブから選択される、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、アダリムマブ、トラスツズマブ及びリツキシマブである、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN2145/MUM/2013 | 2013-06-25 | ||
| IN2145MU2013 IN2013MU02145A (ja) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | |
| PCT/IN2014/000421 WO2014207763A1 (en) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | Purification process for monoclonal antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016525500A JP2016525500A (ja) | 2016-08-25 |
| JP6039828B2 true JP6039828B2 (ja) | 2016-12-07 |
Family
ID=51655799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015563045A Active JP6039828B2 (ja) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | モノクローナル抗体の精製方法 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9708365B2 (ja) |
| EP (1) | EP3013849B1 (ja) |
| JP (1) | JP6039828B2 (ja) |
| KR (1) | KR101683415B1 (ja) |
| CN (1) | CN105263947A (ja) |
| AR (1) | AR096713A1 (ja) |
| AU (1) | AU2014300486B2 (ja) |
| BR (1) | BR112015031196A2 (ja) |
| CA (1) | CA2911874A1 (ja) |
| EA (1) | EA201592192A1 (ja) |
| HK (1) | HK1217344A1 (ja) |
| IL (1) | IL242649A (ja) |
| IN (1) | IN2013MU02145A (ja) |
| MX (1) | MX350610B (ja) |
| NZ (1) | NZ714079A (ja) |
| SG (1) | SG11201509502XA (ja) |
| TW (1) | TWI596107B (ja) |
| WO (1) | WO2014207763A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA201508258B (ja) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI398554B (zh) * | 2010-07-29 | 2013-06-11 | Zhen Ding Technology Co Ltd | 電鍍裝置 |
| EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
| US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
| US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| SG11201507230PA (en) | 2013-03-12 | 2015-10-29 | Abbvie Inc | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
| US9499614B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-22 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| TWI596107B (zh) | 2013-06-25 | 2017-08-21 | 卡地拉保健有限公司 | 單株抗體之新穎純化方法 |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| CN106170298B (zh) | 2013-10-16 | 2024-01-09 | 前瞻疗法公司 | 用于提高抗体稳定性的缓冲液制剂 |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| EP3247718B1 (en) * | 2015-01-21 | 2021-09-01 | Outlook Therapeutics, Inc. | Modulation of charge variants in a monoclonal antibody composition |
| EP3268100A1 (en) * | 2015-03-13 | 2018-01-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Use of alkaline washes during chromatography to remove impurities |
| EP3337812B1 (en) * | 2015-08-21 | 2021-04-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for the reduction of host cell proteins in affinity chromatography |
| JP7073253B2 (ja) | 2015-08-21 | 2022-05-23 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | アフィニティークロマトグラフィーにおける宿主細胞タンパク質の低減方法 |
| JP7084308B2 (ja) | 2016-02-03 | 2022-06-14 | アウトルック セラピューティクス，インコーポレイティド | 抗体安定性を増大させるための緩衝液製剤 |
| JP2019529350A (ja) | 2016-08-16 | 2019-10-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 混合物から個々の抗体を定量する方法 |
| HUE059631T2 (hu) | 2016-10-25 | 2022-12-28 | Regeneron Pharma | Eljárások és összeállítások kromatográfiás adatelemzéshez |
| JP7229157B2 (ja) * | 2016-10-28 | 2023-02-27 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー | チロシン硫酸化抗体変異体の除去のための精製方法；精製された組成物 |
| AU2017380842A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-07-11 | Serum Institute Of India Private Limited | Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof |
| AR111761A1 (es) * | 2017-05-16 | 2019-08-14 | Cj Healthcare Corp | Un método para purificar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de este usando cromatografía de afinidad |
| EP3431168A1 (en) * | 2017-07-19 | 2019-01-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Élimination de médicament non lié après couplage conjugué anticorps-médicament |
| CN108101987A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-06-01 | 安徽未名生物医药有限公司 | 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法 |
| CN110128538B (zh) * | 2018-02-09 | 2022-08-26 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种纯化抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体的方法 |
| CN111902720A (zh) | 2018-03-21 | 2020-11-06 | 沃特世科技公司 | 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法 |
| TW202005694A (zh) | 2018-07-02 | 2020-02-01 | 美商里珍納龍藥品有限公司 | 自混合物製備多肽之系統及方法 |
| WO2020016417A1 (en) * | 2018-07-19 | 2020-01-23 | Ichnos Sciences S.A. | Liquid antibody formulation |
| KR102337683B1 (ko) * | 2018-09-21 | 2021-12-13 | 주식회사 녹십자 | 고효율 항-tfpi 항체 조성물 |
| CN111072773A (zh) * | 2018-10-19 | 2020-04-28 | 菲鹏生物股份有限公司 | 抗体的纯化方法、抗体和应用 |
| WO2020084503A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Cadila Healthcare Limited | A composition comprising antibody with reduced level of basic variants thereof |
| EP3643322A1 (en) * | 2018-10-26 | 2020-04-29 | Mabion SA | Low aggregate anti cd20 ligand formulation |
| CN109320611B (zh) * | 2018-10-31 | 2022-06-03 | 鼎康(武汉)生物医药有限公司 | 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法 |
| CN111153993B (zh) * | 2018-11-07 | 2024-06-28 | 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 | 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法 |
| CN109336969B (zh) * | 2018-11-09 | 2021-02-12 | 杭州奕安济世生物药业有限公司 | 一种抗体的纯化方法 |
| CN111269316B (zh) * | 2018-12-04 | 2024-06-28 | 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 | 抗her2单克隆抗体的纯化方法 |
| US20220411466A1 (en) | 2019-11-22 | 2022-12-29 | Morphosys Ag | Method to increase antibody yield during ion exchange chromatography |
| WO2021139720A1 (zh) * | 2020-01-08 | 2021-07-15 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 阿达木单抗纯化方法及其稳定组合物 |
| KR102154952B1 (ko) * | 2020-02-21 | 2020-09-10 | 프레스티지바이오로직스 주식회사 | 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법 |
| WO2022245306A1 (en) * | 2021-05-20 | 2022-11-24 | Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi | Protein purification by affinity chromatography |
| CN114133446A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-04 | 方坦思(上海)生物医药有限公司 | 单克隆抗体的纯化方法 |
| CN115491328A (zh) * | 2022-08-31 | 2022-12-20 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法 |
| EP4335869A1 (en) | 2022-09-07 | 2024-03-13 | Bio T Biyoteknoloji Cozumleri Ve Uretim Anonim | Resin and chromatography column that purifies antibodies with protease resistant small peptides |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5429746A (en) * | 1994-02-22 | 1995-07-04 | Smith Kline Beecham Corporation | Antibody purification |
| US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| EP1308456B1 (en) | 1998-05-06 | 2007-08-22 | Genentech, Inc. | Antibody purification by ion exchange chromatography |
| SI1308455T1 (sl) | 1998-05-06 | 2006-08-31 | Genentech Inc | Sestavek, ki obsega protitelesa anti-HER2 |
| DE69919701T2 (de) * | 1998-06-01 | 2005-09-15 | Genentech, Inc., South San Francisco | Abtrennung von antikörper-monomeren von deren multimeren mittels ionaustausch-chromatographie |
| EP1614693A4 (en) | 2003-03-31 | 2006-07-19 | Kirin Brewery | PURIFICATION OF A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AND A HUMAN POLYCLONAL ANTIBODY |
| US20050163782A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-07-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Modified binding molecules comprising connecting peptides |
| SE0400501D0 (sv) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Amersham Biosciences Ab | Antibody purification |
| KR101660575B1 (ko) * | 2005-03-11 | 2016-09-27 | 와이어쓰 엘엘씨 | 약한 분배성 크로마토그래피법 |
| ES2402650T3 (es) | 2005-06-17 | 2013-05-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta |
| US8263750B2 (en) | 2006-03-16 | 2012-09-11 | Amgen Inc. | Method for purifying a protein using protein-A affinity chromatography using an intermediate wash step |
| CA2911000A1 (en) | 2006-04-05 | 2007-10-18 | Min W. Wan | Antibody purification |
| JP5386354B2 (ja) | 2006-09-08 | 2014-01-15 | ワイス・エルエルシー | アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製におけるアルギニン洗浄 |
| US8216571B2 (en) | 2007-10-22 | 2012-07-10 | Schering Corporation | Fully human anti-VEGF antibodies and methods of using |
| WO2010030222A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Enhanced protein aggregate removal with multimodal anion exchangers in the presence of protein-excluded zwitterions |
| US20100069617A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions |
| EP2921501A1 (en) | 2008-10-20 | 2015-09-23 | Abbvie Inc. | Isolation and purification of antibodies using Protein A affinity chromatography |
| LT3037104T (lt) | 2009-10-20 | 2020-09-10 | Abbvie Inc. | Anti-il-13 antikūnų izoliavimas ir gryninimas, naudojant afininę baltymo a chromatografiją |
| US20130178608A1 (en) * | 2009-12-29 | 2013-07-11 | Samir Kulkarni | Protein purification by ion exchange |
| EP2526114B1 (de) | 2010-01-22 | 2014-06-18 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Chromatographisches verfahren zur aufreinigung von fc enthaltenden proteinen |
| CN102179237A (zh) * | 2010-04-26 | 2011-09-14 | 无锡加莱克色谱科技有限公司 | 一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法 |
| KR20130142128A (ko) | 2010-10-11 | 2013-12-27 | 애브비 인코포레이티드 | 단백질의 정제 방법 |
| KR102027596B1 (ko) | 2010-12-06 | 2019-10-01 | 타폰 바이오시스템즈, 인코포레이티드 | 생물학적 산물을 위한 연속 처리 방법 |
| US20120238730A1 (en) | 2011-03-15 | 2012-09-20 | Abbott Laboratories | Integrated approach to the isolation and purification of antibodies |
| WO2012176158A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Purification of chimeric protein |
| WO2013066707A1 (en) * | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates |
| WO2013075740A1 (en) | 2011-11-23 | 2013-05-30 | Sanofi | Antibody purification method |
| PL2969099T5 (pl) * | 2013-03-14 | 2022-06-13 | Amgen Inc. | Usuwanie wypłukanego ligandu do oczyszczania na zasadzie powinowactwa |
| CA2909969A1 (en) | 2013-05-13 | 2014-12-31 | Medimmune, Llc | Separation of recombinant polyclonal antibody multimers with minimal separation of monomers |
| TWI596107B (zh) | 2013-06-25 | 2017-08-21 | 卡地拉保健有限公司 | 單株抗體之新穎純化方法 |
-
2014
- 2014-06-24 TW TW103121726A patent/TWI596107B/zh not_active IP Right Cessation
- 2014-06-24 AR ARP140102380A patent/AR096713A1/es unknown
- 2014-06-25 CN CN201480031532.XA patent/CN105263947A/zh active Pending
- 2014-06-25 SG SG11201509502XA patent/SG11201509502XA/en unknown
- 2014-06-25 US US14/895,432 patent/US9708365B2/en active Active
- 2014-06-25 CA CA2911874A patent/CA2911874A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-25 EP EP14777867.4A patent/EP3013849B1/en not_active Revoked
- 2014-06-25 EA EA201592192A patent/EA201592192A1/ru unknown
- 2014-06-25 JP JP2015563045A patent/JP6039828B2/ja active Active
- 2014-06-25 KR KR1020157035759A patent/KR101683415B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-25 WO PCT/IN2014/000421 patent/WO2014207763A1/en active Application Filing
- 2014-06-25 NZ NZ714079A patent/NZ714079A/en not_active IP Right Cessation
- 2014-06-25 IN IN2145MU2013 patent/IN2013MU02145A/en unknown
- 2014-06-25 AU AU2014300486A patent/AU2014300486B2/en not_active Ceased
- 2014-06-25 BR BR112015031196A patent/BR112015031196A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-06-25 MX MX2015016586A patent/MX350610B/es active IP Right Grant
-
2015
- 2015-11-09 ZA ZA2015/08258A patent/ZA201508258B/en unknown
- 2015-11-18 IL IL242649A patent/IL242649A/en not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-05-11 HK HK16105366.7A patent/HK1217344A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2015016586A (es) | 2016-03-16 |
| KR20160003311A (ko) | 2016-01-08 |
| IN2013MU02145A (ja) | 2015-06-05 |
| TWI596107B (zh) | 2017-08-21 |
| SG11201509502XA (en) | 2015-12-30 |
| EP3013849B1 (en) | 2017-09-13 |
| JP2016525500A (ja) | 2016-08-25 |
| AR096713A1 (es) | 2016-01-27 |
| AU2014300486B2 (en) | 2016-06-30 |
| EA201592192A1 (ru) | 2016-07-29 |
| MX350610B (es) | 2017-09-11 |
| EP3013849A1 (en) | 2016-05-04 |
| ZA201508258B (en) | 2017-03-29 |
| CA2911874A1 (en) | 2014-12-31 |
| HK1217344A1 (zh) | 2017-01-06 |
| US20160115195A1 (en) | 2016-04-28 |
| CN105263947A (zh) | 2016-01-20 |
| AU2014300486A1 (en) | 2015-11-26 |
| BR112015031196A2 (pt) | 2017-07-25 |
| US9708365B2 (en) | 2017-07-18 |
| NZ714079A (en) | 2017-05-26 |
| TW201512217A (zh) | 2015-04-01 |
| IL242649A (en) | 2016-03-31 |
| KR101683415B1 (ko) | 2016-12-06 |
| WO2014207763A1 (en) | 2014-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6039828B2 (ja) | モノクローナル抗体の精製方法 | |
| AU2017245478B2 (en) | Protein purification using Bis-Tris buffer | |
| CA3031028C (en) | Affinity chromatography wash buffer | |
| TW201348247A (zh) | 利用蛋白質ａ親和性層析之非人類抗體之新穎純化 | |
| EP2864346B1 (en) | Method of purifying an antibody | |
| KR20130131307A (ko) | 단백질 정제 | |
| US20240158437A1 (en) | Process of purification of protein | |
| JP2020531557A (ja) | タンパク質の精製方法 | |
| JP2017507132A (ja) | 抗体プロセス | |
| CA3182314A1 (en) | An improved process of purification of protein | |
| US20240239838A1 (en) | Process of purification of protein | |
| EP2782925B1 (en) | Protein purification using bis-tris buffer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20160620 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160627 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160909 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161007 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161104 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6039828 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R157 | Certificate of patent or utility model (correction) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R157 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |