JP2006197840A

JP2006197840A - Production of alcoholic beverage using saccharomyces cerevisiae and pichia anomala

Info

Publication number: JP2006197840A
Application number: JP2005012185A
Authority: JP
Inventors: Osamu Kurita; 修栗田
Original assignee: Mie Prefecture
Current assignee: Mie Prefecture
Priority date: 2005-01-20
Filing date: 2005-01-20
Publication date: 2006-08-03

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing an alcoholic beverage containing flavor components in higher ratio, compared with alcoholic beverages which have been produced by only Saccharomyces cerevisiae. <P>SOLUTION: A yeast belonging to Pichia anomala is subjected to mutation treatment by ethidium bromide and small colony of the treated yeast is subjected to selective separation on an YPDG culture medium to provide a variant in which film-forming ability is lowered. An alcohol is produced by using the variant and Saccharomyces cerevisiae to provide the alcohol beverage in which flavor components are abundant. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、皮膜形成能の低い又はないピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母の双方を用いてアルコール飲料を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an alcoholic beverage using both a yeast belonging to Pichia anomala and a yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae having low or no film-forming ability.

香気の豊かな酒類の製造を行うために、サッカロミセス・セレビシェに属する酵母の育種が行われている（例えば、特許文献１−３）。現状では、酢酸イソアミル高生成酵母、カプロン酸高生成酵母が知られているが、サッカロミセス・セレビシェに属さない異種酵母と香気成分を高生成しないサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料の製造に成功した例は報告されていない。
また、ピキア・アノマラに属する酵母はオフフレーバーである酢酸エチルを高生成することから、これまで飲食品の利用に成功した例は報告されていない。 Breeding of yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae has been carried out in order to produce fragrant liquors (for example, Patent Documents 1-3). Currently, isoamyl acetate high-yielding yeast and caproic acid high-yielding yeast are known. No successful examples have been reported.
Moreover, since yeast belonging to Pichia anomala produces high off-flavor ethyl acetate, no examples of successful use of food and drink have been reported so far.

特開２００４−１９４５０４号公報JP 2004-194504 A 特開２００３−２５０５２３号公報JP 2003-250523 A 特開２００２−１９４５０４号公報JP 2002-194504 A

アルコール飲料において、香気成分の有無は品質の重要な要素であり、香気成分の付与はアルコール飲料に対する消費者の多様なニーズに応えるものである。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、従来単一のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母でのみでは、香気成分の多く含むアルコール飲料が製造できなかったという問題点に対して、香気成分を多く含むアルコール飲料の製造法等を提供することにある。 In alcoholic beverages, the presence or absence of a fragrance component is an important element of quality, and the addition of a fragrance component meets the diverse needs of consumers for alcoholic beverages.
The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and in contrast to the problem that an alcoholic beverage containing a large amount of aroma components could not be produced only with yeast belonging to a single Saccharomyces cerevisiae, The object is to provide a method for producing an alcoholic beverage containing a large amount of ingredients.

本発明は、より多くの香気成分を含むアルコール飲料の製造を目的に、サッカロミセス・セレビシェに属さない酵母であるピキア・アノマラ（Pichia anomala）の利用に着目した。そして、ピキア・アノマラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択分離したところ、当該属酵母の特徴である皮膜形成能が低い又はない株を得ることができ、この株は不快臭となる酢酸エチルの生成が低いという新規な性質を有することをはじめて見出したことにより、基本的には本発明を完成した。
そして更に、自然界よりピキア・アノマラに属する酵母を分離し、変異処理することなく、上記呼吸変異株選択培地上で皮膜形成能の低い酵母を単離できることを確認し、これらの新知見に基づき研究を更に進め、下記第３の発明に至ったものである。 The present invention has focused on the use of Pichia anomala, a yeast that does not belong to Saccharomyces cerevisiae, for the purpose of producing an alcoholic beverage containing more aroma components. As a result of selective separation of yeasts with respiratory mutations among yeast belonging to Pichia anomala, it is possible to obtain strains with low or no film-forming ability that are characteristic of the genus yeasts. Basically, the present invention was completed by finding for the first time that it has a novel property of low production of ethyl acetate.
Furthermore, we confirmed that yeasts with low film-forming ability can be isolated on the above-mentioned respiratory mutant selection medium without isolating yeast belonging to Pichia anomala from nature and carrying out mutation treatment, and research based on these new findings This has been further advanced to arrive at the following third invention.

こうして、第１の発明は、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法である。
「変異処理」としては、従来に酵母に対して用いられているいかなる方法を用いることができる。例えば、紫外線照射・放射線照射等の照射方法、変異剤（例えば、臭化エチジウム、エチルメタンサルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素など）を用いた化学的方法がある。これらの方法のうち、化学的方法（特に、臭化エチジウムを用いた方法）が簡便であることから好ましい。 Thus, the first invention is characterized in that a small colony is selectively separated on a respiratory mutant selection medium without or after mutation treatment of yeast belonging to Pichia anomala. Yeast breeding method with low or no film-forming ability.
As the “mutation treatment”, any method conventionally used for yeast can be used. For example, irradiation methods such as ultraviolet irradiation and radiation irradiation, and mutagen (eg, ethidium bromide, ethyl methanesulfonate, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, acridine dye, etc.) were used. There are chemical methods. Among these methods, a chemical method (particularly, a method using ethidium bromide) is preferable because it is simple.

本発明においては、上記変異処理を施すことができるが、主として変異酵母の選別に特色を有するものである。選別には、例えばＹＰＤＧ培地の様な呼吸変異株選択培地を使用する。
「呼吸変異株選択培地」とは、ピキア・アマノラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択するための培地を意味しており、その成分としては、酵母エキス、ポリペプトン、少量のグルコース（デキストロース）、及び主炭素源を含有する培地のことを意味している。 In the present invention, the above-described mutation treatment can be performed, but mainly has a feature in selecting mutant yeast. For selection, a respiratory mutant selection medium such as YPDG medium is used.
“Respiratory mutant selection medium” means a medium for selecting yeasts belonging to Pichia amanora with respiratory mutations, including yeast extract, polypeptone, a small amount of glucose ( Dextrose) and a medium containing a main carbon source.

主炭素源とは、酵母がその炭素源資化に呼吸酵素を必要とする物質のことを意味しており、例えばグリセロール、エタノール、乳酸、コハク酸が使用できる。上記各成分の具体的な濃度としては、酵母エキス０.１〜３ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、ポリペプトン０.２〜５ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、グルコース０.０１〜０.５ｗ／ｖ％（好ましくは０.０５〜０.３ｗ／ｖ％）、主炭素源１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは２〜５ｗ／ｖ％）を用いる。
ここで、本発明においては、主炭素源／グルコースの比（Ｒ）を１よりも大きくしておくことが好ましく、具体的には１０００〜２（好ましくは５００〜３、更に好ましくは２００〜５、更にさらに好ましくは１００〜１０）を用いる。また、培地のｐＨは、ｐＨ４.０〜ｐＨ７.０を用いる。 The main carbon source means a substance that requires a respiration enzyme for yeast to utilize the carbon source. For example, glycerol, ethanol, lactic acid, and succinic acid can be used. Specific concentrations of the above components include 0.1 to 3 w / v% yeast extract (preferably 0.5 to 2 w / v%), 0.2 to 5 w / v% polypeptone (preferably 0.5 to 0.5 w / v%). 2 w / v%), glucose 0.01-0.5 w / v% (preferably 0.05-0.3 w / v%), main carbon source 1-10 w / v% (preferably 2-5 w / v%) ) Is used.
Here, in the present invention, the main carbon source / glucose ratio (R) is preferably larger than 1, specifically 1000-2 (preferably 500-3, more preferably 200-5). More preferably, 100 to 10) is used. Further, the pH of the medium is pH 4.0 to pH 7.0.

なお、本明細書中において、「皮膜形成能が低下した」とは、皮膜形成能の低いものに加えて、皮膜形成能を失ったものを含む。
第２の発明は、上記第１の発明の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母である。
また、第３の発明は、上記第２の発明に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法である。 In the present specification, “the film forming ability is reduced” includes not only the film forming ability is low but also the film forming ability is lost.
The second invention is a yeast having a low or no film-forming ability which has been bred and separated by the method of the first invention.
Moreover, 3rd invention is a manufacturing method of the alcoholic drink manufactured using the yeast as described in said 2nd invention, and Saccharomyces cerevisiae.

本発明のピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低い又はない酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合、これまでただ一つのサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料よりも、多くの好ましい香気成分を含むものができ、品質の良いアルコール飲料を製造できる。 In the case of producing an alcoholic beverage using the yeast belonging to Pichia anomala of the present invention which has low or no film-forming ability and yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae at the same time, produced with only one yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae so far What contains more preferable aroma components than an alcoholic beverage made can be produced, and a quality alcoholic beverage can be manufactured.

次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明を実施するには、ピキア・アノマラに属する酵母を用い、皮膜形成能低い又はない酵母を分離する。そして、ピキア・アノマラに属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母であれば全ての酵母が使用可能であり、例えば清酒酵母（協会７号酵母等）、ワイン酵母（協会ブトウ酒１号酵母）が有効に使用できる。 Next, embodiments of the present invention will be described in detail, but the technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and can be implemented in various forms without changing the gist of the invention. be able to. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.
In practicing the present invention, yeast belonging to Pichia anomala is used to isolate yeast with low or no film-forming ability. Any yeast can be used as long as it belongs to Pichia anomala and yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae. Can be used for

＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞
ピキア・アノマラを、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）１０ｍｌで３０℃にて一晩振とう培養した。遠心分離により集菌した後、滅菌水で洗浄し、臭化エチジウム１０μｇ／ｍｌを含むイーストニトロゲン液体培地に約１０^７個／ｍｌとなるように植菌した。３０℃で一晩培養後、ＹＰＤＧ寒天培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グリセロール３ｗ／ｖ％、０.１％グルコース０.１ｗ／ｖ％、寒天２ｗ／ｖ％）上に約２００コロニーとなるように塗布し、小コロニーを形成する株を選択した。 <Yeast mutation treatment and selective separation of mutants>
Pichia anomala was cultured overnight at 30 ° C. in 10 ml of YPD liquid medium (yeast extract 1 w / v%, polypeptone 2 w / v%, glucose 2 w / v%). The cells were collected by centrifugation, washed with sterilized water, and inoculated into a yeast nitrogen liquid medium containing 10 μg / ml of ethidium bromide at a concentration of about 10 ⁷ cells / ml. After overnight culture at 30 ° C, on YPDG agar medium (yeast extract 1 w / v%, polypeptone 2 w / v%, glycerol 3 w / v%, 0.1% glucose 0.1 w / v%, agar 2 w / v%) The strain was applied so as to be about 200 colonies, and a strain forming a small colony was selected.

ここで、小コロニーとは、変異を起こしていない株のコロニーに比べて、成長が遅く、明らかに小さなものでプチット突然変異株を意味している。また、上記の方法によれば、約０．０１〜１％程度の割合で、変異株を取得することが可能である。
この様にして分離した酵母をＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）に植菌し、３０℃で３−７日間培養し、皮膜形成能の低い又はない酵母を取得することができる。 Here, the small colony means a petite mutant strain that is slow in growth and obviously small compared to a colony of a strain that has not undergone mutation. Moreover, according to said method, it is possible to acquire a mutant at a ratio of about 0.01 to 1%.
The yeast thus isolated was inoculated into a YPD liquid medium (yeast extract 1 w / v%, polypeptone 2 w / v%, glucose 2 w / v%) and cultured at 30 ° C. for 3-7 days. Low or no yeast can be obtained.

（実施例１）
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
ナバナの花より分離したピキア・アノマラに属する酵母（ＫＧ−２株）及び一般に清酒製造に利用されている清酒協会７号酵母（Ｋ−７０１株）を用い，単独及び双方の酵母を含む酒母で、表１に示す仕込配合により、総米５００ｇの仕込をし、清酒を製造した。 Example 1
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Using the yeast belonging to Pichia anomala (KG-2 strain) isolated from nabana flowers and the Sake Association No. 7 yeast (K-701 strain), which is generally used for sake manufacturing, According to the charging composition shown in Table 1, 500 g of total rice was charged to produce sake.

この清酒の製造では、麹米には精米歩合６０％（ｗ／ｖ）の乾燥麹（徳島精工株式会社製）を使用し、掛米には６０％（ｗ／ｖ）の山田錦を用いた。発酵温度は１５℃の一定温度で行った。Ｋ−７０１株とＫＧ−２株を同時に用いて時の酒母において、各酵母の菌数の比が１：１となるように調整した。留添後、２１日目に上槽し、上槽液の分析結果を表２に示す。 In the production of this sake, 60% (w / v) dried rice (made by Tokushima Seiko Co., Ltd.) was used for the polished rice, and 60% (w / v) Yamada Nishiki was used for the rice. . The fermentation temperature was a constant temperature of 15 ° C. Using the K-701 strain and the KG-2 strain at the same time, the ratio of the number of each yeast was adjusted to 1: 1 in the sake mother. On the 21st day after distillation, the upper tank was analyzed, and the analysis results of the upper tank liquid are shown in Table 2.

Ｋ−７０１単独で製成された清酒に比べて、Ｋ−７０１とＫＧ−２を用いて製成された清酒では、好ましい香気成分である酢酸イソアミル及びカプロン酸エチルが多く含まれていた。 Compared to sake made with K-701 alone, sake made with K-701 and KG-2 contained a large amount of isoamyl acetate and ethyl caproate, which are preferred aroma components.

（実施例２）
ピキア・アノマラＮＢＲＣ１０２１３（独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲）を親株とし、上記＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞に従って変異処理した後、皮膜形成の低い株Ｐ−２０を分離した。親株及びＰ−２０の両株とブドウ酒用協会１号酵母（ＯＣ−２：日本醸造協会）を用いて、小規模ワイン醸造を行った。なお、対照はブトウ酒用協会酵母１号のみを用いたもの、及び親株であるピキア・アノマラＮＢＲＣ１０２１３株とブドウ酒用協会１号酵母を同時に用いたものとした。 (Example 2)
Pichia Anomala NBRC 10213 (distributed by National Institute of Technology and Evaluation) was used as a parent strain, and after mutation treatment according to the above <Yeast mutation treatment and selective separation of mutant strain>, strain P-20 having low film formation was obtained. separated. Small scale wine brewing was performed using both the parent strain and P-20 strain and the grape wine association No. 1 yeast (OC-2: Japan Brewing Association). In addition, as a control, it was assumed that only the Butou Sake Association Yeast No. 1 was used, and the parent strain Pichia Anomala NBRC 10213 and the Sake Association No. 1 Yeast were used at the same time.

メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含むブドウ品種マスカットベリーに上記酵母を接種し、２５℃で３日間培養し、これを酒母とした。これら培養菌体をブドウ糖で２６％の糖度に調整された果汁（メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含む）に対して３ｖ／ｖ％植菌し、２０℃で１４日間発酵させた。
発酵終了後、発酵液を遠心分離し、上層液にメタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ添加した後、１５℃で貯蔵した。ワインの香気成分はヘッドスペースクロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表３に示す。 The above-mentioned yeast was inoculated into grape cultivar Muscat Berry containing 100 ppm of potassium metabisulfite, and cultured at 25 ° C. for 3 days. These cultured cells were inoculated with 3 v / v% of fruit juice (containing 100 ppm of potassium metabisulfite) adjusted to a sugar content of 26% with glucose and fermented at 20 ° C. for 14 days.
After completion of fermentation, the fermentation broth was centrifuged, and 100 ppm of potassium metabisulfite was added to the upper layer liquid, and then stored at 15 ° C. The aroma components of wine were measured using headspace chromatography, and the results are shown in Table 3.

サッカロミセス・セレビシェに属するＯＣ−２株とピキア・アノマラに属する酵母Ｐ−２０を同時に用いて製成されたワインの香気成分において、対照となるＯＣ−２及びＯＣ−２とＮＢＲＣ１０２１３株で造られたワインよりも果実様のカプロン酸エチルとカプリル酸エチルが多く含まれていた。 The aroma component of wine produced using the OC-2 strain belonging to Saccharomyces cerevisiae and the yeast P-20 belonging to Pichia anomala was produced with OC-2 and OC-2 serving as controls and the NBRC10213 strain. It contained more fruity ethyl caproate and ethyl caprylate than wine.

このように、本実施形態によれば、（１）ピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低下した変異株を取得することが可能であり、（２）この変異株とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合には、従来のように一種類のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料に比べて、多くの好ましい香気成分を含むアルコール飲料を製造できた。 Thus, according to this embodiment, (1) it is possible to obtain a mutant strain with reduced film-forming ability in yeast belonging to Pichia anomala, and (2) the mutant strain and Saccharomyces cerevisiae When alcoholic beverages were produced using yeasts belonging to the same, alcoholic beverages containing many preferred aroma components could be produced as compared to alcoholic beverages produced with yeast belonging to one kind of Saccharomyces cerevisiae as in the past. .

Claims

ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法。 Yeast with low or no film-forming ability characterized by selectively separating small colonies on a respiratory mutant selection medium after or without mutation treatment of yeast belonging to Pichia anomala Breeding method.

請求項１に記載の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母。 A yeast having low or no ability to form a film, which has been bred and separated by the method according to claim 1.

請求項２に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法。 A method for producing an alcoholic beverage produced by using the yeast according to claim 2 and Saccharomyces cerevisiae.