JP6006118B2 - Glp−1アナログ及び誘導体 - Google Patents
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Description
「配列表」と題する配列表は582バイトであり、2010年11月28日に作成されたもので、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いられる「GLP-1アナログ」という用語又は「GLP-1のアナログ」は、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))のバリアントであるペプチド又は化合物をいい、その配列は配列番号1として配列表に包含される。配列番号1の配列を持つペプチドはまた「野生型」GLP-1として示され得る。
# 1: GLP-1(7-37):
# 2: GLP-1(7-37)_アナログ:
# 行列: EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ: 10.0
# 伸長__ペナルティ: 0.5
# 長さ: 32
# 同一性: 26/32 (81.2%)
# 類似性: 28/32 (87.5%)
# ギャップ: 1/32 ( 3.1%)
# スコア: 132.0
1: 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG- 31
| . | ||||| | |||||| || ||||| | . . | | : | : |
2: 1 HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEHLVQGKGE 32
本明細書でGLP-1ペプチド又はアナログの文脈において用いられる「誘導体」という用語は、化学的に改変されたGLP-1ペプチド又はアナログを意味し、この中で1つ又は複数の置換基がペプチドに共有結合で付着されている。置換基はまた側鎖とも呼ばれ得る。
化学式1: CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-(CH2)x -CO-*
化学式3: HN4C-(CH2)x-CO-*
化学式4: HOOC-C6H4-O-(CH2)yCO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含む、又は持続時間延長性部分からなる。
本発明のアナログ、誘導体及び中間生成物は、薬学的に許容される塩、アミド又はエステルの形であり得る。
本発明はそのうえ2つの中間生成物(化学式67及び化学式68)に関し、これらにおいてPGは保護基を表す。PG基の限定されない例は-OH、又は活性化エステルとして官能化されている基、例えばOPfp、OPnp及びOSucであるが、これらに限定されるものではない。
第一の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は良好な効力を持つ。さらに又は或いは、第二の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は持続時間が延長された薬物動態学的プロファイルを持つ。さらに又は或いは、第三の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は胃腸の酵素による分解に対して安定である。さらに又は或いは、第四の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は比較的低いアルブミン結合アフィニティーを持つ。さらに又は或いは、第五の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
第一の態様によると、アナログ及び誘導体は生物学的に活性がある、又は効力がある。
第二の態様によると、本発明のアナログ及び/又は誘導体は持続時間が延長されている。
第二の態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも4時間、好ましくは少なくとも5時間、一層より好ましくは少なくとも6時間、又は最も好ましくは少なくとも7時間である。
第二の態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のミニブタにおけるin vivoの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも8時間、好ましくは少なくとも12時間、より好ましくは少なくとも16時間、なおより好ましくは少なくとも24時間、一層より好ましくは少なくとも36時間、又は最も好ましくは少なくとも48時間である。
第三の態様によると、本発明のアナログ及び/又は誘導体は1つ又は複数の胃腸の酵素による分解に対して安定である、又は安定化されている。
第四の態様によると、本発明の誘導体はヒト血清アルブミン、HSAへの比較的低い結合アフィニティーを持つ。
第五の態様によると、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
GLP-1(7-37)及びそのアナログのようなペプチドの生産は当該技術分野で周知である。
本発明のアナログ若しくは誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド、アルキル若しくはエステル及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で知られているように調製され得る。
モン)アゴニスト、MCH(メラニン細胞凝集ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニン及びノルアドレナリン再吸収阻害剤、混合セロトニン及びノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2又は3(脱共役タンパク質2又は3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト(GIPアナログ)、ガストリン及びガストリンアナログである。
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明のアナログ及び本発明の誘導体に関する。
(i)高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠性糖尿病などの全ての型の糖尿病の予防及び/若しくは治療、並びに/若しくはHbA1Cの低減;
(ii)2型糖尿病の進行などの糖尿病性疾患進行を遅延させること若しくは予防すること、耐糖能障害(IGT)のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること、及び/若しくは非インスリン要求性2型糖尿病のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること;
(iii)β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加などのβ細胞の機能を改善すること、並びに/若しくはβ細胞のグルコース感受性を回復させること;
(iv)認知障害の予防及び/若しくは治療;
(v)例として食事摂取量の減少、体重低減、食欲抑制、飽満誘導による肥満などの摂食障害の予防及び/若しくは治療;過度の摂食障害、神経性過食症、及び/若しくは統合失調症治療薬若しくはステロイドの投与により誘導される肥満を治療若しくは予防すること;胃運動の低減;並びに/若しくは胃排出を遅延させること;
(vi)末梢神経障害を包含する神経障害、腎症若しくは網膜症などの糖尿病合併症の予防及び/若しくは治療;
(vii)脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害などの脂質パラメーターを改善すること;
(iix) X症候群、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、脳卒中、大脳虚血、左心室性肥大などの早期心疾患若しくは早期心血管疾患、冠動脈疾患、本態性高血圧、急性高血圧緊急症、心筋症、心機能不全、運動耐性、慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、アテローム性動脈硬化症、軽度慢性心不全、狭心症、心臓バイパス再狭窄、間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害及び/若しくは収縮不全などの心血管疾患の予防及び/若しくは治療;
(ix)炎症性腸症候群、小腸症候群若しくはクローン病、消化不良、及び/若しくは胃潰瘍などの胃腸疾患の予防及び/若しくは治療;
(x)重篤疾患患者、重篤疾患多発性腎症(CIPNP)患者及び/若しくは潜在的なCIPNP患者の治療などの重篤疾患の予防及び/若しくは治療;重篤疾患若しくはCIPNP発展の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療及び/若しくは治癒;並びに/若しくは入院中に患者が菌血症、敗血症、及び/若しくは敗血症性ショックを患うことの予防若しくは可能性の低減;並びに/又は
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防及び/若しくは治療。
以下は本発明の特定の実施形態である。
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が筆記及び視認により同定される、実施形態1〜76のいずれか1つのアナログ。
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムの使用により同定される、実施形態1〜77のいずれか1つのアナログ。
化学式1: CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式3: HN4C-(CH2)x-CO-*
化学式4: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中xは6〜18、好ましくは6〜16の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数)から選択される、実施形態92の誘導体。
化学式1a:
化学式2a:
化学式3a:
化学式4a:
i)Nラジカルが第一の*-NR1R2基により表され、R1及びR2は独立して水素、炭素又は硫黄を示すことが可能で、任意で置換されており、及び
ii)COラジカルが第一の*-CO基により表され、
好ましくは、第一の*-NR1R2基は第二の*-CO基とアミド結合を形成する能力があり、第一の*-CO基は第二の*-NR1R2基とアミド結合を形成する能力があり、第二の*-NR1R2基及び第二の*-CO基はそれぞれ第一の*-NR1R2基及び第一の*-CO基として規定され、i)アナログ、ii)持続時間延長性部分、及び/又はiii)別のリンカーの構造の一部を独立して形成する、実施形態110〜112のいずれか1つの誘導体。
化学式5: *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学式6: *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学式7: *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学式8: *-NH-C6H8-CO-*
化学式9: *-NC5H8-CO-*
化学式10: *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数、化学式6及び化学式7はGluのジラジカル)からなる群より選択される少なくとも1つのリンカーを含む、実施形態86〜113のいずれか1つの誘導体。
化学式5a:
化学式6a:
化学式8a:
化学式8b:
化学式9a:
化学式10a:
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式21:
化学式46:
化学式47:
化学式32:
化学式35:
化学式38:
化学式56:
化学式60:
化学式62:
化学式65: から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
化学式21:
化学式46:
; 化学式38:
化学式60:
化学式62:
化学式65:
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式21:
化学式47:
化学式32:
化学式38:
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式32:
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式21: から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
a)少なくとも0.5、好ましくは少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも10、一層より好ましくは少なくとも20、若しくは最も好ましくは少なくとも30;
b)少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、一層より好ましくは少なくとも70、若しくは最も好ましくは少なくとも80;
c)少なくとも90、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、なおより好ましくは少なくとも300、一層より好ましくは少なくとも400、若しくは最も好ましくは少なくとも500;
d)少なくとも600、好ましくは少なくとも700、より好ましくは少なくとも800、一層より好ましくは少なくとも1000、若しくは最も好ましくは少なくとも1300;
e)セマグルチドの比率の少なくとも20%、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも50%、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも75%、一層より好ましくはセマグルチドの比率と少なくとも等しい、若しくは最も好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも2倍である;又は
f)リラグルチドの比率と少なくとも等しい、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも5倍、若しくは最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも10倍
である、実施形態85〜176のいずれか1つの誘導体。
a)600.00nMより低い、好ましくは500.00nMより低い、より好ましくは200.00nMより低い、一層より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い;又は
b)20.00nMより低い、好ましくは10.00nMより低い、より好ましくは5.00nMより低い、一層より好ましくは2.00nMより低い、若しくは最も好ましくは1.00nMより低い、実施形態1〜177のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
a)1000.00nM以下、好ましくは900.00nMより低い、より好ましくは800nMより低い、一層より好ましくは700nMより低い、若しくは最も好ましくは600nMより低い;又は
b)400.00nMより低い、好ましくは300.00nMより低い、より好ましくは200.00nMより低い、一層より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い、実施形態85〜178のいずれか1つの誘導体。
(i)ED50(体重(BW))がアナログ又は誘導体の皮下投与後24時間のBWのデルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、及び/又は
(ii)ED50(血糖(BG))がアナログ又は誘導体の皮下投与後8時間のBGのAUC(曲線下面積)デルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、
実施形態197〜203のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
a)少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、一層より好ましくは少なくとも48時間、若しくは最も好ましくは少なくとも60時間;又は
b)セマグルチドの半減期の少なくとも0.2倍、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.4倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.6倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.8倍、若しくは最も好ましくはセマグルチドの半減期と少なくとも同じ
である、実施形態206〜207のいずれか1つの誘導体。
i)1以上、好ましくは5以上、一層より好ましくは10以上、若しくは最も好ましくは20以上、
ii)25以下、好ましくは20より低い、より好ましくは10より低い、一層より好ましくは5.0より低い、若しくは最も好ましくは1.0より低い、及び/又は
iii)例として1から5の間、1から10の間、1から20の間、1から25の間、5から10の間、5から20の間、5から25の間、10から20の間、若しくは20から25の間など、i)及びii)の限定により規定される範囲内
である、実施形態85〜249のいずれか1つの誘導体。
本実施例部は略語の表で始まり、本発明のペプチド及び誘導体を合成して性質決定する一般的な方法を包含する節が続く。次いで特定のGLP-1ペプチド誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後にこれらのペプチド及び誘導体の活性及び性質に関するいくつかの実施例が包含される(薬理学的方法という見出しの節)。
次の略語(アルファベット順)が以下で用いられる。
Aib: アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API: 医薬品有効成分
AUC: 曲線下面積
BG: 血糖
BHK ベビーハムスター腎臓
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
Bom: ベンジルオキシメチル
BW: 体重
Bzl: ベンジル
Clt: 2-クロロトリチル
コリジン: 2,4,6-トリメチルピリジン
cpm: 1分当たりのカウント数
DCM: ジクロロメタン
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: 4-ジメチルアミノピリジン
DMEM: ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
EGTA: エチレングリコール四酢酸
FCS: ウシ胎児血清
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU: (O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU: (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES: 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール又はヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
HSA: ヒト血清アルブミン
IBMX: 3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp: イミダゾプロピオン酸(des-アミノヒスチジン、DesHとも呼ばれる)
i.v. 静脈内
ivDde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT: 静脈内耐糖能試験
LCMS: 液体クロマトグラフィー質量分析
LYD: ランドレースヨークシャーデュロック
MALDI-MS: MALDI-TOF MSを参照
MALDI-TOF MS: マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析
MeOH: メタノール
Mmt: 4-メトキシトリチル
Mtt: 4-メチルトリチル
NMP: N-メチルピロリドン
OBz: ベンゾイルエステル
OEG: 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp: ペンタフルオロフェノキシ
OPnp: パラ-ニトロフェノキシ
OSu: O-サクシニミジルエステル(ヒドロキシサクシニミドエステル)
OSuc: 2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル
OtBu: tertブチルエステル
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS: リン酸緩衝生理食塩水
PD: 薬力学
Pen/Strep: ペニシリン/ストレプトマイシン
PK: 薬物動態
RP: 逆相
RP-HPLC: 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT: 室温
Rt: 保持時間
s.c.: 皮下
SD: 標準偏差
SEC-HPLC: サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM: 平均値の標準誤差
SPA: シンチレーション近接アッセイ
SPPS: 固相ペプチド合成
tBu: tert-ブチル
TFA: トリフルオロ酢酸
TIS: トリイソプロピルシラン
TLC: 薄層クロマトグラフィー
Tos: トシレート(又はパラ-トルエンスルホニル)
Tris: トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン又は2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt: トリフェニルメチル又はトリチル
Trx: トラネキサム酸
UPLC: 超高速液体クロマトグラフィー
A.一般的方法
この節は、樹脂に結合したペプチドを合成する方法(SPPS法。アミノ酸の脱保護の方法、樹脂からペプチドを切断する方法、及びその精製方法を包含する)、同様に結果として生じるペプチドを検出して性質決定する方法(LCMS法、MALDI法、及びUPLC法)に関する。ペプチドの合成は、酸性条件下で切断できる基とのジペプチドアミド結合上で保護されるジペプチドの使用により、場合によっては改善可能であって、この酸性条件下で切断できる基は2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメトキシベンジルなどであるが、これらに限定されない。セリン又はスレオニンがペプチド中に存在する場合、擬プロリンジペプチドが用いられ得る(例としてNovabiochemから入手可能、W.R.Sampson(1999)、J.Pep.Sci.5、403ページも参照)。用いられた保護アミノ酸誘導体は標準的なFmoc-アミノ酸(例としてAnaspec、IRIS又はNovabiochemから供給されたもの)であった。N末端アミノ酸はアルファアミノ基においてBoc保護された(例としてN末端にHisを有するペプチドについてBoc-His(Boc)-OH、又はBoc-His(Trt)-OH)。配列中のリジンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部分及びスペーサーの付着経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde又はBocのいずれかで保護された。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかによりペプチドに付着できる。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができ、この構成ブロックはFmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル又は4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されない。
SPPS法A
SPPS法Aは、Fmoc化学を用いて、Applied Biosystems 433ペプチド合成装置(ABI433A合成装置とも示される)上で、0.25mmol又は1.0mmol規模で、NMP中でのHBTU又はHATU仲介性カップリング及びFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを利用する製造業者のFastMoc UVプロトコールを用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。
SPPS法Bは、Fmoc化学を用いた、マイクロ波に基づくLibertyペプチド合成装置(CEM Corp.、North Carolina)上での保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は5%ピペリジンのNMP溶液を使用して、70℃又は75℃以下であった。カップリング化学はDIC/HOAtのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(0.75MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間及び温度は一般に5分間、70℃又は75℃以下であった。より規模の大きい反応については、より長いカップリング時間、例えば10分間が用いられた。ヒスチジンアミノ酸は50℃で二重にカップリングされ、又は前のアミノ酸が立体障害を持つ場合(例としてAib)は四重にカップリングされた。アルギニンアミノ酸は室温で25分間カップリングされ、次いで70℃又は75℃で5分間加熱された。いくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として75℃で5分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt及びDIC)が添加されて、混合物が再度加熱される(例として75℃で5分間)ことを意味する。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を原液の(希釈されていない)ヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間懸濁し、その後DCM及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のLibertyペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、任意で手作業のカップリングを包含して、行われた。
SPPS法Dは、手作業のFmoc化学を用いた、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。これはペプチド骨格へのリンカー及び側鎖の付着に典型的に用いられた。カップリング化学は4〜10倍モル過剰の、DIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。カップリング条件は室温で1〜6時間であった。Fmoc-脱保護は20〜25%ピペリジンのNMP溶液を使用して行われ(3×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Dde-脱保護又はivDde-脱保護は2%ヒドラジンのNMP溶液を使用して行われ(2×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Mtt-脱保護又はMmt-脱保護は2% TFA及び2〜3% TISのDCM溶液を使用して行われ(5×20ml、各10分間)、その後、DCM洗浄(2×20ml)、10%メタノール及び5% DIPEAのDCM溶液での洗浄(2×20ml)及びNMP洗浄(4×20ml)が行われるか、又は原液のヘキサフルオロイソプロパノールでの処理(5×20ml、各々10分間)が行われ、その後、上の洗浄が行われた。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかにより、ペプチドに付着できる(下に記載される経路を参照)。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができる(一般的方法を参照)。
SPPS法Eは、Fmoc化学による、Protein Technologies社(Tucson、AZ85714 U.S.A.)のPrelude Solid Peptide Synthesiser上でのペプチド合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は25%ピペリジンのNMP溶液を使用して、2×10分間であった。カップリング化学はDIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(3MのNMP溶液)及びコリジン(3MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は一般に60分間であった。アルギニン及びヒスチジンを包含するがこれらに限定されないいくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として60分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt、DIC及びコリジン)が添加されて、混合物が再度反応される(例として60分間)ことを意味する。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)中に3×10分間懸濁し、その後DCM、20%ピペリジン及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のPreludeペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、行われた。
合成後に樹脂はDCMで洗浄され、ペプチドは2〜3時間のTFA/TIS/水(95/2.5/2.5又は92.5/5/2.5)での処理により樹脂から切断され、その後、ジエチルエーテルを使用して沈殿された。ペプチドは適切な溶媒(例として30%酢酸など)中に溶解され、C18、5μMカラムに対してアセトニトリル/水/TFAを用いた標準的なRP-HPLCにより精製された。画分はUPLC法、MALDI法及びLCMS法の組み合わせにより分析され、適当な画分がプールされて凍結乾燥された。
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析装置はAgilent 1200シリーズHPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。タンパク質スペクトルの逆重畳はAgilent社のタンパク質確認ソフトウェアを使用して計算された。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
グラジエント:25%〜95%アセトニトリルの15分間
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析装置はPerkin Elmer Series 200 HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.05%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.05%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm id 5μm
グラジエント:5%〜90%アセトニトリルの7.5分間、1.5ml/分
Waters Micromass ZQ質量分析装置はWaters Alliance HT HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm id 5μm
グラジエント:10%〜90% Bの7.5分間、1.0ml/分
LCMS4はWaters Acquity UPLCシステム及びMicromass社のLCT Premier XE質量分析装置からなる構成上で行われた。UPLCポンプは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.1%ギ酸水溶液
B:0.1%ギ酸のアセトニトリル溶液
分析は室温で適当な量のサンプル(好ましくは2〜10μl)をカラム上に注入することにより行われ、A及びBのグラジエントを使用して溶出された。UPLC条件、検出器の設定及び質量分析装置の設定は以下であった。
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
グラジエント:5%〜95%アセトニトリルの4.0分間(或いは8.0分間)のリニアグラジエント、0.4ml/分
検出:214nm(TUV(可変同調UV検出器)からのアナログ出力)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000amu(或いは500〜2000amu)、ステップ0.1amu
方法 05 B5 1
UPLC(方法05_B5_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
60% A、40% Bから30% A、70% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法05_B7_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
80% A、20% Bから40% A、60% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法04_A2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
UPLC(方法04_A3_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
UPLC(方法04_A4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
UPLC(方法08_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
UPLC(方法08_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
UPLC(方法05 B10 1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
方法 09 B4 1
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから5% A、95% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法09_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法10_B14_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、50℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
70% A、30% Bから40% A、60% Bの12分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法05_B8_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
50% A、50% Bから20% A、80% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法07_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから5% A、95% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法04_A6_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:10mM TRIS、15mM硫酸アンモニウム、80% H2O、20% CH3CN、pH7.3
B:80% CH3CN、20% H2O
95% A、5% Bから10% A、90% Bの16分間、流速0.35ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法05_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
UPLC(方法02_B4_4):RP分析はWaters 2487デュアルバンド検出器を取り付けたAlliance Waters 2965システムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はSymmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムを用いて、42℃で収集された。5〜95%アセトニトリル、90〜0%水、及び5%トリフルオロ酢酸(1.0%)水溶液の15分間のリニアグラジエントを使用して、流速1.0ml/分で溶出された。
HPLC(方法02_B5_1):RP分析はWaters 2487デュアルバンド検出器を取り付けたAlliance Waters 2695システムを用いて行われた。UV検出値はSymmetry C18、3.5um、3.0mm×100mmカラムを用いて収集された。10〜95%アセトニトリル、95〜0%水、及び5%トリフルオロ酢酸(1.0%)水溶液の8分間のリニアグラジエントを使用して、流速1.0ml/分で溶出された。
分子量はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を用いて決定され、Microflex又はAutoflex(Bruker)上に記録された。アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスが用いられた。
プロトンNMRスペクトルはBrucker Avance DPX 300(300 MHz)を用いて、テトラメチルシランを内部標準として使用して、記録された。化学シフト(σ)はppmで与えられ、***パターンは、sが一重線、dが二重線、ddが二重の二重線、dtが二重の三重線、tが三重線、ttが三重の三重線、qが四重線、quintが五重線、sextが六重線、mが多重線、及びbr=ブロードで示される。
1. 脂肪二酸のモノエステルの合成
C12、C14、C16及びC18の二酸をBoc無水物、DMAP及びt-ブタノールと共にトルエン中で一晩還流すると、t-ブチルモノエステルを優位に与える。集成後に取得されるのは一酸、二酸及びジエステルの混合物である。精製は洗浄、ショートプラグのシリカろ過及び結晶化により実施される。
化学式13:
収率:45.54g(91%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 8.44 (bs, 1H); 7.43 (s, 1H); 7.41〜7.33 (m, 9H); 7.19〜7.10 (m, 6H); 6.65 (s, 1H); 3.66 (q, J=5.9Hz, 2H); 2.79 (t, J=5.9Hz, 2H)。
収率:32.23g(90%)
全体収率:82%
M.p.:111〜113℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.39 (d, J=1.3, 1H); 7.38〜7.32 (m, 9H); 7.20〜7.12 (m, 6H); 6.61 (s, 1H); 3.00 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.70 (t, J=6.5Hz, 2H); 1.93 (bs, 2H)。
化学式14:
収率:6.59g(79%)
RF(SiO2、クロロホルム/酢酸エチル、98:2):0.60
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 1.76 (s, 6H); 1.65 (s, 6H)。
収率:6.73g(88%)
M.p.:161〜162℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.40
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 12.45 (bs, 1H); 7.66 (t, J=5.1Hz, 1H); 7.57〜7.31 (m, 9H); 7.26 (s, 1H); 7.20〜7.02 (m, 6H); 6.66 (s, 1H); 3.25 (m, 2H); 2.57 (t, J=7.3Hz, 2H); 1.21 (s, 6H)。
化学式15:
収率:36.00g(58%)
M.p.:117〜120℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.93 (dm, J=8.3Hz, 2H); 7.48 (dm, J=8.3Hz, 2H); 3.30 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.81 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.34 (s, 9H)。
収率:16.25g(48%)
M.p.:59〜60℃
RF(SiO2、酢酸エチル):0.60
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.31 (dm, J=8.1Hz, 2H); 7.12 (dm, J=8.1Hz, 2H); 2.64 (t, J=7.6Hz, 2H); 2.38 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.96 (m, 2H); 1.31 (s, 9H)。
化学式16:
収率:15.98g(69%)
1H NMRスペクトル(300MHz, アセトン-d3+D2O, δH): 7.78 (bs, 1H); 7.74 (d, J=0.9Hz, 1H); 7.43 (s, 1H)。
収率:23.92g(98%)
1H NMRスペクトル(300MHz, D2O, δH): 8.72 (s, 1H); 7.60 (s, 1H); 4.33 (s, 2H)。
収率:46.59g(96%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 95:5):0.35
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 9.77 (t, J=5.7Hz, 1H); 7.47〜7.34 (m, 9H); 7.33 (d, J=1.5Hz, 1H); 7.13〜7.03 (m, 6H); 6.80 (d, J=0.8Hz, 1H); 4.25 (d, J=5.7Hz, 2H)。
収率:36.30g(100%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.38 (d, J=1.3, 1H); 7.36〜7.30 (m, 9H); 7.18〜7.10 (m, 6H); 6.69 (m, 1H); 3.77 (s, 2H); 1.80 (bs, 2H)。
収率:9.80g(73%)
M.p.:174〜175℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.35
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 8.45 (t, J=5.8Hz, 1H); 7.53 (s, 1H); 7.40〜7.28 (m, 9H); 7.14〜7.01 (m, 6H); 6.84 (s, 1H); 4.39 (d, J=5.8Hz, 2H); 1.44 (s, 6H)。
化学式17:
収率:68.0g(82%)
M.p.:127〜129℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.40〜7.24 (m, 10H); 7.17〜7.06 (m, 6H); 6.55 (s, 1H); 3.72 (t, J=5.3Hz, 2H); 2.68 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.86 (m, 2H)。
収率:31.2g(80%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.30 (m, 10H); 7.16〜7.09 (m, 6H); 6.58 (s, 1H); 4.24 (t, J=6.3Hz, 2H); 2.96 (s, 3H); 2.67 (m, 2H); 2.10 (m, 2H)。
収率:17.2g(52%)
M.p.:211〜214℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.83 (m, 2H); 7.72 (m, 2H); 7.39〜7.27 (m, 10H); 7.18〜7.07 (m, 6H); 6.60 (d, J=0.9Hz, 1H); 3.72 (t, J=7.4Hz, 2H); 2.60 (t, J=7.5Hz, 2H); 1.99 (m, 2H)。
収率:14.2g(72%)
M.p.:112〜113℃
RF(SiO2、アンモニア/メタノール 9:1で飽和されたクロロホルム):0.30
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.28 (m, 10H); 7.18〜7.09 (m, 6H); 6.53 (d, J=1.3Hz, 1H); 2.74 (t, J=6.9Hz, 2H); 2.59 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.95 (bs, 2H); 1.78 (m, 2H)。
化学式18:
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=482(M+1)
UPLC(方法02_B4_4):Rt=8.07分
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 7.36〜7.44 (9H, m)、7.07〜7.12 (6H, m)、6.62 (1H, s)、3.02〜3.09 (2H, q)、2.38〜2.43 (2H, t)、1.61〜1.69 (2H, m)、1.26 (6H, s)。
2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチルマロンアミド酸の合成
化学式19:
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=223(M+1)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=1.79分
(実施例1)
[Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式20:
HPLC(方法05_B2_1):Rt=9.78分(97%)
HPLC(方法04_A2_1):Rt=13.48分(93%)
LCMS4:(M/4)+1=830、(M/3)+1=1106、正確な質量=3320、計算値=3320
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib 8 ,His 31 ,Gln 34 ]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式21:
HPLC(方法02_B4_4):Rt=9.02分(99%)
HPLC(方法02_B5_1):Rt=13.15分(98%)
LCMS4:(M/4)+1=1010、(M/3)+1=1346、正確な質量=4036、計算値=4036
[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]GLP-1(7-37)イル-Glu38-ペプチドアミド
化学式22:
HPLC(方法05_B2_1):Rt=9.46分(100%)
HPLC(方法04_A3_1):Rt=5.12分(93%)
LCMS4:(M/4)+1=870、(M/3)+1=1160、正確な質量=3479、計算値=3479
Nε12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式23:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.2分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.85分
MALDI-MS:3986
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式24:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法04_A4_1):Rt=3.9分
MALDI-MS:4016.8
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式25:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=7.1分
MALDI-MS:4114
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式26:
HPLC(方法08_B2_1):Rt=12.90分(96%)
HPLC(方法05_B5_1):Rt=6.34分(91%)
LCMS4:(M/4)+1=1006、(M/3)+1=1341、正確な質量=4022、計算値=4023
Nε18-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys18,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式27:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.4分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.5分
LCMS4:4178.0
計算されたMW=4177.7
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}[Gly8, His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式28:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.0分
LCMS4:4008.0
計算されたMW=4008.49
Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]-エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式29:
UPLC(方法04_A4_1):Rt=6.08分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.61分
LCMS4:(1010x4)-4=4036
計算されたMW=4036.5
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][D-Ala8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式30:
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.33分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.80分
LCMS4:(1005.97x4)-4=4019.9
計算されたMW=4022.5
N83H-イミダゾル-4-イル-アセチル,Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(8-37)-ペプチド
化学式31:
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.82分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.95分
LCMS1:(999.26x4)-4=3393.0
計算されたMW=3393.5
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式32:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.8分
UPLC(方法04_A4_1):Rt=4.5分
LCMS4:4038.0
計算されたMW=4008.51
N ε26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib 8 ,His 31 ,Gln 34 ]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式33:
HPLC(方法09_B2_1):Rt=12.48分(91%)
HPLC(方法05_B5_1):Rt=5.67分(91%)
LCMS4:(M/4)+1=1002、(M/3)+1=1337、正確な質量=4008、計算値=4008
N ε27 -{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib 8 ,Arg 26 ,Lys 27 ,His 31 ,Gln 34 )GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式34:
UPLC(方法07_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.2分
MALDI-MS:4062
計算されたMW=4064
Nε26-[2-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式35:
理論的な分子質量の3863.3はMALDIにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1)上の保持時間は8.32分であった。
UPLC(方法04_A3_1)上の保持時間は8.69分であった。
Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式36:
理論的な分子質量の3716.2はMALDIにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1)上の保持時間は8.48分であった。
UPLC(方法04_A3_1)上の保持時間は9.07分であった。
N9-{2-[2-(1H-イミダゾル-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(9-37)ペプチド
化学式37:
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.16分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.76分
LCMS4:Rt=2.23分 m/z=1341(m/3)、1006(m/4)
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式38:
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.9分
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.67分
LCMS4:(1010x4)-4=4036, (1346x3)-3=4036.5
計算された質量=4036
Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式39:
UPLC(方法07_B4_1):Rt=8.2分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.9分
MALDI-MS:4136
計算されたMW=4135
[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式40:
UPLC(方法05_B2_1):Rt=9.50分
UPLC(方法04_A2_1):Rt=13.22分
LCMS4(M/4)+1=866、(M/3)+1=1154、正確な質量=4874
Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式41:
UPLC(方法05_B2_1):Rt=14.15分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.41分
LCMS4(M/5)+1=870、(M/4)+1=1087、正確な質量=4345
N ε36 -[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib 8 ,Glu 30 ,His 31 ,Gln 34 ,Lys 36 ]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Gluアミド
化学式42:
UPLC(方法05_B2_1):Rt=13.32分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.14分
LCMS4(M/5)+1=785、(M/4)+1=981、正確な質量=3920
Nα([Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-リジン
化学式43:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=9.30分
UPLC(方法04_A2_1):Rt=15.55分
LCMS4(M/5)+1=690、(M/4)+1=863、正確な質量=3449
[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式44:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=9.28分
LCMS4(M/5)+1=679、(M/4)+1=849、正確な質量=3449
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル]-[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式45:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=11.76分
LCMS4(M/5)+1=815、(M/4)+1=1018、正確な質量=4071
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式46:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.08分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.01分
LCMS4: Rt=1.85分、m/z:3975、M/4=994、M/5=795
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]- Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式47:
UPLC(方法05_B5_1):Rt=4.95分(92%)
LCMS4:m/z=4011、計算値=4011
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式48:
理論的な分子質量の4655.2はMALDIにより確認された。
UPLC(方法 08_B4_1):Rt 7.72分
UPLC(方法 04_A3_1):Rt 5.70分
Nε26-2,3-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]プロパノイル-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式49:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.12分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=7.12分
LCMS_4: Rt=1.42分、m/z:4727、M/3=1575、M/4=1182
Nε18-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,His26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式50:
LCMS4: Rt=3.62分、m/z:4297.0
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.25分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.68分
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,His31,Gln34,Pro37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式51:
理論的な分子質量の4234はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)により確認された。m/z:4234(1A)
UPLC(方法 07_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法 04_A3_1):Rt=9.2分
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式52:
LCMS4:Rt=1.94分、m/z:3994.5
UPLC(方法 08_B2_1):Rt=12.25分
UPLC(方法 04_A3_1):Rt=8.63分
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式53:
LCMS4Rt:=1.92分、m/z:4797.3、M/4:1199.8、M/3:1599.4
UPLC(方法 09_B4_1):Rt=8.12分
UPLC(方法 05_B8_1):Rt=2.03分
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式54:
LCMS4:Rt=1.99分、m/z:4697.0
UPLC(方法 09_B2_1):Rt=12.20分
UPLC(方法 05_B5_1):Rt=5.31分
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式55:
LCMS4:Rt=1.89分、m/z:4641.2
UPLC(方法 09_B2_1):Rt=11.20分
UPLC(方法 05_B5_1):Rt=4.00分
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式56:
LCMS4Rt=1.97分、m/z:4797.3、M/4:1200.1、M/5:1599.8
UPLC(方法 09_B4_1):Rt=8.24分
UPLC(方法 05_B8_1):Rt=2.88分
Nε26-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイル-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式57:
UPLC(方法 09_B2_1):Rt=8.29分
UPLC(方法 05_B5_1):Rt=6.40分
LCMS4 m/z:3762
N8-メチル, Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式58:
理論的な分子質量の4037はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸)により確認された。m/z:4035(1A)
UPLC(方法 07_B5_1):Rt=5.8分
UPLC(方法 07_B4_1):Rt=8.5分
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式59:
LCMS4:Rt=1.89分、m/z:4121.6
UPLC(方法 09_B2_1):Rt 11.97分
UPLC(方法 05_B8_1):Rt 5.30分
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式60:
UPLC(方法 08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法 05_B8_1):Rt=3.11分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4194
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Ile25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式61:
理論的な分子質量の4106はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸)により確認された。m/z:4105(1A)
UPLC(方法 07_B4_1):Rt 8.5分
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys16,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式62:
UPLC(方法 08_B4_1):Rt 8.06分
LCMS4: (M/5)+1=834、(M/4)+1=1042、正確な質量=4167
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式63:
UPLC(方法 10_B14_1):Rt=6.66分
LCMS4(M/4)+1=927、(M/3)+1=1235、正確な質量=3704
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式64:
UPLC(方法 10_B14_1):Rt=10.13分
LCMS4(M/4)+1=913、(M/3)+1=1226、正確な質量=3675
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式65:
UPLC(方法 08_B4_1):Rt=7.76分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4102
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[ Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式66:
UPLC(方法 08_B4_1):Rt=7.78分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4178
(実施例48)
in vitroの効力
本実施例の目的は、本発明のGLP-1化合物のin vitroでの活性又は効力を試験することである。
ヒトGLP-1受容体を発現する安定的に形質導入された細胞株であるBHK467-12A(tk-ts13)から精製された細胞膜は当該GLP-1アナログ又は誘導体で刺激され、cAMP生産能はPerkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen(商標) cAMP Assay Kitを用いて測定された。AlphaScreen Assayの基本原理は、内因的なcAMPと外因的に追加されたビオチンcAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズにコンジュゲートされた特異的な抗体を用いることにより達成される。
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、5% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び0.5mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
Perkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen cAMP Assay Kit(カタログ番号:6760625M);抗cAMP Acceptor Beads(10U/μl)、ストレプトアビジンDonor Beads(10U/μl)及びビオチン化cAMP(133U/μl)を含有。
hGLP-1/BHK467-12A膜の使用;0.6mg/mlに相当する6μg/ウェル(ウェルあたりの用いられる膜の量は変わり得る)
「膜無し」:AlphaScreen Buffer中のAcceptor Beads(最終15μg/ml)
「6μg/ウェルの膜」:膜+AlphaScreen Buffer中のAcceptorビーズ(最終15μg/ml)
10μlの「膜無し」をcAMP標準物質(1ウェルあたり、2連)並びに陽性対照及び陰性対照に添加
10μlの「6μg/ウェルの膜」をGLP-1及びアナログに添加(1ウェルあたり、2連/3連)
陽性対照:10μl「膜無し」+10μl AlphaScreen Buffer
陰性対照:10μl「膜無し」+10μl cAMP Stock Solution(50μM)
1. AlphaScreen Bufferを作成
2. GLP-1/アナログ/cAMP標準物質をAlphaScreen Buffer中に溶解して希釈
3. Donor Beads溶液を作成、30分間室温でインキュベート
4. cAMP/GLP-1/アナログをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
5. 膜/Acceptor Beads Solutionを調製、これをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
6. Donor Beadsを添加:1ウェルあたり30μl
7. プレートをアルミホイル中に包み、振とう機上で3時間(非常に低速で)室温でインキュベート
8. AlphaScreen上でカウント-各プレートはAlphaScreen中でカウント前に3分間プレインキュベート
EC50[pM]値はGraph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を用いて計算された。
GLP-1受容体結合
本実験の目的は、GLP-1受容体への本発明のGLP-1化合物の結合、及びその結合がアルブミンの存在によりどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは下記のin vitro実験においてなされた。
種類(in vitro):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ方法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞株:BHK tk-ts13
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、10% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び1.0mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
Buffer 1:20mM Na-HEPES+10mM EDTA、pH7.4
Buffer 2:20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA、pH7.4
SPA:
試験化合物、膜、SPA粒子及び[125I]]-GLP-1(7-36)NH2はアッセイ緩衝液中で希釈された。25ul(マイクロリッター)の試験化合物はOptiplateに添加された。HSA(2% HSAを含有する「高アルブミン」実験)、又は緩衝液(0.005% HSAを含有する「低アルブミン」実験)が添加された(50ul)。5〜10ugのタンパク質/サンプルが0.1〜0.2mgタンパク質/mlに相当して(50ul)添加された(各膜調製物について好ましくは最適化される)。SPA粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)が0.5mg/ウェル(50ul)の量で添加された。インキュベーションは[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(終濃度0.06nM、49.880DPMに相当、25ul)と共に開始された。プレートはPlateSealerでシールされ、120分間、30℃で、振とうしながらインキュベートされた。プレートは遠心分離され(1500rpm、10分間)、Topcounterにおいてカウントされた。
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005% Tween 20
pH7.4
HSAはSIGMA A1653であった。
IC50値は受容体から50%の125I-GLP-1を転置させる濃度として曲線から読み取られ、比率[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]が決定された。
以下の結果が得られたが、ここで「比率」とは[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA])をいう。
腸の酵素による分解に対する安定性
本実施例の目的は腸の酵素による分解に対する本発明の化合物の安定性を試験することである。
小腸はラットから調製され、8mlの150mM NaCl、20mM Hepes pH 7.4で洗い流された。溶液は15分間、4,600rpmで、Heraeus Multifuge 3 S-R遠心機において75006445ローターを使用して遠心分離された。上清が除去され、0.22μm Millipore Millex GV PVDF(登録商標)膜を通じてろ過された。個体差を平均化するため、数匹の動物のろ液がプールされた。
2.5nmolの試験される化合物は腸抽出物と共に250μlの容量で37℃で1時間にわたってインキュベートされた。腸サンプルは20mM Hepesの存在下pH7.4でアッセイされた。腸抽出物の濃度はパイロット実験においてGLP-1(7-37)の半減期(t1/2)が10〜20分の範囲になるように設定された。小腸抽出物は濃度1.4μg/mlで用いられた。腸抽出物以外の全ての成分は混合され、10分間、37℃で予め温められた。腸抽出物を添加後すぐにサンプル50μlが採取され、同じ容量の1%トリフルオロ酢酸(TFA)と混合された。さらにサンプルは続く15、30及び60分後に採取された。
UPLC分析
10μlのサンプルはWaters Acquityシステムを用いたUPLCにより、BEH C18 1.7μm 2.1×50mmカラムを使用して、0.1% TFA及び0.07% TFAのアセトニトリル溶液の30〜65%グラジエントを5分間かけて、流速0.6ml/分で分析された。ベースライン減算後、波長214nmで記録されたHPLCクロマトグラム中のインタクトな化合物のピーク積分が決定された。
1μlの各サンプルはBruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDIターゲットに移された。分析はBruker Autoflexマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析装置を使用して、予め規定された方法「PAC_measure」を用いて、500〜5000Daの拡張検出範囲及び予め規定された較正方法「PAC_calibrate」を使用して行われた。
HPLCクロマトグラムのピーク積分は時間に対してプロットされた。各化合物の半減期はSigmaPlot 9.0ソフトウェア及び2パラメーター指数関数形崩壊についての式を用いてデータを適合させることにより計算された。
既知化合物であるリラグルチド及びセマグルチドの相対的半減期はそれぞれ4.8及び1.2であった。
ラットにおける薬物動態
本実施例の目的は、本発明の誘導体のラットにおけるin vivoの半減期を調査することである。
セマグルチドの半減期は4時間であった。
ミニブタにおける薬物動態学
本研究の目的は、ミニブタへの静脈内投与後の本発明のGLP-1誘導体のin vivoでの持続時間延長、すなわちその作用時間の延長を決定することである。
試験された誘導体は全てが少なくとも12時間の半減期を持ち、5個は少なくとも24時間の半減期を持ち、4個は少なくとも36時間の半減期を持ち、3個は少なくとも48時間の半減期を持っていた。
経口での生物学的利用能の推定
本実験の目的は本発明のGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能を推定することである。
3個を除いて全ての試験された誘導体は30分時の用量補正曝露が48より高かった。8個は100より高かった。3個は125より高かった。そして1個は150より高かった。
血糖及び体重に対する効果
本研究の目的は糖尿病設定における血糖(BG)及び体重(BW)に対する本発明のGLP-1化合物の効果を検証することである。
1:ビヒクル、皮下投与
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、皮下投与
3:GLP-1誘導体、1.0nmol/kg、皮下投与
4:GLP-1誘導体、3.0nmol/kg、皮下投与
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、皮下投与
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、皮下投与
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、皮下投与
ビヒクル:50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4
試験された誘導体は血糖に対して、同様に体重に対して(両方の場合において低下させる)期待された効果を持っていた。そのうえ、S字状の用量応答曲線が得られ、血糖及び体重のそれぞれについてのED50値の計算が上に説明されたように可能となった。
グルコース仲介性インスリン分泌に対する効果
本実施例の目的はグルコース仲介性インスリン分泌に対する本発明のGLP-1化合物の効果を試験することである。
飼料摂取に対する効果
本実験の目的はブタにおける飼料摂取に対する本発明のGLP-1化合物の効果を調査することである。これは薬力学的(PD)研究において下記のようになされ、飼料摂取がGLP-1誘導体の単回用量投与の1、2、3及び4日後に測定され、ビヒクル処置対照群と比較される。
アルブミン結合アフィニティー
本実施例の目的は本発明のGLP-1誘導体のヒト血清アルブミン(HSA)へのアフィニティーを測定することである。
5個を除いて全ての試験された誘導体は、1以上という比較的高い見かけの解離定数(見かけのKd、μMで表す)に相当する、アルブミンへの比較的低い結合アフィニティーを持っていた。23個は5以上であった。18個は10より大きく、そして12個は20より大きかった。
Claims (8)
- GLP-1(7-37)(配列番号1)の31位に相当する位置におけるヒスチジン残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に相当する位置におけるグルタミン残基及びGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記ヒスチジン残基がH31で示され、前記グルタミン残基がQ34で示されるGLP-1アナログ、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
- 前記アナログのリジン残基に付着したアルブミン結合部分を含む誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、請求項1に記載のGLP-1アナログ。
- 前記アルブミン結合部分が、化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4:
化学式1: CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2: HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式3: HN4C -(CH2)x-CO-*
化学式4: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは6〜18の範囲の整数であり、yは3〜17の範囲の整数である)から選択される持続時間延長性部分を含む、請求項2に記載のGLP-1アナログ。 - 前記アルブミン結合部分が、化学式5、化学式6、化学式7、化学式8、化学式9及び化学式10:
化学式5: *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学式6: *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学式7: *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学式8: *-NH-C6H8-CO-*
化学式9: *-NC5H8-CO-*
化学式10: *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
(式中、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数である)から選択されるリンカーをさらに含む、請求項3に記載のGLP-1アナログ。 - [Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド;
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又はその誘導体を含む、薬剤。
- 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害のための、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加のための、並びに/又はβ細胞のグルコース感受性を回復させるための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又はその誘導体を含む、薬剤。
- 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害のための、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加のための、並びに/又はβ細胞のグルコース感受性を回復させるための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又は誘導体の使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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