JP5713334B2 - Method for separating natural mutants of yeast and mutant yeast - Google Patents
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Description
本発明は、酵母の自然変異株分離方法及び当該方法により得られた自然変異株酵母に関する。詳細には、親株の人為的変異操作を行うことなく優良特性を有する自然変異株酵母をスクリーニング・分離する方法、並びに、当該方法により得られる新規優良酵母に関する。 The present invention relates to a method for separating a natural mutant yeast strain and a natural mutant yeast obtained by the method. Specifically, the present invention relates to a method for screening / separating natural mutant yeast having excellent characteristics without performing artificial mutation operations of the parent strain, and a novel excellent yeast obtained by the method.
清酒、ビール、焼酎、ワインなどの酒類をはじめとして、酵母を用いて醸造・発酵により製造される食品は数多くある。これらの食品の品質は、用いる酵母の性質（特性）に影響されることが多く、より良い品質の製品を製造する目的のため、既存の酵母より優れた特性を有する優良酵母をスクリーニングする試みが一般的に行われている。 There are many foods produced by brewing and fermentation using yeast, including sakes such as sake, beer, shochu, and wine. The quality of these foods is often influenced by the properties (characteristics) of the yeast used, and for the purpose of producing a better quality product, there are attempts to screen excellent yeasts that have superior characteristics over existing yeasts. Generally done.
しかし、例えば清酒製造において現在使われている協会酵母６号（秋田県、新政）、７号（長野県、真澄）、９号（熊本県、香露）、１００１号（茨城県、明利）、１２号（宮城県、浦霞）などは、清酒製造場の醪から分離された酵母が主体である。これらの酵母は胞子形成能が脱落しているため、交配による遺伝子の組み換えは起こらず出芽により増殖することから優良形質が保存されると考えられている。このため、既存の協会酵母よりも優れた新しい酵母を育種するには交配育種では難しく、これまでは遺伝子組み換え、紫外線照射やＥＭＳなどの薬品で強制的に変異を生じさせて人為的変異株をつくり、麹エキス寒天培地などを用いて純粋分離培養で単菌分離して選抜育種する方法が行われてきた。 However, for example, association yeast 6 (Akita Prefecture, Shinsei), 7 (Nagano Prefecture, Masumi), 9 (Kumamoto Prefecture, Kasuro), 1001 (Ibaraki Prefecture, Mei), currently used in sake production, No. 12 (Miyagi Prefecture, Urabuchi) is mainly yeast isolated from sake brewery. Since these yeasts have lost their spore-forming ability, gene recombination by mating does not occur, and growth by budding is thought to preserve the excellent traits. For this reason, it is difficult to breed new yeasts that are superior to existing association yeasts, and so far it has been difficult to produce artificial mutants by forcibly causing mutations with drugs such as genetic recombination, ultraviolet irradiation, and EMS. A method has been used in which a single cell is isolated and selectively bred by pure isolation culture using a koji extract agar medium or the like.
この既存の育種技術は、人為的に変異を起こさせるため目的以外の変異が生じる可能性があり、また、変異株の中から優良酵母を選抜する方法が煩雑であるという問題点がある。つまり、選抜育種は多くの変異株の中からひとつだけを選び出す作業であり、選抜基準が最も重要であるが、これまでの選抜方法は糖類資化性、ＴＴＣ法、β−アラニン法、セルレニン耐性、アミノ酸アナログなど各種の薬剤を用いた識別培養を実施して親株と異なる株を選抜し、最終的に試験醸造を実施して発酵特性と製成酒の官能評価により優良実用酵母を選抜する方法が行われている（非特許文献１）。 This existing breeding technique has a problem that a mutation other than the target may occur due to artificial mutation, and a method for selecting a good yeast from mutants is complicated. In other words, selection breeding is the work of selecting only one of many mutants, and selection criteria are the most important, but the selection methods so far are saccharide utilization, TTC method, β-alanine method, cerulenin resistance , Identification culture using various drugs such as amino acid analogs, selecting strains different from the parent strain, and finally conducting test brewing to select excellent practical yeasts based on fermentation characteristics and sensory evaluation of sake (Non-patent Document 1).
このように、人為的変異株をつくりその中から優良酵母を選抜するこれまでの方法は、選抜基準が明確でないため多大な労力と時間を要する欠点を持っている。このため、例えば清酒酵母においては、協会酵母の中で醪から分離した株以外の優良酵母はアルコール耐性酵母のＫ１１、セルレニン耐性酵母のＫ１６０１、Ｋ１７０１、Ｋ１８０１などごく僅かである。 As described above, the conventional methods for producing artificial mutants and selecting excellent yeasts from them have the disadvantages of requiring a lot of labor and time since the selection criteria are not clear. For this reason, for example, in sake yeast, there are very few excellent yeasts other than those isolated from koji among association yeasts, such as K11 for alcohol-resistant yeast, K1601, K1701, and K1801 for cerulenin-resistant yeast.
一方、本発明者らは、清酒の官能評価と化学成分との関係を研究した結果、フーゼルアルコール（ｎ−プロパノール、ｉ−ブタノール、ｉ−アミルアルコール）、芳香族アルコール（チロソール、β−フェニルエタノール、トリプトフォール）が清酒の味に大きく関係していることを明らかにした（非特許文献２、３）。フーゼルアルコールは清酒の味の「きれいさ、かるさ」に関係し、ｎ−プロパノールは４００ｐｐｍ以上、ｉ−ブタノールは１００ｐｐｍ以上、ｉ−アミルアルコールは５０ｐｐｍ以上の濃度で官能評価が徐々に悪くなる。芳香族アルコールは清酒の後味の「苦味、渋味、雑味」に関係し、清酒に多量に含まれると官能評価が低下することが確認された。以上より、清酒の品質向上にはフーゼルアルコール、芳香族アルコールの低減が重要であることを見出した。
On the other hand, as a result of studying the relationship between sensory evaluation and chemical components of sake, the present inventors have found that fusel alcohol (n-propanol, i-butanol, i-amyl alcohol), aromatic alcohol (tyrosol, β-phenylethanol). , Tryptofol) has been clarified to be greatly related to the taste of sake (
清酒醪では、酵母は増殖の窒素源として主にアミノ酸を資化する。種々のアミノ酸のアミノ基を使い必要なタンパク質を合成する。脱アミノされた化合物は脱炭酸反応、還元反応を経て元のアミノ酸より炭素数がひとつ少ないアルコールとなり菌体外に放出されることが知られている（非特許文献４）。 In sake lees, yeast mainly assimilate amino acids as a nitrogen source for growth. Synthesize necessary proteins using amino groups of various amino acids. It is known that a deaminated compound undergoes a decarboxylation reaction and a reduction reaction, becomes an alcohol having one carbon number less than the original amino acid, and is released outside the cells (Non-patent Document 4).
このような背景技術の中で、人為的変異株を作成することなく、簡便かつ効率的に保存菌株の中からフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量が低減した自然変異株酵母を取得できる方法の開発が、特に清酒などの酒類製造業界から強く望まれていた。 In such a background art, a natural mutant yeast having a reduced production amount of fusel alcohol and aromatic alcohol can be easily and efficiently obtained from a stored strain without creating an artificial mutant. Development was strongly desired by the liquor manufacturing industry, particularly sake.
本発明は、主課題として、人為的に変異株を作成することなく簡便かつ効率的に保存菌株の中に混在するフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量が低減した自然変異株酵母を単離する技術を提供することを目的とする。さらに、従課題として、その中から発酵特性と製成酒の品質がより良い優良酵母を分離する技術を提供することを目的とする。 As a main subject, the present invention isolates naturally-mutated yeast with reduced production amounts of fusel alcohol and aromatic alcohol that are easily and efficiently mixed in preserved strains without artificially creating mutant strains. The purpose is to provide technology. Furthermore, it aims at providing the technique which isolate | separates the excellent yeast from which the fermentation characteristic and the quality of produced sake are better as a subordinate subject.
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、２０種類のアミノ酸のうちでどのアミノ酸がフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成に関係しているか調べたところ、バリンからｉ−ブタノール、ロイシンおよびイソロイシンからｉ−アミルアルコール、チロシンからチロソール、フェニルアラニンからβ−フェニルエタノール、トリプトファンからトリプトフォールが生成することを確認した。この知見から、これらのアミノ酸資化量の少ない酵母を育種すれば清酒醸造におけるフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量を低減できると考えるに至った。 In order to achieve the above object, the present inventors conducted intensive research and examined which amino acid among 20 types of amino acids is related to the formation of fusel alcohol and aromatic alcohol. From valine to i-butanol, It was confirmed that leucine and isoleucine produce i-amyl alcohol, tyrosine from tyrosol, phenylalanine from β-phenylethanol, and tryptophan from tryptophore. From this knowledge, it has been thought that the production of fusel alcohol and aromatic alcohol in sake brewing can be reduced by breeding these yeasts with less amino acid utilization.
そして、窒素源としてこれらのアミノ酸を単独で含む平板培地（最小栄養平板培地）で酵母が増殖できるかどうか調べたところ、全てのアミノ酸を含む完全培地の場合は２〜３日で増殖し大きさが均一なコロニーを形成するが、特定アミノ酸を単独の窒素源とした最小栄養平板培地の場合は増殖が遅く、４〜１２日間の長時間を要するが増殖はしてくること、大小さまざまなコロニーが形成されることを知った。これは、最小栄養平板培地の場合は酵母細胞毎の増殖力に差が生じてコロニーの大きさとして現れたことを示すものであり、コロニーの大きさの異なる株を釣菌することにより自然変異株を容易に分離できることを見出し、本発明に至った。 And it was investigated whether yeast could grow on a plate medium (minimum nutrient plate medium) containing these amino acids alone as a nitrogen source. In the case of a complete medium containing all amino acids, it grew in 2 to 3 days and was large. Form a uniform colony, but in the case of a minimum nutrient plate medium using a specific amino acid as a single nitrogen source, the growth is slow, and it takes 4 to 12 days, but it grows. Knew that would be formed. This shows that in the case of the minimum nutrient plate medium, the difference in the growth ability of each yeast cell occurred and it appeared as a colony size. The present inventors have found that strains can be easily separated and have reached the present invention.
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンから選ばれる１種のアミノ酸を単一の窒素源とする最小栄養平板培地で４〜１２日間（好ましくは５〜１０日間）人為的な変異処理を行っていない親株酵母を培養し、形成されたコロニーのうち、当該酵母を全てのアミノ酸を含む完全培地で培養したときに形成されるコロニーより小さいものを選択して取得すること、を特徴とする当該アミノ酸低資化性の自然変異株酵母を分離する方法。
（２）（１）に記載の方法により得られた自然変異株酵母から、コハク酸生成量が親株より少ないものを更に選択すること、を特徴とする自然変異株酵母の分離方法。
（３）（１）又は（２）に記載の方法により得られた自然変異株酵母から、アラニン及び／又はグルタミン酸生成量が親株より多いものを更に選択すること、を特徴とする自然変異株酵母の分離方法。
（４）酵母が清酒酵母である（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法により得られた、フーゼルアルコール及び／又は芳香族アルコールの生成量が親株より少なく（一例としては清酒中のフーゼルアルコールが５５０ｐｐｍ未満、芳香族アルコールが７０ｐｐｍ未満等）、及び／又は、コハク酸生成量が親株より少なくアラニン及びグルタミン酸生成量が親株より多いこと、を特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する自然変異株酵母。
（６）清酒酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８５）。
（７）清酒酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−２（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８６）。
（８）清酒酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−３（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８７）。
That is, the embodiment of the present invention is as follows.
(1) Artificial mutation for 4 to 12 days (preferably 5 to 10 days) in a minimal nutrient plate medium using one amino acid selected from valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan as a single nitrogen source It is characterized by culturing a parent yeast that has not been treated and selecting and obtaining a colony that is smaller than a colony formed when the yeast is cultured in a complete medium containing all amino acids. A method for isolating a naturally occurring mutant yeast having low amino acid utilization.
(2) A method for separating a naturally occurring mutant yeast, which further comprises selecting from the naturally occurring mutant yeast obtained by the method according to (1) a succinic acid production amount smaller than that of the parent strain.
(3) A natural mutant yeast characterized by further selecting an alanine and / or glutamic acid production amount higher than that of the parent strain from the natural mutant yeast obtained by the method according to (1) or (2) Separation method.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the yeast is sake yeast.
(5) The production amount of fusel alcohol and / or aromatic alcohol obtained by the method according to any one of (1) to (4) is less than the parent strain (for example, 550 ppm of fusel alcohol in sake) And / or a natural mutant strain belonging to Saccharomyces cerevisiae characterized in that the amount of succinic acid produced is less than that of the parent strain and the amount of alanine and glutamic acid produced is greater than that of the parent strain. yeast.
(6) Sake yeast, Saccharomyces cerevisiae IYAPU-1 (NITE AP-885).
(7) Sake yeast, Saccharomyces cerevisiae IYAPU-2 (NITE AP-886).
(8) Sake yeast, Saccharomyces cerevisiae IYAPU-3 (NITE AP-887).
本発明によれば、平板培養の段階で目的の自然変異株だけを容易に識別して分離できる。これは、薬剤を用いた識別培養等を実施していた従来技術に比べると格段の効率である。さらに、従来、協会酵母は胞子形成能が脱落しているため優良形質が変わらず保存菌株は均一であると考えられてきたが、本発明において協会酵母も保存培養中に自然変異が生じて長年の間に自然変異株の集合体になり優良形質が変化していることが確認され、本発明によれば、この協会酵母の保存菌株に僅かに含まれる自然変異株を簡便かつ効率的に識別分離できる。 According to the present invention, only the target natural mutant can be easily identified and separated at the stage of plate culture. This is remarkably more efficient than the prior art that performed identification culture using a drug. Furthermore, the association yeast has been considered to have a uniform preserved strain because its sporulation ability has been lost, and the preserved strain has been thought to be uniform in the present invention. It was confirmed that the natural traits were aggregates of natural mutants and the excellent traits were changed. According to the present invention, natural mutants slightly contained in the preserved strains of this association yeast were easily and efficiently identified. Can be separated.
本発明は、親株の人為的変異操作を行うことなく優良特性を有する自然変異株酵母をスクリーニング・分離する方法等に関するものであり、醸造食品等に用いられている酵母全般に広く適用できるものであるが、以下、清酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを例として詳述する。 The present invention relates to a method for screening and isolating natural mutant yeast having excellent characteristics without performing artificial mutation operations of the parent strain, etc., and can be widely applied to all yeasts used in brewed foods and the like. Hereinafter, the sake yeast Saccharomyces cerevisiae will be described in detail as an example.
まず、本発明においては、優良清酒酵母スクリーニングの親株として協会酵母等をそのまま用いる。酵母は、生存競争のためや増殖力を高めるために置かれた環境の栄養条件によって自然変異を起こすと考えられる。協会酵母は各地の清酒製造場において自然変異株が主に増殖した醪から分離された経緯を考慮すると、実際の醪において自然変異が生じていることも予想される。しかしながら、麹エキス寒天培地、ＹＭ培地（酵母エキス、ペプトン、グルコース）などの完全栄養培地を用いるこれまでの分離培養では親株、変異株ともほぼ同じ大きさコロニーになるため保存菌株のなかに変異株が混在していることは見出せなかった。 First, in the present invention, association yeast or the like is used as it is as a parent strain for excellent sake yeast screening. Yeasts are thought to undergo natural mutation due to environmental nutrient conditions placed in order to compete for survival and increase their ability to grow. Considering the fact that the association yeast was isolated from the grapes where the natural mutants grew mainly at the sake breweries in various places, it is also expected that natural mutations have occurred in the actual grapes. However, since the parental and mutant strains have almost the same size in the previous isolation culture using a complete nutrient medium such as koji extract agar medium and YM medium (yeast extract, peptone, glucose), the mutant strain is a mutant strain. Could not be found.
本発明では、保存菌株中の自然変異株酵母を単離するため、まず選択培地として、炭素源をグルコース、窒素源を単一のアミノ酸、微量栄養素としてＤｉｆｃｏ社製品のイーストナイトロゲンベース ｗ／ｏ アミノ酸＆硫安、寒天で構成する最小栄養平板培地を用いる。アミノ酸は２０種類存在するが、プロリンなど酵母が資化しないアミノ酸を除いた他のアミノ酸を単独で用いることにより、酵母菌株ごとの増殖力に差が生じる。 In the present invention, in order to isolate a naturally occurring mutant yeast in a stock strain, first, as a selective medium, a carbon source is glucose, a nitrogen source is a single amino acid, and a micronutrient is a yeast nitrogen base product w / o of Difco. A minimal nutrient plate medium composed of amino acids, ammonium sulfate and agar is used. Although there are 20 types of amino acids, the use of other amino acids, except for amino acids that are not assimilated by yeast, such as proline, causes a difference in the growth ability of each yeast strain.
本発明の目的はフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量の少ない酵母の選抜育種であることから、ｉ−ブタノールに変換されるバリン、ｉ−アミルアルコールに変換されるロイシン、β−フェニルエタノールに変換されるフェニルアラニンを唯一の窒素源とする最小栄養平板培地が優れている。 Since the object of the present invention is selective breeding of yeast with a low production amount of fusel alcohol and aromatic alcohol, valine converted to i-butanol, leucine converted to i-amyl alcohol, and converted to β-phenylethanol Minimal nutrient plate medium with phenylalanine as the only nitrogen source is excellent.
選抜方法としては、人為的な変異処理を行っていない（そのままの状態の）上述の親株酵母を、４〜１２日間（好ましくは５〜１０日間）上述の選択培地で培養し、形成されたコロニーのうち当該酵母を全てのアミノ酸を含む完全培地で培養したときに形成されるコロニーより小さいもの（一例としては、コロニーの直径が２ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ以下のもの）を選択して取得する。このとき、なるべく小さいコロニーを選択するのが好ましい。目的のコロニーは、殺菌した竹串で釣菌し、麹エキス培地などに植菌して拡大培養することで大量に得られる。 As a selection method, colonies formed by culturing the above-described parent strain yeast that has not been subjected to artificial mutation treatment (as it is) in the above-mentioned selective medium for 4 to 12 days (preferably 5 to 10 days) Are obtained by selecting those smaller than the colonies formed when the yeast is cultured in a complete medium containing all amino acids (for example, those having a colony diameter of less than 2 mm, preferably 1 mm or less). At this time, it is preferable to select a colony as small as possible. The target colony can be obtained in large quantities by culturing with a sterilized bamboo skewer, inoculating in a salmon extract medium, etc., and cultivating it.
さらに本発明においては、清酒の品質に影響を与える成分であるコハク酸、アラニン、グルタミン酸生成量により、更なる選抜を行うことができる。コハク酸は、本発明者らの最近の研究から、含有量が多い清酒はエグ味が感じられ官能評価が低下することがわかった成分である。また、アラニンとグルタミン酸は、アラニンの甘味とグルタミン酸の酸味の調和が清酒の「ふくらみ、旨味」を構成し、酵母が醪の後半で生成するアミノ酸である。そして、アラニンは純米酒に最も多く、グルタミン酸は２番目に多く含まれるアミノ酸である。この２つのアミノ酸は製成酒中に一定の比率（好ましくはアラニン／グルタミン酸比で１．１〜２．２、更に好ましくは１．４〜１．６５）で存在するのが好適であり、さらには、製成酒中のコハク酸濃度とアラニン、グルタミン酸濃度は負の相関関係があることが本発明により見出されている。 Furthermore, in this invention, the further selection can be performed with the production amount of succinic acid, alanine, and glutamic acid, which are components affecting the quality of sake. Succinic acid is a component that has been found from recent studies by the present inventors that sake with a high content has a taste of taste and lowers sensory evaluation. Alanine and glutamic acid are amino acids produced by yeast in the second half of the koji, where harmony between the sweetness of alanine and the acidity of glutamic acid constitutes the “bulge, umami” of sake. And alanine is the most abundant in pure rice sake, and glutamic acid is the second most abundant amino acid. The two amino acids are preferably present in the sake in a certain ratio (preferably an alanine / glutamic acid ratio of 1.1 to 2.2, more preferably 1.4 to 1.65). Has been found by the present invention to have a negative correlation between the succinic acid concentration and the alanine and glutamic acid concentrations in the sake.
この選抜方法は、選択培地（最小栄養平板培地）で取得した菌株を麹エキス培地などに植菌して拡大培養し、その培養液をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析などの定法によりコハク酸、アラニン、グルタミン酸のうち少なくとも１種以上の含有量を計測し、親株のそれと比較する方法が例示される。また、取得した菌株を用いて清酒を製造し、清酒中のデータを親株のものと比較して選抜しても良い。なお、この選抜は親株との比較で行うものであるが、協会酵母を親株とした場合の一例として、コハク酸は清酒中で６００ｐｐｍ以下、好ましくは５００ｐｐｍ以下を選抜基準とすることができ、アラニン及びグルタミン酸は清酒中で総量として５５０ｐｐｍ以上、好ましくは６００〜１０００ｐｐｍの範囲を選抜基準とすることができる。 This selection method involves inoculating a bacterial strain obtained from a selective medium (minimum nutrient plate medium) into a koji extract medium and cultivating it, and cultivating the culture solution by a standard method such as HPLC (high performance liquid chromatography), A method of measuring the content of at least one of alanine and glutamic acid and comparing it with that of the parent strain is exemplified. Moreover, sake may be manufactured using the acquired strain, and the data in sake may be selected by comparison with the parent strain. This selection is carried out by comparison with the parent strain. As an example when the association yeast is used as the parent strain, succinic acid can be used in the sake at 600 ppm or less, preferably 500 ppm or less as the selection criterion. In addition, the total amount of glutamic acid in sake is 550 ppm or more, preferably in the range of 600 to 1000 ppm as a selection criterion.
本発明では、上述のような手法で目的とする優良清酒酵母を取得することができる。一例として挙げると、協会酵母Ｋ６０１、Ｋ１００１、Ｋ１５０１を親株として、それぞれ優良自然変異株を取得するのに成功し、Ｋ６０１から取得した株をＩＹＡＰＵ−１、Ｋ１００１から取得した株をＩＹＡＰＵ−２、Ｋ１５０１から取得した株をＩＹＡＰＵ−３と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにそれぞれＮＩＴＥ ＡＰ−８８５、ＮＩＴＥ ＡＰ−８８６、ＮＩＴＥ ＡＰ−８８７として受領された。 In the present invention, the desired excellent sake yeast can be obtained by the method described above. As an example, the association yeasts K601, K1001, and K1501 were used as parent strains to successfully obtain excellent natural mutants, and the strains obtained from K601 were IYAPU-1 and the strains obtained from K1001 were IYAPU-2, K1501. Was acquired as NITE AP-885, NITE AP-886, and NITE AP-887, respectively.
本発明により得られる優良清酒酵母の主な菌学的性質は、親株を人為的に変異処理するものではないため、選択培地に用いた窒素源のアミノ酸の資化性、コハク酸の生成量などごく一部を除き親株と同一である。したがって、例えば協会酵母を親株とした場合には、本発明によって得られる自然変異株酵母は、胞子形成しない点やその炭素源資化性、発酵性など基本的には親株協会酵母の性質がそのまま保存されている。 The main bacteriological properties of the excellent sake yeast obtained according to the present invention are not to artificially mutate the parent strain, so the assimilation of amino acid of nitrogen source used in the selective medium, the amount of succinic acid produced, etc. Except for a few, it is the same as the parent stock. Therefore, for example, when an association yeast is used as a parent strain, the spontaneous mutant yeast obtained by the present invention basically has the same characteristics as the parent strain association yeast, such as the fact that it does not sporulate, its carbon source utilization ability, and fermentability. Saved.
協会酵母を親株として、本発明により取得した自然変異株の主な菌学的性質を例示すると、以下の通りである。なお、炭素源資化性と発酵性は酵母様真菌同定キット（アピＣオキサノグラム）を使い１９種類の糖類について調べた。
（ａ）ＹＭ液体培地で生育させたときの菌の形態
（１）栄養細胞の大きさ：長径１０ミクロン程度。
（２）栄養細胞の形状：球形からやや卵形。
（３）増殖の形式：出芽。
（ｂ）胞子形成の有無
胞子形成しない。
（ｃ）生理学的・化学分類学的性質
（１）最適生育条件（ｐＨ）：５〜６。
（２）生育の範囲（ｐＨ）：３〜６。
（３）硝酸塩の資化：なし。
（４）脂肪の分解：なし。
（５）尿素の分解：なし。
（６）ゼラチンの液化：なし。
（７）カロチノイドの生成：なし。
（８）顕著な有機酸の生成：コハク酸生成が少ない。
（９）デンプン様物質の生成：特にみあたらない。
（１０）ビタミンの要求性：特にない。
（１１）炭素源資化性：グルコース、マルトース、シュークロースを資化する。
（１２）炭素源発酵性：グルコース、シュークロースを発酵する。
The main bacteriological properties of the natural mutant strain obtained by the present invention with the association yeast as the parent strain are as follows. In addition, carbon source utilization property and fermentability were investigated about 19 types of saccharides using the yeast-like fungi identification kit (Api C oxanogram).
(A) Bacteria morphology when grown in YM liquid medium (1) Vegetative cell size: about 10 microns in major axis.
(2) Vegetative cell shape: slightly spherical to oval.
(3) Form of growth: budding.
(B) Presence or absence of sporulation No sporulation.
(C) Physiological and chemical taxonomic properties (1) Optimal growth conditions (pH): 5-6.
(2) Growth range (pH): 3-6.
(3) Utilization of nitrate: None.
(4) Fat breakdown: None.
(5) Urea decomposition: None.
(6) Liquefaction of gelatin: None.
(7) Carotenoid production: None.
(8) Significant organic acid production: Succinic acid production is low.
(9) Production of starch-like substance: not particularly found.
(10) Requirement of vitamin: Not particularly.
(11) Carbon source assimilation: assimilate glucose, maltose and sucrose.
(12) Carbon source fermentability: ferment glucose and sucrose.
本発明の最小栄養平板培地による自然変異株酵母の分離法は、特殊な培養設備や試薬などを必要とせず、容易に実施することが可能である。そして、分離した自然変異株酵母は、親株酵母と全く同様に用いることができ、例えば清酒酵母においては、清酒製造に必要な親株由来の形質も維持しているため非常に好適である。 The method for separating naturally mutant yeast using the minimal nutrient plate medium of the present invention can be easily carried out without requiring special culture facilities or reagents. The isolated natural mutant yeast can be used in exactly the same manner as the parent yeast. For example, sake yeast is very suitable because it maintains the traits derived from the parent strain necessary for sake production.
以下、本発明の実施例について清酒酵母を例として述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。 Hereinafter, examples of the present invention will be described using sake yeast as an example, but the present invention is not limited thereto.
（清酒酵母によるアミノ酸からの高級アルコールの生成）
麹エキス液体培地を用いて、清酒酵母による高級アルコールの生成を調べた。対照を麹エキス液体培地とし、これに２０種類のアミノ酸をそれぞれ単独に１００ｐｐｍ添加したアミノ酸補填培地を用いて、同じ協会９０１号酵母を植えて３０℃、３日間培養した。培養終了後に０．４５μのフィルターで培養液をろ過して酵母菌体を除き、培養液中の高級アルコールの生成をガスクロマトグラフ装置でヘッドスペース法を用いて調べた（日本醸造協会誌、９６（１１）、７８９−７９５（２００１）に記載の方法を参照）。
(Production of higher alcohols from amino acids by sake yeast)
Using the koji extract liquid medium, the production of higher alcohol by sake yeast was examined. The control was a koji extract liquid medium, and the same association 901 yeast was planted and cultured at 30 ° C. for 3 days using an amino acid-supplemented medium in which 20 kinds of amino acids were individually added to 100 ppm. After completion of the culture, the culture solution was filtered with a 0.45 μ filter to remove yeast cells, and the production of higher alcohol in the culture solution was examined using a head chromatograph with a gas chromatograph (Japan Brewing Association, 96 ( 11), see the method described in 789-795 (2001)).
結果は表１に示したが、対照に比べて高級アルコールが多量に生成したのは、培地にバリン、ロイシン、イソロイシンを添加したもののみであり、バリンからｉ−ブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）、ロイシンとイソロイシンからｉ−アミルアルコール（ｉ−ＡｍＯＨ）が生成した。この結果から、清酒のｉ−ブタノール、ｉ−アミルアルコール濃度を低減するにはバリン、ロイシン、イソロイシンの資化量の少ない変異株酵母を用いれば実現することが見出された。 The results are shown in Table 1. Compared with the control, a higher alcohol was produced in a large amount only when valine, leucine and isoleucine were added to the medium, and from valine to i-butanol (i-BuOH) and leucine. And isoleucine produced i-amyl alcohol (i-AmOH). From this result, it was found that the use of mutant yeasts with low amounts of utilization of valine, leucine and isoleucine can be achieved to reduce the concentration of sake i-butanol and i-amyl alcohol.
（清酒酵母によるアミノ酸からの芳香族アルコールの生成）
麹エキス液体培地を用いて、清酒酵母による芳香族アルコールの生成を調べた。発明者らが分離した３３株の酵母を麹エキス液体培地に植えて、３０℃、３日間培養した。培養終了後に０．４５μのフィルターで培養液をろ過して酵母菌体を除き、培養液中の芳香族アルコールの生成を逆相クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣ法で調べた（非特許文献３に記載の方法を参照）。
(Production of aromatic alcohol from amino acids by sake yeast)
Using a koji extract liquid medium, the production of aromatic alcohol by sake yeast was examined. 33 strains of yeast isolated by the inventors were planted in a koji extract liquid medium and cultured at 30 ° C. for 3 days. After completion of the culture, the culture solution was filtered with a 0.45 μ filter to remove yeast cells, and the production of aromatic alcohol in the culture solution was examined by HPLC using reverse phase chromatography (described in Non-Patent Document 3). See how).
結果は図１に示したが、培養中の酵母によるチロシン資化量とチロソール生成量、フェニルアラニン資化量とβ−フェニルアラニン生成量について比例関係が認められた。この結果から、清酒のチロソール、β−フェニルエタノール濃度を低減するにはチロシン、フェニルアラニンの資化量の少ない変異株酵母を用いれば実現することが見出された。 The results are shown in FIG. 1, and a proportional relationship was observed between the amount of tyrosine assimilated and the amount of tyrosol produced by yeast in culture, the amount of phenylalanine assimilated and the amount of β-phenylalanine produced. From this result, it has been found that the use of mutant yeasts with low amounts of tyrosine and phenylalanine can be achieved to reduce the concentration of tyrosol and β-phenylethanol in sake.
（バリン、ロイシン、フェニルアラニンをそれぞれ唯一の窒素源とする最小栄養平板培地による自然変異株の分離）
最小栄養平板培地の調製は、Ｄｉｆｃｏ社製品のイーストナイトロゲンベース ｗ／ｏ アミノ酸＆硫安を１７０ｍｇ、各アミノ酸を単独に１００ｍｇとり、これらを蒸留水２０ｍｌに加熱熱溶解し０．４５μのフィルターで無菌ろ過した（Ａ液）。次に、寒天を２ｇ、グルコースを２ｇとり、これらを蒸留水８０ｍｌに溶解しオートクレーブ殺菌した（Ｂ液）。Ｂ液が熱いうちにＡ液を混合し、無菌シャーレ１枚に約２０ｍｌ流し込み最小栄養培地プレートを５枚作成した。本培地はアミノ酸濃度１，０００ｐｐｍ、グルコース濃度２％となる。アミノ酸としてバリン、ロイシン、フェニルアラニンを用いた。
(Separation of natural mutants using a minimal nutrient plate medium containing valine, leucine and phenylalanine as the only nitrogen source)
Preparation of minimum nutrient plate medium is 170 mg of Difco's yeast nitrogen-based w / o amino acid & ammonium sulfate, 100 mg of each amino acid alone, heat-dissolved in 20 ml of distilled water, and sterile with 0.45μ filter. It filtered (A liquid). Next, 2 g of agar and 2 g of glucose were taken, dissolved in 80 ml of distilled water, and autoclaved (liquid B). While the B solution was hot, the A solution was mixed, and about 20 ml was poured into one sterile petri dish to prepare five minimum nutrient medium plates. This medium has an amino acid concentration of 1,000 ppm and a glucose concentration of 2%. Valine, leucine and phenylalanine were used as amino acids.
麹エキス培地で培養保存されている協会酵母Ｋ−９０１を１００μｌとり、無菌水を用いて１０４倍に希釈して約１，０００個／ｍｌの濃度とし、希釈液１００μｌを最小栄養培地プレートに均一に塗布して植菌した。そして、３０℃で５〜１０日間培養し、コロニーが適当な大きさに達した時に培養終了とした。この条件で約５０〜１００個の大小のコロニーが形成された。 The association Yeast K-901 stored cultured koji extract medium takes 100 [mu] l, to a concentration of about 000 cells / ml was diluted 10 4 times with sterile water, to a minimum nutrient medium plates dilutions 100 [mu] l It was applied evenly and inoculated. And it culture | cultivated at 30 degreeC for 5 to 10 days, and was complete | finished when the colony reached an appropriate size. Under these conditions, about 50 to 100 large and small colonies were formed.
釣菌は殺菌した竹串で行い、コロニーが協会酵母Ｋ−９０１を全てのアミノ酸を含む完全培地で培養したときに形成されるコロニーより特に小さいもの１０個を釣菌し、麹エキス培地３ｍｌに植菌した。これを３０℃で３日間拡大培養した。釣菌株の保存は、１５％グリセリン溶液１ｍｌに拡大培養液２００μｌを懸濁してマイナス８５℃の冷凍庫で保存した。釣菌株のフーゼルアルコール、芳香族アルコール生成量の比較は、更に麹エキス培地１０ｍｌで拡大培養し、０．４５μのフィルターで酵母菌体を除いた培養液を用いて行った。実施例１、２と同様に、フーゼルアルコールはガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により分析し、芳香族アルコールはＨＰＬＣを用いた方法により分析した。 The fungus is sterilized on bamboo skewers, and 10 colonies that are smaller than the colony formed when the association yeast K-901 is cultured in a complete medium containing all amino acids are fished. Inoculated. This was expanded and cultured at 30 ° C. for 3 days. For storage of the fishing strain, 200 μl of the expanded culture solution was suspended in 1 ml of a 15% glycerin solution and stored in a minus 85 ° C. freezer. Comparison of the production amounts of the fishing strains of fusel alcohol and aromatic alcohol was further carried out using a culture solution obtained by further culturing with 10 ml of the salmon extract medium and removing the yeast cells with a 0.45 μ filter. In the same manner as in Examples 1 and 2, fusel alcohol was analyzed by a headspace method using gas chromatography, and aromatic alcohol was analyzed by a method using HPLC.
バリンを唯一の窒素源とした最小栄養平板培地による結果を表２に、同じくロイシンの結果を表３、フェニルアラニンの結果を表４に示した。表から明らかなように、釣菌した１０個の株はフーゼルアルコール、芳香族アルコール生成量に大きな違いがあり、最大／最小の数値から明らかなように釣菌した１０株の間には１．４〜４．７倍の大きな違いが観察された。この結果はアミノ酸を単独に唯一の窒素源とした最小栄養平板培地を用いればこれまで存在が知られていなかった保存菌株の中の自然変異株を容易に効率的に分離できることを示すものである。 Table 2 shows the results of the minimum nutrient plate medium using valine as the only nitrogen source, Table 3 shows the results of leucine, and Table 4 shows the results of phenylalanine. As can be seen from the table, the 10 strains that were fished differed greatly in the amount of fusel alcohol and aromatic alcohol produced. As is clear from the maximum / minimum values, there were 1. A large difference of 4 to 4.7 times was observed. This result shows that natural mutants can be easily and efficiently isolated from preserved strains that have not been known to exist by using a minimal nutrient plate medium containing amino acids as the sole nitrogen source. .
（優良清酒酵母の選抜）
フェニルアラニンを唯一の窒素源とする最小栄養平板培地を用いて、協会酵母Ｋ６０１、Ｋ７０１、Ｋ９０１、Ｋ１００１、Ｋ１４０１、Ｋ１５０１からそれぞれ親株よりも優れた自然変異株の分離を行った。選抜基準としては上述のフーゼルアルコール、芳香族アルコールの他に有機酸としてコハク酸、呈味性アミノ酸としてアラニン、グルタミン酸を加えた。
(Selection of excellent sake yeast)
Using a minimal nutrient plate medium containing phenylalanine as the only nitrogen source, natural mutant strains superior to the parent strain were isolated from association yeasts K601, K701, K901, K1001, K1401, and K1501, respectively. As selection criteria, succinic acid was added as an organic acid, and alanine and glutamic acid were added as taste amino acids in addition to the above-mentioned fusel alcohol and aromatic alcohol.
まず最小栄養培地の平板培地で培養し、各酵母からコロニーの大きさの小さい１０株を釣菌した。次に麹エキス培地で培養した培養液を分析し、選抜基準であるフーゼルアルコール、芳香族アルコール、コハク酸、アラニン、グルタミン酸を比較し１０株から５株を選抜した。なお、有機酸量、アミノ酸量の分析は定法に従った。この選抜した５株と親株を加えて総米１００ｇの小仕込試験を実施し１０℃、３０日間の発酵を行い製成酒を得た。製成酒の化学分析と官能評価を行い、最も総合評価の高かった分離株を優良酵母として選択した。 First, the cells were cultured in a plate medium as a minimum nutrient medium, and 10 strains with small colonies were fished from each yeast. Next, the culture broth cultured in the koji extract medium was analyzed, and 5 strains were selected from 10 strains by comparing selection criteria such as fusel alcohol, aromatic alcohol, succinic acid, alanine and glutamic acid. In addition, the analysis of the amount of organic acids and the amount of amino acids followed a conventional method. The selected 5 strains and the parent strain were added to conduct a small preparation test of 100 g of total rice, and fermentation was performed at 10 ° C. for 30 days to obtain a sake. Chemical analysis and sensory evaluation of the sake were performed, and the isolate with the highest overall evaluation was selected as the excellent yeast.
表５〜表８は、親株とそれから分離選抜した最も総合評価の高かった優良自然変異株（ＩＹＡＰＵ−１〜６）を比べたものである。製成酒の官能評価は表５に示したが、分離選抜した酵母は親株に比べて総合評価が大幅に向上した。その理由を化学成分で比べてみると、表６から明らかなようにコハク酸は各酵母とも親株より大幅に減少している。本発明者らは、コハク酸含有量は５５０ｐｐｍ以下（好ましくは５００ｐｐｍ以下）が望ましいと考えているが、選抜株はほぼ満足できる数値であった。さらに、ほとんどの選抜株において、親株より総有機酸量も低減していた。 Tables 5 to 8 compare the parent strain and the excellent natural mutant strains (IYAPU-1 to 6), which were selected and separated from the parent strain, with the highest overall evaluation. The sensory evaluation of the produced sake is shown in Table 5, but the overall evaluation of the separated and selected yeast was greatly improved compared to the parent strain. When the reason is compared in terms of chemical components, as is apparent from Table 6, succinic acid is significantly reduced in each yeast compared to the parent strain. The present inventors consider that the succinic acid content is preferably 550 ppm or less (preferably 500 ppm or less), but the selected strains were values that were almost satisfactory. Furthermore, in most selected strains, the total organic acid amount was also reduced compared to the parent strain.
また、フーゼルアルコール（ｎ−プロパノール、ｉ−ブタノール、ｉ−アミルアルコール）生成量は表７に示したように親株よりかなり減少していた。表７には示していないが、フェニルアラニンで選抜した株であることからもわかるとおりβ−フェニルエタノール生成量も親株より減少していた。更に、選抜株は酢酸エチルが大幅に減少しており、これが官能評価においてエステル臭の低減し総合評価に大きく貢献していると思われる。なお、Ｋ９０１から分離選抜したＩＹＡＰＵ−５、Ｋ１００１から分離選抜したＩＹＡＰＵ−２は、吟醸香の成分であるカプロン酸エチルが大幅に向上していた。 In addition, as shown in Table 7, the production amount of fusel alcohol (n-propanol, i-butanol, i-amyl alcohol) was considerably reduced as compared with the parent strain. Although not shown in Table 7, as can be seen from the strain selected with phenylalanine, the amount of β-phenylethanol produced was also lower than that of the parent strain. Furthermore, the selected strains have significantly reduced ethyl acetate, and this seems to contribute to overall evaluation by reducing ester odor in sensory evaluation. In addition, in IYAPU-5 separated and selected from K901 and IYAPU-2 separated and selected from K1001, ethyl caproate, which is a component of ginjo aroma, was greatly improved.
さらには、表８に示したように、呈味性アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸の総量についても、各変異株は親株より生成量が向上していた。これによって、官能評価（特に清酒の呈味性）の向上に大きく貢献していることがわかった。なお、その他の呈味性アミノ酸として、アルギニン及びアスパラギン酸についても、全ての変異株で親株より生成量が増加傾向にあった。 Furthermore, as shown in Table 8, the amount of each mutant was improved from the parent strain in terms of the total amount of alanine and glutamic acid, which are tasteful amino acids. It was found that this greatly contributed to the improvement of sensory evaluation (especially the taste of sake). In addition, as other tasty amino acids, arginine and aspartic acid also had a tendency to increase the production amount of the parent strain in all the mutant strains.
本発明は、清酒製造に用いられている協会酵母からそれに含まれる自然変異株を分離する技術と分離選抜した酵母に関するものであるが、遺伝子組み換え、紫外線照射、薬品処理など全く人為的な変異を加えていないため極めて自然であり、当業界の要望に応えるものである。 The present invention relates to a technique for separating a natural mutant contained in an association yeast used in sake production and a yeast that has been separated and selected. However, artificial mutation such as genetic recombination, ultraviolet irradiation, chemical treatment, etc. It is very natural because it has not been added, and meets the needs of the industry.
さらに本発明は、清酒酵母以外の酒類酵母（ビール酵母、焼酎酵母、ワイン酵母等）やその他食品に用いられている酵母（パン酵母等）についても、同様にフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量の少ない優良酵母、呈味性アミノ酸生成量の多い優良酵母などの分離に用いることができる。そして、得られた酵母を用いることで、香りや呈味の良い酒類等を製造することができる。 Furthermore, the present invention also relates to alcoholic yeasts other than sake yeast (beer yeast, shochu yeast, wine yeast, etc.) and other yeasts used in foods (such as baker's yeast). It can be used for the separation of excellent yeasts with a small amount and excellent yeasts with a large amount of tasteful amino acids. And by using the obtained yeast, liquors with good aroma and taste can be produced.
本発明を要約すれば、以下の通りである。 The present invention is summarized as follows.
本発明は、簡便かつ効率的に保存菌株の中に混在するフーゼルアルコール、芳香族アルコールの生成量が低減した自然変異株酵母を単離する技術を提供し、さらには、その中から発酵特性と製成酒の品質がより良い優良酵母を分離する技術を提供することを目的とする。 The present invention provides a technology for isolating naturally-mutated yeast having a reduced production amount of fusel alcohol and aromatic alcohol that are easily and efficiently mixed in preserved strains, and further, fermentation characteristics and It aims at providing the technique which isolate | separates the quality yeast with better quality of sake.
そして、窒素源として単一のアミノ酸を加えた最小栄養培地の平板プレートを用いて酵母を培養し、形成されたコロニーのうち、当該酵母を全てのアミノ酸を含む完全培地で培養したときに形成されるコロニーより小さいものを選択して取得する。さらに、コハク酸などの有機酸生成量やアラニン、グルタミン酸などの呈味性アミノ酸生成量を基準として選択することもできる。このようにして取得した優良酵母を使用して製造した酒類は、香りや呈味に優れたものとなり、例えば清酒においては、苦味、渋味、雑味、エグ味が非常に少なく、エステル臭が少なくかるい風味であり、且つふくらみ、旨味のある呈味性に優れた清酒が得られる。さらには、上述の寄託手続が進められている株を清酒製造に用いた場合、原料米の精白歩合が高くても（例えば５０％以上でも）大吟醸のような香味、呈味が良好な清酒を製造できる。 It is formed when yeast is cultured using a plate of a minimal nutrient medium to which a single amino acid is added as a nitrogen source, and among the formed colonies, the yeast is cultured in a complete medium containing all amino acids. Select and obtain a smaller colony. Furthermore, it can also be selected based on the production amount of organic acids such as succinic acid and the production amount of tasty amino acids such as alanine and glutamic acid. Alcohol produced using the excellent yeast obtained in this way has excellent aroma and taste.For example, in sake, there are very little bitterness, astringency, miscellaneous taste, taste, and ester odor. A sake with a light and light flavor and excellent swelling and umami taste can be obtained. Furthermore, when the above-deposited procedures are used for sake production, sake with a good flavor and taste like Daiginjo even if the polishing ratio of the raw rice is high (for example, 50% or more). Can be manufactured.
本発明において寄託手続が進められている微生物の受領番号を下記に示す。
（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８５）。
（２）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−２（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８６）。
（３）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＹＡＰＵ−３（ＮＩＴＥ ＡＰ−８８７）。
The receipt numbers of microorganisms for which deposit procedures are being carried out in the present invention are shown below.
(1) Saccharomyces cerevisiae IYAPU-1 (NITE AP-885).
(2) Saccharomyces cerevisiae IYAPU-2 (NITE AP-886).
(3) Saccharomyces cerevisiae IYAPU-3 (NITE AP-887).
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