JP5945538B2 - ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の安定な製剤 - Google Patents

Description

本発明は、本明細書に記載するように、免疫原性組成物としてのナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の製剤に関する。また、本発明は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の立体構造を保存する方法、およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の効力を決定するための方法にも関する。

ｒＬＰ２０８６は、いくつかのナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する交差反応性細菌抗体を誘発する、組換えの２８キロダルトンのリポタンパク質である。推定されるアミノ酸配列相同性に基づいて、ｒＬＰ２０８６の２つの異なるサブファミリー、すなわち、ＡおよびＢが同定された。これら２つのサブファミリーが、種々のレベルのポリソルベート８０（ＰＳ−８０）を伴って、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム中に各２０、６０、１２０および２００μｇ／ｍＬを含有する、ＭｎＢ−ｒＬＰ２０８６ワクチン試料の製剤において使用された。ポリソルベート８０は、ＴＷＥＥＮ８０としてもまた公知であり、ソルビトールから誘導された非イオン性界面活性物質かつ乳化剤であり、医薬製剤中では、乳化剤、可溶化剤および安定化剤として頻繁に使用される。ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６免疫原性組成物中のポリソルベート８０の存在が、製剤化、加工、ろ過、充填および輸送の間の凝集を阻止し、フィルターメンブランの吸収を低下させ、チューブの吸収を低下させると考えられている。

いくつかの実施形態では、本発明は、安定な免疫原性組成物を提供し、組成物中のＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドの効力が、少なくとも約１〜１２カ月間、約６〜１８カ月間、約１２〜２４カ月間、約２４〜３６カ月間または約３６〜４８カ月間維持される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比が、約０．５：１〜約１０：１の間、約１：１〜約５：１の間、または約１．４：１〜４．２：１の間である。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比が、約２．８：１である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の量が、容器、例として、シリンジまたはバイアル中でのケイ素とポリペプチドの結合を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例として、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート−８０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、多価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価カチオンは、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、リン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、アルミニウムを、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして含む。いくつかの実施形態では、アルミニウムの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、アルミニウムの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ヒスチジンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ヒスチジンのｐＨは、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、コハク酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間または約３ｍＭ〜約７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、コハク酸塩のｐＨは、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、５ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された組成物は、アルミニウムを含む緩衝液中に再懸濁されている。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして存在する。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのｒＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのｒＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

別の態様では、本発明は、約０．５：１〜１０：１の間、約１：１〜約５：１の間、または約１．４：１〜約４．２：１の間の界面活性剤対タンパク質のモル比を有する緩衝液中にＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを保存することによって、免疫原性組成物中のＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドの効力を安定化させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比は、約２．８：１である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の量が、容器、例として、シリンジまたはバイアル中でのケイ素とポリペプチドの結合を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例として、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート−８０である。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、多価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価カチオンが、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、緩衝液が、リン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液が、アルミニウムを、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして含む。いくつかの実施形態では、アルミニウムの濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、アルミニウムの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、ヒスチジンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度が、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ヒスチジンのｐＨが、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、コハク酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度が、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間または約３ｍＭ〜約７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、コハク酸塩のｐＨが、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された組成物は、アルミニウムを含む緩衝液中に再懸濁されている。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして存在する。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

別の態様では、本発明は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムを有し、約０．５：１〜１０：１の間の界面活性剤対タンパク質のモル比を有する緩衝液中に、ＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチドおよびＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを保存することによって、免疫原性組成物中のＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチドおよびＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドの効力を安定化させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１：１〜約５：１の間、または約１．４：１〜約４．２：１の間である。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比は、約２．８：１である。いくつかの実施形態では、界面活性剤の量が、容器、例として、シリンジまたはバイアル中でのケイ素とポリペプチドの結合を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例として、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート−８０である。

いくつかの実施形態では、アルミニウムは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして存在する。いくつかの実施形態では、アルミニウムの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、ヒスチジンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度が、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ヒスチジンのｐＨが、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、コハク酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度が、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間または約３ｍＭ〜約７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、コハク酸塩のｐＨが、約５．０〜約８．０の間または約５．８〜約６．０の間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された組成物は、アルミニウムを含む緩衝液中に再懸濁されている。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムまたはミョウバンとして存在する。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

いくつかの実施形態では、緩衝液が、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して約２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌから本質的になる。

別の態様では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチドおよび／またはｒＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドの効力を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）各サブファミリータンパク質上の立体構造エピトープを認識する第１および第２の機能性モノクローナル抗体を、免疫原性組成物に結合させるステップと、（ｂ）当該ポリペプチドに結合している抗体を定量化するステップとを含む。いくつかの実施形態では、定量化を、電気化学発光により実施する。いくつかの実施形態では、両方の抗体により認識されるエピトープを示しているポリペプチドを定量化する。いくつかの実施形態では、第１の抗体を、標識、例として、ビオチンにコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、第１の抗体を、コンジュゲートした標識に結合する化合物、例として、ストレプトアビジンビーズまたはストレプトアビジンカラムにより単離する。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、定量的な標識により結合される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物の効力を、基準物質の効力と比較する。

ポリソルベート８０の種々の濃度を有する製剤中のサブファミリーＢの安定性を示すグラフである。 ポリソルベート８０の種々の濃度を伴うサブファミリーＢの加速安定性を示すグラフである。 ２００μｇ／ｍＬのサブファミリーＢの２８日にわたる効力を示すグラフである。 ２０μｇ／ｍＬのサブファミリーＢの２８日にわたる効力を示すグラフである。 異なるモル比を有する２００μｇ／ｍＬについての効力の結果を示すグラフである。 異なるモル比を有する２０μｇ／ｍＬについての効力の結果を示すグラフである。 ｐＨ６．５におけるリン酸アルミニウムとタンパク質の結合を示すグラフである。 ｐＨの関数としての、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢの結合を示すグラフである。 ｐＨ、緩衝液およびタンパク質濃度の、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢの結合に対する作用を示すグラフである。 リン酸アルミニウムを有さないｒＬＰ２０８６製剤の視覚的外観を示す図である。 外観試料、２〜８℃のＯＤ測定値を示すグラフである。 ＡｌＰＯ_４を有する製剤およびＡｌＰＯ_４を有さない製剤の場合のサブファミリーＡについての効力の結果を示すグラフである。 ＡｌＰＯ_４を有する製剤およびＡｌＰＯ_４を有さない製剤の場合のサブファミリーＢについての効力の結果を示すグラフである。 ０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを有するｒＬＰ２０８６プラセボにおけるポリソルベート８０の結果を示すグラフである。 サブファミリーＡについてのポリソルベート８０の結果を示すグラフである。 サブファミリーＢについてのポリソルベート８０の結果を示すグラフである。 サブファミリーＢについての効力と結合型モル比との相関性を示すグラフである。 サブファミリーＡについてのモル比の結果を示すグラフである。 サブファミリーＢについてのモル比の結果を示すグラフである。 ４００μｇ／ｍＬのｒＬＰ２０８６製剤についてのモル比の結果を示すグラフである。 異なる時点におけるｒＬＰ２０８６薬剤についてのポリソルベート８０の結果を示すグラフである。 異なる時点におけるｒＬＰ２０８６薬剤についての結合型モル比の結果を示すグラフである。 サブファミリーＡについての効力および結合型モル比の結果を示すグラフである。 サブファミリーＢについての効力および結合型モル比の結果を示すグラフである。 コハク酸緩衝液およびヒスチジン緩衝液中のＡｌＰＯ_４を有する場合のサブファミリーＡの結合を示すグラフである。 コハク酸緩衝液およびヒスチジン緩衝液中のＡｌＰＯ_４を有する場合のサブファミリーＢの結合を示すグラフである。 コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびリン酸緩衝液中における結合の比較を示すグラフである。 ＡｌＰＯ_４を有する場合のサブファミリーＡのｐＨ依存性の結合を示すグラフである。 ＡｌＰＯ_４を有する場合のサブファミリーＢのｐＨ依存性の結合を示すグラフである。

別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似するかまたはそれらと同等である方法および材料を、本発明の実行または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を、下記に記載する。材料、方法および例は、例示のためのものに過ぎず、それらに本発明を限定する意図はない。本明細書において言及する刊行物、特許およびその他の文献は全て、それらの全体が参照により組み込まれている。

本明細書全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または変化形、例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述する整数または整数の群を包含するが、任意のその他の整数および整数の群を排除しないことを示していることが理解されよう。

定義
本明細書で使用する場合、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数形への言及を含む。したがって、例えば、「この方法」という言及は、本明細書に記載し、かつ／または当業者であれば、本開示を読み取れば明らかになるであろう等のタイプの１つまたは複数の方法および／またはステップを含む。

本明細書で使用する場合、複数形は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、単数形への言及を含む。したがって、例えば、「これらの方法」という言及は、本明細書に記載し、かつ／または当業者であれば、本開示を読み取れば明らかになるであろう等のタイプの１つまたは複数の方法および／またはステップを含む。

本明細書で使用する場合、「約」は、値、例として、記述する濃度範囲、時間枠、分子量、温度またはｐＨの統計学的に意味のある範囲内を意味する。そのような範囲は、指標内、典型的には所与の値または範囲の２０％の範囲内、さらにより典型的には１０％の範囲内、さらにより典型的には５％の範囲内であり得る。用語「約」が包含する、許される変動は、研究下の特定の系によって異なることになり、当業者であれば容易に理解することができる。また、本出願内で範囲を記載する場合は常に、範囲内の全ての整数も、本発明の実施形態として企図される。

用語「アジュバント」は、本明細書においてさらに記載および例示するように、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。本発明のワクチン中で使用することができるアジュバントの非限定的な例として、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲｉＢｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル等の鉱物ゲル、水中油型乳剤、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント等の油中水型乳剤、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたはその他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、ならびにアブリジン脂質−アミンアジュバントが挙げられる。

用語「アルミニウムとタンパク質の結合」は、アルミニウムに結合しているタンパク質分子の組成物中のパーセントを指す。アルミニウムとタンパク質の結合は、本明細書に開示するかまたは当技術分野で公知である方法を使用して決定することができる。

用語「有効免疫原性量」は、本明細書で使用する場合、脊椎動物宿主中で免疫応答を惹起するのに有効であるポリペプチドまたはポリペプチドを含む組成物の量を指す。例えば、本発明のｒＬＰ２０８６タンパク質の有効免疫原性量は、脊椎動物宿主中で免疫応答を惹起するのに有効な量である。具体的な「有効免疫原性投与量または量」は、宿主の年齢、体重および医学的状態、ならびに投与方法によって異なることになる。当業者であれば、適切な用量を容易に決定する。

用語「モル比」は、本明細書で使用する場合、組成物中の２つの異なる要素のモル数の比を指す。いくつかの実施形態では、モル比は、界面活性剤のモル対タンパク質のモルの比である。いくつかの実施形態では、モル比は、ポリソルベート８０のモル対タンパク質のモルの比である。タンパク質およびポリソルベート８０の濃度に基づいて、以下の式を使用して、モル比を計算する。

例えば、０．０１％ポリソルベート８０および２００μｇを含む組成物は、１０．８：１［（０．０１／０．２）×２１６］の界面活性剤対タンパク質のモル比を有する。３モルのポリソルベート８０対２モルのタンパク質の比は、３：２のＰＳ８０対タンパク質のモル比と表わされるであろう。さらに、モル比を単一の数として記載する場合、モル比は、その単一の数対１の比を指す。例えば、０．５、２および１０のポリソルベート８０対タンパク質の比はそれぞれ、０．５：１、２：１および１０：１の比を指す。本明細書で使用する場合、用語「界面活性剤対タンパク質」のモル比および「ポリソルベート８０対タンパク質」のモル比は一般に、界面活性剤（またはポリソルベート８０）対タンパク質抗原、特に、Ｐ２０８６抗原のモル比を指す。本明細書に開示する教示に基づいて、当業者であれば、その他の界面活性剤についてのモル比およびその他の界面活性剤を有する製剤に最適なモル比を計算するための方法を決定することができるであろう。本明細書で使用する場合、「低い」モル比は一般に、「高い」モル比よりも少ない、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質抗原のモル比を指す。「高い」モル比は一般に、「低い」モル比よりも多い、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質抗原のモル比を指す。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質の「高いモル比」は、１０：１よりも多いモル比を指す。いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質の「低いモル比」は、０．５：１〜１０：１の間のモル比を指す。

用語「ＯＲＦ２０８６」は、本明細書で使用する場合、ナイセリア種の細菌に由来するオープンリーディングフレーム２０８６を指す。ナイセリアＯＲＦ２０８６、そこからコードされるタンパク質、それらのタンパク質の断片、およびそれらのタンパク質を含む免疫原性組成物は、当技術分野で公知であり、例えば、それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第ＵＳ２００６０２５７４１３号および第ＵＳ２００９０２０２５９３号に記載されている。用語「Ｐ２０８６」は一般に、ＯＲＦ２０８６がコードするタンパク質を指す。本発明のＰ２０８６タンパク質は、脂質が付加されていてもよく、または脂質が付加されていなくてもよい。「ＬＰ２０８６」および「Ｐ２０８６」は典型的にはそれぞれ、２０８６タンパク質の脂質が付加されている形態および脂質が付加されていない形態を指す。本発明のＰ２０８６タンパク質は、組換えであり得る。「ｒＬＰ２０８６」および「ｒＰ２０８６」は典型的にはそれぞれ、組換え２０８６タンパク質の脂質が付加されている形態および脂質が付加されていない形態を指す。

用語「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で使用する場合、ヒトまたはその他の脊椎動物宿主への投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含むことを意図する。典型的には、薬学的に許容できる担体は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた、動物において使用するために連邦、州政府の規制当局もしくはその他の規制当局による承認を得ているかまたは米国薬局方もしくはその他の一般に認識されている薬局方に収載されている担体である。用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌の液体、例として、水、および石油、動物、植物または合成の起源のものを含めた、油であり得る。水、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を、液体の担体として、特に、注射用液剤のために用いることができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。また、組成物は所望により、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、持続放出性製剤等の剤型をとることができる。適切な薬学的担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与様式に適すべきである。適切な担体は、当業者に明らかであり、投与経路に大いに依存することになる。

用語「効力」は、免疫原性応答を起こす抗原の能力を指す。いくつかの実施形態では、効力を、抗体に結合するエピトープの能力により測定する。効力は、抗原もしくはエピトープの完全性の喪失または抗原もしくはエピトープの立体構造の変化に起因して経時的に喪失または低下し得る。効力は、これらに限定されないが、光、温度、凍結／解凍のサイクル、撹拌およびｐＨを含めた要因に起因して、喪失または低下し得る。効力は、本明細書において開示する方法および当技術分野で公知のアッセイにより測定することができる。そのような効力決定アッセイは、これらに限定されないが、動物ワクチン接種モデル、血清殺菌力アッセイ（ＳＢＡ）、フローサイトメトリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力アッセイを含む。効力を決定するための好ましい方法は、ＳＢＡおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力アッセイである。効力を決定するためのより好ましい方法は、ＳＢＡである。いくつかの実施形態では、効力を、免疫応答に関与する少なくとも１つのエピトープを標的とする少なくとも１つのモノクローナル抗体を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、試験試料の効力を、基準標準物質の効力と比較する。いくつかの実施形態では、基準標準物質は、Ｔ_０時の試験試料である。いくつかの実施形態では、基準標準物質は、界面活性剤を有さない免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、基準標準物質は、１０：１よりも高い界面活性剤対タンパク質のモル比を有する免疫原性組成物である。

「防御」免疫応答は、対象を感染から防御するように働く、液性または細胞媒介性のいずれかの免疫応答を惹起する免疫原性組成物の能力を指す。もたらされる防御は、絶対的である必要はなく、すなわち、対照の対象集団、例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与されない感染動物と比較して統計学的に有意な改善があるならば、感染を完全に予防または根絶する必要はない。防御は、感染症状の重症度または発症速度の緩和に限定され得る。一般に、「防御免疫応答」は、各抗原に対する測定可能な機能性抗体の応答の何らかのレベルを含めた、少なくとも５０％の対象における特定の抗原に特異的な抗体のレベルの増加の誘発を含むであろう。特定の状況では、「防御免疫応答」は、各抗原に対する測定可能な機能性抗体の応答の何らかのレベルを含めた、少なくとも５０％の対象における、特定の抗原に特異的な抗体のレベルの２倍の増加または４倍の増加の誘発を含むことができるであろう。特定の実施形態では、オプソニン化抗体が、防御免疫応答と相関する。したがって、オプソニン化貪食作用アッセイ、例えば、下記に記載するアッセイにおいて細菌数のパーセント減少を測定することによって、防御免疫応答をアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物の非存在下の細菌数と比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の細菌数の減少がある。

用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、産物の最小の長さに制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等が、この定義の内に含まれる。完全長タンパク質およびそれらの断片の両方が、この定義により包含される。また、これらの用語は、好ましくは、タンパク質を投与する動物内で免疫学的応答を惹起する能力をタンパク質が維持するような、未変性配列に対する（一般に、保存的な性質であるが、非保存的であってもよい）改変、例として、欠失、付加および置換も含む。また、発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、脂質付加、リン酸化等も含まれる。

用語「組換え」は、本明細書で使用する場合、遺伝子工学的方法により産生される任意のタンパク質、ポリペプチド、または目的の遺伝子を発現する細胞を指す。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。本発明のタンパク質は、天然の供給源から単離するかまたは遺伝子工学的方法により産生することができる。「組換え」は、本明細書で使用する場合、その起源または操作に起因して、それが本来結び付いているポリヌクレオチドの全部または一部と結び付いていない核酸分子をさらに表す。用語「組換え」は、宿主細胞に関して使用する場合、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意味する。

用語「安定な」および「安定性」は、免疫原性を一定期間にわたり維持する抗原の能力を指す。安定性を、経時的な効力として測定することができる。用語「安定な」および「安定性」は、免疫原性組成物の物理的、化学的および立体構造的な安定性をさらに指す。タンパク質組成の不安定性は、化学的分解、またはタンパク質分子が凝集して、より高次のポリマーを形成することによってか、ヘテロ二量体がモノマーに解離すること、脱グリコシル化、グリコシル化の改変、または本発明中に含むタンパク質組成の少なくとも１つの生物学的活性を低下させる任意のその他の構造的改変によって引き起こされ得る。安定性は、試料の光散乱、光（吸光度もしくは光学密度）の見かけの減弱、（例えば、分子ふるいクロマトグラフィーによる）サイズ、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的活性、および／または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による特性の測定を含めた、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。安定性を評価するためのその他の方法は、当技術分野で公知であり、また、本発明に従って使用することもできる。

いくつかの実施形態では、本発明の安定な製剤中の抗原は、基準標準物質と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の効力を、少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、９カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、４２カ月間、４８カ月間、５４カ月間または６０カ月間維持することができる。いくつかの実施形態では、本発明の安定な製剤中の抗原は、基準標準物質と比較して、少なくとも５０％の効力を、少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間または５年間維持することができる。また、用語「安定な」および「安定性」は、エピトープまたは免疫反応性を一定期間にわたり維持する抗原の能力も指す。例えば、本発明の安定な製剤中の抗原は、基準標準物質と比較して、そのエピトープまたは免疫反応性の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を、少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、９カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、４２カ月間、４８カ月間、５４カ月間または６０カ月間維持することができる。いくつかの実施形態では、安定性を、環境条件に関して測定する。環境条件の非限定的な例として、光、温度、凍結／解凍のサイクル、撹拌およびｐＨが挙げられる。当業者であれば、抗原性エピトープの存在または免疫反応性を、本明細書において開示する方法または当技術分野で公知のその他の方法を使用して決定することができるであろう。例えば、ＭｃＮｅｉｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７：３４１７〜３４２１（２００９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗原の安定性を、その製剤化の日から測定する。いくつかの実施形態では、抗原の安定性を、その保存条件を変化させた日から測定する。保存条件の変化の非限定的な例として、凍結から冷蔵への変化、凍結から室温への変化、冷蔵から室温への変化、冷蔵から凍結への変化、室温から凍結への変化、室温から冷蔵への変化、明所から暗所への変化、または撹拌の導入が挙げられる。

用語「安定化剤」は、抗原に結合し、抗原のエピトープまたは免疫反応性を一定期間にわたり維持する化合物を指す。安定化剤は、当技術分野で公知である。安定化剤の例として、多価カチオン、例えば、カルシウムまたはアルミニウムが挙げられる。

用語「対象」は、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類、または任意のその他の動物を指す。また、用語「対象」は、ヒトも含む。また、用語「対象」は、家庭用ペットも含む。家庭用ペットの非限定的な例として、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、ケナガイタチ、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメおよびカエルが挙げられる。また、用語「対象」は、家畜動物も含む。家畜動物の非限定的な例として、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウおよびシチメンチョウが挙げられる。

用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、互換的に使用し、対象内において免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物を指す。

一般的な説明
本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原ではなく、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原が、二価のワクチン製剤中で効力を経時的に喪失し、したがって、不安定であるという新規の発見から生み出されている。二価の製剤中の構成成分を変化させることによって、二価のワクチン製剤中の界面活性剤対タンパク質の高いモル比により、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原に特異的な不安定性が生じることを決定した。二価および一価の製剤中の界面活性剤対タンパク質のモル比を低下させると、効力の経時的な維持により決定した場合、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の安定性の増加が生じ、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原の安定性には影響が及ばなかった。この結果は驚くべきものであるが、これは、リポタンパク質は典型的には、それらの疎水性脂質部分の凝集を阻止するために高い界面活性剤濃度を使用して精製および保存されるからである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を含み、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を備える免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原性組成物中のｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の安定性を維持する方法を提供し、この方法は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を備える緩衝液中に保存するステップを含む。

さらなる研究から、低いモル比の免疫原性組成物を撹拌すると、低いモル比の製剤からは、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびＢ抗原の凝集が生じることが明らかになった。しかし、低いモル比の組成物中のアルミニウム濃度を増加させると、撹拌しても、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびＢ抗原の凝集が阻止された。さらに、ｒＬＰ０２８６サブファミリーＡ抗原は、アルミニウムの非存在下では、低い界面活性剤のモル比の作用に対して感受性が高まる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原、高い濃度のアルミニウムを含み、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を備える免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原性組成物中のｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の安定性を維持する方法を提供し、この方法は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を、高い濃度のアルミニウムを含み、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を備える緩衝液中に保存するステップを含む。

免疫原性組成物
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするタンパク質を含む免疫原性組成物は、当技術分野で公知である。例示的な免疫原性組成物として、米国特許出願公開第ＵＳ２００６０２５７４１３号および第ＵＳ２００９０２０２５９３号に記載されているものが挙げられ、それらの出願公開は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。そこに記載されているそのような免疫原性組成物は、ＯＲＦ２０８６タンパク質と同定されている、殺菌活性を示すタンパク質、その免疫原性部分、および／またはそれらの生物学的同等物を含む。ＯＲＦ２０８６タンパク質は、ナイセリア種のオープンリーディングフレーム２０８６がコードするタンパク質を指す。

タンパク質は、組換えタンパク質であっても、または自然のナイセリア種から単離したタンパク質であってもよい。例えば、ナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質は、細菌株、例として、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ならびにナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）の株を含めた、ナイセリア種の細菌株から単離することができ、前記タンパク質の免疫原性部分および／または生物学的同等物であってもよい。

ＯＲＦ２０８６タンパク質は、２０８６のサブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質、それらの免疫原性部分、および／またはそれらの生物学的同等物を含む。ＯＲＦ２０８６タンパク質またはそれらの同等物等は、脂質が付加されていてもよく、または脂質が付加されていなくてもよい。好ましくは、ナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質は、脂質が付加されている。

ある１つの実施形態では、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするタンパク質に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質を含む。

一実施形態では、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするサブファミリーＡタンパク質に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードする単離サブファミリーＡタンパク質を含む。

別の実施形態では、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするサブファミリーＢタンパク質に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードする単離サブファミリーＢタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、Ｂ０１変異体である。

さらに別の実施形態では、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするサブファミリーＡタンパク質に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質、およびナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするサブファミリーＢタンパク質に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードする単離サブファミリーＡタンパク質、およびナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードする単離サブファミリーＢタンパク質を含む。

一実施形態では、免疫原性組成物は、１：１のサブファミリーＡタンパク質対サブファミリーＢタンパク質の比を含む。

免疫原性組成物は、ナイセリアＯＲＦ２０８６に由来するヌクレオチド配列がコードするタンパク質、ポリヌクレオチドまたはそれらの同等物を、免疫原性組成物中の唯一の活性免疫原として含むことができる。あるいは、免疫原性組成物は、その他のナイセリア種の免疫原性ポリペプチド、あるいは１つまたは複数のその他の微生物病原体（例えば、非限定的に、ウイルス、プリオン、細菌もしくは真菌）の免疫学的に活性なタンパク質、または莢膜多糖体を含めて、活性免疫原をさらに含んでもよい。組成物は、１つまたは複数の所望のタンパク質、断片、または選ばれた適応に望まれる医薬化合物を含むことができる。

本発明は、いずれの多抗原型または多価の免疫原性組成物も企図する。例えば、免疫原性組成物は、２つ以上のＯＲＦ２０８６タンパク質の組合せ、ＯＲＦ２０８６タンパク質と１つまたは複数のＰｏｒ Ａタンパク質との組合せ、ＯＲＦ２０８６タンパク質と髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５の多糖体および／もしくは多糖体コンジュゲートとの組合せ、ＯＲＦ２０８６タンパク質を、髄膜炎菌および肺炎球菌の組合せと組み合わせたもの、または前述のうちのいずれかの組合せを、所望の投与、例えば、粘膜送達に適した剤型をとって含むことができる。当業者であれば、そのような多抗原型または多価の免疫学的組成物を容易に製剤化することができるであろう。

また、本発明は、複合免疫化投与計画も企図し、ある病原体に対して有用な任意の組成物を、本発明の組成物の中にかまたは本発明の組成物と組み合わせることができる。例えば、非限定的に、患者は、本発明の免疫原性組成物、および複合免疫化投与計画の一部としての、ヒトパピローマウイルスウイルス（ＨＰＶ）に対して免疫化するための別の免疫学的組成物、例として、ＨＰＶワクチンＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）の投与を受けることができる。当業者であれば、複合免疫化投与計画を開発および実行する目的で、本発明の免疫原性組成物と併せて使用するための免疫原性組成物を容易に選択することができるであろう。

ＯＲＦ２０８６ポリペプチド、断片および同等物を、コンジュゲート免疫原性組成物の一部として使用することができ、いくつかの血清型および／またはいくつかの疾患に対して免疫原性の特性を有する組成物を生成するために、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドを担体にコンジュゲートさせる。あるいは、ＯＲＦ２０８６ポリペプチドのうちの１つを、その他の免疫原性ポリペプチドのための担体タンパク質として使用することができる。そのような免疫原性組成物の製剤化は、当業者に周知である。

本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容できる担体を含む。適切な薬学的に許容できる担体および／または希釈剤は、あらゆる従来の溶媒、分散媒体、充填剤、固体の担体、水溶液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。適切な薬学的に許容できる担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１つまたは複数、およびそれらの組合せを含む。

薬学的に許容できる担体は、少量の補助物質、例として、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤をさらに含むこともでき、これらは、抗体の有効期間または有効性を増強する。薬学的に許容できる担体の調製および使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性成分と不和合性でない限り、本発明の免疫原性組成物中でのそれらの使用が企図される。

免疫原性組成物は、例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれかにより非経口投与してもよく、経口によりまたは鼻腔内に投与してもよい。筋肉内免疫化ための方法は、Ｗｏｌｆｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；１１（４）：４７４〜８５（１９９１）およびＳｅｄｅｇａｈら、ＰＮＡＳ ９１巻、ｐｐ．９８６６〜９８７０（１９９４）により記載されている。その他の投与様式は、例えば、非限定的に、経口製剤、肺用製剤、坐剤および経皮適用を用いる。経口製剤は、例えば、非限定的に、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、筋肉内投与する。

本発明の免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを含むことができる。例示的なアジュバントとして、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、５２９（アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）；ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ−エチルアミン）（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；およびコレラ毒素が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、アジュバントはＱＳ−２１である。

さらなる例示的なアジュバントとして、Ａサブユニットを含めた、コレラ毒素の無毒性の誘導体、および／あるいはナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ポリペプチドと、コレラ毒素もしくはそのＢサブユニット（「ＣＴＢ」）とのコンジュゲートもしくは遺伝子工学的に作製した融合体、プロコレラゲノイド（ｐｒｏｃｈｏｌｅｒａｇｅｎｏｉｄ）、シゾフィランを含めた、真菌の多糖体、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド（「ＭＤＰ」）誘導体、ホルボールエステル、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定毒素、ブロックポリマー、またはサポニンが挙げられる。

リン酸アルミニウムは、アジュバントとして、第一相臨床治験において、０．１２５ｍｇ／用量の濃度まで使用されており、この濃度は、米国連邦規制基準［６１０．１５（ａ）］が特定する限度の０．８５ｍｇ／用量よりもはるかに低い。アルミニウム含有アジュバントは、筋肉内または皮下投与の場合、抗原の免疫応答を強化するために、ヒトにおいて広く使用されている。

特定の好ましい実施形態では、本発明のタンパク質を、粘膜アジュバントを含む経口投与のための免疫原性組成物中で使用し、ヒト宿主においてナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を治療または予防するために使用する。粘膜アジュバントは、コレラ毒素であってよい；しかし、好ましくは、本発明に従って使用することができるコレラ毒素以外の粘膜アジュバントとして、Ａサブユニットを突然変異させたコレラホロ毒素の無毒性の誘導体、化学的に改変したコレラ毒素、またはコレラ毒素のアミノ酸配列の改変により産生させた関連のタンパク質が挙げられる。本発明の免疫原性組成物を調製するのに特に有用であり得る特定のコレラ毒素については、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際出願公開ＷＯ００／１８４３４に開示されている突然変異体のコレラホロ毒素Ｅ２９Ｈを参照されたい。これらを、本発明のポリペプチドに添加するかまたは本発明のポリペプチドとコンジュゲートさせることができる。同じ技法を、粘膜アジュバント特性または送達特性を有するその他の分子、例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の熱不安定毒素（ＬＴ）に適用することができる。粘膜アジュバント活性または送達活性を有するその他の化合物、例として、胆汁；ポリカチオン、例として、ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリオルニチン；界面活性剤、例として、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム；脂質コンジュゲート物質；抗生物質、例として、ストレプトマイシン；ビタミンＡ；ならびに粘膜表面の構造的または機能的な完全性を変化させるその他の化合物を使用することができる。その他の粘膜活性を示す化合物は、微生物構造の誘導体、例として、ＭＤＰ；アクリジンおよびシメチジンを含む。また、上記したＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、ＭＰＬおよびＩＬ−１２も使用することができる。

本発明の免疫原性組成物は、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）、ＣＴＢを含有するＩＳＣＯＭ、リポソームの形態で送達するか、または吸着に適したサイズのマイクロスフェアを形成するために、アクリレートまたはポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコシド）等の化合物中に被包することができる。また、本発明のタンパク質は、油性乳剤中に組み込むこともできる。

患者に投与する免疫原性組成物の量（すなわち、用量）を、特定の抗原、（存在する場合には）アジュバント、特定の患者の年齢、性別、体重、種、状態、および投与経路等の要因を考慮に入れて、当業者に公知の標準的な技法に従って決定することができる。

例えば、思春期のヒト患者のための投与量は、少なくとも０．１μｇ、１μｇ、１０μｇまたは５０μｇのナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質を含み、最大８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇまたは２００μｇのナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質を含むことができる。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力アッセイ
免疫原性組成物中のサブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質中の機能性エピトープを、立体構造に特異的なモノクローナル抗体を使用して、ｒＬＰ２０８６基準物質と比べて定量化することによって、効力を決定する。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて免疫応答を惹起して、殺菌性抗体を生成させることになるサブファミリーＡまたはサブファミリーＢのｒＬＰ２０８６タンパク質中の機能性エピトープを定量的に測定することによって、効力を決定する。選択したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いる効力アッセイに定量化技術を使用する。立体構造性であり、オーバーラップしない２つの機能性モノクローナル抗体を、免疫原性組成物中の各サブファミリーのｒＬＰ２０８６タンパク質について選択する。２つの精製モノクローナル抗体のうち、第１の抗体を、第１のタグにコンジュゲートさせ、第１のタグを使用して、ｒＬＰ２０８６タンパク質分子を捕捉する。いくつかの実施形態では、第１のタグは、ビオチン、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓタグ、またはビーズ（例えば、カルボキシル化ポリスチレンビーズもしくは常磁性ビーズ）である。いくつかの実施形態では、第１のタグを、ストレプトアビジンビーズ、ストレプトアビジンカラム、ニッケルビーズ、ニッケルカラム、遠心分離を用いて、または磁場を用いて捕捉する。第２の抗体を、第２のタグにコンジュゲートさせ、第２のタグは定量化可能である。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、蛍光体または放射標識である。いくつかの実施形態では、第２のタグを、蛍光体またはＨＲＰにコンジュゲートさせたストレプトアビジンを用いて、電気化学発光、蛍光検出または放射活性検出によって検出する。各免疫原性組成物中の２つのｍＡｂにより認識される両方のエピトープを示すタンパク質のみが測定されることになる。タンパク質のいずれか一方または両方のエピトープの変化が反映されることになる。試料の効力を、基準物質の効力と比べて報告する。

いくつかの実施形態では、本発明は、２０８６タンパク質の効力を決定するための方法を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、（１）第１のモノクローナルＡｂおよび第２のｍＡｂを、２０８６タンパク質を含む免疫原性組成物と共にインキュベートするステップであって、第１のｍＡｂがｍＡｂを捕捉するために使用する第１のタグにコンジュゲートしており、第２のｍＡｂが検出可能である第２のタグにコンジュゲートしており、第１および第２のｍＡｂは、２０８６基準タンパク質上の異なる立体構造エピトープを標的とするステップと、（２）第１のｍＡｂに結合している２０８６タンパク質を、第１のタグを使用して捕捉するステップと、（３）第２のタグを使用して捕捉した第２のｍＡｂに結合している２０８６タンパク質を検出し、その量を定量化するステップとを含む。いくつかの実施形態では、２０８６タンパク質は、サブファミリーＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、２０８６タンパク質は、サブファミリーＢタンパク質である。いくつかの実施形態では、２０８６タンパク質は、脂質が付加されている。いくつかの実施形態では、２０８６タンパク質は、脂質が付加されていない。いくつかの実施形態では、２０８６タンパク質は組換えである。いくつかの実施形態では、第１のタグは、ビオチン、６×Ｈｉｓタグ、またはビーズ（例えば、カルボキシル化ポリスチレンビーズもしくは常磁性ビーズ）である。いくつかの実施形態では、第１のタグを、ストレプトアビジンビーズ、ストレプトアビジンカラム、グルタチオンビーズ、グルタチオンカラム、ニッケルビーズ、ニッケルカラム、遠心分離を用いて、または磁場を用いて捕捉する。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ビオチン、ＨＲＰ、蛍光体または放射標識である。いくつかの実施形態では、第２のタグを、蛍光体またはＨＲＰにコンジュゲートさせたストレプトアビジンを用いて、電気化学発光、蛍光検出または放射活性検出によって検出する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、複数の２０８６タンパク質変異体を含む。

ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の効力の安定性
いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を経時的に安定化させる免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を有する緩衝液を含む。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５〜約１０の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１〜約５の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１．４〜約４．２の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、多価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価カチオンは、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３およびミョウバンのうちの１つまたは複数として存在する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約０．７５ｍｇ／ｍＬの間、または約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．６５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．９５ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬのアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアルミニウムとタンパク質の結合がある。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ヒスチジンを含む緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間、または約８ｍＭ〜１２ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、コハク酸塩を含む緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間、または約３ｍＭ〜７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物のｐＨは、約５．０〜約８．０の間、約５．５〜約７．０の間、または約５．８〜約６．０の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物のｐＨは、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４または約６．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質抗原の免疫原性組成物の製剤は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質抗原の免疫原性組成物の製剤は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ５ｍＭコハク酸緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を経時的に安定化させる方法を提供し、この方法は、抗原を、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を有する緩衝液中に保存するステップを含む。

いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５〜約１０の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１〜約５の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１．４〜約４．２の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート−８０である。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、多価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価カチオンは、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３およびミョウバンのうちの１つまたは複数として存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液中の安定化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約０．７５ｍｇ／ｍＬの間、または約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムである。いくつかの実施形態では、緩衝液中の安定化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．６５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．９５ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬのアルミニウムである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアルミニウムとタンパク質の結合がある。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間、または約８ｍＭ〜１２ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、コハク酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間、または約３ｍＭ〜７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、約５．０〜約８．０の間、約５．５〜約７．０の間、または約５．８〜約６．０の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４または約６．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質抗原を保存する緩衝液は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質抗原を保存する緩衝液は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ５ｍＭコハク酸緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびＢ抗原の効力の安定性
いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原および／またはｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を経時的に安定化させる免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は、安定化剤の高い濃度を有し、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を有する緩衝液を含む。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５〜約１０の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１〜約５の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１．４〜約４．２の間である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、多価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価カチオンは、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３およびミョウバンのうちの１つまたは複数として存在する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約０．７５ｍｇ／ｍＬの間、または約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．６５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．９５ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬのアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアルミニウムとタンパク質の結合がある。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ヒスチジンを含む緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間、または約８ｍＭ〜１２ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、コハク酸塩を含む緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間、または約３ｍＭ〜７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約５．０〜約８．０の間、約５．５〜約７．０の間、または約５．８〜約６．０の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４または約６．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢのタンパク質抗原の製剤は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質抗原の免疫原性組成物の製剤は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ５ｍＭコハク酸緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、本発明は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原および／またはｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原を経時的に安定化させる方法を提供し、この方法は、抗原を、安定化剤の高い濃度を有し、界面活性剤対タンパク質の低いモル比を有する緩衝液中に保存するステップを含む。

いくつかの実施形態では、界面活性剤対タンパク質のモル比は、１０：１未満である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５〜約１０の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１〜約５の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約１．４〜約４．２の間である。いくつかの実施形態では、緩衝液中の界面活性剤対タンパク質のモル比は、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

いくつかの実施形態では、緩衝液中の安定化剤は、多価カチオンである。いくつかの実施形態では、多価カチオンは、カルシウムまたはアルミニウムである。いくつかの実施形態では、アルミニウムは、ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３およびミョウバンのうちの１つまたは複数として存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液中の安定化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約０．７５ｍｇ／ｍＬの間、または約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約０．６ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムである。いくつかの実施形態では、緩衝液中の安定化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．６５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．９５ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬのアルミニウムである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアルミニウムとタンパク質の結合がある。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間、または約８ｍＭ〜１２ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、ヒスチジンの濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、コハク酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの間、約２ｍＭ〜約１０ｍＭの間、または約３ｍＭ〜７ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、コハク酸塩の濃度は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭまたは約２０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、約５．０〜約８．０の間、約５．５〜約７．０の間、または約５．８〜約６．０の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４または約６．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢのタンパク質抗原を保存する緩衝液は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

いくつかの実施形態では、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢのタンパク質抗原を保存する緩衝液は、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウムを含有し、２．８のポリソルベート８０：タンパク質のモル比をもつ５ｍＭコハク酸緩衝溶液、ｐＨ６．０である。

本発明がより良好に理解され得るために、以下の実施例を記載する。実施例は例示のためのものに過ぎず、実施例により本発明の範囲が限定されると解釈してはならない。

本明細書に引用する参考文献は全て、参照により本明細書に組み込まれている。

（実施例１）
実験手順
アルミニウムの結合の決定
アルミニウムおよび少なくとも１つのタンパク質抗原を含む組成物を遠心分離し、その結果、アルミニウムがペレット化された。アルミニウム吸収タンパク質の遠心分離は、当技術分野で公知である。例えば、Ｅｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７巻（２４）：３１７５〜３１８０（２００９）を参照されたい。また、アルミニウム結合型のタンパク質もペレット化され、一方、アルミニウム非結合型のタンパク質は、上清中に残留した。上清およびペレット中の総タンパク質を、ローリーアッセイにより決定した。上清中の総タンパク質を、組成物に添加した総タンパク質で割り、１００％を乗じることによって、パーセント結合型タンパク質を計算した。同様に、パーセント非結合型タンパク質を、上清中の総タンパク質を、組成物に添加した総タンパク質で割り、１００％を乗じることによって計算した。

サブファミリーＡ抗原およびサブファミリーＢ抗原の両方を含む組成物については、上清中のサブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の個々の濃度を、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した。サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の分離および溶出を、強力なアニオンカラムおよび高い塩濃度の溶出液を使用して実施した。サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の両方を、励起＝２８０ｒｕｎおよび放射＝３１０ｒｕｎに設定した蛍光検出器を使用して検出および定量化した。サブファミリーＡタンパク質とサブファミリーＢタンパク質とは、明確に異なる保持時間で溶出し、ｒＬＰ２０８６タンパク質基準物質に対して得た検量線を使用して定量化した。パーセント非結合型タンパク質は、上清中の総タンパク質を、組成物に添加した総タンパク質で割り、１００％を乗じることによって計算した。パーセント結合型タンパク質は、１００％からパーセント非結合型タンパク質を減じることによって計算した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力アッセイ
ｒＬＰ２０８６の効力アッセイは、ｒＬＰ２０８６薬物物質の単一のタンパク質分子上の、立体構造性であり、オーバーラップしないエピトープを認識する２つの機能性モノクローナル抗体に依存する均一な捕捉アッセイまたはサンドイッチアッセイである。一方の精製モノクローナル抗体は、捕捉抗体（ｍＡｂ）として働き、特有の色でコードされた識別子を有するカルボキシル化ポリスチレンビーズに化学的にコンジュゲートしている。第２の抗体は、ビオチン化されており、検出抗体として働き、続いて、この抗体に、蛍光体Ｒ−フィコエリトリンにコンジュゲートしているストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）が結合する。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ検出装置の流体素子が、個々のマイクロスフェアおよびそれらに伴うＳＡ−ＰＥシグナルを定量化する。マイクロスフェアを伴うＲ−フィコエリトリンからの蛍光シグナルは、ビーズコンジュゲート抗体、抗原および検出抗体の間で三成分複合体が形成されることによってのみ検出されることになり、ｒＬＰ２０８６試料中の機能性エピトープの数に比例することになる。一方または両方のエピトープが変化すると、基準標準物質に比して蛍光の喪失が生じ、このことは、効力の喪失を示すことになる。
試薬
モノクローナル抗体コンジュゲートマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのビーズ領域１２番またはビーズ領域６６番にコンジュゲートしている）。
ビオチン化モノクローナル抗体。
ｒＬＰ２０８６基準物質、サブファミリーＡおよびＢ、２ｍｇ／ｍｌ。−７０℃で保存。
ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢの二価の対照
ストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリンにコンジュゲート、凍結乾燥
緩衝液
１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
０．８５％ｗ／ｖ生理食塩水中の５％ｗ／ｖポリソルベート８０（ＰＳ−８０）。
マトリックス緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、０．０２％ポリソルベート８０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）。
アッセイ用緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％ポリソルベート８０、０．１％アジドを有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）。
１００×ストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡ−ＰＥ）−凍結乾燥ストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリンのバイアルを開け、１ｍＬの蒸留水を添加する。完全に溶解するまでボルテックスした。

手順
２００μＬのサブファミリーＡタンパク質および２００μＬのサブファミリーＢタンパク質を、６００μＬのマトリックス緩衝液に添加して、各サブファミリーの４００μｇ／ｍｌの濃度を得た。８つの濃度（３３３３〜１．５ｎｇ／ｍＬ）の検量線を、ストック溶液をアッセイ用緩衝液中に希釈することによって得た。

２００μＬの二価の対照を、８００μＬのマトリックス緩衝液に添加して、各サブファミリーの４００μｇ／ｍＬの濃度を得た。１００、５０および１２．５ｎｇ／ｍＬの作業濃度を作製するために、４００μｇ／ｍＬのストックをアッセイ用緩衝液中で希釈した。１００および１２．５ｎｇ／ｍＬはそれぞれ、高い対照および低い対照、すなわち、（ＣＨ）および（ＣＬ）を表した。

試験試料を、マトリックス緩衝液中で４００μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。１００、５０および１２．５ｎｇ／ｍＬの作業溶液を、４００μｇ／ｍＬのストックから調製した。

アッセイ用緩衝液中の２×１０^５ビーズ／ｍＬのコンジュゲートビーズ濃度および３０μｇ／ｍＬの検出抗体濃度を使用した均質アッセイ用混合物を調製した。０．４ｍＬの標準物質、対照、試料またはブランクを、２ｍＬの９６ウェルの深いウェルプレートに添加することによって、試料プレートを調製した。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ_ＨＴＳ−ＢＶフィルタープレートのフィルターを、１００μＬのアッセイ用緩衝液を添加することによってあらかじめ湿潤させ、次いで、この緩衝液を、真空吸引（ｖａｃｕｕｍ ｓｕｃｔｉｏｎ）により、フィルターを通して吸引した。２５μＬの調製した均質アッセイ用混合物を、９６ウェルのプレートに添加した。標準物質、対照、試料またはブランク溶液それぞれの２５μＬを、９６ウェルのフィルタープレートの各ウェルに添加した。プレートを、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。

抗原と抗体とのインキュベーションの後に、緩衝液を、真空吸引（ｖａｃｕｕｍ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により、フィルターを通して除去した。各ウェルのフィルターを、１００μＬのアッセイ用緩衝液を用いて３回洗浄し、続いて、真空吸引（ｖａｃｕｕｍ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）した。最終の洗浄の後、５０μＬの１×ＳＡ−ＰＥを各ウェルに添加した。暗所において、タイター上で、室温で振とうしながら１０分間プレートをインキュベートした。

ＳＡ−ＰＥとのインキュベーションの後に、７５μＬのアッセイ用緩衝液をプレートの各ウェルに添加して、１２５μＬの総体積を得た。プレートを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ２００ Ｓｙｓｔｅｍ上で直ちに読み取った。

血清殺菌力アッセイ
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＱＣ、カナダ）から得たＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ、雌、２．５〜３．０ｋｇを全細胞ＥＬＩＳＡによりあらかじめスクリーニングして、２つの異なる髄膜炎菌株（それぞれのＰ２０８６サブファミリーから１つ）に対して低い反応性を示すウサギを同定した。これらのウサギは一般に、非常に低いバックグラウンドを有し、最も低い値を示すウサギを選択して、使用した。ウサギに、一価のｒＬＰ２０８６−Ａ０５ワクチン、一価のｒＬＰ２０８６−Ｂ０１ワクチンまたは二価のｒＬＰ２０８６−Ａ０５＋Ｂ０１ワクチンのいずれかを用いて、０、４および９週目に筋肉内にワクチン接種した。それぞれの用量は、一価のワクチンについては１００μｇのタンパク質および二価のワクチンについては１００μｇの各タンパク質を含有し、１０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ポリソルベート８０および２５０μｇのＡｌＰＯ_４中に製剤化した。ワクチンを、右後ろ足中に筋肉内注射した（０．５ｍｌ／投与）。対照として、ウサギの１つの群に、製剤用緩衝液単独を用いてワクチン接種した。免疫前（０週目）の血清試料および免疫された（１０週目）血清試料を得て、解析した。動物プロトコールは全て、確立されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に忠実に従った。

ｒＬＰ２０８６ワクチンを用いて免疫化したウサギ中の血清殺菌性抗体を、ヒト補体を用いるＳＢＡを使用して決定した。ウサギ免疫血清を、内因性の補体活性を除去するために熱不活性化し、続いて、９６ウェルのマイクロタイタープレート中のＣａ２＋およびＭｇ２＋を有するダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で１：２に段階希釈して、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する血清殺菌活性について試験した。アッセイに使用する細菌は、ケロッグの補充物質を補充したＧＣ培地（ＧＣＫ）中で増殖させ、６５０ｎｍにおける光学密度によりモニターした。細菌は、アッセイにおいて使用するために、０．５０〜０．５５の最終的なＯＤ_６５０で採取し、Ｄ−ＰＢＳ中に希釈し、１０００〜３０００ＣＦＵを、２０％ヒト補体と共にアッセイ混合物に添加した。

検出可能な殺菌活性を示さないヒト血清を、外来の補体供給源として使用した。補体供給源を、それぞれの個々の試験株に対する適切性について試験した。補体供給源は、免疫血清が添加されていない対照中で生存する細菌の数が＞７５％である場合のみに使用した。この研究に記載するＳＢＡを実施するには、１０種の特有の補体供給源が必要であった。

５％ＣＯ_２下、３７℃における３０分間のインキュベーションの後、Ｄ−ＰＢＳを、反応混合物に添加し、一定分量を、５０％ＧＣＫ培地を充填したマイクロフィルタープレートに移した。マイクロフィルタープレートをろ過し、５％ＣＯ_２下、３７℃で一晩インキュベートし、マイクロコロニーを染色し、定量化した。血清殺菌力価を、免疫血清を有さない対照ウェル中のＣＦＵと比較して、ＣＦＵの５０％の低下をもたらす補間した血清希釈度の逆数と定義した。ＳＢＡ力価を、３７℃における３０分間のインキュベーションの後に細菌数の５０％の低下を引き起こす補間した試験血清の希釈度の逆数と定義する。Ｐ２０８６免疫血清について、対応する免疫前血清と比較してＳＢＡ力価の４倍以上の上昇がある場合に、Ｐ２０８６免疫血清による死滅に対する感受性が確立された。検出限度は、ウサギ血清については、８の力価であった。アッセイ株に対して開始希釈度では陰性である血清には、アッセイについての検出限度の２分の１の力価（すなわち、ウサギについては４）を割り当てた。

フローサイトメトリー
ＭｎＢ細胞を、０．４５〜０．５５のＯＤ_６５０まで増殖させ、続いて、１×ＰＢＳ中の１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に１０分間固定した。１００マイクロリットル／ウェルの細菌を、９６ウェルのＵ底ポリスチレン製プレート中に蒔き、遠心沈殿させ、１×ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１回洗浄した。抗ＬＰ２０８６モノクローナル抗体を、細菌ペレットに添加し、再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中での２回の洗浄の後、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、細胞ペレットに添加し、再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中での２回の洗浄の後、細胞ペレットを、１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。マウスＩｇＧを、陰性対照として含めた。１ウェル当たり２万（２０，０００）個の事象を、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター上で獲得し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ７ソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して解析した。対数のＦＳＣ対ＳＳＣのドットプロット中で、細菌細胞に関するゲーティング後の各試料について、ＰＥチャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＭＦＩが、対照のマウスＩｇＧのＭＦＩの３倍である場合に、ＭＦＩを陽性とみなした。

（実施例２）
ｒＬＰ２０８６タンパク質とポリソルベート８０の結合
ｒＬＰ２０８６タンパク質ＡおよびＢのそれぞれに結合しているポリソルベート８０の安定性を理解するために、２００μｇ／ｍＬサブファミリーＡをアルミニウム（Ａｌ）と共に用いて製剤化したｒＬＰ２０８６試料および２００μｇ／ｍＬサブファミリーＢを用いて製剤化した別のｒＬＰ２０８６試料の両方を、２〜８℃および２５℃で保存し、それらのタンパク質およびポリソルベート８０の含有量について５カ月後に試験した。また、プラセボ（タンパク質を有さない緩衝液＋Ａｌ）についても解析した。プラセボ中のポリソルベート８０の分布を、図１４に示し、一方、サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質についてのポリソルベート８０の分布をそれぞれ、図１５および図１６に示す。図１７に示すように、サブファミリーＢについての相対効力（％）を、結合型モル比と比較した。

結果
図１４に示すように、総％ポリソルベート８０と上清中の％ポリソルベート８０とが同じであり（０．０１７％）、このことは、ポリソルベート８０は、アルミニウムに結合することも、ペレット中に捕捉されることもなかったことを示している。さらに、ポリソルベート８０は、２〜８℃および２５℃の両方で５カ月後も安定であった。

ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ試料およびサブファミリーＢ試料の、結合型（ペレット）、非結合型（上清）および全体のポリソルベート８０の分布をそれぞれ、図１５および図１６に示す。サブファミリーＡについては、上清およびペレット中の％ポリソルベート８０は、２〜８℃および２５℃、５カ月目の時点においては変化がなかった。しかし、サブファミリーＢ試料については、２５℃、５カ月目の時点において、ペレット中により多くのポリソルベート８０が観察された。上清およびペレット中のポリソルベート８０の２〜８℃と２５℃とにおける異なる濃度にもかかわらず、両方のサブファミリーについて、正確な質量バランスが達成された。このマトリックスでは、ｒＬＰ２０８６タンパク質はリン酸アルミニウムに１００％結合するので、ペレットにおいて結び付いているポリソルベート８０は、タンパク質分子に結合している可能性が最も高かった。

タンパク質ＡおよびＢの両方がポリソルベート８０に結合したが、タンパク質Ａの結合は、２〜８℃で保存した試料と２５℃で保存した試料とで同じであり、タンパク質Ｂの結合は、２〜８℃で保存した試料と比較して、２５℃で保存した試料ではほとんど２倍であった。サブファミリーＢについての相対効力を、Ｔ_ｏおよび５カ月目の時点において、２〜８℃および２５℃の両方で決定し、図１７に記載するように、サブファミリーＢの相対効力は、結合型モル比に反比例する挙動を示すことが見出された。％効力は、Ｔ_０時の１２０から、５Ｍ／２５℃においては１６％に低下し、一方、結合型モル比は、同じ期間中に、５．３から１３．９に増加した。

（実施例３）
臨界モル比の研究
ｒＬＰ２０８６の安定性に必要なポリソルベート８０の臨界濃度を決定するために、表１に記載するように、２００μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬのサブファミリーＡのみ、サブファミリーＢのみ、ならびにサブファミリーＡおよびＢの両方を、異なるポリソルベート８０の濃度と共に含有する４０個のｒＬＰ２０８６製剤を調製した。各試料について、総タンパク質および結合型タンパク質、ならびに全体、上清およびペレットの％ポリソルベート８０を、時間ゼロ（Ｔ_０）、１４日目および１カ月目において、２〜８℃および２５℃の両方で決定した。この研究から得られた結果を図１８〜図２４に示す。

結果
上清、ペレットおよび全体のポリソルベート８０の濃度を、リン酸アルミニウムを有するｒＬＰ２０８６製剤試料４０個全てについて決定した。全体および結合型のモル比を、サブファミリーＡおよびＢの両方について決定したが、２００μｇ／ｍＬにおける０．００５％ポリソルベート８０（５．４のモル比）以下を含有する両方のサブファミリーについては、それぞれ図１８および図１９に示すように、全体のモル比と結合型モル比とが類似するように見える。しかし、０．００６５％ポリソルベート８０（７．０のモル比）以上を含有する試料については、サブファミリーＢについての全体のモル比が、結合型モル比よりもはるかに高かった。また、図２０に記載するように、各４００μｇ／ｍＬにおけるサブファミリーＡ、サブファミリーＢおよびサブファミリーＡ＋Ｂについての全体のモル比と結合型モル比とについてのデータは、０．００８％ポリソルベート８０（８．６のモル比）以下を含有する製剤については同様に近かったが、０．０１７％ポリソルベート８０（１８．４のモル比）を含有する製剤については、全体のモル比が結合型モル比よりもはるかに高かった。

（実施例４）
経時的なポリソルベート８０の結合
上清およびペレット中のパーセント（％）ポリソルベート８０を、ＡｌＰＯ_４を有するサブファミリーＡおよびＢの製剤試料について、Ｔ_０、１４日目／２５℃、１カ月目／４℃、および１カ月目／２５℃において決定した。サブファミリーＡおよびＢの製剤試料の両方について、上清中の％ポリソルベート８０は、２〜８℃で保存した試料については比較的同じであった。しかし、上清中の％ポリソルベート８０は、２５℃で保存した試料については、わずか１４日後でさえ劇的に減少した。サブファミリーＡおよびＢの両方について、ペレット中の％ポリソルベート８０は、Ｔ_０／５℃および１カ月目／５℃においては比較的類似していた。しかし、上清中の％ポリソルベートは、２５℃で保存した試料、とりわけ、０．００８％ポリソルベート８０（８．６のモル比）以上を含有するサブファミリーＢについては顕著に増加した。また、％ポリソルベート８０を、上清およびペレット中で、ＡｌＰＯ_４を有するｒＬＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢの製剤について、Ｔ_０、１４日目／２５℃、１カ月目／４℃、および１カ月目／２５℃において決定した。図２１に示すように、ポリソルベート８０の濃度は、０．００８％を含有する試料については、４つの時点全てについておよそ同じであった。しかし、ポリソルベート８０の濃度は、２５℃で保存した、０．０１７％ポリソルベート８０を含有する試料については増加した。ポリソルベート８０は、０．００８％以下のポリソルベート８０を含有する試料の上清中には見出されなかった。図２２に示すように、結合型モル比は、０．００８％以下のポリソルベート８０を含有する試料については、４つの時点全てにおいて安定であった。しかし、結合型モル比は、２５℃で保存した、０．０１７％ポリソルベート８０を含有する試料については増加した。

効力を、ＡｌＰＯ_４を有するサブファミリーＡおよびＢの製剤試料について、Ｔ_０および１４日目／２５℃において決定した（それぞれ、図２３および図２５）。図２３に記載するように、異なる全体のモル比におけるサブファミリーＡについての効力は、５℃および２５℃の両方において９１〜１０２の範囲に及んだ。また、結合型モル比の結果も、いずれの温度においても比較的同じであったが、全体のモル比／結合型モル比が増加するにつれて、効力の軽微な増加が見られた。

５℃の試料については、サブファミリーＢについての効力は、９．０までの全体のモル比については約９５％であった。しかし、全体のモル比が１８．１に増加すると、サブファミリーＢの効力は７９％に減少した。さらに、１８．１の全体のモル比を有する試料は、その他の試料と比較して、より高い結合型モル比を有した。２５℃においては、全体のモル比が、５．３から１８．１まで増加するにつれて、サブファミリーＢの効力は８３％から５％への顕著な低下を示した。結合型モル比の値は、２５℃の試料については、全体のモル比が増加するにつれて、５．３から１３．８まで増加した。したがって、サブファミリーＢについての効力は、結合型モル比に反比例する。

サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の両方が、ポリソルベート８０に結合した。サブファミリーＡの結合は、２〜８℃で保存した試料と２５℃で保存した試料とで同じであったが、サブファミリーＢの結合は、２５℃で保存した試料では、ほとんど２倍であった。さらに、臨界モル比の研究から、２００μｇ／ｍＬの製剤試料は、０．００８％以下のポリソルベート８０を含有する場合に安定であることも示され、この濃度は、４．２以下の全体のモル比と同等である。

（実施例５）
界面活性剤濃度とｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗原の効力
ポリソルベート８０の種々の濃度を伴う、さらなる安定性の研究により、効力を維持するためのポリソルベート８０対タンパク質のモル比の臨界が裏付けられた。１つの実験では、免疫原性組成物を、２００μｇの投与量（４００μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度）で、０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム（リン酸アルミニウムとして）を有し、０．０１％、０．０２％、０．０５％または０．１％のポリソルベート８０（５．３、１０．７、２６．７および５３．４のポリソルベート８０対ｒＬＰ２０８６タンパク質の対応するモル比）でスパイクした１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液（ＨＢＳ）中、ｐＨ６．３において製剤化した。製剤化した試料は、２５℃でインキュベートし、対照試料は、２〜８℃で保存した。時間「０」においては、０．１％までのポリソルベート８０の濃度では、効力の顕著な変化はなかった。しかし、より長い期間については、２〜８℃および２５℃において、効力の低下が、温度およびポリソルベート８０の濃度の関数として観察された。免疫原性組成物中のポリソルベート８０の濃度を、０．０１％から０．１％まで増加させると、安定性の３カ月目の時点で、２５℃および２〜８℃においてそれぞれ、サブファミリーＢタンパク質の効力が１０％未満および２５％に低下することが示された（図１）。

さらなる安定性の研究（図２）を実施し、サブファミリーＢタンパク質を、ＨＢＳ中の４ｍｇ／ｍＬの濃度で評価し、０．０６、０．５および１％の最終濃度（３．３、２６．７および５３．４の対応するモル比）までポリソルベート８０でスパイクした。対照は、０．０９％ポリソルベート８０を含有した。０．０６％ポリソルベート８０（３．３のモル比）中のサブファミリーＢタンパク質は安定であった。ポリソルベート８０を、濃度を０．５％および１％（それぞれ、２６．７および５３．４のモル比）に増加させて含有させた同じ試料は不安定であった。４００μｇ／ｍＬの免疫原性組成物製剤については、サブファミリーＢタンパク質の不安定性が、０．０１％（５．３のモル比）以上の濃度のポリソルベート８０を含有する製剤全てにおいて認められた。しかし、４ｍｇ／ｍＬタンパク質と０．０６％ポリソルベート８０との濃度においては、効力の低下はなかったが、これは、ポリソルベート８０対タンパク質の比（３．３）が、４００μｇ／ｍＬタンパク質と０．０１％ポリソルベート８０との濃度における比（５．３のモル比）よりも低いことによる。したがって、ポリソルベート８０によるサブファミリーＢタンパク質の効力の低下は、ポリソルベート８０界面活性剤対タンパク質のモル比に相関し、マトリックス中のポリソルベート８０の絶対濃度には相関しなかった。

したがって、ワクチン中の、および続いて２〜８℃で保存する間のサブファミリーＢタンパク質の安定性を維持するためには、ポリソルベート８０の濃度を、免疫原性組成物中では低下させなければならない。２０および２００μｇの投与量において、ポリソルベート８０の種々のモル比（０、１．１、２．７および５．３）を伴う免疫原性組成物について２８日間の加速安定性の研究を設計した（図３および図４）。二価の（サブファミリーＡとサブファミリーＢとの）製剤を、１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液、ｐＨ６．０、リン酸アルミニウムとしての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム中に、ポリソルベート８０の種々の濃度を伴って調製した。２〜８℃の対照群と併せて、試料を２５℃でインキュベートした。試料を効力について０、７、１４および２８日目に解析した。サブファミリーＡタンパク質（データは図示せず）およびサブファミリーＢタンパク質の両方が、５．３未満のポリソルベート８０対タンパク質のモル比をもつ群全てについて安定であった。８０％超の効力の値を、アッセイの変動性の範囲内にあるとみなす。５．３のモル比においては、サブファミリーＢタンパク質の効力についての減少傾向を、２５℃の試料について観察した。

包括的な研究により、ポリソルベート８０対タンパク質の種々のモル比を伴って製剤化した全ての予測される臨床投与量（２０、６０、１２０および２００μｇの投与量）を、加速保存安定性条件下で評価して、ポリソルベート８０対タンパク質のモル比の、ＭｎＢ ｒＬＰ２０８６タンパク質の安定性に対する作用を調査した。およそ１．４〜１０．７の範囲に及ぶポリソルベート８０対タンパク質のモル比で製剤化した二価のＭｎＢ ｒＬＰ２０８６免疫原性組成物を使用した。ポリソルベート８０対タンパク質のモル比を（１．４、２．４、３．４、３．９、４．３、４．７および１０．７に）増加させて製剤化した免疫原性組成物を生成するために、免疫原性組成物を製剤化する間に、さらなるポリソルベート８０を必要としないように、ポリソルベート８０を添加することによって、抗原を変動するモル比に対して調節した。この研究では、２セットの抗原のロットを使用した。一方のセットのサブファミリーＡおよびＢのロットは、１．４のポリソルベート８０対タンパク質のモル比で生成し、他方は２．４に設定した。２．４のモル比を有するセットのタンパク質を使用して、さらなるポリソルベート８０でスパイクすることによって、３．４、３．９、４．３および１０．７のモル比を調節した。免疫原性組成物の最終的なマトリックスは、１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、０．５ｍｇ／ｍＬリン酸アルミニウムであり、上記で言及したポリソルベート８０対タンパク質のモル比を有した。２〜８℃または２５℃における特定の期間にわたる保存の後、試験の２４時間前に、ロッカーを用いて穏やかな混合を適用した。ＩＥＸ−ＨＰＬＣによる総タンパク質、効力、外観、上清画分の３２０ｎｍにおける光学密度、およびｐＨを試験した。

２００および２０μｇの用量の効力の結果をそれぞれ、図５および図６に示す。効力アッセイは、研究で使用したその他の試験よりも感度がよかった。全体的に、サブファミリーＡ抗原またはサブファミリーＢ抗原のいずれについても、４．３以下のモル比を有する全ての投与量については、最初の時点と比較して、効力の顕著な低下は観察されなかった。２５℃で保存したサブファミリーＢタンパク質については、４．７のモル比を有する製剤を、効力の軽微な低下に起因して限界であるとみなした。１０．７のモル比の製剤については、サブファミリーＢ抗原についての効力の結果は、２５℃で保存した試料の場合、２〜８℃で保存した試料よりも顕著に低かった。

（実施例６）
アルミニウム濃度とｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗原およびＢ抗原の効力
いくつかの実験を実施して、サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の両方の９５％超の結合を確保するのに最適なリン酸アルミニウムのレベルを決定した。最初の研究は、ｐＨ６．５における製剤化の最適化に焦点を合わせた。製剤を、サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質に由来するそれぞれのタンパク質の２００μｇ／ｍＬを標的投与量として、０．０２％ポリソルベート８０および０．２５ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬのいずれかのアルミニウム（リン酸アルミニウムとして）を有するｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン緩衝液中に調製した。サブファミリーＢタンパク質は、サブファミリーＡタンパク質よりも低い程度でリン酸アルミニウムに結合した（図７）。アルミニウム含有量を０．２５ｍｇ／ｍＬから０．５ｍｇ／ｍＬに増加させると、サブファミリーＢタンパク質の結合が、＞８０％に増加した。タンパク質とアルミニウム懸濁液との間の結合機構が大部分はイオン性の相互作用であることから、懸濁液のｐＨが、結合に影響を及ぼす要因である。

製剤のｐＨを、サブファミリーＢタンパク質の９０〜９５％超の結合を確保するように最適化した。異なるロットの免疫原性組成物を用いた、Ａタンパク質およびＢタンパク質のそれぞれが２００μｇ／ｍＬであり、５．６〜６．５の範囲に及ぶｐＨを有する複数の製剤について調べた（図８）。両方のタンパク質の９０〜９５％超の結合が、５．６〜６．４の範囲に及ぶｐＨを有する製剤において生じた。製剤のｐＨを６．５以上に増加させると、サブファミリーＢタンパク質の結合が顕著に低下した。サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の両方の９０％超の結合を確保するために推奨される標的ｐＨは６．０である。

また、ｐＨ、緩衝液、タンパク質およびポリソルベート８０の濃度を変化させることによる製剤化の変数および／または限界下での製剤のロバスト性も評価した（図９）。サブファミリーＡタンパク質の結合は、総タンパク質濃度が５００μｇ／ｍＬ（各タンパク質２５０μｇ／ｍＬ）までは、一貫して高かった（≧９５％）が、サブファミリーＢタンパク質の結合は、タンパク質濃度およびｐＨに対してより感受性を示した。市販の製剤は、２００μｇの投与量で使用されるので、この実験から得られた結果により、０．５ｍｇ／ｍＬリン酸アルミニウムを用いた６．０のｐＨにおける製剤化の推奨がさらに支持される。

リン酸アルミニウムを有する製剤とリン酸アルミニウムを有さない製剤とを評価して、サブファミリーＢタンパク質の安定性のために十分低いポリソルベート８０の濃度で、リン酸アルミニウムを有さない安定な製剤を提供することの実現可能性を調査した。免疫原性組成物を、２０および２００μｇの投与量で、０〜５．３のモル比の範囲に及ぶポリソルベート８０の濃度を有するヒスチジン緩衝溶液の緩衝液中に製剤化した。試料の半分を、パルスモード（２秒間のオンおよび１秒間のオフ）下で５００ｒｐｍに設定したデジタル複数チューブ型ボルテックスミキサーを用いて、試験の前に２４時間撹拌した。この条件を採用して、輸送条件の間の極度の振動を模倣するために、最終的な免疫原性組成物の出荷包装段階において典型的に実施されるＩＳＴＡ試験（国際安全輸送協会）をシミュレートした。

撹拌すると、リン酸アルミニウムを有さない製剤は沈殿し、沈殿により最終的には、サブファミリーＡ抗原およびＢ抗原の両方の効力の喪失に至った。外観試験（図１０）およびλ＝３２０ｎｍにおける吸光度の測定（図１１）から、リン酸アルミニウムを有さない製剤を撹拌すると、凝集体および／または沈殿物が形成されることが示された。これらの試料の効力試験（図１２および図１３）から、試験した時点全てにおいて、サブファミリーＡタンパク質およびＢタンパク質の両方について、効力の顕著な喪失が示された。低い量のポリソルベート８０を含有する製剤において、効力の喪失が最も著しかった。低い量のポリソルベート８０は、サブファミリーＢタンパク質の安定化を維持するのに必要であることから、安定性を保つには、製剤中にリン酸アルミニウムを含めることが必要である。ｒＬＰ２０８６免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムと共に製剤化することができ、リン酸アルミニウムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力アッセイにより測定されるように効力の安定性を増強するように働くであろう。

（実施例７）
緩衝剤としてのコハク酸塩およびヒスチジン
一連の製剤を調製して、コハク酸塩中とヒスチジン中とで、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡタンパク質およびＢタンパク質の結合、ならびにｐＨ、ポリソルベート８０およびＭｇＣｌ２の結合に対する作用を比較した（表２）。ｐＨ、緩衝液、タンパク質およびポリソルベートの濃度を変化させることによる製剤化の変数および／または限界下での製剤のロバスト性を評価した（図２５および２６）。アルミニウムとサブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質の結合は、使用した緩衝液（ヒスチジンまたはコハク酸）にかかわらず類似していた。

緩衝塩および混合時間の、アルミニウムの結合に対する作用を、３つの一般に使用されている緩衝塩を用いて評価し、これらの緩衝塩は、それらのｐＫａが生理的な範囲内にあり、これらの塩が一般に安全であるとみなされていることから選ばれた。ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡタンパク質およびＢタンパク質を、３つの緩衝塩、すなわち、５ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭヒスチジンまたは１０ｍＭリン酸塩のうちの１つと共に、それぞれの塩のｐＫａに適しているｐＨで製剤化して、それぞれの条件における結合の程度を決定した。結合が完了に達するのに必要な時間を、試料を５分または１２０分のいずれかの間混合させてから、結合したタンパク質の量を測定することによって評価した。

図２７に示すように、サブファミリーＢタンパク質は、リン酸緩衝液中、ｐＨ６．８において結合の低下を示し、一方、サブファミリーＡタンパク質は、同じ条件において顕著な影響は受けなかった。アルミニウムに結合したタンパク質の量は、ヒスチジンと共に製剤化した試料またはコハク酸塩と共に製剤化した試料で類似していた。したがって、これら２つの緩衝塩を選んで、さらに評価した。理論に縛られる意図はないが、リン酸緩衝液中の結合の低下は、ＡｌＰＯ_４上の結合部位についての、添加されたリン酸イオンとの競合から生じる可能性がある。

これらの条件、ならびにタンパク質およびＡｌＰＯ_４の濃度では、結合は、室温での５分間の混合の後に完了し、類似の結果が、２時間の混合の後にも得られた。

リン酸緩衝液中、ｐＨ６．８におけるサブファミリーＢタンパク質の結合の低下がｐＨまたは緩衝塩間の差に起因するかどうかをさらに調べるために、ヒスチジン緩衝製剤またはコハク酸緩衝製剤のいずれかの中で、５．３〜７．０のｐＨ範囲にわたり、結合を測定した。０．２ｍｇ／ｍＬの各サブファミリータンパク質（０．４ｍｇ／ｍＬの総タンパク質）、０．０２％ＰＳ８０、０．５ｍｇのＡｌ／ｍＬおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する二価の製剤を調製した。試料を１０ｍＭヒスチジンまたは５ｍＭコハク酸塩のいずれかの中に製剤化して、緩衝塩の作用を比較した。製剤化の後、各試料のｐＨを個々に検証した。

ｐＨ５．３〜７．０の結合プロファイルを、サブファミリーＡタンパク質については図２８に、サブファミリーＢタンパク質については図２９に示す。サブファミリーＡタンパク質は、結合したタンパク質の量の変化をほとんど示さず、試験したｐＨ範囲にわたり、９５％超の結合を維持した。標的ｐＨが７．０である、ヒスチジンを含有する製剤からは、６．８のｐＨが生じた。タンパク質またはＡｌＰＯ_４に対して起こり得る作用を回避するために、ｐＨの７．０への（例えば、塩基の添加による）調節は行なわず、したがって、このデータポイントについての結果は利用できない。

サブファミリーＢタンパク質の結合プロファイル（図２９に示す）は、ｐＨ依存性の傾向を示した。しかし、結合を、ヒスチジン緩衝製剤中で実施した場合であっても、コハク酸緩衝製剤中で実施した場合であっても、アルミニウムに結合したタンパク質の量は類似していた。結合は、緩衝塩ではなく、製剤のｐＨに依存した。結合は、ｐＨ６．５までは９５％（ヒスチジン中では９４％、コハク酸塩中では９５％）で維持されたが、ｐＨが６．５超になると減少した。ｐＨ７．０では、結合が約８２％まで減少し、緩衝塩間で小さな差が生じた。

これらの濃度におけるサブファミリーＢタンパク質のＡｌＰＯ_４とのロバストな結合を得るためには、６．５以下のｐＨが好ましい。

（実施例８）
安全性、耐容性および免疫原性の研究
０および２カ月目の投与；０、２および６カ月目の投与；０および２カ月目の投与、続いて、１２カ月目の追加免疫の投与のいずれかの投与計画に従って、研究を実施して、健常な思春期の集団において、投与したｒＬＰ２０８６ワクチンの安全性、耐容性および免疫原性を評価した。

免疫原性組成物は、ｒＬＰ２０８６ワクチン（脂質が付加されている組換え体）である。免疫原性組成物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中に発現させたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂ組換えＯＲＦ２０８６タンパク質を含み、ｒＬＰ２０８６の１つのサブファミリーＡ株および１つのサブファミリーＢ株から構成される二価のワクチンとして製剤化されている。特に、免疫原性組成物は、それぞれ６０μｇ、１２０μｇまたは２００μｇの精製サブファミリーＡ ｒＬＰ２０８６タンパク質および精製サブファミリーＢ ｒＬＰ２０８６タンパク質、２．８のモル比のポリソルベート８０ならびにＡｌＰＯ_４として、０．２５ｍｇのＡｌ^３＋、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン緩衝溶液を含有するように製剤化した０．５ｍＬ用量である。対照の組成物は、０．５ｍＬ用量中に、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を含む。

対象を、５群に無作為に帰属させる。表３を参照されたい。対象を、２つの年齢群、すなわち、≧１１歳〜＜１４歳、および≧１４歳〜＜１９歳に階層化する。

生理食塩水を、プラセボとして使用するが、これは、活性な対照として働くことができる、安全で、免疫原性を示し、かつ有効な、実績のあるＭｎＢに対するワクチンがないことによる。

表３に従って、ワクチン接種の各来診（例えば、来診１、２、４および６）時に、対象は、１回用量のｒＬＰ２０８６ワクチンまたは生理食塩水の投与を受ける。標準的なワクチン接種の慣行を順守し、ワクチンは血管内には注射しない。ｒＬＰ２０８６ワクチンを、上部三角筋内に０．５ｍＬを注射することによって筋肉内投与する。生理食塩水を、上部三角筋内に筋肉内投与する。
Ａ．来診１
来診１、１日目、ワクチン接種１の際に、対象は、最初に採血され、次いで、ワクチン接種を受ける。来診１の採血およびワクチン接種１は、同日に行う。ワクチン接種の前に、血液試料（およそ２０ｍＬ）を、対象から収集する。群１、２、３および４に無作為化した対象については、ｒＬＰ２０８６ワクチンの単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。群５の対象については、生理食塩水の単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。
Ｂ．来診２（来診１の４２〜７０日後）、ワクチン接種２
群１、２および３については、ｒＬＰ２０８６ワクチンの単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。群４および５については、生理食塩水の単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。
Ｃ．来診３（来診２の２８〜４２日後）、ワクチン接種２後の採血
血液試料（およそ２０ｍＬ）を、対象から収集する。
Ｄ．来診４（来診２の１０５〜１２６日後）、ワクチン接種３
群２、４および５については、ｒＬＰ２０８６ワクチンの単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。群１および３については、生理食塩水の単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。
Ｅ．来診５（来診４の２８〜４２日後）、ワクチン接種３後の採血
血液試料（およそ２０ｍＬ）を、対象から収集する。
Ｆ．来診６（来診４の１６１〜１７５日後）、ワクチン接種４
来診６時に、対象は、最初に採血され、次いで、ワクチン接種を受ける。来診６の採血およびワクチン接種４は、同日に行う。ワクチン接種の前に、血液試料（およそ２０ｍＬ）を、対象から収集する。群３および５については、ｒＬＰ２０８６ワクチンの単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。群１、２および４の対象については、生理食塩水の単回の０．５ｍＬの筋肉内注射を、上部三角筋内に投与する。
Ｇ．来診７（来診６の２８〜４２日後）、ワクチン接種４後の採血
血液試料（およそ２０ｍＬ）を、対象から収集する。

免疫原性の結果
この研究の主要な目標は、ＬＰ２０８６サブファミリーＡタンパク質およびＬＰ２０８６サブファミリーＢタンパク質を発現するＭｎＢ株を用いて実施するＳＢＡにより測定する場合の６０μｇ、１２０μｇおよび２００μｇのｒＬＰ２０８６ワクチンの免疫原性を評価することであった。

この研究の副次的な目標は、ｒＬＰ２０８６ワクチンのサブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質とＩｇの結合の定量化により決定する場合の６０μｇ、１２０μｇおよび２００μｇのｒＬＰ２０８６ワクチンの免疫原性を評価することであった。

表４に示すように、ＳＢＡ活性を、３つのサブファミリーＡ株および３つのサブファミリーＢ株を使用して評価した。

規定したレベルに達する力価を示した対象の比率を、表５に示す。両方のサブファミリーについて、規定したＳＢＡ力価のレベルを達成した対象の比率は、投与２の後においてよりも、投与３の後においての方が多かった。

免疫原性データから、ワクチンは、ＭｎＢのサブファミリーＡ株およびサブファミリーＢ株に対して顕著なＳＢＡ活性を有する抗体を生成することができることが示されている。サブファミリーＡ株２については、投与２の後、ＳＢＡ応答率は、８８．９％〜９０．９％の範囲に及び、投与３の後、ＳＢＡ応答率は、９０．０％〜９７．４％の範囲に及んだ。サブファミリーＡ株１の変異体については、投与２および投与３の両方の後、１００．０％の対象が、６０μｇおよび１２０μｇの両方の用量レベルにおいて、この変異体に対するＳＢＡ応答を示した。２００μｇの用量レベルにおいては、投与２および投与３の後にそれぞれ、対象の９６．５％および９９．０％がＳＢＡ応答を示した。サブファミリーＡ株１の変異体については、ＳＢＡ応答率は、投与２の後には８５．０％〜９６．３％および投与３の後には９５．２％〜９７．４％の範囲に及んだ。

サブファミリーＢ株１の変異体については、投与２の後、ＳＢＡ応答率は、７６．２％〜８１．０％の範囲に及び、投与３の後、ＳＢＡ応答率は、８９．５％〜９２．０％の範囲に及んだ。サブファミリーＢ株２の変異体については、投与２の後、ＳＢＡ応答率を有する対象のパーセントは、２１．１％〜３３．３％の範囲に及んだ。しかし、第３の投与の後、６０μｇ、１２０μｇおよび２００μｇの用量レベルにおいてそれぞれ、対象の５３．３％、７５．６％および６７．９％がＳＢＡ応答を示した。サブファミリーＢ株３の変異体については、ＳＢＡ応答率は、投与２の後には６１．９％〜７０．８％および投与３の後には７６．２％〜８８．７％の範囲に及んだ。

全体的に、試験したのがサブファミリーＡ株であるかまたはサブファミリーＢ株であるかにかかわりなく、高い比率の対象が、≧ＬＬＯＱのＳＢＡ力価で応答した。ｈＳＢＡデータは、６０μｇ〜２００μｇの用量において、ロバストな免疫応答を示したが、明確な用量応答関係はなかった。応答の頻度は、調べた解析方法にかかわりなく、１２０μｇの群の数値が最も高かった。２００μｇの群は、１２０μｇの用量レベルを上回る免疫応答の改善を示さなかった。

Claims (52)

1. ナイセリア・メニンギティディス血清群Ｂ ＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチド、ナイセリア・メニンギティディス血清群Ｂ ＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、界面活性剤、およびアルミニウムを含み、ここで界面活性剤対タンパク質のモル比が１：１〜５：１の間であり、９５％より多いサブファミリーＢポリペプチドがアルミニウムに結合しており、凍結乾燥されていない、免疫原性組成物。
2. 界面活性剤対タンパク質のモル比が、１．４：１〜４．２：１の間である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 界面活性剤対タンパク質のモル比が、２．８：１である、請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
5. 界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
6. 界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 多価カチオンをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
8. 多価カチオンが、カルシウムまたはアルミニウムである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. （Ｃａ）_３（ＰＯ_４）_２を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. アルミニウムの濃度が、０．５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
11. ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３およびミョウバンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
12. ヒスチジンをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. ヒスチジンの濃度が、２ｍＭ〜２０ｍＭの間である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
14. ヒスチジンの濃度が、５ｍＭ〜１５ｍＭの間である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
15. コハク酸塩をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. コハク酸塩の濃度が、２ｍＭ〜１０ｍＭの間である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
17. コハク酸塩の濃度が、３ｍＭ〜７ｍＭの間である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
18. コハク酸塩の濃度が、５ｍＭである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
19. ｐＨが、５．０〜８．０の間である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
20. ｐＨが、５．８〜６．０の間である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
21. ヒスチジンの濃度が、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
22. タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
23. ２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
24. ２００ｕｇ／ｍＬのｒＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
25. タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
26. ２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
27. ２００ｕｇ／ｍＬのｒＬＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチド、２００ｕｇ／ｍＬのＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチド、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
28. 免疫原性組成物中のナイセリア・メニンギティディス由来のＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドの効力を安定化させるための方法であって、ここで組成物は凍結乾燥されておらず、効力とは免疫応答を上昇させる能力を意味し、１：１〜５：１の間の界面活性剤対タンパク質のモル比を有する組成物中にＬＰ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを製剤化するステップを含み、ここで組成物はさらにナイセリア・メニンギティディス血清群Ｂ ＬＰ２０８６（ｆＨＢＰ）サブファミリーＡポリペプチド、界面活性剤、および０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間のアルミニウムを含み、ここで９５％より多いサブファミリーＢポリペプチドがアルミニウムに結合している、方法。
29. 界面活性剤対タンパク質のモル比が、１．４：１〜４．２：１の間である、請求項２８に記載の方法。
30. 界面活性剤対タンパク質のモル比が、２．８：１である、請求項２９に記載の方法。
31. 界面活性剤が、容器中でのケイ素とポリペプチドの結合を低下させる、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 容器が、シリンジまたはバイアルである、請求項３１に記載の方法。
33. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤である、請求項２８に記載の方法。
35. 界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項２８に記載の方法。
36. 組成物が、多価カチオンをさらに含む、請求項２８から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 多価カチオンが、カルシウムまたはアルミニウムである、請求項３６に記載の方法。
38. 組成物が、（Ｃａ）_３（ＰＯ_４）_２を含む、請求項２８に記載の方法。
39. アルミニウムの濃度が、０．５ｍｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
40. 組成物が、ＡｌＰＯ_４、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３またはミョウバンを含む、請求項２８から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. ヒスチジンをさらに含む、請求項２８から４０のいずれか一項に記載の方法。
42. ヒスチジンの濃度が、２ｍＭ〜２０ｍＭの間である、請求項４１に記載の方法。
43. ヒスチジンの濃度が、５ｍＭ〜１５ｍＭの間である、請求項４１に記載の方法。
44. コハク酸塩をさらに含む、請求項２８から４３のいずれか一項に記載の方法。
45. コハク酸塩の濃度が、２ｍＭ〜１０ｍＭの間である、請求項４４に記載の方法。
46. コハク酸塩の濃度が、３ｍＭ〜７ｍＭの間である、請求項４４に記載の方法。
47. ｐＨが、５．０〜８．０の間である、請求項２８から４６のいずれか一項に記載の方法。
48. ｐＨが、５．８〜６．０の間である、請求項４７に記載の方法。
49. ヒスチジンの濃度が、１０ｍＭ、ｐＨ６．０である、請求項４１に記載の方法。
50. コハク酸塩の濃度が、５ｍＭ、ｐＨ６．０である、請求項４４に記載の方法。
51. サブファミリーＢタンパク質を、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む組成物中に製剤化する、請求項２８に記載の方法。
52. サブファミリーＢタンパク質を、タンパク質に対して２．８：１のモル比のポリソルベート８０、ＡｌＰＯ_４としての０．５ｍｇ／ｍＬアルミニウム、５ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む組成物中に製剤化する、請求項２８に記載の方法。
    

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