JP7229157B2 - チロシン硫酸化抗体変異体の除去のための精製方法；精製された組成物 - Google Patents

Description

本発明は、チロシン硫酸化を欠く抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む組成物、ならびに組成物の製造のための精製方法に関する。

チロシン硫酸化は、スルフェートトリオキシド（ＳＯ_３）基がアミノ酸チロシン基の側鎖上のヒドロキシル基に共有結合している翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。このＰＴＭはトランスゴルジ網において生じ、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）の２つの酵素により触媒される。その分子メカニズムは３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホスルフェートからチロシンへの活性化スルフェートの転移を含み、種々のタンパク質およびペプチド上で見出されている。最近の知見は、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼ２が硫酸化のための酸残基に隣接するチロシンを認識することを示している。このＰＴＭはタンパク質間の相互作用の強化をもたらし、分泌タンパク質および膜貫通タンパク質上で生じる。幾つかのケモカイン受容体は、例えば、ＨＩＶ－１および幾つかの糖タンパク質ホルモンの主要受容体であるＣＣＲ５のＮ末端細胞外ドメインにおいて硫酸化されたチロシンであることが示されている。例えば、ヒル由来トロンビン阻害性ペプチドであるヒルジンの天然形態は硫酸化チロシンである。興味深いことに、種々の血液凝固障害の治療に使用されるヒルジンの２つの組換え形態（ＲｅｖａｓｃおよびＲｅｆｌｕｄａｎ）は硫酸化されていない。硫酸化は生体分子の質量を８０Ｄａ増加させ、これはホスファート部分（ＰＯ_３）と同じ質量差である。相当安定なＰ－Ｏ結合を形成するＰＯ_３とは異なり、ＳＯ_３は非常に不安定であり、高温および低ｐＨ条件下で容易に分解する。

治療用抗体製剤中の異なるＰＴＭ変異体の存在は、修飾の位置に応じて抗体効力、バイオアベイラビリティまたは免疫原性における変動をもたらしうる不均一性を招く。そのような問題は規制当局の面前でも問題を引き起こしうる。チロシン硫酸化はケモカイン受容体および他のタンパク質において述べられているが、そのような修飾が抗体製剤において存在するかどうかを確認し、そして確認された場合にはそれらを除去する必要がある。

発明の概括
本発明は、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９）を含む組成物を提供し、例えば、
アミノ酸配列：ＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
アミノ酸配列：ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
アミノ酸配列：ＱＱＳＴＥＤＰＲＴ（配列番号４０）を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または
アミノ酸配列：ＤＹＮＶＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
アミノ酸配列：
ＤＩＮＰＮＮＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号５９）；
ＤＩＮＰＮＳＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６０）；
ＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６１）；
ＤＩＮＰＮＱＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６２）；
ＤＩＮＰＮＧＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６３）；もしくは
ＤＩＮＰＮＸ_１ＧＧＴＩＹＸ_２ＱＫＦＸ_３Ｘ_４（配列番号６４）（ここで、Ｘ_１＝Ｄ、Ｎ、ＳまたはＱ；Ｘ_２＝ＡまたはＳ；Ｘ_３＝ＱまたはＫ；そしてＸ_４＝ＥまたはＧ）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および
ＣＤＲ－Ｈ３：ＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨ（配列番号３５）；
を含む重鎖可変ドメイン
を含み、これは、ＣＤＲ－Ｌ１上の検出可能なレベルの硫酸化チロシンを欠く。例えば、本発明の１つの実施形態においては、該組成物中の抗体またはフラグメントは更に、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４、ＦＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４および定常ドメインからなる群から選択される１以上のメンバーにおける検出可能なレベルの硫酸化チロシンを欠く。本発明の１つの実施形態においては、該抗体またはフラグメントは、操作された酵母またはＣＨＯ Ｎ結合グリカンを含む。本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９）含有組成物は、チロシン硫酸化を欠く１以上の種の抗体であって、そして、約１４８５９０Ｄａ、１４８７５２Ｄａおよび／または１４８９１４Ｄａの分子量（例えば、表１に示されている、例えば、Ｇ０Ｆおよび／またはＧ１Ｆグリカン種、ピログルタメートに変換されたＮ末端重鎖グルタミンおよび／またはリジンが除去されたＣ末端重鎖を有するもの）を有する抗体を含む。

本発明はまた、１以上の硫酸化チロシン（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１上のもの）を含む抗体または抗原結合性フラグメントと硫酸化チロシンを欠く抗体または抗原結合性フラグメントとを含む水性混合物から、チロシン硫酸化抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９）を除去する方法を提供し、該方法は、混合物のｐＨを約６．５～約７．０または約６．５～約７．５に調整し、混合物をアニオン交換樹脂と接触させ、そして、混合物の非樹脂結合水性画分を樹脂から取り出し、保持することを含む。本発明の１つの実施形態においては、該方法は、例えばアイソクラチック（均一濃度）条件下、水性組成物でカラムを洗浄し、そして、洗浄組成物を樹脂から取り出し、保持することを含む。本発明の１つの実施形態においては、樹脂はカラム内に存在し、該方法は、混合物をカラムに加え、そして、カラムからフロースルー画分を集めることを含む。本発明の１つの実施形態においては、該方法は、ジメチルアミノプロピルアニオン交換リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化し、混合物のｐＨを約６．５に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む。本発明の１つの実施形態においては、該方法は、四級化ポリエチレンイミンアニオン交換リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（所望により５ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化し、混合物のｐＨを約７．０に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（所望により５ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む。本発明の１つの実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィーフロースルーのＡ_２８０吸光度をモニターし、そして、Ａ_２８０が最初に少なくとも約２．５吸光度単位／ｃｍに達したら、それを集め保持し；そして、Ａ_２８０が約１．０吸光度単位／ｃｍ未満に低下したら、それを集めず保持しない。本発明の１つの実施形態においては、本発明の方法は更に、カチオン交換クロマトグラフィー、結合－溶出方式の更なるアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、分別沈殿、濾過、遠心分離またはウイルス不活性化により、抗体または抗原結合性フラグメントを精製することを含む。本発明の１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントの免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖をチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させる。本発明の１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、
アミノ酸配列：ＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
アミノ酸配列：ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
アミノ酸配列：ＱＱＳＴＥＤＰＲＴ（配列番号４０）を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または
アミノ酸配列：ＤＹＮＶＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
アミノ酸配列：
ＤＩＮＰＮＮＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号５９）；
ＤＩＮＰＮＳＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６０）；
ＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６１）；
ＤＩＮＰＮＱＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６２）；
ＤＩＮＰＮＧＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号６３）；もしくは
ＤＩＮＰＮＸ_１ＧＧＴＩＹＸ_２ＱＫＦＸ_３Ｘ_４（配列番号６４）（ここで、Ｘ_１＝Ｄ、Ｎ、ＳまたはＱ；Ｘ_２＝ＡまたはＳ；Ｘ_３＝ＱまたはＫ；そしてＸ_４＝ＥまたはＧ）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および
ＣＤＲ－Ｈ３：ＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨ（配列番号３５）；
を含む重鎖可変ドメインを含む。そのような方法の産物である組成物も本発明の一部である。本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９）をＡＥＸクロマトグラフィーにより精製し、ここで、該抗体は硫酸化チロシンを欠き、約１４８５９０Ｄａ、１４８７５２Ｄａおよび／または１４８９１４Ｄａの分子量を有する（例えば、表１に示されているように、例えば、Ｇ０Ｆおよび／またはＧ１Ｆグリカン種、ピログルタメートに変換されたＮ末端重鎖グルタミンおよび／またはリジンが除去されたＣ末端重鎖を有する）。

発明の詳細な説明
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現されるある抗体および他のタンパク質は、硫酸化チロシン変異体で汚染されている。そのような変異体の質量分析は、付加硫酸基の質量に対応する約＋８０Ｄａの付加物により特徴づけられる。そのような付加物はまた、アルカリホスファターゼ耐性であり、抗硫酸化チロシン抗体と反応性である。本発明は、そのような汚染チロシン硫酸化変異体を含む組成物の精製方法、並びに該変異体を実質的に含有しない抗体組成物を提供する。

本発明においては、当技術分野の技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。本明細書中に特に定められていない限り、本発明に関して用いられる科学技術用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。更に、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションの技術ならびにそれらに関して用いられる命名法は、当技術分野でよく知られており、一般的に用いられているものである。特に示されていない限り、本発明の方法および技術は、一般に、本明細書の全体にわたって引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおり、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い行われる。例えば、Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｃｒｅｇｇ（編），Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０），Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２年までの補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。

硫酸化チロシンは、例えば以下の構造を有する、硫酸基が付加されたチロシンを含む。

クロマトグラフィー
本発明は、硫酸化チロシンを含む汚染変異抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、Ａｂ１～Ａｂ９）を組成物（例えば、一部のものは硫酸化チロシンを有し一部のものは硫酸化チロシンを欠く抗体またはフラグメントの混合物を含む組成物）から除去して、検出不可能なレベルのチロシン硫酸化変異体（例えば、チロシン硫酸化ＣＤＲ－Ｌ１、例えば、Ａｂ１またはＡｂ６のもの）を含む組成物を得るための方法を提供する。本発明の１つの実施形態においては、組成物をフロースルー方式のアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーで処理して、チロシン硫酸化変異体を除去する。本発明の１つの実施形態においては、ＡＥＸ樹脂はジメチルアミノプロピルリガンド（すなわち、ジメチルアミノプロピル部分を含むリガンド）を有する。例えば、本発明の１つの実施形態においては、ＡＥＸクロマトグラフィーに付す組成物は、事前のプロテインＡクロマトグラフィー精製の産物である。本発明の１つの実施形態においては、ＡＥＸ（例えば、ジメチルアミノプロピルリガンドを有するもの）での処理の前に、例えばＴｒｉｓ（例えば、０．５Ｍ、０．７２５Ｍまたは１Ｍ）で組成物を約６．５のｐＨにｐＨ調整する。本発明の１つの実施形態においては、ＡＥＸカラム（例えば、ジメチルアミノプロピルリガンドを有するもの）を、例えば２５ｍＭのリン酸ナトリウム、例えばｐＨ５、６．２または６．５のリン酸ナトリウムで平衡化する。本発明の１つの実施形態においては、カラム（例えば、ジメチルアミノプロピルリガンドを有するもの）をバッファー（例えば、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、例えば、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム）で洗浄して、カラム内に存在するがＡＥＸ樹脂に強固には結合していない抗体またはフラグメントを回収することが可能である。ＡＥＸ樹脂に強固には結合していないフロースルーを集め（例えば、画分中に）、そして、例えばプールする。本発明の１つの実施形態においては、使用後、カラムは、例えば１Ｍ ＮａＣｌで、剥離される（ｓｔｒｉｐ）。

ＡＥＸフロースルー物質の質量分析は、ＣＤＲ－Ｌ１上のチロシン硫酸化を欠くＡｂ６の幾つかのグリコシル化種を示した。これらの種は以下の表１に要約されている。これらの理論質量は、重鎖上のＮ末端グルタミンがＮ末端ピログルタミン酸（ｐＥ１）に変換され、そして重鎖上のＣ末端リジンが除去（－Ｋ）されたＡｂ６分子の計算質量を意味する。

本発明は、検出可能なレベルのチロシン硫酸化（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１上のもの）を欠き、約１４８５９０、１４８７４９および／もしくは１４８９１５の１以上の分子量を有する種を含み、および／またはグリカン種Ｇ０Ｆおよび／またはＧ１Ｆを含む、抗ＬＡＧ３抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９；好ましくはＡｂ６）を含む組成物を含む。

フロースルー方式は、ポリペプチドの回収のための溶出工程を含まない方法による、クロマトグラフィー樹脂を使用するポリペプチドの精製を意味する。そのような方法においては、目的のポリペプチドは樹脂に強固には結合しないが、目的のポリペプチドから除去される汚染物質は樹脂に強固に結合する。例えば、チロシン硫酸化を有する汚染変異体抗体とチロシン硫酸化を欠く抗体とを含む組成物を、ＡＥＸ樹脂を含有するカラム上にローディングし、カラムのフロースルーにおいて抗体またはフラグメントを集め保持することを含む方法において、フロースルー方式でＡＥＸ樹脂が使用される。硫酸化を欠く未結合抗体は、溶出をもたらさない条件下、例えば、アイソクラチック（均一濃度）条件下、カラムから洗い流され（および保持され）うる。そのような方法においては、汚染物質はカラムに結合したままであり、チロシン硫酸化を欠く抗体はフロースルー内に留まるであろう。

結合／溶出様式は、溶出工程を含む方法による、クロマトグラフィー樹脂を使用するポリペプチドの精製を意味する。そのような方法においては、目的のポリペプチドは樹脂に強固に結合するが、目的のポリペプチドから除去される汚染物質は樹脂に強固に結合する。クロマトグラフィーカラムの場合、汚染物質はカラムを通って流れ、樹脂にほとんど結合しないままである。所望により行ってもよい洗浄の後の結合抗体は、樹脂からの解離を引き起こす溶出バッファーにさらされると、解離し集められ保持される。

クロマトグラフィー樹脂リガンドは、多成分移動相中に存在する所望の分子（例えば、抗体または混入物）に可逆的に結合する固定相粒子（例えば、セファロース粒子）に固定されている物質である。

本発明の１つの実施形態においては、ＡＥＸ樹脂はリガンド四級化ポリエチレンイミン（すなわち、四級化ポリエチレンイミン部分を含む配位子）を有する。本発明の１つの実施形態においては、樹脂（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドを有するもの）を１Ｍ ＮａＣｌで予め平衡化する。本発明の１つの実施形態においては、樹脂（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドを有するもの）は、リン酸ナトリウム（例えば、２５ｍＭ）およびＮａＣｌ（例えば、５ｍＭ）（ｐＨ約７．０）で平衡化される。本発明の１つの実施形態においては、カラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドを有するもの）はフィード体でローディングされ、リン酸ナトリウム（例えば、２５ｍＭ）およびＮａＣｌ（例えば、５ｍＭ）（ｐＨ約７．０）で洗浄され、フロースルーが例えば画分中に集められ、そして、例えばプールする。本発明のもう１つの実施形態においては、本発明の方法は、アニオン交換リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内でｐＨ約６．５～７．５の約１０～５０ｍＭ リン酸ナトリウムで平衡化し、混合物のｐＨを約６．５～７．５に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂をｐＨ約６．５～７．５の約１０～５０ｍＭ リン酸ナトリウムで洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む。本発明のもう１つの実施形態においては、本発明の方法は、アニオン交換リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内でｐＨ約６．５～７．０の約１０～５０ｍＭ リン酸ナトリウムで平衡化し、混合物のｐＨを約６．５～７．０に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂をｐＨ約６．５～７．０の約１０～５０ｍＭ リン酸ナトリウムで洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む。

任意の適切な量の抗体または抗原結合性フラグメントは、クロマトグラフィー樹脂、例えばクロマトグラフィーカラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ）にローディングすることが可能である。例えば、本発明の１つの実施形態においては、樹脂（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ）１リットル当たり約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１００～１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、１５０～２００、１００～２００、２５０～３５０または２８０～３２０グラムの物質、例えば抗体またはフラグメントがローディングされる。

クロマトグラフィーカラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ樹脂を含有するもの）を使用する場合、任意の許容可能な寸法が用いられうる。例えば、本発明の１つの実施形態においては、カラムの直径または高さは、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｃｍである。

流速は、ある時間にわたってカラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ樹脂を含有するもの）を通過する移動相の体積を意味する。本発明の１つの実施形態においては、流速は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５リットル／時である。

本発明の１つの実施形態においては、カラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ樹脂を含有するもの）のフロースルー（通過液）の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ_２８０）をモニターする。本発明の１つの実施形態においては、フロースルーの主要Ａ_２８０ピークにおける抗体またはフラグメント産物を収集し、保持する。本発明の１つの実施形態においては、Ａ_２８０が１ｃｍ（経路長）当たり約１．０、１．５、２．０、２．５または３．０のＡ_２８０吸光度単位に達したらフロースルーを収集し、そして、Ａ_２８０が１ｃｍ（光路長）当たり約１．０、１．５、２．０、２．５または３．０のＡ_２８０吸光度単位を下回ると収集を停止する。

移動相中の粒子状物質による目詰まりからクロマトグラフィーカラム（例えば、四級化ポリエチレンイミンリガンドまたはジメチルアミノプロピルリガンドを有するＡＥＸ樹脂を含有するもの）を保護するために、プレカラムフィルターを使用することが可能である。本発明の１つの実施形態においては、フィルターはポリエーテルスルホン膜である。また、フロースルーから粒状物を除去するために、ポストカラムフィルターを使用することが可能である。本発明の１つの実施形態においては、フィルターは０．２または０．５μｍの孔径を有する。

硫酸化チロシンを有する変異体の存在は、例えば、フロースルー画分の質量分析により確認されうる。硫酸化変異体は、非硫酸化変異体より高い質量を有するであろう。例えば、本発明の１つの実施形態においては、硫酸化変異体は、硫酸化を欠く変異体より約８０Ｄａ重い。本発明の１つの実施形態においては、硫酸化はホスファターゼによる消化に抵抗性であり、そして、硫酸化ペプチドは、リン酸化ペプチドと比較して電子移動解離（ＥＴＤ）による異なる断片化パターンを有する。

本発明の１つの実施形態においては、チロシン硫酸化を欠く抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９、好ましくはＡｂ６）を含む組成物は、検出可能なチロシン硫酸化（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１におけるもの）を欠く組成物を意味する。検出不可能なレベルのチロシン硫酸化（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１におけるもの）を含む組成物は、組成物の質量分析によっては観察できないレベルを含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、組成物の質量分析は組成物の免疫グロブリンペプチドの無傷型および還元型の質量測定ならびに還元ペプチドマッピングにより行われる。本発明の１つの実施形態においては、還元ペプチドマッピングは、抗体免疫グロブリンジスルフィド結合の変性および還元、ならびに遊離システインのアルキル化、ひき続く酵素消化（例えば、ＬｙｓＣ、トリプシンまたはＧｌｕＣを使用するもの）を含む。酵素消化ペプチドを質量分析により分析した。本発明の１つの実施形態においては、「検出不可能」なレベルは、組成物中の未修飾種と比較して約０．５％未満（約０．４、０．３、０．２、０．１％未満）のチロシン硫酸化種（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１上のもの）を意味する。

ポリペプチドの分子量は、例えば、アミノ酸の既知重量（修飾または非修飾体／硫酸化または非硫酸化体）および既知修飾（例えば、酸化、脱アミド化、グリコシル化、ＣおよびＮ末端修飾）に基づいて計算されうる。分子量は、例えば液体クロマトグラフィーと組合された質量分析により測定されうる。本発明の１つの実施形態においては、質量分析は四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）質量分析またはオービトラップ質量分析である。

「クロマトグラフィー」なる語は、吸着剤として作用する樹脂に物質を接触させることにより、目的の溶質（例えば、組成物中の物質）を組成物中の他の物質から分離する方法を意味する。吸着剤は、例えば、ｐＩ、疎水性、サイズおよび構造のような溶質の特性により、その方法の特定の緩衝条件下、物質を幾分強力に吸着または保持する。クロマトグラフィーは、クロマトグラフィー樹脂の床を介した、例えば樹脂含有カラムを介した、組成物の通常の浸透の方法により行われうる。バッチクロマトグラフィー精製は、樹脂のスラリーを調製し、そして抗体またはフラグメント含有組成物をスラリーと接触させて分離されるべき物質を樹脂に吸着させることを含む。樹脂に結合していない物質を含む溶液は、例えば、スラリーを沈降させて上清を除去することによってスラリーから分離され、そして、非結合物質は、保持または廃棄されうる。場合によりスラリーは１以上の洗浄工程に付されうる。所望により、スラリーを適切な溶出バッファーと接触させて、樹脂結合物質を樹脂から脱着させることが可能である。脱着した物質は保持または廃棄されうる。本発明の１つの実施形態においては、組成物中の抗体の硫酸化チロシン変異体はアニオン交換樹脂に結合し、一方、非硫酸化チロシン変異体は樹脂に有意には結合しない。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーにより精製される。プロテインＧおよびプロテインＡは、それぞれＧ群連鎖球菌およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の細菌性タンパク質である。ＩｇＧ型抗体のＦｃ領域に対するプロテインＧおよびプロテインＡのアフィニティは、ＩｇＧ、Ｆｃ領域を含有するＩｇＧフラグメント、およびＩｇＧサブクラスの精製の基礎を形成する。プロテインＡまたはプロテインＧは、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーに使用されうるセファロースのような固相に結合されうる。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびプロテインＡおよび／またはプロテインＧを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マルチモーダル（多方式）クロマトグラフィー（混合方式）により精製される。マルチモーダルまたは混合方式タンパク質クロマトグラフィーは、複数様態の相互作用、例えばイオン交換、ヒドロキシアパタイト、アフィニティ、サイズ排除および／または疎水性相互作用が可能なリガンドで官能化された樹脂に基づく。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよび混合態様のクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロテインＬクロマトグラフィーにより精製される。プロテインＬは、免疫グロブリン軽鎖を介して免疫グロブリンに結合するペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）タンパク質である。プロテインＬは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含む全ての抗体クラスの代表物に結合する。組換えタンパク質Ｌは免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントのカッパ軽鎖の可変領域に結合する。プロテインＬは、ヒトにおいては４つのカッパ軽鎖サブタイプの３つ（１、３および４）に、マウスにおいてはカッパ１に結合する。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびプロテインＬクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製される。ＨＩＣは疎水性の差異によってタンパク質を分離する。分離はタンパク質とクロマトグラフィー媒体の疎水性表面との間の可逆的相互作用に基づく。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびＨＩＣを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製される。ＳＥＣは分子サイズの差異によってタンパク質を分離する。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびＳＥＣクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、ウイルス不活性化に付される。例えば、本発明の１つの実施形態においては、ウイルスの不活性化は、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物のｐＨ処理により行われる。具体的には、極端なｐＨへの組成物の直接的な曝露がウイルス除去のために用いられうる。例えば、ｐＨ処理は、本発明の１つの実施形態においては、低ｐＨ処理（例えば、ｐＨ３．０～３．６）である。本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは高ｐＨ処理に付される。本発明の１つの実施形態においては、ウイルスの不活性化は、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の溶媒または界面活性剤を使用して行われる。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびウイルス不活性化を含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

「イオン交換」は、分子の正味表面電荷の差に基づいて分子を分離する。分子はそれらの電荷特性において相当異なっており、それらの総電荷、電荷密度および表面電荷分布の差異に応じて、荷電クロマトグラフィー樹脂との異なる度合の相互作用を示す。本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。「イオン交換クロマトグラフィー」はカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび混合方式クロマトグラフィーを含む。

「イオン交換」樹脂なる語は、負に荷電した（すなわち、カチオン交換）または正に荷電した（すなわち、アニオン交換）固相を意味する。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製される。「カチオン交換」樹脂とは、負に荷電した固相であって、該固相を通過する水溶液中のカチオンとの交換のための遊離カチオンを有する固相を意味する。カチオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合される任意の負荷電リガンドが使用されうる。カチオン交換材には、リガンド：スルホプロピル（ＳＰ） －ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＳＯ_３ ^－；メチルスルホナート（Ｓ） －ＣＨ_２－ＳＯ_３ ^－；またはカルボキシメチル（ＣＭ） －ＣＨ_２－ＣＯＯ^－を有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製される。「アニオン交換」樹脂は、正に荷電した固相であって、それに結合した１以上の正荷電リガンドを有する固相を意味する。アニオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合される任意の正荷電リガンドが使用されうる。アニオン交換材には、リガンド：四級アンモニウム（Ｑ） －ＣＨ_２－Ｎ^＋－（ＣＨ_３）_３－；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ） －ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ^＋－（ＣＨ_２－ＣＨ_３）_２；またはジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ） －ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｎ^＋－（ＣＨ_２－ＣＨ_３）_２を有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧｏＰｕｒｅ Ｄ ５０μｍカラムはジメチルアミノプロピル官能基を有する。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよびＡＥＸクロマトグラフィー（結合／溶出方式）を含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

「固相」または「固定相」なる語は、１以上のリガンド（例えば、アニオン交換リガンドまたはカチオン交換リガンド）が付着しうる任意の非水性マトリックスを意味するものとして用いられ、あるいは、サイズ排除クロマトグラフィーの場合には、それは樹脂のゲル構造を意味しうる。移動相は液体であり、例えば、クロマトグラフィー精製において固相上に抗体または抗原結合性フラグメントを運ぶ水性物質である。移動相には、カラムに適用されるローディングバッファーが含まれうる。固相を形成させるために使用されうる物質の例には、多糖（例えば、アガロースおよびセルロース）および他の機械的に安定なマトリックス、例えばシリカ（例えば、制御細孔ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子およびこれらのいずれかの誘導体が含まれる。

精製のために抗体または抗原結合性フラグメントを含有する混合物をローディングする前に、クロマトグラフィー樹脂のｐＨおよび伝導性を調整するために、「平衡化」バッファーまたは溶液が使用される。この目的に使用されうる適切なバッファーまたは溶液は当技術分野でよく知られており（例えば、前記のバッファー）、目的のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー工程において使用される選択された樹脂に適合しうるｐＨでの任意のバッファーを包含する。

抗体または抗原結合性フラグメントを含有する混合物を精製樹脂（例えば、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂）上にローディングするために、「ローディング」バッファーまたは溶液が使用される。任意の適切な溶液がローディングバッファーとして使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、ローディングバッファーは、溶出バッファーのような前の精製工程に由来する緩衝化混合物から調製される。

「洗浄」バッファーまたは溶液なる語は、抗体または抗原結合性フラグメントを溶出する前に精製樹脂（例えば、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂）から１以上の不純物を溶出するために使用される組成物である。「洗浄」なる語は、適切な組成物がクロマトグラフィー樹脂を通過することを示す。本発明の１つの実施形態においては、洗浄液はアイソクラチック（均一濃度）である。アイソクラチック洗浄条件下、クロマトグラフィーの移動相は実質的に同じままである。

チロシン硫酸化変異体抗体および抗原結合性フラグメントは汚染物質（コンタミナント）であるが、本発明は、例えば、ＡＥＸクロマトグラフィー樹脂に結合している、または非チロシン硫酸化変異体の非存在下で結合していないそのような変異体を含む組成物を含む。非結合変異体は、非チロシン硫酸化抗体およびフラグメントからの除去の後にＡＥＸカラムから溶出することにより得られうる。

「溶出」バッファーは、クロマトグラフィー樹脂に結合した分子（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント）を解離させる。

上流処理
汚染チロシン硫酸化変異体から精製される抗体および抗原結合性フラグメントは、宿主細胞発現により産生されうる。例えば、本発明の方法は、１つの実施形態においては、変異体の除去の前に、該抗体または抗原結合性フラグメントのそのような発現に有利な条件下での培地内の宿主細胞における重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン鎖の発現、ならびに、宿主細胞および／または培地からの単離を含む。本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいは宿主細胞発現およびフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の範囲は、チロシン硫酸化（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１上のもの）を含有しない抗体または抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法を含み、該製造方法は、（ｉ）該抗体またはフラグメントの免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内に導入し、（ｉｉ）該細胞における該免疫グロブリン鎖の発現に有利な条件下、宿主細胞を培養し、例えば、ここで、該免疫グロブリン鎖を有する抗体または抗原結合性フラグメントは宿主細胞から培地内に分泌され、そして、（ｉｉｉ）本明細書に記載されているフロースルー方式のアニオン交換クロマトグラフィーを含む方法により宿主細胞および／または培地から免疫グロブリン鎖ポリペプチドを単離することを含む。

例えば、抗体またはフラグメントは、細胞溶解、例えば、粉砕／擦過（例えば、ガラスビーズを使用するもの）、フレンチプレス細胞溶解、酵素消化または超音波処理のような方法により宿主細胞から遊離されうる。それにより得られる可溶性物質および不溶性物質を含む細胞溶解細胞は、細胞ライセートを構成する。本発明は、硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいは細胞溶解およびフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、遠心分離を含む方法により精製される。細胞ライセートまたは他の懸濁液の遠心分離は、抗体またはフラグメントを含有する水性画分から、細胞片のようなほとんどの粒子状物質を除去する。例えば、本発明の１つの実施形態においては、遠心分離は、（例えば、ライセートのライセート固体画分を廃棄することを含む細胞溶解物に対して）約４０，０００～５０，０００×ｇで１５～３０分間行われる。本発明の１つの実施形態においては、遠心分離により液体培地から細胞を除去する。例えば、約８，０００×ｇ～約１５，０００×ｇの範囲内の重力（例えば、約８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００または１５０００）（例えば、約０．９×１０^－８～２．８×１０^９の範囲のＱ／ＳＩＧＭＡ比により特徴づけられる）を用いる遠心分離を行う。本発明の１つの実施形態においては、液体遠心分離液をデプスフィルター（例えば、０．１～約０．２μｍの孔径を有するもの）に付す。本発明は、硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいは遠心分離およびフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーを含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、分泌シグナル配列に融合した宿主細胞において発現され、宿主細胞から宿主細胞の培地内に分泌される。

本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは濾過（例えば、ＡＥＸクロマトグラフィー精製の前または後に）により精製される。例えば、本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントを含む水性組成物は、例えば、約１μｍ、０．４５μｍまたは０．２２μｍの孔径を有するフィルタを通して、固体粒子状物質を除去するために濾過される。本発明の１つの実施形態においては、フィルターは酢酸セルロースまたはポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）から作成される。本発明は、硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよび濾過を含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、分別沈殿により精製される。塩濃度の増加はタンパク質間の疎水性相互作用を増強し、選択的沈殿を引き起こす。本発明の１つの実施形態においては、抗体またはフラグメントを含む水性組成物は、硫酸アンモニウム、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；例えば、ＰＥＧ４０００）、アセトン、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、硫酸ストレプトマイシンまたはカプリル酸の存在下で沈殿させる。本発明は、硫酸化チロシン変異体を欠く抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物の製造方法、あるいはフロースルー方式のＡＥＸクロマトグラフィーおよび分別沈殿を含む方法により硫酸化チロシン変異体を除去するための、抗体またはその抗原結合性フラグメントの精製方法を含む。

本発明の１つの実施形態においては、免疫グロブリン鎖が発現される宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ハイブリドーマ細胞、または真菌もしくは酵母細胞、例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。本発明の１つの実施形態においては、宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞は、グルタミンシンターゼを欠く。

本発明の１つの実施形態においては、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、１以上の発現制御配列、例えばプロモーターに機能的に連結されている。例えば、免疫グロブリンは、発現ベクター内に存在する。高レベルの抗体または抗原結合性フラグメントの発現を達成するために、強力なプロモーター／エンハンサー、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／または伸長因子アルファ（ＥＦ１α）プロモーターを使用して、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の発現を駆動することが可能である。

本発明の１つの実施形態においては、核から細胞質への転写ｍＲＮＡの移出を増強するために、５’非翻訳領域におけるイントロン配列がプロモーター／エンハンサーの後に含まれ、ｍＲＮＡレベルを最大にするために１以上の３’ポリアデニル化シグナル配列が含まれる。本発明の１つの実施形態においては、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０後期もしくは初期ポリアデニル化シグナル配列またはウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である。本発明の１つの実施形態においては、翻訳開始を増強するために、第１翻訳開始コドンの直前にＧＣＣ ＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（配列番号６９）を配置することにより、コンセンサスコザック配列が生成される。本発明の１つの実施形態においては、抗体またはフラグメントの分泌を導くために、免疫グロブリン鎖の直前にシグナルペプチド配列が配置される。

細胞培養の条件はモニター可能であり、必要に応じて調整されうる。例えば、ｐＨ、細胞数、細胞生存性および温度のような条件がモニターされ調整されうる。本発明の１つの実施形態においては、細胞培養の温度は、例えば、接種の４８時間後に３７℃から３０～３５℃に調整される。本発明の１つの実施形態においては、溶存酸素がモニターされ、および／または、２０～５０％のような設定値に調整される。本発明の１つの実施形態においては、溶存ＣＯ_２がモニターされ、および／または例えば約１２０～１５０ｍｍＨｇ以下に調整される。本発明の１つの実施形態においては、浸透圧がモニターされ、および／または、例えば約２７０～３３０ｍＯｓｍ／ｋｇに調整される。

抗体
本発明は、検出可能なレベルの硫酸化チロシンを欠く抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む組成物、ならびにそのような抗体およびフラグメントを含む組成物の単離方法を提供する。例えば、本発明の１つの実施形態においては、抗体またはフラグメントは硫酸化チロシンを含み、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７またはＴＳＬＰから選択される抗原に結合する。

本発明の抗体および抗原結合性フラグメントが結合するポリペプチドに関する「ＬＡＧ３」なる語は、ヒトおよびカニクイザルの、例えばマカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）またはマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＬＡＧ３、ならびにその断片、例えば、シグナルペプチドを欠くその成熟断片を意味する。

チロシン硫酸化を欠く抗ＬＡＧ３抗体（例えば、ＷＯ２０１６０２８６７２に開示されているＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９）の免疫グロブリン鎖の例には、以下に要約されているものが含まれる。例えば、ここで、抗体またはフラグメントは、以下に記載されているＣＤＲおよび／または免疫グロブリン鎖の１以上を含む。本発明の１つの実施形態においては、汚染抗体または抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮ（配列番号３８）を有するＣＤＲ－Ｌ１を含み、ここで、Ｙ（下線付き太字）は硫酸化されている。

本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合性フラグメントは、４Ａ１０の重鎖免疫グロブリンおよび／または軽鎖免疫グロブリン；Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ鎖、あるいは軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲ（例えば、４Ａ１０のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を含む。

本発明の１つの実施形態においては、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９のいずれにおいても、任意のＮ末端重鎖グルタミンがピログルタメートに変換され、および／または任意のＣ末端重鎖リジンが除去される。

本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合性フラグメントは１９Ｅ８の重鎖免疫グロブリンおよび／または軽鎖免疫グロブリン；Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ鎖、あるいは軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲ（例えば、１９Ｅ８のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合性フラグメントは１１Ｃ９の重鎖免疫グロブリンおよび／または軽鎖免疫グロブリン；Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ鎖、あるいは軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲ（例えば、１１Ｃ９のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合性フラグメントは２２Ｄ２の重鎖免疫グロブリンおよび／または軽鎖免疫グロブリン；Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ鎖、あるいは軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲ（例えば、２２Ｄ２のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を含む。

本発明の１つの実施形態においては、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合性フラグメントはＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９の重鎖免疫グロブリンおよび／または軽鎖免疫グロブリン；Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ鎖、あるいは軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲ（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８またはＡｂ９のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を含む。

本発明の１つの実施形態においては、本発明の任意の抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性フラグメントのＣＤＲ－Ｈ２は、アミノ酸配列：ＤＩＮＰＮＸ_１ＧＧＴＩＹＸ_２ＱＫＦＸ_３Ｘ_４（配列番号６４）を含み、ここで、
Ｘ_１＝Ｄ、Ｎ、ＳまたはＱ；
Ｘ_２＝ＡまたはＳ；
Ｘ_３＝ＱまたはＫ；
Ｘ_４＝ＥまたはＧである。

本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ Ｎ結合グリカン）または操作された酵母細胞（操作酵母Ｎ結合グリカン）、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された免疫グロブリンに典型的に付加されるＮ結合グリカンを含む抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、４Ａ１０、１９Ｅ８、１１Ｃ９および／または２２Ｄ２；例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８および／またはＡｂ９）を含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、図１１に示されている「操作酵母Ｎ結合グリカン」または「ＣＨＯ Ｎ結合グリカン」（例えば、Ｇ０および／またはＧ０－Ｆおよび／またはＧ１および／またはＧ１－Ｆおよび／またはＧ２－Ｆおよび／またはＭａｎ５）の１以上を含む。本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、操作酵母Ｎ結合グリカン、すなわち、Ｇ０および／またはＧ１および／またはＧ２を含み、所望により、更にＭａｎ５を含む。本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＣＨＯ Ｎ結合グリカン、すなわち、Ｇ０－Ｆ、Ｇ１－ＦおよびＧ２－Ｆを含み、所望により、更にＧ０および／またはＧ１および／またはＧ２および／またはＭａｎ５を含む。本発明の１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメントの免疫グロブリン鎖上の全Ｎ結合グリカンの約８０％～約９５％（例えば、約８０～９０％、約８５％、約９０％または約９５％）は操作酵母Ｎ結合グリカンまたはＣＨＯ Ｎ結合グリカンである。Ｎｅｔｔら，Ｙｅａｓｔ．２８（３）：２３７－２５２（２０１１）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１３（５７９２）：１４４１－１４４３（２００６）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（５）：３８７－３９２（２００７）を参照されたい。例えば、本発明の１つの実施形態においては、操作酵母細胞はＧＦＩ５．０もしくはＹＧＬＹ８３１６、または米国特許第７，７９５，００２号もしくはＺｈａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．９８８：３１－４３（２０１３）に記載されている株である。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０６６７６５も参照されたい。

抗ＬＡＧ３抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、Ａｂ８および／またはＡｂ９）のチロシン硫酸化変異体は、約１４８６７０Ｄａ、１４８８３２Ｄａおよび／または１４８９９４Ｄａの分子量を含む。チロシン硫酸化を欠く変異体は約１４８５９０Ｄａ、１４８７５２Ｄａおよび／または１４８９１４Ｄａの分子量を含む。

「単離」された抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それらが産生された細胞または細胞培養からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含有しない。そのような生物学的分子には、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞破片および増殖培地のような他の物質が含まれる。単離された抗体または抗原結合性フラグメントは更に、宿主細胞由来の又はその増殖培地の生物学的分子のような発現系成分を少なくとも部分的に含有しないことが可能である。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような生物学的分子の完全な非存在、または水、バッファーもしくは塩の非存在、または該抗体もしくはフラグメントを含む医薬製剤の成分を指すものではない。

抗体の抗原結合性フラグメントは、完全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体の一部分である。抗原結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ；ならびに抗体フラグメントから形成されるナノボディおよび多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。

一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。

モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体であり、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８；Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７；およびＰｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１を参照されたい。

キメラ抗体は、第１抗体からの可変ドメインと第２抗体からの定常ドメインとを有する抗体であり、ここで、第１抗体および第２抗体は異なる種からのものである（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５）。典型的には、可変ドメインは実験動物（「親抗体」）、例えばげっ歯類からの抗体から得られ、定常ドメイン配列はヒト抗体から得られ、その結果、生じるキメラ抗体は、ヒト対象において不利な免疫応答を惹起する可能性が親（例えば、マウス）抗体の場合より低くなるであろう。

ヒト化抗体はヒト抗体および非ヒト（例えば、マウスまたはラット）抗体の両方からの配列を含有する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、超可変ループの全部または実質的に全部は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含みうる。

免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに帰属されうる。免疫グロブリンの、少なくとも５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３およびＩｇＧ－４；ＩｇＡ－１およびＩｇＡ－２に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスの任意の抗体および抗原結合性フラグメント（例えば、抗ＬＡＧ３）を含む。

１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、抗ＬＡＧ３）は、重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えばγ１、γ２、γ３もしくはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、抗ＬＡＧ３）は、軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダもしくはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。例えば、限定的なものではないが、ヒト重鎖定常領域はγ４であることが可能であり、そして、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう１つの実施形態においては、該抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を有するγ４である（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１－８，２００１）。

ＡＥＸフィード（太線トレース）、ストリップ（細線トレース）およびプール画分（破線トレース）のＩＥＸ－ＨＰＬＣ ＵＶプロファイルの重ね合わせ。 ＡＥＸフィード、プールおよびストリップサンプルの無傷型質量スペクトル。 ＡＥＸプールおよびストリップサンプルの還元型軽鎖質量スペクトル。 図４Ａ～Ｂ：ＡＥＸプールおよびストリップ画分の還元型ＬｙｓＣペプチドマッピングのＵＶトレース。 図５Ａ～Ｃ。（Ａ）４００～１８００ｍ／ｚにおける、（Ｂ）ｍ／ｚ ３００～１１００で拡大された、（Ｃ）ｍ／ｚ １２００～２０００で拡大された、軽鎖ＡＡ２５～４３ ＋ ８０ＤａのＣＩＤ断片化スペクトル。 軽鎖ペプチドＡＡ２５～４３ ＋ ８０ＤａのＥＴＤ断片化。８０Ｄａ結合フラグメントイオンを標識した。 図７Ａ～Ｂ。（Ａ）アルカリホスファターゼ処理の存在下および非存在下のＡＥＸストリップ画分のデコンボリューションされた無傷型質量スペクトル。（Ｂ）アルカリホスファターゼ処理の存在下および非存在下のニワトリ卵白アルブミンのデコンボリューションされた無傷型質量スペクトル。 図８Ａ～Ｂ。（Ａ）正規化濃度のｍＡｂ ＡＥＸプールおよびストリップを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに付し、ウエスタンハイブリダイゼーションによりヒト重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に関してプローブし（上パネル）、ついで、ストリップし、そして抗スルホチロシンに関して再プローブした（下パネル）。右端のＨＣおよびＬＣに関する表示を参照されたい。（Ｂ）ＡＥＸストリップおよびプールに加えて、正規化濃度の異なるＣＨＯ由来ｍＡｂを還元ＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、ウエスタンハイブリダイゼーションによりヒトＨＣおよびＬＣに関してプローブし、ついで、ストリップし、そして抗スルホチロシンに関して再プローブする。（Ａ）および（Ｂ）の両方に関して、ＭａｇｉｃＭａｒｋ ＸＰをタンパク質分子量標準として使用した。等量のＨＥＫ２９３およびＥＧＦ処理Ａ４３１細胞抽出物を対照として分析する。 図９Ａ～Ｃ。（Ａ）ＡＥＸストリップ画分からのＬＣ２５～４３ ＋ ８０Ｄａ、（Ｂ）合成ペプチドＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号６５）＋リン酸化、および（Ｃ）合成ペプチドＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号６５）＋硫酸化のＳＩＣ。 重鎖および軽鎖の両方に関するリボン図におけるＣＤＲループを示すｍＡｂチロシン（Ｙ３１）部位。 チャイニーズハムスター卵巣細胞において産生されるモノクローナル抗体に関する主要Ｎ結合グリカン（ＣＨＯ Ｎ結合グリカン）、および操作された酵母細胞において産生されるモノクローナル抗体に関する主要Ｎ結合グリカン（操作された酵母Ｎ結合グリカン）；正方形：Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）；円：マンノース（Ｍａｎ）；菱形：ガラクトース（Ｇａｌ）；三角形：フコース（Ｆｕｃ）。

実施例
これらの実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１：抗体チロシン硫酸化変異体の特定および精製方法。

本実施例においては、Ａｂ６のチロシン硫酸化抗体変異体の存在を特定し、該変異体を除去するための精製方法を開発した。

材料および方法
アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能であった。抗チロシン硫酸化抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から入手可能であった。合成ペプチドはＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。

アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー
ＧＥ Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ系を使用することにより、ＰＯＲＯＳ ＧｏＰｕｒｅ Ｄプレパックカラム（０．５×５ｃｍ、１ｍＬ）をフロースルー方式で使用して、ＡＥＸクロマトグラフィーを行った。プロテインＡクロマトグラフィー精製ｍＡｂを１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ６．５にｐＨ調整し、カラム上にローディングした。タンパク質のローディングの前に、カラムを２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化し、ローディング後、カラムを２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌでストリップした。実施中に２８０ｎｍの吸光度をモニターした。画分、プールおよびストリップならびにＡＥＸロードを集め、分析した。

イオン交換ＨＰＬＣ
Ａｇｉｌｅｎｔ １６００シリーズ系を使用し、ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０カラム（４×２５０ｍｍ、３．１４ｍｌ）上、環境温度でイオン交換ＨＰＬＣを行った。移動相Ｂは３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）であり、移動相Ａは２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）であった。カラムを、まず、流速１．０ｍＬ／分で１４％移動相Ｂで１０分間平衡化した。ついで移動相Ｂの勾配（１８分で１４％から８０％）を用いて、ｍＡｂタンパク質をカラムから溶出した。ついでカラムを１００％移動相Ｂで３分間洗浄し、次のサンプル分析のために１４％移動相Ｂで再平衡化した。溶出液の２８０ｎｍでの吸光度をＬＣ実施の全体にわたってモニターした。

無傷型および還元型のＬＣ／ＭＳ
２０μｇのサンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓを使用して、ＲＰ－ＨＰＬＣ分離を行った。使用したカラムはＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ４，１．７μｍ，１．０×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ；－Ｏ－（Ｓｉ）（ＣＨ_３）_２－Ｃ_４Ｈ_９リガンド）であった。移動相は、移動相Ａとしての水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）、および移動相Ｂとしてのアセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．１％ＦＡであった。ＬＣ流速は０．０８ｍＬ／分であり、カラム温度は８０℃に維持した。３０％～９０％Ｂの４～１５分の勾配を用いて、抗体を溶出した。ｍ／ｚ ８００～４０００の範囲でスキャンするＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ系で、ＭＳスペクトルを得た。

２０μｇのサンプルを還元バッファー（６Ｍ グアニジンＨＣｌを含有する５０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０））で１００μＬの最終容量まで希釈した。２マイクロリットルの１Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液をサンプルのそれぞれに加え、続いて５６℃で２０分間インキュベートした。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ＣｌａｓｓでＲＰ－ＵＰＬＣ分離を行った。用いたカラムはＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ，ＢＥＨ３００ Ｃ４，２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ）であった。ｍ／ｚ ６００～３０００の範囲でスキャンするＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ系でＭＳスペクトルを得た。ＭＳデータをＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１のＭａｘＥｎｔ１により分析した。

ペプチドマッピングＬＣ／ＭＳ
１００μｇのサンプルを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、６Ｍ グアニジンＨＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００μＬの変性バッファーとバッファー交換した。溶液中の２０ｍＭ ＤＴＴを使用して、５６℃で３０分間還元反応を行った。サンプルを、５０ｍＭ ヨードアセトアミドで暗所で室温で３０分間アルキル化した。アルキル化反応を、１μＬの５００ｍＭ ＤＴＴ溶液を加えることにより終了させた。還元およびアルキル化サンプルを消化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０）で３００μＬの最終体積に希釈した後、Ｌｙｓ－Ｃ酵素（Ｗａｋｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を１：２０（ｗ：ｗ）の酵素：基質比で加えた。溶液を３７℃で４時間インキュベートした。ＨＡＬＯ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＳ－Ｃ１８，２．１×１５０ｎｍ，２．７μｍカラム（ＭＡＣ－ＭＯＤ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒｄ，ＰＡ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ＣｌａｓｓでのＲＰ－ＨＰＬＣによりペプチドを分離した。ｍ／ｚ １００～２０００の範囲でスキャンするＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ系で、ＭＳスペクトルを得た。ＭＳデータをＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ １．３（Ｗａｔｅｒｓ）により分析した。

標的ＭＳ／ＭＳ
標的ペプチドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳを、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で行った。ＦＴモードでの１７５００の分解能を、ＭＳ／ＭＳの取得のために適用した。ＨＡＬＯ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＳ－Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ，２．７μｍ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓにより、ペプチドを分離した。前駆体イオンのｍ／ｚ値に応じたｍ／ｚ範囲でＭＳ／ＭＳをスキャンした。正規化フラグメンテーションエネルギーを、ＣＩＤフラグメンテーションに関しては３５％に、ＥＴＤフラグメンテーションに関しては３５％に設定した。ＭＳ２データを手動で解釈した。

アルカリホスファターゼ処理
ＡＥＸストリップ画分中の１０μｇのｍＡｂタンパク質を、５０μＬのホスファターゼ反応バッファー中で希釈した。子ウシ腸からの１μＬ（１０単位）のアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｓｈ，ＭＡ）を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。ニワトリ卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として並列処理した。質量分析のために１０μＬの溶液をＬＣ／ＭＳに注入した。

ウエスタンブロッティング
Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ ＸＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに特定濃度のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および対照細胞抽出物（ＨＥＫ２９３全細胞抽出物およびＥＧＦ刺激Ａ４３１細胞ライセート（Ｍｉｌｌｉｌｐｏｒｅ））の両方を、９５℃での加熱とともにβ－メルカプトエタノールにより還元し、ついで、４～２０％勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）を使用して、トリス（Ｔｒｉｓ）－グリシンに基づくＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離した。続いて、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動転写し、４℃で揺動させながらトリス緩衝食塩水 ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）（Ｓｉｇｍａ）中で一晩洗浄した。ついで膜を、トリス緩衝食塩水 ＋ １％ ＢＳＡ（ＴＢＳ－ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）中、連続的に揺動させながら室温で１時間ブロッキングした。一次抗体（抗スルホチロシン／抗チロシン硫酸化（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．））をＴＢＳ－ＢＳＡ中に希釈し、そして、該膜と共に室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を５％脱脂乳タンパク質 ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０－リン酸緩衝生理食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈し、そして、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴでの最終洗浄の後、化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を現像に使用した。シグナルを写真フィルム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）への露出およびそれに続く処理により回収した。一次抗体間のニトロセルロース膜のストリッピングを、既に示されているとおりに行った（Ｋａｕｆｍａｎｎ ＳＨ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈａｐｅｒ ＪＨ．，Ｔｈｅ ｅｒａｓａｂｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７．１６１（１）：ｐ．８９－９５）。

結果および考察
ｍＡｂ分子の分離
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）は、典型的には、モノクローナル抗体精製中の純化（ｐｏｌｉｓｈ）工程として利用される。この工程は、典型的にはフロースルー方式で操作され、ここで、ｍＡｂはカラムを通って流動し、処理中の不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡ）はカラムに結合する。ＡＥＸの開発中に、カラムにローディングされ樹脂に結合したｍＡｂの一部がタンパク質の回収に影響を及ぼすことが認められた。タンパク質の結合画分はＡＥＸクロマトグラフィーのストリップ画分中に溶出した。ＡＥＸカラムに結合したｍＡｂを特徴づけるために、ＡＥＸクロマトグラフィーの画分を分析した：「ロード（ローディング）」はＡＥＸ精製前のサンプルに関するものであり；「プール」はサンプルのフロースルー部分に関するものであり；そして、「ストリップ」はサンプルの結合画分に関するものである。ＡＥＸクロマトグラフィーからのロード、プールおよびストリップ画分を、まず、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分析した。図１はＡＥＸロード、プールおよびストリップ画分におけるｍＡｂのＩＥＸ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１に示されているとおり、ストリップ画分は、ロードおよびプールと比較して有意に多い量の酸性変異体を含有しており：すなわち、プール画分（破線トレース）における２３％、およびフィード（供給）画分（太線トレース）における３３％と比較して、ストリップ画分（細線トレース）においては～６５％の酸変異体である。酸性プレ主要ピークにおいて、追加的な差異が認められた。このピークは、ＡＥＸフィードにおいてより高レベルで存在し、ここで、ＡＥＸプールにおいては、このピークは最小であった。ストリップ画分は酸性プレ主要ピークにより富化していた。また、前記と同じバッファーおよび塩条件で、ｐＨ７．０または７．５でＡＥＸクロマトグラフィーを行った。ｐＨ７．０においても、酸性プレ主要ピークの同様の減少がＡＥＸプールにおいて観察された。

質量分析による無傷型および還元型タンパク質の分析
不純物を特徴づけるために、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳを用いる無傷型および還元型のＬＣ／ＭＳにより、３つ全ての画分（ＡＥＸロード、プールおよびストリップ）を分析した。図２は無傷分子のデコンボリューション質量スペクトルを示す。３つの主要グリコフォーム、すなわち、それぞれ１４８５９１Ｄａ、１４８７５１Ｄａおよび１４８９１２Ｄａの質量を有するＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ／Ｇ１ＦおよびＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆが３つ全ての画分において観察された。Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆを有するこの分子の計算した無傷型の質量は１４８５９０Ｄａである。無傷型の質量測定の質量誤差は全て２５ｐｐｍ以内である。追加的な種はＡＥＸストリップ画分においてのみ検出された。これらの種は３つの主要グリコフォーム（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ／Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ／Ｇ１Ｆ）の８０Ｄａの質量増加（１４８６６８、１４８８３０、１４８９９１Ｄａ）に対応する。修飾を局在化するために、還元剤ＤＴＴによるジスルフィド結合の切断の後、軽鎖および重鎖の質量を測定した。ストリップ画分とプール画分との重鎖質量に差は認められず、このことは、修飾が重鎖上に位置していないことを示唆している（データ非表示）。図３に示されているとおり、両方の画分（ストリップ画分およびプール画分）において、軽鎖アポ形態質量（２３６７４Ｄａ）および糖化軽鎖質量（２３８３６Ｄａ）が検出された。軽鎖の８０Ｄａの増加を伴うピークはＡＥＸストリップ画分における２３７５４Ｄａにおいてのみ観察された。還元型の質量測定の質量誤差は２０ｐｐｍ以内である。これらのデータは、８０Ｄａの修飾がＡｂ６の軽鎖上に位置していることを示唆している。

ペプチドマッピングによるｍＡｂ抗体の分析
修飾部位を更に特定するために、ＡＥＸストリップおよびプール画分を還元し、アルキル化し、ついでＬｙｓＣ酵素により消化した。ペプチド混合物をＱ－ＴＯＦ ＭＳにより質量マッピングした。これら２つの画分のＵＶトレースを比較すると、２つの差異が認められた。図４（ａ）および（ｂ）に示されているとおり、ＡＥＸストリップ画分において、２つの新たなピークが保持時間３７．６分および６５．２分において検出された。新たなピークにおける観察されたｍ／ｚは３７．６分における１１６５．４７９６（２＋）および６５．２分における１４７６．７３７２（４＋）Ｄａである。観察された質量は、それぞれ６．４ｐｐｍおよび９．８ｐｐｍの質量誤差を有する軽鎖ペプチドＡＡ２５－４３ ＋ ８０ＤａおよびＡＡ２５－７８ ＋ ８０Ｄａに対応する。軽鎖ペプチドＡＡ２５－７８は、１つの誤切断部位を含有する。軽鎖ペプチドＡＡ２５－４３およびＡＡ２５－７８の修飾形態および非修飾形態が図４に表示されている。抽出イオンクロマトグラム（ＳＩＣ）におけるピーク面積に基づいて、この修飾ペプチドのレベルは、ＡＡ２５－４３およびＡＡ２５－７８に関してそれらのアポ形態と比較して２０．９％および２１．６％であると推定された。

修飾ペプチドのＭＳ／ＭＳフラグメンテーション
質量が８０Ｄａ増加する修飾には２つの可能性があり、すなわち、リン酸化（＋７９．９６６３Ｄａ）および硫酸化（＋７９．９５６８Ｄａ）である。これら２つの修飾の理論的質量差は僅か０．００９５Ｄａであり、このことは、質量のみにより識別することを困難にする。まず、標的ペプチドＡＡ２５－７８を衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化し、生成したフラグメントをＬＴＱ－オービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ＭＳにより分析した。図５に示されているとおり、前駆体イオンからの修飾基（８０Ｄａ）の完全な喪失が観察された。ペプチド骨格からのフラグメントのみが検出され、これはＬＣ２５－４３のペプチド配列を証明している。一方、ＣＩＤフラグメンテーションからは部位特異的情報は得られなかった。硫酸化チロシン（ｓＹ）は非常に不安定であり、そして、標準的なＣＩＤ条件下で容易に喪失しうると報告されている（Ｎｅｍｅｔｈ－Ｃａｗｌｅｙ ＪＦ１，Ｋ．Ｓ．，Ｒｏｕｓｅ ＪＣ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００１．３６（１２）：ｐ．１３０１－１１）。ペプチド主鎖フラグメンテーションの時点で元の前駆体イオンが存在しなかったため、陽イオンＣＩＤ ＭＳ／ＭＳを用いるスルフェート部分の位置に関する部位特異的情報を得ることは不可能であった。一方、リン酸化ペプチドはＣＩＤ下で存続する傾向にあり、ペプチド骨格のフラグメンテーションは修飾の部位特異的特定を可能にする（Ｎｅｍｅｔｈ－Ｃａｗｌｅｙ ＪＦ１，Ｋ．Ｓ．，Ｒｏｕｓｅ ＪＣ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００１．３６（１２）：ｐ．１３０１－１１）。図５において、前駆体イオンからの８０Ｄａの中性喪失が観察された。リン酸化に関する特徴的な中性喪失イオンは－Ｈ_３ＰＯ_４（－９８Ｄａ）であり、特徴的なフラグメントイオンはＰＯ_３ ^－（－７９Ｄａ）であることが公知である。一方、硫酸化では、特徴的な中性喪失イオンおよびフラグメントイオンは共に８０Ｄａを有する－ＳＯ_３イオンである（Ｍｏｎｉｇａｔｔｉ Ｆ，Ｈ．Ｂ．，Ｓｔｅｅｎ Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ－－Ａ ｐｒｉｍｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，２００６．１７６４（１２）：ｐ．１９０４－１３）。ＣＩＤ ＭＳ２データは、８０Ｄａの修飾が硫酸化であることを示唆している。

広く用いられているもう１つのフラグメンテーションメカニズムは、電子移動解離（ＥＴＤ）である。それは電子を多重プロトン化ペプチド／タンパク質に移動させ、これはＮ－Ｃα主鎖結合の切断をもたらし、ＰＴＭ局在化の情報を喪失することなくｃ型およびｚ型フラグメントイオンを生成しうる（Ｍｉｋｅｓｈ ＬＭ，Ｕ．Ｂ．，Ｃｈｉ Ａ，Ｃｏｏｎ ＪＪ，Ｓｙｋａ ＪＥ，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ Ｊ，Ｈｕｎｔ ＤＦ．，Ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ＥＴＤ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，２００６．１７６４（１２）：ｐ．１８１１－２２）。ＥＴＤはＣＩＤと共に相補的な情報を提供し：すなわち、ＥＴＤ法は、ＳＯ_３基の保持を可能にし、したがって、アミノ酸局在化を可能にし、一方、ＣＩＤは、好ましくは、不安定な修飾をフラグメント化する。本発明者らの場合、ＥＴＤフラグメンテーションおよび高分解能質量検出を用いるＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（オービトラップ）により、標的ペプチドを分析した。図６に示されているとおり、８０Ｄａの修飾の部分的喪失が前駆体イオンにおいて観察された。ＳＯ_３基（８０Ｄａ）が結合したフラグメントイオンが表示されている。ＳＯ_３結合フラグメントイオン（ｃ９、ｃ１１、ｃ１２～１６）の検出に基づいて、修飾部位は軽鎖上のチロシン３１であると確認され、これはｍＡｂ分子のＣＤＲ１領域内に存在する。

アルカリホスファターゼ処理
チロシンのリン酸化および硫酸化は等重体（ｉｓｏｂａｒｉｃ）であるため、アルカリホスファターゼを使用してこれら２つの修飾を区別した（Ｙｕ Ｙ，Ｈ．Ａ．，Ｍｏｏｒｅ ＫＬ，Ｌｅａｒｙ ＪＡ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｏ－ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７．４（７）：ｐ．５８３－８）。アルカリホスファターゼは、タンパク質からリン酸化基を除去するために広く用いられている。ニワトリアルブミンを陽性対照として使用したが、このタンパク質はそのリン酸化およびグリコシル化形態に関して詳細に知られているからである。ＡＥＸストリップ画分におけるニワトリアルブミンおよびｍＡｂをホスファターゼで処理し、３７℃で並行してインキュベートした。図７は、ホスファターゼ処理の前および後のｍＡｂおよびニワトリ卵白アルブミンの測定した無傷型質量を示す。図７（ａ）に示されているとおり、ｍＡｂに関する質量変化は観察されなかった。一方、ニワトリアルブミンに関しては、１６０Ｄａの明らかな質量シフトが全ての主要グリコフォームについて観察された（図７（ｂ））。ニワトリアルブミンは２つのリン酸化部位を含有するため、１６０Ｄａの喪失はアルカリホスファターゼの活性を証明している。ホスファターゼ処理の前および後で質量変化は見られなかったため、ＡＥＸストリップにおけるこのｍＡｂはリン酸化されていないと示唆される。

ウエスタンブロット
これまでのところ、ＬＣ／ＭＳ分析は、軽鎖ＣＤＲ上のチロシン３１への８０Ｄａ付加体の性質を調べるために使用されている。ホスファターゼ処理後のｍＡｂ ＡＥＸストリップ画分のＭＳ２分析および質量分析は、８０Ｄａ付加体がチロシン３１上の硫酸化であることを示唆している。しかし、これらの質量分析に基づく技術がチロシン硫酸化およびリン酸化を直接識別する能力は、これら２つの基の分子量が類似しているため問題となる。この問題への対処を開始するために、抗スルホチロシン特異的モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングを適用して、ｍＡｂ ＡＥＸストリップ画分におけるチロシン硫酸化の存在を確認した（Ｘｕ Ｊ，Ｄ．Ｘ．，Ｔａｎｇ Ｍ，Ｌｉ Ｌ，Ｘｉａｏ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｌ，Ｚｈｏｎｇ Ｊ，Ｂｏｄｅ ＡＭ，Ｄｏｎｇ Ｚ，Ｔａｏ Ｙ，Ｃａｏ Ｙ．，Ｔｙｒｏｓｙｌｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－１ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，２０１３．８（３）：ｐ．ｅ５６１１４）。図８ａ（上パネル）において、正規化濃度のｍＡｂ ＡＥＸプールおよびストリップ画分を還元ＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、ウエスタンハイブリダイゼーションによりヒト重鎖および軽鎖に関してプローブした。増加した濃度のプールおよびストリップからの重鎖および軽鎖を、最初の検出抗体から「ストリップ（除去）」し、そして、抗スルホチロシン特異的モノクローナル抗体で再プローブした（下パネル）。図８ａ（下パネル）に示されているとおり、陽性シグナルはストリップ画分の軽鎖上でのみ検出され、このことは、それがチロシン硫酸化を含むことを示唆している。リン酸化との交差反応性に関する対照として、レーン１にリン酸化タンパク質に富む市販のＥＧＦ処理Ａ４３１細胞抽出物をローディングした。下パネルのレーン１における陽性シグナルの欠如は、抗スルホチロシンモノクローナル抗体がリン酸化との強い交差反応性を有さないことを示している（図８ａ、下パネル）。更に、抗スルホチロシンモノクローナル抗体に関する陽性対照として製造業者により提案されたＨＥＫ２９３抽出物を、レーン２にローディングした。底～２０ＫＤａ未満の陽性シグナルは、製造業者の分析と一致している（図８ａ、下パネル）。図８ｂにおいては、ＡＥＸストリップおよびプールに加えて、正規化濃度の異なるＣＨＯ由来ｍＡｂ（ｍＡｂ１、２および３）を還元ＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、ウエスタンハイブリダイゼーションによりヒト重鎖および軽鎖に関してプローブし（上パネル）、ついでストリップし、そして抗スルホチロシンに関して再プローブした（下パネル）。図８ａと合致して、抗スルホチロシン抗体でプローブされた場合、ＡＥＸ ｍＡｂストリップのみが軽鎖の位置に陽性シグナルを示す。同様の量のタンパク質を分析した場合、その他の３つのＣＨＯ由来のＭｅｒｃｋ ｍＡｂについては、チロシン硫酸化に関して陽性シグナルは観察されなかった。これは、これら３つのｍＡｂにおいて、増加したレベルのＡＥＸ酸性ピークまたはチロシン硫酸化ホットスポットが検出されなかったという本発明者らの観察と合致している（データ非表示）。

硫酸化またはリン酸化を伴う合成ペプチドとの保持時間の比較
リン酸化と硫酸化とを更に識別するために、Ｙ３１上のリン酸化または硫酸化のいずれかで修飾されたＬＣ ＡＡ２５－４３（ＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ）（配列番号６５）の同一配列を有する合成ペプチドをＬＣ／ＭＳにより分析した。図９は合成ペプチドＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号６５）＋リン酸化、ＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号６５）＋硫酸化およびＡＡ２５－４３ ＋ ８０Ｄａ（ＡＥＸストリップにおけるもの）のＳＩＣを示す。硫酸化を伴う合成ペプチドはＡＥＸストリップと同じ保持時間で溶出するが、リン酸化を伴う合成ペプチドはＡＥＸストリップより早く溶出する。これは、軽鎖上のＹ３１が硫酸化されているという本発明者らの観察を更に証明している。

チロシン硫酸化部位の構造
タンパク質チロシン硫酸化反応は、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼと称されるゴルジ酵素により触媒される。従来の研究は、－５～＋５位内の幾つかの酸性残基によって通常包囲されている接近可能なチロシン残基をＴＰＳＴが認識することを示した（Ｈｏｒｔｉｎ Ｇ，Ｆ．Ｒ．，Ｇｏｒｄｏｎ ＪＩ，Ｓｔｒａｕｓｓ ＡＷ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８６．１４１（１）：ｐ．３２６－３３；Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ＧＬ，Ｎ．Ｈ．Ｊ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１９９３．２（２）：ｐ．２１５－２２；Ｔｅｒａｍｏｔｏ Ｔ１，Ｆ．Ｙ．，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｋｕｒｏｇｉ Ｋ，Ｓｏｅｊｉｍａ Ｍ，Ａｄａｃｈｉ Ｒ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｙ，Ｍｉｓｈｉｒｏ－Ｓａｔｏ Ｅ，Ｌｉｕ ＭＣ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｙ，Ｓｕｉｋｏ Ｍ，Ｋｉｍｕｒａ Ｍ，Ｋａｋｕｔａ Ｙ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｙｒｏｓｙｌｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－２ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３．４：ｐ．１５７２）。受容体チロシンは、ＴＰＳＴ２基質結合部位における正荷電残基の認識を可能にするために近くに酸性残基を有する必要がある。受容体チロシンはまた、ＴＰＳＴ２の深い裂け目に嵌るように本質的に柔軟な領域内に存在する必要がある。しかし、チロシン硫酸化部位に関する一般的なコンセンサス配列は定められていない。硫酸化チロシンの配列周辺を示す最も一般的な特徴には、チロシンから２残基以内の１つの酸性アミノ酸の存在、５残基以内の少なくとも３つの酸性アミノ酸の存在、および付近のターン（回転）誘発性アミノ酸の存在などが含まれる（Ｍｏｎｉｇａｔｔｉ Ｆ，Ｈ．Ｂ．，Ｓｔｅｅｎ Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ－－Ａ ｐｒｉｍｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，２００６．１７６４（１２）：ｐ．１９０４－１３）。図１０は、ＭＯＥソフトウェア（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）により作製されたリボン図におけるＣＤＲループの状況におけるｍＡｂチロシン部位の構造を示す。このｍＡｂ上の軽鎖Ｙ３１に近い配列はＸＳＸＳＸＤＹＥＧＤＳＤＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号６５）である。この配列においては、Ｙ３１の隣接残基、すなわち、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は共に酸性である。合計４つの酸性残基、すなわち、３つのＤおよび１つのＥがＹ３１から５残基以内に存在する。４つのターン誘発性残基、すなわち、３つのセリン（Ｓ）および１つのグリシン（Ｇ）がＹ３１の近傍に存在する。隣接酸性アミノ酸および局所的二次構造の要素を伴うＹ３１の特有の構造が、この修飾を引き起こすための必須の役割を果たしている。

本発明者らは、ＣＨＯ産生抗体における予想外のＯ結合チロシン硫酸化の存在を示す証拠をここに記載する。この不安定な修飾の位置は、ＥＴＤフラグメンテーションを伴う質量分析により確認されたとおり、軽鎖のＣＤＲ１領域に見出された。このチロシン硫酸化は、ホスファターゼ処理、抗チロシン硫酸化抗体を使用するウエスタンブロット実験および合成硫酸化ペプチドとの保持時間の相関によって更に確認された。ＣＤＲチロシンの構造分析は硫酸化に対する酸性残基の影響を証明している。隣接酸性アミノ酸残基および局所二次構造の要素が、Ｙ３１を硫酸化のホットスポットにするための必須の役割を果たしている可能性がある。

本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲において限定されるべきではない。実際、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載されている実施形態、および本明細書に具体的には記載されていない他の実施形態を含み、本明細書に具体的に記載されている実施形態は必ずしも網羅的であることを意図していない。本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。

特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルが本出願の全体にわたって引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。本出願は、米国仮特許出願第６２／４１４，２０９号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権を主張するものである。本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が、参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が参照により組み入れるという宣誓陳述の直前直後にない場合であっても、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関連づけることを出願人が意図しているものである。参照により組み入れるという宣誓陳述が本明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。参考文献が、特許請求している条項に関する定義を記載しており、それが本明細書に記載されている定義と矛盾する場合には、本出願に記載されている定義が特許請求している発明を解釈するために用いられるものとする。

Claims (13)

1. チロシン硫酸化およびチロシン非硫酸化抗体を含む水性混合物からチロシン硫酸化抗体を除去する方法であって、
   混合物のｐＨを６．５～７．５に調整し、水性混合物をアニオン交換樹脂と接触させ、そして、樹脂からの混合物の非樹脂結合水性画分を保持することを含み；
   ここで、チロシン硫酸化抗体またはチロシン非硫酸化抗体が、
   配列番号５２の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ヒトＬＡＧ３抗体であるか、または、
   配列番号５２の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１の軽鎖アミノ酸配列を含み、且つ、Ｎ末端重鎖グルタミンがピログルタメートに変換されている、および／または、Ｃ末端重鎖リジンが除去されており、
   そしてここで、チロシン硫酸化は、ＣＤＲ－Ｌ１上において存在する、抗ヒトＬＡＧ３抗体である、
   方法。
2. 混合物のｐＨを調整する工程が、混合物のｐＨを６．５～７．０に調整することを含む、請求項１記載の方法。
3. アニオン交換リガンドを含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で１０～５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５～７．５）で平衡化し、水性混合物のｐＨを６．５～７．５に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を１０～５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５～７．５）で洗浄し、そして洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む、請求項１記載の方法。
4. アイソクラチック条件下、水性組成物で樹脂を洗浄し、そして、樹脂から洗浄組成物を取り出し、そして保持することを更に含む、請求項１または２に記載の方法。
5. ジメチルアミノプロピルアニオン交換リガンドを含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化し、水性混合物のｐＨを６．５に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む、請求項２に記載の方法。
6. 四級化ポリエチレンイミンアニオン交換リガンドを含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で２５ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化し、水性混合物のｐＨを７．０に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を２５ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、そして、洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む、請求項２に記載の方法。
7. アニオン交換リガンドを含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラム内で１０～５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５～７．５）で平衡化し、水性混合物のｐＨを６．５～７．５に調整し、混合物をカラムに適用し、カラムからフロースルー画分を集め、カラム内の樹脂を１０～５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５～７．５）で洗浄し、そして洗浄液からフロースルー画分を集めることを含む、請求項１記載の方法。
8. Ａ_２８０が最初に少なくとも２．５吸光度単位／ｃｍに達したら、Ａ_２８０吸光度のアニオン交換クロマトグラフィーフロースルーを集め、そして、Ａ_２８０が１．０吸光度単位／ｃｍ未満に低下するまでそれを継続する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
9. カチオン交換クロマトグラフィー、結合－溶出方式のアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、分別沈殿、濾過、遠心分離またはウイルス不活性化により、抗体を精製することを更に含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
10. 抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させる、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
11. チロシン非硫酸化抗体が、１４８５９０Ｄａ、１４８７５２Ｄａおよび／または１４８９１４Ｄａの分子量を有する抗体である、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
12. ヒトリンパ球活性化遺伝子３（ｈＬＡＧ３）に特異的に結合する抗体（抗ｈＬＡＧ３）を含む、精製された組成物であって、該抗体は、
    配列番号５２の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１の軽鎖アミノ酸配列を含み、ここで、抗ヒトＬＡＧ３抗体は、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現され；そして、精製された組成物は、ＣＤＲ－Ｌ１上においてチロシン非硫酸化抗ヒトＬＡＧ３抗体と比較して０．５％未満の硫酸化チロシンを含む抗ヒトＬＡＧ３抗体を有し、
    ここで、チロシン非硫酸化抗ヒトＬＡＧ３抗体は、１４８５９０Ｄａ、１４８７５２Ｄａまたは１４８９１４Ｄａの分子量を有するグリコシル化抗体種である、精製された組成物。
13. 抗ヒトＬＡＧ３抗体が、Ｎ末端重鎖グルタミンがピログルタメートに変換されている、および／または、Ｃ末端重鎖リジンが除去されているものを有する、請求項１２記載の精製された組成物。

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