JP5959247B2

JP5959247B2 - 顕微鏡

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Publication number: JP5959247B2
Application number: JP2012057804A
Authority: JP
Inventors: 健彦林
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2016-08-02
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: JP2013190680A

Description

本発明は、観察試料のピント位置を自動調整可能な顕微鏡に関する。

近年、微細な試料の観察像を生成し、ビデオ画像として表示したり記録することができる顕微鏡装置が、生物分野における研究や工業分野における検査工程等において幅広く利用されている。

顕微鏡装置を用いて試料を観察する場合、ピント合わせを正確に行うことが必要となる。また、検査工程等のルーチン作業においては、検査時間を短縮するために、ピント合わせを素早く行うことが非常に重要となる。

顕微鏡装置におけるピント合わせ作業は、通常、顕微鏡装置に備えられた焦準ハンドルを操作して、観察試料に対する対物レンズの焦点を調節することで行われる。しかしながら、ピント合わせ作業を手動で行う場合、ユーザは、素早くピントを合わせられるようになるまで、ある程度習熟する必要がある。特に、高倍の対物レンズのように、焦点深度が浅く、合焦範囲が狭い場合には、かなりの習熟が要求される。
一方、ピント合わせ作業における操作性が悪い顕微鏡装置の場合、ユーザの疲労や生産効率の低下といった影響を及ぼすことがある。

このため、ピント合わせを自動的に行う自動合焦機能を備える顕微鏡装置について、数多くの提案がなされてきた。
例えば、特許文献１には、焦点検出光取得手段として２分割ディテクタを使用し、対物レンズごとに異なる合焦検出用の赤外光と実際に観察する可視光との波長差を補正すると共に、試料の光軸方向における任意の位置に対する合焦動作（フォーカスオフセット）を行うことができるように、光軸方向に一定量だけ移動可能なレンズを設けて、赤外光の焦点位置を調整する自動焦点検出顕微鏡が開示されている。

また、特許文献２には、焦点検出光取得手段としてＰＳＤ（受光素子）等のエリアセンサを用い、色収差補正及びフォーカスオフセットが可能な自動焦点検出顕微鏡が開示されている。

特開平１１−２４９０２７号公報特開昭６２−１３１２１９号公報

しかしながら、上記特許文献１に開示された自動焦点検出顕微鏡においては、合焦検出光学系内に移動機構を設けるため、装置の大型化及びコストの増加を招いてしまう。

一方、上記特許文献２においては、光学特性上、フォーカスオフセット量を広く確保するために、エリアセンサの受光面のサイズを大きくすることでスポット像の更なる変化を捉えられるようにするか、或いは、オートフォーカス（ＡＦ）光の標本側における実効的な開口数を下げることによって、スポット像の変化の感度を緩める必要がある。しかしながら、エリアセンサの受光面のサイズを大きくすると、当然ながらコストの増加につながってしまう。また、センサの大型化が可能だったとしても、フォーカスオフセット量が大きい領域では、スポット像の面積が大きくなり、単位面積あたりの光強度が低下するため、十分なＳ／Ｎを得ることができなくなる。一方、ＡＦ光の標本側における実効的な開口数を下げると、フォーカスオフセット量は広くなるが、合焦精度が低下してしまう。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、安価な構成で実現でき、合焦精度を犠牲にすることなく広範囲のフォーカスオフセットを行うことが可能な顕微鏡を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡は、対物レンズと、観察対象である試料が載置された保持部材と前記対物レンズとの相対距離を変化させる焦準手段と、第１の照明光を前記試料に投光する照明光学系と、前記第１の照明光が投光されることにより前記試料から出射し、前記対物レンズを通過した観察光を観察するための無限遠補正光学系である観察光学系と、前記第１の照明光及び前記観察光とは波長が異なる第２の照明光を発振する光源と、前記第２の照明光を前記対物レンズを通して前記試料に投光する共に、前記保持部材と前記試料との境界面である第１の反射面と、前記保持部材の第１の反射面とは反対側の面である第２の反射面とのいずれかで反射され、前記対物レンズを再び通過した前記第２の照明光を集光させる合焦検出光学系と、前記合焦検出光学系によって集光された前記第２の照明光を検出する焦点検出器と、前記焦点検出器により検出された前記第２の照明光の状態に応じて、前記第１又は第２の反射面と前記対物レンズの焦点位置との光軸方向における相対距離を算出する焦点位置算出手段と、前記試料の光軸方向における観察位置を設定する入力手段と、前記焦点位置算出手段の算出結果に基づいて、前記入力手段により設定された前記観察位置と前記対物レンズの焦点位置とを一致させるよう、前記焦準手段を制御する制御手段と、を備え、前記合焦検出光学系は、前記試料に投光される前記第２の照明光を集光光の状態で前記対物レンズに入射させることにより、前記第２の照明光の集光位置を前記対物レンズの焦点位置よりも該対物レンズ側にシフトさせるシフト手段を有する。

上記顕微鏡において、前記対物レンズは液浸系の対物レンズであり、前記対物レンズの焦点位置に対する前記第２の照明光の集光位置のシフト量は、前記入力手段によって設定可能な観察位置の範囲の１／２以下であることを特徴とする。

上記顕微鏡において、前記対物レンズは乾燥系の対物レンズであり、前記対物レンズの焦点位置に対する前記第２の照明光の集光位置のシフト量は、前記入力手段によって設定可能な観察位置の範囲の１／２以下の距離と前記保持部材の厚みとを足し合わせた量であることを特徴とする。

上記顕微鏡において、前記シフト手段は、前記光源から出射した前記第２の照明光を集束させるレンズと、前記レンズの位置を光軸に沿って移動させることにより、前記シフト量を変化させる移動手段と、を有することを特徴とする。

上記顕微鏡において、前記シフト手段は、前記光源から出射した前記第２の照明光の焦点距離の切換が可能なズーム光学系と、前記焦点距離を切り換えることにより、前記シフト量を変化させる切換手段と、を有することを特徴とする。

上記顕微鏡において、前記シフト手段は、複数のレンズからなるリレー光学系と、前記複数のレンズの間隔を調整することにより、前記シフト量を変化させる調整手段と、を有することを特徴とする。

本発明によれば、第２の照明光を集光光の状態で対物レンズに入射させて第２の照明光の集光位置を対物レンズの焦点位置よりも該対物レンズ側にシフトさせるシフト手段を合焦光学系に設けるので、受光センサを大型化することなく、安価且つ簡単な構成で、合焦精度を犠牲にすることなく広範囲なフォーカスオフセットを実行可能な顕微鏡を実現することができる。

図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡の構成を模式的に示す一部断面図である。図２は、図１のＡ−Ａにおける一部断面図である。図３は、図１に示すレボルバ近傍及びセンサヘッド内の構成を示す模式図である。図４は、図３に示すセンサヘッドの動作を説明するための模式図である。図５は、スポット像の重心位置の特性を示すグラフである。図６は、図５に示す各集光位置におけるスポット像を示す模式図である。図７は、変形例１における顕微鏡の動作を説明するための図である。図８は、変形例２における集束レンズの構成例を示す模式図である。図９は、図８に示すリレー光学系の動作を説明する図である。図１０は、実施の形態２に係る顕微鏡の一部の構成を示す模式図である。図１１は、実施の形態２におけるスポット像の状態を説明する図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、これら実施の形態によって本発明が限定されるものではない。また、各図面の記載において、同一部分には同一の符号を付して示している。図面は模式的なものであり、各部の寸法の関係や比率は、現実と異なることに留意する必要がある。図面の相互間においても、互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれる。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡の構成を模式的に示す一部断面図である。また、図２は、図１のＡ−Ａにおける顕微鏡本体内の一部断面図である。なお、図２においては、図１に示す落射蛍光投光管１３０及び励起フィルタ１３１の記載を省略している。

図１及び図２に示すように、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡１は、顕微鏡本体１０と、該顕微鏡本体１０の動作を制御する制御装置２０とを備える。

顕微鏡本体１０は、試料ＳＰの上方から試料ＳＰに照射され、該試料ＳＰを透過した透過光、又は試料ＳＰの下方から試料に照射され、該試料ＳＰによって反射された反射光を観察する所謂倒立型の顕微鏡である。顕微鏡本体１０は、試料ＳＰを載せた容器（ガラスボトムディッシュ）１００が載置される試料ステージ１０１と、試料ステージ１０１下方に配置された筐体１０２と、筐体１０２上に設けられた透過照明支柱１０３に取り付けられた透過照明用の光源１０４と、筐体１０２に取り付けられた落射照明用の光源１０５、筐体１０２に取り付けられたオートフォーカスセンサヘッド（以下、単にセンサヘッドともいう）１０６、及びＣＣＤ等の撮像素子１０７とを備える。

光源１０４は、試料ＳＰを透過観察する際に用いられる光源であり、可視領域の照明光を発生する。
透過照明支柱１０３内には、光源１０４から出射した照明光を試料ステージ１０１の方向に折り曲げるミラー１１１が設けられている。また、透過照明支柱１０３には、ミラー１１１が折り曲げた照明光を収束させるコンデンサレンズ１１２が取り付けられている。

試料ステージ１０１は、ミラー１１１が折り曲げた照明光の光路（透過照明光路）Ｌ１と直交する平面（ＸＹ平面）において移動可能に設けられている。また、試料ステージ１０１には、制御装置２０の制御の下で動作する焦準用モータ駆動部１０９によって駆動される焦準用モータ１０８が設けられており、制御装置２０を介した電気的な制御により、光路Ｌ１に沿って上下方向に移動可能となっている。なお、筐体１０２には、手動で合焦操作を行う際に用いられる焦準ハンドル１１０も設けられており、焦準ハンドル１１０を操作することにより、手動で試料ステージ１０１を上下方向に移動させることも可能である。

試料ステージ１０１には、照明光が透過可能な開口１０１ａが設けられており、この開口１０１ａを覆うように、試料ＳＰが入ったガラスボトムディッシュ１００が載置される。なお、本実施の形態１においては、試料ＳＰを保持する部材として、底面が透明なガラスからなり、側面に隔壁が設けられたガラスボトムディッシュ１００を用いているが、その代わりに、一般的なスライドガラスや、ウェルプレート等、底面が透明で試料ＳＰを保持可能な部材であれば、どのような部材を用いても良い。

試料ステージ１０１下方（筐体１０２内）の光路Ｌ１上には、レボルバ１２２によって交換可能に保持された対物レンズ１２１、１２１’と、ダイクロイックミラー１２３と、光路Ｌ１に挿脱可能に設けられた蛍光フィルタカセット１２４と、結像レンズ１２５と、光路切換プリズム１２６と、ミラー１２７とが配置されている。また、対物レンズ１２１と結像レンズ１２５は、無限遠補正光学系を構成している。ここで、無限遠補正光学系とは、一般に、標本から対物レンズを経た光線が対物レンズでは結像せずに、無限遠の平行光束として結像レンズに入り、結像レンズによって中間像を結ぶ光学系のことである。

レボルバ１２２には、図示しない複数の孔部が設けられており、各孔部に対物レンズ１２１、１２１’が挿入されている。なお、図１〜図３においては、レボルバ１２２に２つの対物レンズ１２１、１２１’が挿入されている状態を示しているが、レボルバ１２２には、孔部の数に応じて、さらに多くの（例えば、５つ）対物レンズを設けることも可能である。

また、レボルバ１２２には、制御装置２０の下で動作するレボルバ用モータ駆動部１４２によって駆動され、レボルバ１２２を回転させるレボルバ用モータ１４１が設けられている。ユーザは、制御装置２０を操作することにより、所望の対物レンズ１２１、１２１’を光路Ｌ１に挿入させることができる。なお、レボルバ１２２は、手動で回転させることも可能である。

さらに、レボルバ１２２には、どの孔部が光路Ｌ１に挿入されているかを検出するレボ孔位置検出部１４３が設けられている。制御装置２０は、どの孔部にどの倍率の対物レンズ１２１、１２１’が挿入されているかを対応付ける情報を予め保有しており、この情報と、レボ孔位置検出部１４３から出力信号とに基づいて、現在光路Ｌ１に挿入されている対物レンズ１２１の倍率を認識することができる。

ダイクロイックミラー１２３は、後述するオートフォーカスに用いられるレーザ光の波長成分（赤外領域）を反射させ、その他の波長成分（可視領域）を透過させる。具体的には、試料ＳＰを透過した透過照明光（観察光）や、試料ＳＰに照射させる落射照明光や、試料ＳＰによって反射された落射照明光（観察光）や、試料ＳＰから発生した蛍光光（観察光）等は、ダイクロイックミラー１２３を透過する。

蛍光フィルタカセット１２４は、試料ＳＰが蛍光色素により染色されている場合に、落射蛍光投光管１３０から出射した落射照明光のうち、当該蛍光色素を励起可能な波長成分（励起光）を選択的に透過する励起フィルタ１３１と、励起光を試料ＳＰの方向に選択的に反射すると共に、試料ＳＰにおいて蛍光色素が励起することにより発生した蛍光光を選択的に透過させるダイクロイックミラー１３２と、ダイクロイックミラー１３２を透過した蛍光光から不要な波長成分を吸収する吸収フィルタ１３３とを含む。蛍光フィルタカセット１２４において、これらの励起フィルタ１３１、ダイクロイックミラー１３２、吸収フィルタ１３３は、複数種類ずつ、ターレット等の切換機構により交換可能に用意されており、使用される蛍光色素に応じて適宜組み合わせて使用される。

光路切換プリズム１２６は、対物レンズ１２１を透過した試料ＳＰの観察光の一部を分岐し、観察光路Ｌ２上に設けられた撮像素子１０７に入射させる。結像レンズ１２５は、光路切換プリズム１２６によって分岐される観察光を撮像素子１０７が有する受光面において結像させる。撮像素子１０７が受光した観察光は、撮像素子１０７において電気信号に変換され、試料ＳＰの画像データとして、制御装置２０に出力される。

ミラー１２７は、光路切換プリズム１２６を透過した観察光を反射し、観察光路Ｌ３上に設けられた複数のリレーレンズ１２８を介して接眼レンズ１２９に入射する。ユーザは、接眼レンズ１２９を介して、試料ＳＰの拡大像を観察することができる。

一方、光源１０５は、試料ＳＰを蛍光観察する際に用いられる光源であり、例えば紫外領域の照明光を発生する水銀ランプによって構成される。また、筐体１０２内には、さらに、光源１０５が発生した光を透過照明光路Ｌ１の方向に導く落射蛍光投光管１３０が設けられている。蛍光フィルタカセット１２４は、落射蛍光投光管１３０と透過照明光路Ｌ１とが交差する位置に挿入可能となっている。

制御装置２０は、例えば、パーソナルコンピュータやワークステーション等によって構成される。制御装置２０は、制御部２１と、種々の命令や情報の入力を受け付けて制御部２１に入力する入力部２２と、制御部２１が実行する種々のプログラムや当該プログラムの実行中に使用される各種情報を記憶するメモリ２３と、表示部２４とを備える。

制御部２１は、例えば、ＣＰＵ等のハードウェアによって実現され、メモリ２３に記憶された所定のプログラムを読み込むことにより、顕微鏡１全体の動作を統括して制御する。

入力部２２は、例えば、キーボードやマウス等の入力デバイスのほか、各種操作ボタン等の入力部材を含んでも良い。例えば、入力部２２は、レボルバ１２２を回転させて所望の倍率の対物レンズ１２１、１２１’を光路Ｌ１に挿入させるための対物レンズ変換スイッチや、試料ステージ１０１を光路Ｌ１に沿って上下方向に移動させるための上下動スイッチや、オートフォーカス動作の設定及び解除を行うオートフォーカススイッチ等を含む。入力部２２は、これらの入力デバイスや入力部材に対する操作により入力された信号を受け付け、制御部２１に出力する。

メモリ２３は、例えば、顕微鏡１の制御プログラムを格納したＲＯＭと、当該制御に必要なデータを随時格納する揮発性メモリであるＲＡＭとによって実現される。
表示部２４は、ＬＣＤや有機ＥＬ等のディスプレイであり、制御部２１の制御の下で種々の画像や情報を表示する。

この他、制御装置２０は、制御信号の入出力を行なうＩ／Ｏポートや、これらの各部を互いに接続するデータバス（いずれも図示せず）を備えている。制御装置２０は、当該制御装置２０に接続される各種モータ駆動部や光源駆動部（発振器）やアドレスデコーダ等（いずれも後述）の周辺装置に対し、これらのＩ／Ｏポートやデータバスを介して制御を行う。

制御装置２０には、フォーカスオフセット値を変更する際の入力手段として、ジョグエンコーダ２６及びパルスカウンタ２７が設けられている。ジョグエンコーダ２６のエンコーダ信号はパルスカウンタ２７にてパルス数に変換されて制御部２１に入力される。制御部２１は、パルスカウンタ２７からのパルス数を読み込むことにより、ジョグエンコーダ２６がどちらの方向にどれだけ回転されたかを判断し、ジョグエンコーダ２６の回転量に応じてフォーカスオフセット値を変更する。

なお、フォーカスオフセット値の変更を入力する手段はジョグエンコーダ２６に限定されない。例えば、フォーカスオフセット値の増減を支持するボタンを入力部２２に設けるなどしても良い。この場合、制御部２１は、ボタンを押す回数や押している時間等に応じて、フォーカスオフセット値の変更を設定することとしても良い。

次に、センサヘッド１０６の内部構成及び動作について、詳細に説明する。図３は、顕微鏡本体１０のレボルバ１２２近傍及びセンサヘッド１０６内の構成を示す模式図である。また、図４は、センサヘッド１０６の動作を説明するための模式図である。

センサヘッド１０６は、オートフォーカスに使用されるレーザ光（以下、ＡＦ光という）を発振する基準光源１５０と、該基準光源１５０を制御部２１の制御の下で駆動する光源駆動部１５１と、基準光源１５０から出射したＡＦ光の光軸上に設けられたコリメートレンズ１５２と、偏光ビームスプリッタ１５３と、集束レンズ１５４と、λ／４波長板１５５と、コリメートレンズ１５２によってコリメートされたＡＦ光の一部をカットする投光側ストッパ１５６と、偏光ビームスプリッタ１５３によって反射されたＡＦ光の光路上に配置された集束レンズ１５７と、位置検出器（Position Sensitive Detector：ＰＳＤ）１５８と、増幅器１５９と、Ａ／Ｄ変換器１６０とを有する。

基準光源１５０としては、赤外線等の可視外光波長領域のレーザ光を発振可能な光源が使用される。基準光源１５０は、光源駆動部１５１の制御によりパルス点灯を行なうと共に、強弱をコントロールされる。

コリメートレンズ１５２は、基準光源１５０から出射したＡＦ光をコリメートする。
投光側ストッパ１５６は、コリメートされたＡＦ光のうち、ＡＦ光の光軸と直交する面における半分の領域をカットする。

偏光ビームスプリッタ１５３は、カットされなかった残りのＡＦ光のうちＰ偏光成分を透過させて、ダイクロイックミラー１２３の方向に導くと共に、ダイクロイックミラー１２３の方向からの入射する光のうちＳ偏光成分を反射して集束レンズ１５７の方向に導く。

集束レンズ１５４は、偏光ビームスプリッタ１５３を透過したＡＦ光をわずかに集束させる。
λ／４波長板１５５は、透過するＡＦ光を直線偏光から円偏光へ、または円偏光から直線偏光に変換する。センサヘッド１０６において、λ／４波長板１５５は、偏光ビームスプリッタ１５３を通過した直線偏光の方向に対して光学軸が４５°となるように配置される。

集束レンズ１５７は、偏光ビームスプリッタ１４３によって反射されたＡＦ光を集光して位置検出器１５８に結像させる。
位置検出器１５８は、ＡＦ光を入射させる受光面を有し、ＡＦ光が結像したスポットの位置に応じた電圧信号を出力する。
増幅器１５９は、位置検出器１５８が出力した電圧信号を所定の増幅率で増幅する。
Ａ／Ｄ変換器１６０は、増幅された電圧信号をディジタル値に変換して制御装置２０に出力する。

基準光源から出射したＡＦ光は、コリメートレンズ１５２によってコリメートされた後、投光側ストッパ１５６によって半分（図３においては、図の上半分）をカットされる。残りのＡＦ光は、偏光ビームスプリッタ１５３を通過してＰ偏光となり、集束レンズ１５４によって僅かに集束された後、その直線偏光の方向に対して光学軸が４５°となるように配置されたλ／４波長板１５５によって円偏光に変換させられる。このＡＦ光は、ダイクロイックミラー１２３によって反射され、対物レンズ１２１により１点に集光されて試料ＳＰ又はその近傍にスポット状の像を形成する。

この際、観察光学系においてはコリメート光が対物レンズ１２１により集光されて試料ＳＰに集光するのに対して、ＡＦ光は集束レンズ１５４により僅かに集束されているので、ＡＦ光の集光位置は、対物レンズ１２１の焦点位置（観察光の集光位置）よりも、対物レンズ１２１側（図３においては図の下側）にシフトする。

ここで、細胞等の生物標本を観察する場合、一般に、観察対象である試料ＳＰは３次元的な構造を有するため、ユーザは、試料ＳＰの内部、即ち、フォーカス基準面（例えば試料ＳＰとガラスボトムディッシュ１００との境界面）よりも光路Ｌ１に沿って試料ＳＰ側（図の上方）にオフセットした位置を観察する。このため、本実施の形態１においては、観察光の集光位置に対してＡＦ光の集光位置を対物レンズ１２１側にシフトさせるため、集束レンズ１５４によって僅かに集光させたＡＦ光を対物レンズ１２１に入射させている。

試料ＳＰにより反射されたＡＦ光は、対物レンズ１２１及びダイクロイックミラー１２３を介してλ／４波長板１５５を通過し、この際に、円偏光からＳ偏光となる。このＳ偏光のＡＦ光は、集束レンズ１５４を通過した後、偏光ビームスプリッタ１５３によって反射され、集束レンズ１５７により集光されて、位置検出器１５８の受光面に結像する。それにより、位置検出器１５８から、ＡＦ光のスポットの位置に応じた電圧信号が出力される。この電圧信号は、増幅器１５９によって所定の増幅率で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器１６０によりディジタル値に変換され、ＡＦ光のスポット像面データとして制御装置２０に出力される。制御装置２０は、このスポット像面データに基づいて、境界面Ｃ１と対物レンズ１２１の焦点位置との間の光軸方向における相対距離を算出して、オートフォーカスを実行する。

次に、対物レンズ１２１の焦点位置に対するＡＦ光の集光位置のシフト量δの決定方法について、図４〜６を参照しながら説明する。図４（ａ）〜（ｃ）の各々において、上図は、観察光及びＡＦ光の集光位置近傍を拡大して示しており、下図は、上図の状況において位置検出器１５８の受光面に結像するＡＦ光のスポット像を示している。なお、図４においては、試料ステージ１０１の記載を省略している。

本実施の形態１においては、ガラスボトムディッシュ１００内の試料ＳＰが生物標本であり、対物レンズ１２１が液浸系（例えば、オイルイマージョンタイプ）の対物レンズである場合について説明する。この場合、図４に示すように、ガラスボトムディッシュ１００と対物レンズ１２１との間の空間は、イマージョンオイルＬＱによって満たされる。

一般に、生物標本の屈折率は水の屈折率（１．３）の近傍であり、試料ＳＰ内部においてほぼ均一である。また、ガラスボトムディッシュ１００及びイマージョンオイルＬＱの屈折率は約１．５である。従って、ガラスボトムディッシュ１００と試料ＳＰとの境界面Ｃ１における反射率は約０．４％となり、イマージョンオイルＬＱとガラスボトムディッシュ１００との境界面Ｃ２における反射率は約０％となる。このため、対物レンズ１２１によって試料ＳＰ又はその近傍に集光されるＡＦ光は、境界面Ｃ２ではほとんど反射されず、主に、境界面Ｃ１で反射される。

このような状況の下で、図４（ａ）に示すように、観察光及び照明光の集光位置（対物レンズ１２１の焦点位置）が境界面Ｃ１と一致する場合を想定する。この場合、ＡＦ光の集光位置は境界面Ｃ１よりも下方、即ち、ＡＦ光が境界面Ｃ１に到達する手前の点となる。このため、ＡＦ光は、一旦集光した後、再び拡散した状態で境界面Ｃ１において反射される。従って、ＡＦ光のスポット像ＩＭ１の範囲はある程度広がり、広がった分だけ単位面積当たりの光強度は弱くなる。また、スポット像ＩＭ１の重心位置Ｇは、位置検出器１５８の像面の中心Ｃ（ＡＦ光の光軸Ｌ４に対応する点）から偏った位置となる。

次に、図４（ｂ）に示すように、対物レンズ１２１が試料ＳＰに若干近づき、観察光及び照明光の集光位置が試料ＳＰの内部に入り、ＡＦ光の集光位置が境界面Ｃ１と一致する場合を想定する。この場合、ＡＦ光のスポット像ＩＭ２は、像面の中心Ｃの１点に集光し、光強度は最も強くなる。

さらに、図４（ｃ）に示すように、対物レンズ１２１が試料ＳＰにさらに近づき、観察光及び照明光の集光位置が試料ＳＰのさらに深い位置に入り、ＡＦ光の集光位置も境界面Ｃ１を超えて試料ＳＰの内部に入る場合を想定する。この場合、ＡＦ光は、集光する前の拡散した状態で境界面Ｃ１において反射される。従って、ＡＦ光のスポット像ＩＭ３の範囲はある程度広がり、広がった分だけ単位面積あたりの光強度は弱くなる。

このように、試料ＳＰに対する観察光（照明光）及びＡＦ光の集光位置を変化させることにより、位置検出器１５８の受光面に結像するスポット像の単位面積当たりの光強度及び重心位置Ｇが変化する。

図５は、ＡＦ光の集光位置に対するスポット像の重心位置の特性を示すグラフである。図５において、横軸は、光路Ｌ１（Ｚ軸）上におけるＡＦ光の集光位置を示す。縦軸は、位置検出器１５８の受光面におけるスポット像の重心位置Ｇのｙ座標を示す。この重心位置（ｙ座標の値）は、位置検出器１５８の出力信号に基づき、受光面における輝度分布から算出したものである。また、図６（ａ）〜（ｇ）は、図５に示す集光位置Ｐ_a〜Ｐ_gにおけるスポット像をそれぞれ示している。

図５に示すように、スポット像の重心位置の特性は、ｙ＝０となる集光位置Ｐ_d（ＡＦの集光位置が境界面Ｃ１と一致している状態：（図４（ｂ）参照）を中心として、対称に表れる。

このうち、集光位置Ｐ_b〜Ｐ_fに対応する図６（ｂ）〜（ｆ）において、スポット像は、集光位置がＰ_dから離れるほど大きくなり、その重心位置Ｇは中心Ｃから離れていく。このため、図５の集光位置Ｐ_b〜Ｐ_fの間の領域は、重心位置Ｇが線形に変化する線形領域となっている。

また、集光領域Ｐ_a、Ｐ_b、Ｐ_f、Ｐ_gに対応する図６（ａ）、（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）において、スポット像は、一部が受光面からはみ出すほど、受光面の半分の領域いっぱいに広がっている。このため、重心位置Ｇは受光面の半分の領域のほぼ中央の位置となりあまり変化しない。従って、図５の集光位置Ｐ_a〜Ｐ_b、及びＰ_f〜Ｐ_gの領域は、重心位置Ｇの変化が少ないプラトー領域となっている。

なお、プラトー領域の外側は、スポット像の単位面積あたりの光強度が低下し、電気系の暗ノイズ等に埋もれてしまうため、有効な出力強度（輝度情報）が検出されない領域である。

このような重心位置の特性のうち、線形領域（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）においては、ＡＦ光の集光位置と重心位置Ｇとが一意に決まるため、フォーカスオフセットを行うことが可能となる。しかしながら、線形領域の端部における誤差等を考慮しマージンを取って、実際には、線形領域の一部の領域（例えば、１／２以下の領域）をフォーカスオフセット範囲とすることが好ましい。そこで、本実施の形態１においては、線形領域（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）の約１／２の範囲である集光位置Ｐ_c〜Ｐ_eをフォーカスオフセット範囲として設定している。即ち、対物レンズ１２１の焦点位置に対するＡＦ光の集光位置のシフト量δがδ＝｜Ｐ_c−Ｐ_d｜となるように、集束レンズ１５４を含む光学系の構成を決定する。

次に、顕微鏡１におけるオートフォーカス動作について説明する。
入力部２２に設けられたオートフォーカススイッチが押下されると、制御部２１は、光源駆動部１５１に対し、動作を開始させる制御信号を出力する。それに応じて、光源駆動部１５１は、基準光源１５０の発振を開始させる。基準光源１５０から出射したＡＦ光は、コリメートレンズ１５２、偏光ビームスプリッタ１５３、集束レンズ１５４、λ／波長板１５５、ダイクロイックミラー１２３、及び対物レンズ１２１を介して、試料ＳＰ又はその近傍に集光する。

また、制御部２１は、焦準用モータ駆動部１０９に動作を開始させる制御信号を出力する。それに応じて、焦準用モータ駆動部１０９は、焦準用モータ１０８を駆動して試料ステージをＺ方向に沿って移動させ、試料ステージ１０１に対する対物レンズ１２１の相対距離を変化させる。

ここで、ＡＦ光の集光位置が図５に示す線形領域（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）にある間、重心位置ＧとＡＦ光の集光位置との関係が一意に決まるため、制御部２１は、その間、位置検出器１５８の出力信号を取り込み、スポット像の重心位置Ｇを算出する。そして、算出した重心位置Ｇを、対物レンズの倍率ごとに設定されてメモリ２３に予め記憶されているＡＦ目標値と比較し、その差分から、周知の比較制御等を用いて焦準用モータ駆動部１０９を制御することにより、オートフォーカスを実行する。

なお、オートフォーカス動作を集光位置Ｐ_b〜Ｐ_fの範囲外から実行する場合、制御部２１は、まず、位置検出器１５８の出力信号をモニタしながら焦準用モータ駆動部１０９を動作させて、光強度が所定値以上になる領域をラフにサーチする。そして、ＡＦ光の集光位置が線形の領域（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）に入った時点で、上述した比較制御等により、線形の領域内を詳細にサーチすれば良い。

また、この比例制御による追い込み動作を連続的に繰り返し実行することで、通常、時間の経過につれて環境温度の変動や、顕微鏡本体の発熱等によって発生するフォーカスドリフトを補正することができる。つまり、時間を追って顕微鏡のフォーカス位置を安定的に維持することができるようになるため、例えば、長時間にわたって生細胞試料の変化を観察するタイムラプス観察に非常に有効である。

次に、上述したオートフォーカス動作の実行中に設定されるフォーカスオフセットについて説明する。
オートフォーカス動作中、制御部２１は、パルスカウンタ２７の出力信号に基づいてジョグエンコーダ２６をモニタする。そして、ジョグエンコーダ２６において回転を示す信号が発生した場合、制御部２１は、当該回転量に応じてフォーカスオフセット値を変更する。より詳細には、制御部２１は、回転量に応じたフォーカスオフセット値を、対物レンズ１２１ごとに設定され、予めメモリ２３に記憶されているＡＦ目標値に加算して、ＡＦ目標位置を更新する。そして、現在のＰＳＤ出力値と更新されたＡＦ目標値とを比較して、その差分がゼロとなるように、比較制御等を用いて焦準用モータ駆動部１０９を制御することにより、試料ステージ１０１を移動させる。このような動作を繰り返し実行することで、オートフォーカス動作によって検出された合焦位置に対してフォーカスオフセット値が付加設定され、ユーザが観察したい部位に合焦させることができる。

なお、このように、ユーザの操作によりジョグエンコーダ２６から入力された信号に基づいてフォーカスオフセット値又はＡＦ目標位置が変更された場合、制御部２１は、変更後のフォーカスオフセット値又はＡＦ目標位置を、そのときの光路Ｌ１に挿入されていた対物レンズ１２１と関連付けてメモリ２３内に記憶させても良い。この場合、一旦対物レンズ１２１を交換した後でも、再び同じ対物レンズ１２１を使用する際には、メモリ２３に記憶された情報に基づいて、変更後のフォーカスオフセット値に対してオートフォーカス動作を再開させることができる。従って、ユーザは、対物レンズ１２１を交換するたびにフォーカスオフセット値を設定し直すことなく、常に観察したい位置に正確にピントがあった状態から試料ＳＰの観察を開始することが可能となる。また、対物レンズごとに異なる色収差もＡＦ目標位置に反映されるので、常に高精度な観察を行うことが可能となる。

ここで、上述したように、本実施の形態１においては、フォーカスオフセットの実行範囲を制限している。即ち、集光位置Ｐ_cがフォーカスオフセットの下限であり、集光位置Ｐ_dに対して集光位置Ｐ_cと対称な集光位置Ｐ_eがフォーカスオフセットの上限である。このため、制御部２１は、ユーザの操作によりジョグエンコーダ２６から入力された信号に基づいて変更されたフォーカスオフセット値が、上記実行範囲の上限又は下限に達した場合、図示しない警告ランプやブザー等の手段により、その旨をユーザに通知するようにしても良い。

次に、本実施の形態１において、対物レンズ１２１の焦点位置に対してＡＦ光の集光位置よりも対物レンズ１２１側にシフトさせてフォーカスオフセットを行う理由を説明する。

ＡＦ光の検出にエリアセンサやラインセンサを用いた汎用的な顕微鏡においては、通常、対物レンズの焦点位置とＡＦ光の集光位置とが、サブミクロンオーダの色収差はあるにせよ、ほぼ一致するように構成されている。つまり、この場合、対物レンズ１２１の焦点位置に対するＡＦ光の集光位置のシフト量δがほぼ０であるため、ＡＦ光の集光位置が図５に示すＺ＝Ｐ_dにある時、対物レンズ１２１の焦点位置は、図４に示す境界面Ｃ１にあることになる。しかしながら、観察者が観察したい場所は、通常、境界面Ｃ１よりも上側（試料ＳＰの内部）にあるので、フォーカスオフセットする場合に使用可能な領域は、図５に示すＺ＝Ｐ_dより上側に限定される。言い換えれば、重心位置ＧとＡＦ光の集光位置との関係が一意に決まる線形領域がＺ＝Ｐ_bからＺ＝Ｐ_fまであるにもかかわらず、有効に活用できる領域が、Ｚ＝Ｐ_dからＺ＝Ｐ_fの領域に限定されてしまう。

このような構成の顕微鏡においてフォーカスオフセットを行う場合、広範囲のフォーカスオフセット量を確保するためには、図５に示す重心位置の特性における線形領域（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）を拡大する必要がある。

そのために考えられる方法として、ＡＦ光を検出するセンサとして、より大型のセンサを用いることが挙げられる。それにより、図６に示すように、ＡＦ光の集光位置が境界面Ｃ１に一致している状態（図６（ｄ）の状態）から離れて、スポット像が大きくなった場合であっても、スポット像の変化を十分に捉えることができる。

しかしながら、この場合、センサの大型化によるコスト増加を招いてしまう。また、センサを大型化したとしても、スポット像の単位面積あたりの光強度は面積に反比例して低下する。このため、スポット像を徐々に拡大していった場合、当初は重心位置が線形に変化していても、重心位置の変化がプラトー領域に達する前にノイズに埋もれてしまうことが考えられる。

この問題を解決するためには、ＡＦ光の強度をオートフォーカス動作の段階に応じて変化させたり、センサや増幅器のＳ／Ｎを改良したりすることが考えられるが、装置構成が複雑になり、やはりコスト増加につながってしまう。

広範囲のフォーカスオフセット量を確保するための別の方法として、重心位置の特性における線形領域の傾きを緩めることが考えられる。これは、対物レンズ１２１から試料ＳＰに向かって集束するＡＦ光のＮＡを低下させることに実現される。しかしながら、この場合、ＡＦ光の集光位置の変化に対するセンサの感度が鈍くなってしまう。従って、オートフォーカスの合焦精度とのトレードオフになってしまう。

それに対して、本実施の形態１においては、ＡＦ光の集光位置を対物レンズ１２１の焦点位置よりも対物レンズ１２１側に意図的にシフトさせることにより、フォーカスオフセット可能な範囲を、必要な分だけ広く取ることができる。即ち、重心位置の特性における線形領域は位置検出器１５８のスペックによって決定されるが、実施の形態１によれば、従来は有効に活用されていなかった、境界面Ｃ１よりも下側に対応する線形領域（図５のＺ＝Ｐ_b〜Ｐ_d）を有効活用できるようになる。

以上説明したように、実施の形態１によれば、広範囲なフォーカスオフセットを行うことが可能な顕微鏡を、ＡＦ光を検出するセンサを大型化したり、Ｓ／Ｎの向上等の対策を採ることなく、また、合焦精度を犠牲にすることなく、安価な構成で実現することが可能となる。

（変形例１）
次に、上記実施の形態１と同様の構成の顕微鏡１において、乾燥系の対物レンズを用いる場合について、図７を参照しながら説明する。
この場合、ガラスボトムディッシュ１００と対物レンズ１２１との間の空間は空気（屈折率１）で満たされるため、ガラスボトムディッシュ１００と試料ＳＰとの境界面Ｃ１における反射率が約０．４％であるのに対し、ガラスボトムディッシュ１００と空気との境界面Ｃ２における反射率が圧倒的に大きくなる。このため、対物レンズ１２１によって試料ＳＰ又はその近傍に集光されるＡＦ光は、境界面Ｃ２においてほとんど反射されることになる。

このような状況の下で、まず、図７（ａ）に示すように、観察光及び照明光の集光位置（対物レンズ１２１の焦点位置）が境界面Ｃ１と一致する場合を想定する。この場合、ＡＦ光の集光位置は境界面Ｃ２よりも下方、即ち、ＡＦ光が境界面Ｃ２に到達する手前の点となる。このため、ＡＦ光、一旦集光した後、再び拡散した状態で境界面Ｃ２において反射されるので、ある程度範囲が広がったスポット像ＩＭ１’が得られ、その重心位置Ｇは中心Ｃからずれた位置となる。

次に、図７（ｂ）に示すように、対物レンズ１２１が試料ＳＰに若干近づき、観察光及び照明光の集光位置が試料ＳＰの内部に入り、ＡＦ光の集光位置が境界面Ｃ２と一致する場合を想定する。この場合、スポット像ＩＭ２’は、像面の中心Ｃの１点に集光し、光強度は最も強くなる。

さらに、図７（ｃ）に示すように、対物レンズ１２１が試料ＳＰにさらに近づき、観察光及び照明光の集光位置が試料ＳＰのさらに深い位置に入り、ＡＦ光の集光位置も境界面Ｃ１を超えて試料ＳＰの内部に入る場合を想定する。この場合、ＡＦ光は集光する前の拡散した状態で境界面Ｃ２において反射されるので、スポット像ＩＭ３’の範囲はある程度広がり、その重心位置Ｇは、中心Ｃからずれた位置となる。

このような乾燥系の対物レンズを用いる場合、ＡＦ光の集光位置が境界面Ｃ２上にあるとき（図７（ｂ）参照）、図５に示す重心位置の特性においては線形領域の中心（集光位置Ｐ_d）となる。従って、この場合、対物レンズの焦点位置に対するＡＦ光の集光位置のシフト量δ’を、フォーカスオフセット可能な範囲（集光位置Ｐ_b〜Ｐ_f）の１／２程度の距離にガラスボトムディッシュ１００の厚みΔｃを加えた量に設定すれば良い。

（変形例２）
上記実施の形態１とその変形例１においては、液浸系対物レンズと乾燥系対物レンズとで、対物レンズの焦点位置に対するＡＦ光の集光位置のシフト量δ、δ’が異なっている。そこで、集束レンズ１５４を、手動又は電動で焦点距離の切換が可能なズーム光学系で構成し、対物レンズの焦点距離とＡＦ光の集光位置との間のシフト量を２段階以上で切り換える切換手段を設けることにより、液浸系の対物レンズと乾燥系対物レンズとの両方で使用可能な顕微鏡を実現することができる。或いは、集束レンズ１５４を光軸に沿って移動させる移動手段を設けることにより、対物レンズの焦点距離とＡＦ光の集光位置との間のシフト量を変化させるようにしても良い。

（変形例３）
図３に示す集束レンズ１５４は、例えば図８（ａ）、（ｂ）に示すような２つのレンズを含むリレー光学系で構成しても良い。
図８（ａ）に示す構成は、互いに焦点に近い位置に配置された２枚の正のレンズ１７１、１７２と、レンズ１７２の光軸方向に駆動するモータ１７３とを含む。一方、図８（ｂ）においては、互いに焦点に近い位置に配置された正のレンズ１７４及び負のレンズ１７５と、レンズ１７５を光軸方向に駆動するモータ１７６とを含む。なお、いずれの構成においてもレンズ１７２、１７５の移動をガイドするガイド手段は省略されている。

このようなリレー光学系によれば、当該リレー光学系を構成するレンズのいずれかを光軸方向に移動させて、両者の間隔を調整することにより、リレー光学系に入射するＡＦ光の集束状態を変化させ、対物レンズ１２１（図３参照）を通過した後のＡＦ光の集光位置を任意の位置に変化させることができる。この作用について、正のレンズ１７１、１７２からなるリレー光学系の場合を例として、図９を参照しながら説明する。

例えば、図９（ａ）に示すレンズ１７１、１７２の配置に対し、図９（ｂ）に示すように、レンズ１７２を図の左方向に長さＤだけシフトさせると、対物レンズ１２１によって集光されたＡＦ光の集光位置は図の右方向に長さｄだけシフトする。これらのシフト量Ｄ、ｄの関係は、レンズ１７１、１７２及び対物レンズ１２１各々の焦点距離とレンズ間隔とによって一意に決まる。従って、このようなリレー光学系によれば、対物レンズ１２１の焦点位置とＡＦ光の集光位置との間のシフト量δ又はδ’を任意の量に設定することができる。

即ち、液浸系対物レンズを用いる場合には、フォーカスオフセット可能な範囲の約１／２に相当する距離だけ、対物レンズの焦点位置に対してＡＦ光の集光位置がシフトするように、レンズ１７２の位置を決定すれば良く、乾燥系対物レンズを用いる場合には、フォーカスオフセット可能な範囲の約１／２に相当する距離にガラスボトムディッシュ１００の厚みΔｃを加えた距離だけ、対物レンズの焦点位置に対してＡＦ光の集光位置がシフトするように、レンズ１７２の位置を決定すれば良い。それにより、液浸系対物レンズと乾燥系対物レンズとの両方で使用可能な顕微鏡を実現することができる。

なお、上記説明においては、レンズ１７２、１７５をモータ１７３、１７６により電動で移動させることとしたが、手動で移動させる機構としても良い。又、上記説明においては、レンズ１７２、１７５を任意の位置に移動可能としたが、少なくとも２種類の位置に段階的に位置決め可能な構成としても良い。さらに、図８（ａ）においてはレンズ１７２側を移動させるようにしたが、レンズ１７３側を移動させても良い。同様に、図８（ｂ）においてはレンズ１７５側を移動させるようにしたが、レンズ１７４側を移動させるようにしても良い。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
図１０は、実施の形態２に係る顕微鏡の一部の構成を示す模式図である。
図１０に示すように、実施の形態２に係る顕微鏡（以下、単に顕微鏡ともいう）１は、図３に示すオートフォーカスセンサヘッド（以下、単にセンサヘッドともいう）１０６の代わりに、オートフォーカスセンサヘッド１８０を備える。なお、実施の形態２に係る顕微鏡におけるオートフォーカスセンサヘッド１８０以外の構成については、図１及び図２に示すものと同様である。

センサヘッド１８０は、図３に示すコリメートレンズ１５２及び投光側ストッパ１５６の代わりに、コリメータレンズ１８１を備える。また、基準光源１５０及びコリメータレンズ１８１は、偏光ビームスプリッタ１５３及び集束レンズ１５４とは光軸同士をずらして配置されており、基準光源１５０から出射したＡＦ光は、コリメータレンズ１８１によってコリメートされた後、偏光ビームスプリッタ１５３を通過して集束レンズ１５４に入射する。

また、センサヘッド１８０は、ＡＦ光のスポット像を検出する受光センサとして、図３に示す位置検出器１５８の代わりに、ＣＣＤセンサ１８２を備える。センサヘッド１８０におけるそれ以外の構成については、実施の形態１と同様である。

このようなセンサヘッド１８０の構成の場合、図１１に示すように、ＣＣＤセンサ１８２の受光面に形成されるスポット像ＩＭ４〜ＩＭ６は円形を保ちつつ、ＡＦ光の集光位置に応じて、重心位置や変形や光強度を変化させる。ＣＣＤセンサ１８２は、検出したスポット像の輝度を表す出力信号を制御部２１に出力する。

この場合、制御部２１は、ＣＣＤセンサ１８２からの出力信号に基づいて、スポット像ＩＭ４〜ＩＭ６の重心位置Ｇを算出する。ＣＣＤセンサ１８２の場合、スポット像ＩＭ４〜ＩＭ６の重心位置Ｇを、ピクセル以下の計算値として出力可能であり、十分な分解能を得ることができる。この後、制御部２１は、実施の形態１と同様にして、重心位置Ｇを用いたオートフォーカス動作及びフォーカスオフセット動作を実行する。

以上説明したように、実施の形態２によれば、スポット像を検出する受光センサを大型化することなく、また、合焦精度を犠牲にすることなく、簡単な構成で広範囲のフォーカスオフセットを行うことが可能となる。

以上説明した実施の形態１及び２において、スポット像を検出する受光センサは、２次元ＰＳＤ又はＣＣＤに限定されず、例えば、１次元のＰＳＤやＣＣＤや２分割のフォトディテクタをスポット像の移動方向に沿って配置して受光センサを構成しても良い。

また、実施の形態１及び２においては、集束レンズ１５４を省略しても良い。この場合、コリメートレンズ１５２、１８１を光軸方向にずらすことにより、基準光源１５０から出射したＡＦ光を集束光として対物レンズ１２１に入射させることが可能となる。

また、実施の形態１及び２においては、試料ステージ１０１を移動させることにより、対物レンズ１２１との相対距離を変化させ、フォーカス調整を行っているが、反対に、試料ステージ１０１を固定し、対物レンズ１２１を保持するレボルバ１２２を移動させても良い。或いは、試料ステージ１０１及びレボルバ１２２の両方を移動させても良い。

以上説明した実施の形態は、本発明を実施するための例にすぎず、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本発明は、各実施の形態や変形例に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成できる。本発明は、仕様等に応じて種々変形することが可能であり、更に本発明の範囲内において、他の様々な実施の形態が可能である。

１顕微鏡
１０顕微鏡本体
２０制御装置
２１制御部
２２入力部
２３メモリ
２４表示部
２６ジョグエンコーダ
２７パルスカウンタ
１００ガラスボトムディッシュ
１０１ａ開口
１０１試料ステージ
１０２筐体
１０３透過照明支柱
１０４１０５光源
１０６オートフォーカスセンサヘッド
１０７撮像素子
１０８焦準用モータ
１０９焦準用モータ駆動部
１１０焦準ハンドル
１１１ミラー
１１２コンデンサレンズ
１２１、１２１’ 対物レンズ
１２２レボルバ
１２３ダイクロイックミラー
１２４蛍光フィルタカセット
１２５結像レンズ
１２６光路切換プリズム
１２７ミラー
１２８リレーレンズ
１２９接眼レンズ
１３０落射蛍光投光管
１３１励起フィルタ
１３２ダイクロイックミラー
１３３吸収フィルタ
１４１レボルバ用モータ
１４２レボルバ用モータ駆動部
１４３レボ孔位置検出部
１５０基準光源
１５１光源駆動部
１５２コリメートレンズ
１５３偏光ビームスプリッタ
１５４、１５７集束レンズ
１５５ λ／４波長板
１５６投光側ストッパ
１５８位置検出器
１５９増幅器
１６０Ａ／Ｄ変換器
１７１、１７２、１７４、１７５レンズ
１７３、１７６モータ
１８０オートフォーカスセンサヘッド
１８１コリメータレンズ
１８２ＣＣＤセンサ

Claims

対物レンズと、
観察対象である試料が載置された保持部材と前記対物レンズとの相対距離を変化させる焦準手段と、
第１の照明光を前記試料に投光する照明光学系と、
前記第１の照明光が投光されることにより前記試料から出射し、前記対物レンズを通過した観察光を観察するための無限遠補正光学系である観察光学系と、
前記第１の照明光及び前記観察光とは波長が異なる第２の照明光を発振する光源と、
前記第２の照明光を前記対物レンズを通して前記試料に投光する共に、前記保持部材と前記試料との境界面である第１の反射面と、前記保持部材の第１の反射面とは反対側の面である第２の反射面とのいずれかで反射され、前記対物レンズを再び通過した前記第２の照明光を集光させる合焦検出光学系と、
前記合焦検出光学系によって集光された前記第２の照明光を検出する焦点検出器と、
前記焦点検出器により検出された前記第２の照明光のスポット像の重心情報から、前記第１又は第２の反射面と前記対物レンズの焦点位置との光軸方向における相対距離を算出する焦点位置算出手段と、
前記試料の光軸方向における観察位置を設定する入力手段と、
前記焦点位置算出手段の算出結果に基づいて、前記入力手段により設定された前記観察位置と前記対物レンズの焦点位置とを一致させるよう、前記焦準手段を制御する制御手段と、
を備え、
前記合焦検出光学系は、前記試料に投光される前記第２の照明光を集光光の状態で前記対物レンズに入射させることにより、前記第２の照明光の集光位置を前記対物レンズの焦点位置よりも該対物レンズ側にシフトさせるシフト手段を有し、
前記制御手段は、前記シフト手段によって前記第２の照明光の集光位置を前記対物レンズの焦点位置よりも該対物レンズ側にシフトさせた状態のまま、前記第２の照明光の集光位置を移動することなく、設定された前記観察位置と前記対物レンズの焦点位置とを一致させるよう前記焦準手段を制御することを特徴とする顕微鏡。
前記対物レンズは液浸系の対物レンズであり、
前記対物レンズの焦点位置に対する前記第２の照明光の集光位置のシフト量は、前記入力手段によって設定可能な観察位置の範囲の１／２以下であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記対物レンズは乾燥系の対物レンズであり、
前記対物レンズの焦点位置に対する前記第２の照明光の集光位置のシフト量は、前記入力手段によって設定可能な観察位置の範囲の１／２以下の距離と前記保持部材の厚みとを足し合わせた量であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記シフト手段は、
前記光源から出射した前記第２の照明光を集束させるレンズと、
前記レンズの位置を光軸に沿って移動させることにより、前記シフト量を変化させる移動手段と、
を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
前記シフト手段は、
前記光源から出射した前記第２の照明光の焦点距離の切換が可能なズーム光学系と、
前記焦点距離を切り換えることにより、前記シフト量を変化させる切換手段と、
を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
前記シフト手段は、
複数のレンズからなるリレー光学系と、
前記複数のレンズの間隔を調整することにより、前記シフト量を変化させる調整手段と、
を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。