CN114133446A - 单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种单克隆抗体的纯化方法，涉及抗体纯化领域。该单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：S1、抗体细胞分离：对得到的细胞发酵液进行离心处理；S2、阳离子交换层析：采用琼脂糖凝胶对内部的蛋白进行吸附，去除多余杂质；S3、抗原亲和层析：通过抗原对抗体蛋白进行筛选，减少杂质蛋白的含量；S4、除杂处理：对处理过程中溶液中的其他杂质进行去除，保持抗体的纯度。通过本发明进行抗体提纯，不需要每步对抗体蛋白进行沉淀，减少提纯的步骤，提高提纯的效率且其纯度基本不受影响，便于进行大规模地进行，通过在洗脱液中加入巴西木素，可以防止在提纯过程中或者提纯后，蛋白抗体出现聚集的现象。
Description
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域，具体为一种单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。
从细胞培养基中纯化药物级单克隆抗体蛋白质包括收获/净化，接着通过使用一系列的柱层析步骤与膜超滤和渗滤结合而纯化。在纯化之后，期望的抗体制剂经适当配制并且存储在合适的条件中。然而，很多时候，这些步骤无法提供具有其药物应用所需的期望水平的纯度和质量的抗体。有时，在柱纯化期间，观察到工艺相关的和产物相关的杂质与期望的抗体一起共洗脱。因此，从期望的制剂中减少或去除这样的杂质是重要的。此外，蛋白质聚集是在单克隆抗体生产期间主要关心的问题。聚集体的存在可以降低单克隆抗体的疗效并且已知在人类中引发免疫原应答。因此，在下游纯化期间，主要通过柱层析从单克隆抗体期望的制剂中去除聚集体是必须的。
但是现有的提取技术在每一步的提取后，均需要对含有抗体的溶液进行调节，从而使抗体蛋白沉淀进行提取，虽然提取的纯度能够保证，但是增加了提纯的步骤与时间，而且在进行多次沉淀的过程中，蛋白易于出现蛋白质聚集现象。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种单克隆抗体的纯化方法，解决了抗体蛋白出现蛋白质聚集以及提纯步骤较多的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
S1、抗体细胞分离
对含有抗体的细胞发酵液进行离心操作，取得离心液，然后将离心液经过除菌过滤器，获得含有抗体的第一混合物；
S2、阳离子交换层析
采用琼脂糖凝胶作为基质，制作成为交换柱，通过将S1中得到的第一混合物先进行洗涤，再次进行洗脱，从而得到含有抗体的第二混合物，使纯度提高；
S3、抗原亲和层析
将抗原固化在固体支持物上，通过将S2中得到的第二混合物进行层析，通过洗涤缓冲液进行洗涤，再次进行洗脱，得到含有较高纯度抗体的第三混合物；
S4、除杂处理
对内部病毒进行灭活处理，采用高浓度盐溶液，通过调节PH值为4.5-5.5之间，对抗体进行析出，然后通过透析，使蛋白质进行聚拢，再次通过超过滤使抗体进行进一步纯化，得到最终的单克隆抗体。
优选的，所述S1中离心的速度为5000r/min-7000r/min，所述离心的时间为20min-30min。
优选的，所述S2中交换柱的柱高为20厘米－40厘米，内部流速为60cm/h-200cm/h。
优选的，所述S2中洗涤用洗涤液为醋酸盐溶液，且其PH值为5.5-5.8，所述洗脱用洗脱液为磷酸钠盐与巴西木素的混合物，且其PH值为7.2-7.5。
优选的，所述S3中洗涤缓冲液为脂族羧酸盐溶液，所述脂族羧酸盐溶液为脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐和脂族羧酸的钾盐中的一种或几种。
优选的，所述S3中洗脱采用洗脱液为醋酸钠、乙酸、tris碱、巴西木素的混合物，所述洗脱时，溶液的PH值为7.2-7.5。
(三)有益效果
本发明提供了一种单克隆抗体的纯化方法。具备以下有益效果：
1、通过本发明进行抗体提纯，不需要每步对抗体蛋白进行沉淀，减少提纯的步骤，提高提纯的效率且其纯度基本不受影响，便于进行大规模地进行。
2、本发明，通过在洗脱液中加入巴西木素，可以防止在提纯过程中或者提纯后，蛋白抗体出现聚集的现象。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本发明实施例提供一种单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
S1、抗体细胞分离
对含有抗体的细胞发酵液进行离心操作，使内部的重量分子与轻量分子进行分离，去除相当一部分杂质分子，取得离心液，然后将离心液经过除菌过滤器，去除内部细菌，获得含有抗体的第一混合物；
S2、阳离子交换层析
采用琼脂糖凝胶作为基质，制作成为交换柱，通过将S1中得到的第一混合物先进行洗涤，再次进行洗脱，从而得到含有抗体的第二混合物，使纯度提高，采用琼脂糖凝胶对内部的蛋白进行吸附，去除多余杂质；
S3、抗原亲和层析
将抗原固化在固体支持物上，通过将S2中得到的第二混合物进行层析，通过洗涤缓冲液进行洗涤，再次进行洗脱，得到含有较高纯度抗体的第三混合物，通过抗原对抗体蛋白进行筛选，减少杂质蛋白的含量；
S4、除杂处理
对内部病毒进行灭活处理，采用高浓度盐溶液，通过调节PH值为4.5-5.5之间，对抗体进行析出，然后通过透析，使蛋白质进行聚拢，再次通过超过滤使抗体进行进一步纯化，得到最终的单克隆抗体，对处理过程中溶液中的其他杂质进行去除，保持抗体的纯度。
S1中离心的速度为5000r/min-7000r/min，离心的时间为20min-30min，S2中交换柱的柱高为20厘米-40厘米，内部流速为60cm/h-200cm/h，S2中洗涤用洗涤液为醋酸盐溶液，且其PH值为5.5-5.8，洗脱用洗脱液为磷酸钠盐与巴西木素的混合物，且其PH值为7.2-7.5，S3中洗涤缓冲液为脂族羧酸盐溶液，脂族羧酸盐溶液为脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐和脂族羧酸的钾盐中的一种或几种，S3中洗脱采用洗脱液为醋酸钠、乙酸、tris碱、巴西木素的混合物，洗脱时，溶液的PH值为7.2-7.5。
巴西木素又称苏方木素。巴酉红木红，巴西苏木素，苏仿隐色素。墟拍黄色结晶在空气中和光照下变为橙色。溶于水，易溶于乙醇和***。溶于氢氧化碱溶液并形成胭脂红色。在酸性下呈黄色。存在于豆科植物苏木的心材。也可由洽成法得到外消旋体，再经拆分制得，有显著的抗菌活性，还可作为染料及酸碱反应。且巴西木素在抑制多种蛋白聚集方面具有较为突出的表现，本发明采用巴西木素，并且达到期待目标。
对比例：采用现有手段进行纯化：纯化步骤为：细胞分离－蛋白A层析(调节PH沉淀，去除大部分杂质)－低pH温育－中和和再调节－疏水相互作用层析(调节PH沉淀，去除大部分杂质)－超滤－渗滤－阴离子交换层析(调节PH沉淀，去除大部分杂质)－纳滤－超滤－渗滤－微滤。
实施例与对比例的检测数据如表一所示：
表一 检测结果
以上数据，均实验二十次，采用均值，时间以传统纯化方法为1，实施例的时间为相应占比。
综上可知，采用本发明的纯化方法，不仅提高了纯化的效率，而且出现蛋白质聚集的现象较低，得到的纯度与传统方法没有太大区别，适合大规模的推广。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、抗体细胞分离
对含有抗体的细胞发酵液进行离心操作，取得离心液，然后将离心液经过除菌过滤器，获得含有抗体的第一混合物；
S2、阳离子交换层析
采用琼脂糖凝胶作为基质，制作成为交换柱，通过将S1中得到的第一混合物先进行洗涤，再次进行洗脱，从而得到含有抗体的第二混合物，使纯度提高；
S3、抗原亲和层析
将抗原固化在固体支持物上，通过将S2中得到的第二混合物进行层析，通过洗涤缓冲液进行洗涤，再次进行洗脱，得到含有较高纯度抗体的第三混合物；
S4、除杂处理
对内部病毒进行灭活处理，采用高浓度盐溶液，通过调节PH值为4.5-5.5之间，对抗体进行析出，然后通过透析，使蛋白质进行聚拢，再次通过超过滤使抗体进行进一步纯化，得到最终的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述S1中离心的速度为5000r/min-7000r/min，所述离心的时间为20min-30min。
3.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述S2中交换柱的柱高为20厘米－40厘米，内部流速为60cm/h-200cm/h。
4.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述S2中洗涤用洗涤液为醋酸盐溶液，且其PH值为5.5-5.8，所述洗脱用洗脱液为磷酸钠盐与巴西木素的混合物，且其PH值为7.2-7.5。
5.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述S3中洗涤缓冲液为脂族羧酸盐溶液，所述脂族羧酸盐溶液为脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐和脂族羧酸的钾盐中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述S3中洗脱采用洗脱液为醋酸钠、乙酸、tris碱、巴西木素的混合物，所述洗脱时，溶液的PH值为7.2-7.5。
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