CN111072773A - 抗体的纯化方法、抗体和应用 - Google Patents

抗体的纯化方法、抗体和应用 Download PDF

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CN111072773A CN201811226606.1A CN201811226606A CN111072773A CN 111072773 A CN111072773 A CN 111072773A CN 201811226606 A CN201811226606 A CN 201811226606A CN 111072773 A CN111072773 A CN 111072773A
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Abstract

本发明提供了一种抗体的纯化方法、抗体和应用，涉及蛋白纯化的技术领域。该纯化方法包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；其中组合层析依次包括(a)亲和层析以捕获抗体；(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理。该抗体纯化方法具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高的优点。

Description

抗体的纯化方法、抗体和应用
技术领域
本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其是涉及一种抗体的纯化方法、抗体和应用。
背景技术
1986年首次治疗性单克隆抗体(单抗)获得批准后，人们对治疗性单抗的需求显着增加。截止2015年11月，53种新型治疗性单克隆抗体进入3期临床研究，比2009年增加了104％，其中六个已于2016年在欧盟或美国首次获得批准。目前每年约有4种新的治疗性单抗产品的获得上市批准，按照这样的增加速度，到2020年市场上预计将会有70种单抗，全球销售额将达到1250亿美元。
治疗单克隆抗体的纯化制备，多数是基于Protein A的亲和层析作为第一步进行纯化，但是通常情况下，一步ProteinA亲和层析的纯度等方面达不到治疗抗体的要求(一般纯度要求>95％)，另外由于是CHO细胞系作为宿主表达抗体时，细胞培养上清中，不仅含有目标抗体，而且还有宿主蛋白(HCP)，宿主DNA(HCD)等杂质，单纯一步Protein A层析去除不掉全部的杂质，需要额外增一步或者几步层析过程来满足要求。
治疗性单克隆抗体最常见的纯化工艺的层析过程是Protein A(亲和层析，AC)，脱盐(BEX)，阳离子交换(CEX)，脱盐(BEX)，阴离子交换(AEX)。脱盐过程可以使用脱盐柱或者超滤脱盐。目前，几乎大部分纯化工作人员都是采用的手动一步层析方法，每步层析都需要单独的上样，洗脱，处理样品，然后进行下一步层析操作，极少同时用到手动两步层析方法进行纯化。手动层析不仅会造成样品的损失，而且人工耗时多，设备投入量较大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗体的纯化方法，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高的优点。
本发明的第二目的在于提供一种使用上述抗体的纯化方法纯化得到的抗体。
本发明的第三目的在于提供一种上述抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种抗体的纯化方法，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:
(a)亲和层析以捕获抗体；
(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；
(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；
其中，AKTA Avant 150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position 3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position 1。
优选地，用于步骤(a)的亲和层析柱中的填料包括Protein A、Protein G或Protein L中的至少一种；优选为Protein A。
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式包括：离子交换层析、亲和层析、羟基磷灰石层析或疏水相互作用层析。
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为离子交换层析，优选为阳离子交换层析。
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为疏水相互作用层析。
优选地，所述纯化方法还包括将AKTA Avant 150的样品泵的上样入口设置为变量，以用于依次纯化多个抗体样品。
优选地，所述组合层析的流路包括：
(x1)亲和上样：抗体粗品经Sample pump从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Fraction collection，进行收集流传液；
(x2)亲和Wash杂质：Buffer A1经System pump A从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，流出后至废弃液中；
(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：Buffer B1经System pump B从Injection valve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，峰收集后不经排出重新流回Injection valve并注入凝胶过滤层析柱；
(x4)层析上样：Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，流出后收集滤液；
(x5)层析洗脱：将Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，同时Buffer B2经System pump B从Injection valve注入管路后流经层析柱进行梯度洗脱，以洗脱与层析柱结合的抗体，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve后流至Fraction Collection，流出后收集滤液得到纯化后的抗体。
优选地，所述组合层析的流路还包括用于层析柱再生的步骤：
(x6)步骤(a)中使用的亲和层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉杂质进行再生处理，滤液依次流经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA1经System pump A从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉柱子中残留的碱溶液，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste。
(X7)步骤(b)和步骤(c)中使用的层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA2，经System pump A从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve流至Waste。
优选地，经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至阳离子交换层析柱；
流路使用的缓冲液包括：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4；
BufferA2：pH为5.0～5.5，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；
BufferB1：pH为3.2～3.4，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；
BufferB2：pH为5.0～5.5，含有浓度为20～50mM的NaAC和浓度为1～2M的NaCl溶液；
Buffer B3:0.1～0.2M NaOH溶液。
优选地，经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至疏水相互作用层析柱；
流路使用的缓冲液包括：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4；
BufferA2：pH为7.5～8.0，含有浓度为20～50mM的PB和1.5M的(NH)2SO4,溶液；
BufferB1：pH为3.2～3.4，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液
BufferB2:pH7.5～8.0,含有浓度为20～50mM的PB,
BufferB3：含有浓度为0.1M的NaOH溶液。
本发明还提供了一种使用上述抗体的纯化方法纯化得到的抗体。
本发明还提供了上述抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的抗体的纯化方法，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析。组合层析的过程中无需人工参与，仪器可以过夜运行，充分利用晚上时间，设备利用率高。
(2)本发明处理的样品通量高，大大减少了人工成本投入；操作简单，只需要在编辑好的程序中输入样品名和进样口，就可以完成程序操作，不易出现由于人为操作原因而产生的错误；并且整个层析过程中，样品始终是停留在仪器管路或者柱子中，这样就减少了样品中间处理过程中的损失。
(3)本发明全自动化三步层析纯化后抗体，纯度比一步Protein A纯度高，杂质含量少。
(4)本发明全自动化三步层析纯化抗体，比手动三步层析处理相同数量的样品减少约一半的时间，大大提高抗体药物的前期研发小样的纯化速度。
(5)本发明全自动三步层析纯化抗体样品，完全是基于一台AKTA Avant 150建立的，不需要额外增加泵和紫外检测器等等纯化配件或者设备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的亲和上样的流路示意图；
图2为本发明实施例1提供的亲和洗脱杂质的流路示意图；
图3为本发明实施例1提供的亲和洗脱和凝胶过滤层析上样的流路示意图；
图4为本发明实施例1提供的层析上样的流路示意图；
图5为本发明实施例1提供的层析洗脱的流路示意图；
图6，图7为本发明实施例1提供的亲和再生的流路示意图；
图8，图9为本发明实施例1提供的亲和再生的流路示意图；
图10为本发明实施例1提供的AKTA Avant 150运行的主程序的流程图；
图11为本发明效果例1提供的纯化后的抗体的色谱图；
图12-A为单独使用ProteinA亲和层析纯化后的抗体的SEC(TSK G3000)结果；
图12-B为使用实施例提供的纯化方法纯化的抗体的SEC(TSK G3000)结果；
图13为HCP去除的对比图；
图14为实施例1提供的纯化方法和人工纯化方法的耗时对比结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
本发明提供了一种抗体的纯化方法，该方法基于AKTA Avant 150完全自动化完成抗体的三步纯化，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:
(a)亲和层析以捕获抗体；
(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；
(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；
其中，AKTA Avant 150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position 3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position 1。
AKTA蛋白纯化***是美国通用电气生产的用于纯化工艺的液相层析***，配合层析柱和方法模块使用可进行各种层析技术的操作。通过软件的控制，AKTA蛋白纯化***能快速的完成蛋白质的纯化工作。
本发明使用AKTA Avant 150，全自动化的完成抗体的三步层析，所述三部层析依次包括亲和层析、凝胶过滤层析和用于对抗体精纯处理的层析。本发明所述对抗体精纯处理是指抗体在经过亲和层析和凝胶过滤层析后使用层析法对抗体进行再次纯化，以进一步提高抗体的纯度。需要说明的是本发明不限制三部层析中最后一步层析的方式，只要可以达到对抗体更进一步的纯化的效果即可。
亲和层析是根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的一种技术，亲和层析是目前最为有效的蛋白质分离纯化方法。亲和层析根据目标蛋白的专一性而设计，如酶与底物、抗原与抗体等。亲和层析具有高纯度、高收率，以及能保持生物大分子的天然活性等优点，具有良好的选择性。抗体片段分离用的亲和层析介质，主要是一些能与免疫球蛋白发生相互作用的蛋白质配基。
凝胶过滤层析又称体积排阻层析(size exclusion chromatography，SEC)，利用待分离蛋白之间分子量的差异对目标蛋白进行分离，在凝胶过滤层析操作中，小分子量的蛋白能进入介质的一些小通道，从而延长了停留时间。分子量越小的蛋白，能进入越多的内部通道，在介质中停留时间越长，这样就使得不同蛋白得以依据分子量大小而分离。GFC分离机理明确，适用性广，将其应用于亲和层析分离后，抗体片段可以进一步精制。
本发明提供的抗体的纯化方法，组合层析的过程中无需人工参与，仪器可以过夜运行，充分利用晚上时间，设备利用率高。本发明处理的样品通量高，大大减少了人工成本投入；操作简单，只需要在编辑好的程序中输入样品名和进样口，就可以完成程序操作，不易出现由于人为操作原因而产生的错误；并且整个层析过程中，样品始终是停留在仪器管路或者柱子中，这样就减少了样品中间处理过程中的损失。本发明全自动化三步层析纯化后抗体，纯度比一步Protein A纯度高，杂质含量少。本发明全自动化三步层析纯化抗体，比手动三步层析处理相同数量的样品减少约一半的时间，大大提高抗体药物的前期研发小样的纯化速度。本发明全自动三步层析纯化抗体样品，完全是基于一台AKTA avant建立的，不需要额外增加泵和紫外检测器等纯化配件或者设备。
在一些可选的实施方式中，用于步骤(a)的亲和层析柱中的填料包括来源于金黄色葡萄球菌的Protein A、来源于链球菌的Protein G或来源于大消化链球菌的Protein L中的至少一种；优选为Protein A。
Protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，能够选择性地与免疫球蛋白的Fc结构域结合。Protein A配体可以偶联到不同的基质上，例如交联琼脂糖、表面修饰的多孔玻璃、聚苯乙烯、陶瓷型外壳或者其它有机高分子材料形成不同的protein A填料，具有较高的载量、选择性和稳定性。
在一些可选的实施方式中，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式包括：离子交换层析、亲和层析、羟基磷灰石层析或疏水相互作用层析，优选使用离子交换层析，更优选为阳离子交换层析；或者优选疏水相互作用层析。
离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC)：是利用离子交换介质与不同蛋白质分子间的作用力不同来进行分离的，其主要依赖的是蛋白质分子表面静电荷的差异。蛋白都有特定的等电点(pI)，当环境高于其等电点时，蛋白质表面呈现的净电荷为负，当环境低于其等电点时，蛋白质表面呈现的净电荷为正根据各蛋白的等电点，通过调节流动相来调节蛋白所带的电荷，其中带责(正)电荷的蛋白被阴(阳)离子交换介质所吸附，未结合的蛋白将直接穿出，再通过改变流动相或盐浓度来洗脱吸附的蛋白，从而达到分离的目的。
疏水相互作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)依赖于生物大分子与疏水配基之间的疏水相互作用的差异来实现对蛋白的分离纯化高盐情况下，蛋白表面的疏水基团被暴露，通过与配基的疏水相互作用结合而被吸附；当盐浓度下降，蛋白表面的水化层增加，使得疏水相互作用减弱，从而实现蛋白解吸多数情况下抗体的疏水性要强于大部分杂质组分，因此HIC可作为精制步骤用于抗体纯化。
羟基磷灰石层析(hydroxyapatite chromatography，HAC)是以羟基磷灰石为介质的层析分离技术。羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)与其他层析介质的区别在于羟基磷灰石既是功能配基，又是层析基质羟基磷灰石上的两个作用位点，其中带负电的PO4 3-的位点可以与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换的特性，可采用盐浓度梯度洗脱，而带正电Ca2+位点可与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合。
在一些可选的实施方式中，所述纯化方法还包括将AKTA Avant 150的样品泵的上样入口(SampL inlet)设置为变量，就可以依次三步纯化多个抗体样品，最多可纯化七个抗体样品，节约了大量的实验时间。
在一些可选的实施方式中，使用AKTA Avant 150进行三部层析时，粗蛋白与各缓冲液的流路包括如下过程：
(x1)亲和上样：抗体粗品经Sample pump从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Fraction collection，进行收集流传液；
(x2)亲和Wash杂质：Buffer A1经System pump A从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，流出后至废弃液中；
(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：Buffer B1经System pump B从Injection valve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，峰收集后不经排出重新流回Injection valve并注入凝胶过滤层析柱；
(x4)层析上样：Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，流出后收集滤液；
(x5)层析洗脱：将Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，同时Buffer B2经System pump B从Injection valve注入管路后流经层析柱进行梯度洗脱，以洗脱与层析柱结合的抗体，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve后流至Fraction Collection，流出后收集滤液得到纯化后的抗体。
在一些可选的实施方式中，使用AKTA Avant 150进行三部层析时，要依次纯化多个抗体样品，因此在纯化每个抗体样品之后还需要对层析柱进行再生，层析柱进行再生时粗蛋白与各缓冲液的流路包括如下过程：
(x6)步骤(a)中使用的亲和层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉杂质进行再生处理，滤液依次流经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA1经System pump A从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉柱子中残留的碱溶液，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste。
(X7)步骤(b)和步骤(c)中使用的层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA2，经System pump A从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve流至Waste。
其中，上述System pump A和System pump B为一种高端精度泵，用于在纯化运行中提供缓冲液。Sample pump为一种高端精度泵，用于在纯化运行中提供样品或缓冲液。Injection valve为将样品导向柱上的阀。UV monitor为监视器，同时测量190至700纳米范围内三个波长UV/Vis吸光率。Conductivity monitor为连续测量缓冲液和样品溶液的电导度的监视器。pH valve为允许在流路中包括pH电极或在运行时绕开该电极的阀。pH电极可在安装到pH Valve中时进行校准，它还允许在流路中包括限流器或在运行时绕开该限流器。Fraction collection为可进行最多175种分馏的圆形馏分收集器。
在一些可选的实施方式中，三部层析的最后一步使用阳离子交换层析，因此经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至阳离子交换层析柱；在该纯化***中，流路使用的缓冲液优选包括如下：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4，例如可以为但不限于为7.2、7.3或7.4。
BufferA2：pH为5.0～5.5，例如可以为但不限于为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5；含有浓度为20～50mM的NaAC溶液，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
BufferB1：pH为3.2～3.4，例如可以为但不限于为3.2、3.3或3.4；含有浓度为20～50mM的NaAC溶液，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
BufferB2：pH为5.0～5.5，例如可以为但不限于为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5；含有浓度为20～50mM的NaAC，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM；和浓度为1～2M的NaCl溶液，例如可以为但不限于为1M、1.2M、1.4M、1.6M、1.8M或2M。
Buffer B3:0.1～0.2M NaOH溶液，例如可以为但不限于为0.1M、0.12M、0.15M、0.18M或0.2M。
在另一些可选的实施方式中，三部层析的最后一步使用疏水相互作用层析，在该纯化***中，流路使用的缓冲液优选包括如下：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4，例如可以为但不限于为7.2、7.3或7.4。
BufferA2：pH为7.5～8.0，例如可以为但不限于为7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0；含有浓度为20～50mM的PB，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM；和1.5M的(NH)2SO4,溶液。
BufferB1：pH为3.2～3.4，例如可以为但不限于为3.2、3.3或3.4；含有浓度为20～50mM的NaAC溶液，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
BufferB2：pH7.5～8.0，例如可以为但不限于为7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0；含有浓度为20～50mM的PB，例如可以为但不限于为20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
BufferB3：含有浓度为0.1M的NaOH溶液。
本发明还提供了一种使用上述抗体的纯化方法纯化得到的抗体，所述抗体和上述抗体的制备方法基于相同的发明构思，因此具有上述抗体的纯化方法的所有有益效果，在此不再赘述。
本发明还提供了一种上述抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用，由于上述抗体纯化方法可以纯化出纯度更高的抗体，同时在纯化的过程中降低里引入其他杂质的可能，并且纯化时间更短，因此将上述抗体的纯化方法应用在制备抗体药物中，可以更好的提高抗体药物的质量和生产效率。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果：
本实施例提供了一种基于AKTA avant的三步层析(Protein A-BEX-CEX)自动化纯化单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
1.1将设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将BEX层析柱(50mL Desalting，GEHealthcare)替换掉Loop环上，亲和层析柱(5mL博格隆，AT ProteinA Dimond)连在柱位Position 3，离子柱(5mL Capto S GE Healthcare)连接在Position 1.
1.2自动化三步层析的流路
(x1)亲和上样：抗体粗品经Sample pump从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Fraction collection，进行收集流传液，参考图1所示。
(x2)亲和Wash杂质：Buffer A1经System pump A从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，流出后至废弃液中，参考图2所示。
(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：Buffer B1经System pump B从Injection valve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，峰收集后不经排出重新流回Injection valve并注入凝胶过滤层析柱，参考图3所示。
(x4)层析上样：Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，流出后收集滤液，参考图4所示。
(x5)层析洗脱：将Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，同时Buffer B2经System pump B从Injection valve注入管路后流经层析柱进行梯度洗脱，以洗脱与层析柱结合的抗体，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve后流至Fraction Collection，流出后收集滤液得到纯化后的抗体，参考图5所示。
(x6)步骤(a)中使用的亲和层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉杂质进行再生处理，滤液依次流经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA1经System pump A从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉柱子中残留的碱溶液，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，参考图6和图7所示。
(X7)步骤(b)和步骤(c)中使用的层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA2，经System pump A从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve流至Waste，参考图8和图9所示。
其中，图1-图9中加粗的线条表示样品和/或缓冲液流过的路径。
其中，BufferA1：pH为7.2的PBS；BufferA2：pH为5.0，含有浓度为20mM的NaAC溶液；BufferB1：pH为3.4，含有浓度为20mM的NaAC溶液；BufferB2：pH为5.0，含有浓度为20mM的NaAC和浓度为1M的NaCl溶液；Buffer B3:0.1～0.2M NaOH溶液。
3程序方法的编辑
在AKTAAvant150的Methodeditor中Textinstruction进行编辑，就得到了如图10所示的主程序Phase。
基于上述程序只需要在Scouting中输入样品名称(SampleID)和样品入口(Sampleinlet)，对应的管路充满缓冲溶液。
其中，A1&Buffer管路对应的缓冲液为BufferA1；B1管路对应的缓冲液为BufferB1；B2管路对应的缓冲液为0.1M NaOH；A2管路对应的缓冲液为BufferA2；B3管路对应的缓冲液为BufferB2。
收集器中放入50ml收集管(收集流传)，15ml收集管(收集样品)，S1～S7是对应的抗体发酵上清样品，就可以自动化完成7个抗体由亲和，脱盐换液到离子交换的三步层析过程。
效果例1
7个单克隆抗体三步全自动化纯化制备
50mlCHO细胞发酵发酵(表达量约0.5mg/ml)将样品用0.22um的针头滤器过滤后备用，按照发明方法说明，将所有的缓冲溶液充满相应的管路，S1～S7预先充满PBS后，对应***过滤后的发酵上清。
按照实施例1将柱子和相应的管路连接，按照实施例1程序方法在Scouting中输入样品名称(SampleID)和样品入口(Sampleinlet)，在Systemcontrol中运行程序。
其中一个样品对应的色谱图如图11所示；鉴定全自动化三步层析后洗脱下来每管的组份，合并纯度较好的样品，SEC(TSK G3000)结果如图12-A所示和图12-B所示，由图12-A和图12-B可以看出三步层析的纯度比一步Protein A要高。
HCP去除的对比如图13所示，A-(ProteinA+BEX+CEX)表示全自动化三步层析，M-(ProteinA+BEX+CEX)表示人工手动的三步层析，从图可以看出，全自动化的三步层析比一步ProteinA亲和层析可以显著性去除HCP，并且和手动的三步层析去杂效果相当。
耗时对比结果如图14所示，单步层析的总时间是人工和机器耗时不间断的情况下，总时间>32h；全自动化三步层析只需人工准备样品和设定程序，利用机器过夜运行，总耗时比单步层析减少约一半的时间，人工实际参与工作时间约4h，大大减少了人工成本。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种抗体的纯化方法，其特征在于，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:
(a)亲和层析以捕获抗体；
(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；
(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；
其中，AKTA Avant 150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position 1。
2.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，用于步骤(a)的亲和层析柱中的填料包括Protein A、Protein G或Protein L中的至少一种；优选为Protein A。
3.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式包括：离子交换层析、亲和层析、羟基磷灰石层析或疏水相互作用层析；
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为离子交换层析，优选为阳离子交换层析；
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为疏水相互作用层析。
4.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括将AKTAAvant 150的样品泵的上样入口设置为变量，以用于依次纯化多个抗体样品。
5.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述组合层析的流路包括：
(x1)亲和上样：抗体粗品经Sample pump从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve流至Fraction collection，进行收集流传液；
(x2)亲和Wash杂质：Buffer A1经System pump A从Injection valve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，流出后至废弃液中；
(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：Buffer B1经System pump B从Injectionvalve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，峰收集后不经排出重新流回Injection valve并注入凝胶过滤层析柱；
(x4)层析上样：Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Outlet valve，流出后收集滤液；
(x5)层析洗脱：将Buffer A2经System pump A从Injection valve注入管路，同时Buffer B2经System pump B从Injection valve注入管路后流经层析柱进行梯度洗脱，以洗脱与层析柱结合的抗体，然后滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve后流至Fraction Collection，流出后收集滤液得到纯化后的抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述组合层析的流路还包括用于层析柱再生的步骤：
(x6)步骤(a)中使用的亲和层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injectionvalve注入管路，经亲和层析柱以洗掉杂质进行再生处理，滤液依次流经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA1经System pump A从Injection valve注入管路，经亲和层析柱以洗掉柱子中残留的碱溶液，滤液依次经UVmonitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste；
(X7)步骤(b)和步骤(c)中使用的层析柱再生：将Buffer B3经System pump B从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pH valve流至Waste，然后将BufferA2，经System pump A从Injection valve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UV monitor、Conductivity monitor和pHvalve流至Waste。
7.根据权利要求6所述的抗体的纯化方法，其特征在于，经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至阳离子交换层析柱；
流路使用的缓冲液包括：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4；
BufferA2：pH为5.0～5.5，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；
BufferB1：pH为3.2～3.4，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；
BufferB2：pH为5.0～5.5，含有浓度为20～50mM的NaAC和浓度为1～2M的NaCl溶液；
Buffer B3：0.1～0.2M NaOH溶液。
8.根据权利要求6所述的抗体的纯化方法，其特征在于，经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至疏水相互作用层析柱；
流路使用的缓冲液包括：
BufferA1：PBS，pH7.2～7.4；
BufferA2：pH为7.5～8.0，含有浓度为20～50mM的PB和1.5M的(NH)2SO4，溶液；
BufferB1：pH为3.2～3.4，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；
BufferB2：pH7.5～8.0，含有浓度为20～50mM的PB；
BufferB3：含有浓度为0.1M的NaOH溶液。
9.一种使用权利要求1-8中任一项所述的抗体的纯化方法纯化得到的抗体。
10.权利要求1-8中任一项所述的抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用。
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