JP5937029B2 - Trail発現亢進剤 - Google Patents
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Description
[2]自己免疫性炎症の予防又はその改善のために用いられる、上記[1]記載のTRAIL発現亢進剤。
数式1:β−グルカン(g/100g)=ブドウ糖(g/100g)×0.9
・培養物の調製
以下のようにしてアウレオバシジウム プルランス M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)の培養液を調製した。
予め調製した前培養液を、ショ糖1%、アスコルビン酸0.1%、米糠0.1%を含む液体培地(pH5.3)に適量接種して、25℃、72〜96時間(製造バッチによって異なる)、通気撹拌培養を行った。培養終了後、この培養液を121℃、15分間殺菌した。なお、得られた殺菌後の培養液は、固形分およそ1.2質量%を含む。
上記アウレオバシジウム培養液を珪藻土で濾過することによって不溶物を取り除いた後、粉末状の活性炭(和光純薬工業株式会社)を用いて低分子化合物を吸着、除去し、分画分子量20,000の限外濾過膜での限外濾過に供した。その後、限外濾過の非通過画分に回収されたβ−グルカンを80%エタノールで沈殿させ、得られた沈殿を精製水で再溶解し、エタノールを加熱により除去したものを精製β−グルカンとして用いた。
マウスのマクロファージ様培養細胞株であるRAW264.7細胞(ATCC TIB-71)、およびヒト単球細胞に由来する培養細胞株、THP-1細胞(ATCC TIB-202)は、RPMI-1640(Sigma-Aldrich社)に10%のウシ胎児血清(FBS: fetal bovine serum)及び100 units/mlのペニシリンと100 μg/mlストレプトマイシンを添加した培地中で、37°C 、5% CO2の条件下で培養を行った。
THP-1細胞のマクロファージへの分化誘導は、培地に終濃度100nM PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)を添加し、37°C 、5% CO2の条件下で3日間培養することで行った。マクロファージへ分化誘導させたTHP-1細胞は、さらにPMAを含まない培地中で24時間培養を行った後、実験に供した。
被検物質による刺激後の細胞を集め、RNA 抽出試薬「TRIzol」(商品名、Invitrogen社)を用いて総RNAを抽出した。抽出した総RNAをDNase I(商品名、タカラバイオ株式会社)で処理した後、ランダムプライマー及びオリゴ dT プライマーと、逆転写酵素「ReverTraAce」(商品名、東洋紡株式会社)を用いた逆転写反応により、cDNAの合成を行った。リアルタイムPCR 法によるTRAIL、TNF-α、及びFasLのmRNA発現量の解析は、それぞれのmRNAに特異的なPCRプライマー及びTaqポリメラーゼ「SYBR Premix Ex Taq II」(商品名、タカラバイオ株式会社)を用いて、リアルタイムPCR解析装置「BioRad CFX96 real-time PCR detection system」(商品名、Bio-Rad社)により、メーカーの推奨するプロトコールに従って行った。
TRAIL、TNF-α、及びFasLのmRNAを特異的に検出するプライマーとしては、以下のものを用いた。
(1) TRAIL mRNA用
5’- CCAACGAGATGAAGCAGCTGCAGG -3’
5’- CCTGCAAGCAGGGTCTGTTCAAGA -3
(2) TNF-α mRNA用
5’- GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT -3’
5’- CCACTTGGTGGTTTGCTACGA -3’
(3) FasL mRNA用
5’- CCACCTGCAGAAGGAACTGGCA -3’
5’- ATGGGCCACACTCCTCGGCT -3’
被検物質による刺激後の細胞を、PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した後、RIPA (25 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)にプロテアーゼインヒビターのカクテル(Complete Mini; Roche社)を添加したもので溶解し、細胞残渣を遠心分離によって除いて総細胞抽出液とした。20 μgのタンパク質を10%SDSポリアクリルアミド電気泳動で分画し、PVDF膜(Immobilon-P Transfer Membrane、 Millipore社)に転写されたTRAILタンパク質及びアクチンタンパク質の検出を、それぞれの特異抗体を用いて行った。
TRAILタンパク質及びアクチン(Actin)タンパク質の検出は、それぞれ市販の抗マウスTRAIL抗体(オリエンタル酵母工業株式会社)及び抗β-アクチン抗体(Chemicon社)を用いて行った。
2 x 105個のRAW264.7細胞を37°C、5% CO2で1晩培養し、終濃度100 μg/mlの精製β−グルカン、終濃度5 μMのCpG DNA (CpG-A、Hycult Biotech社)、あるいは終濃度100 μg/mlのリポポリサッカライド(大腸菌055:B5由来、Sigma-Aldrich社)で刺激を加えた。刺激後6時間が経過した細胞を集めてその細胞から総RNAを調製し、TRAIL、TNF-α、及びFasLのmRNAを特異的に検出するプライマーを用いたリアルタイムRT-PCR法により、これら遺伝子の発現について解析を行った。データはGAPDH mRNAの発現量で標準化した後、コントロール(control)の細胞におけるそれぞれの発現量に対する相対的な比として表した。エラーバーは3回の独立した試行における標準偏差を表す(図1)。
2 x 105個のRAW264.7細胞を37°C、5% CO2で1晩培養し、終濃度100 μg/mlの精製β−グルカンで刺激を加え、刺激後24時間が経過した細胞から総細胞抽出液を調製した。20 μgのタンパク質をSDS-PAGEにより分画し、TRAIL特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析を行った。結果を図2に示す。図2中、矢印はそれぞれ、膜結合型TRAIL: TRAIL(M)、可溶型TRAIL: TRAIL(S)、及び内部標準として用いたアクチン(Actin)のバンドを示す。
RAW264.7細胞に対する刺激物質として、終濃度100 μg/mlの精製β−グルカン(アウレオバシジウム培養液由来)とともに、それを終濃度100 μg/mlの大麦由来のβ−グルカン(「大麦βグルカン顆粒」、株式会社ADEKA社製)又は終濃度100 μg/mlのパン酵母由来のβ−グルカン(「オルタスβグルカン85粉末」、株式会社オルタス社製)に替えて行なった以外は、上記試験例1と同様にして、それらの刺激物質によるTRAIL mRNAの発現量を解析した。データはGAPDH mRNAの発現量で標準化した後、コントロール(control)の細胞におけるそれぞれの発現量に対する相対的な比として表した。エラーバーは3回の独立した試行における標準偏差を表す(図3A)。
Claims (2)
- アウレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pullulans)の培養物由来のβ−グルカン含有培養組成物を有効成分として含有することを特徴とするTRAIL発現亢進剤。
- 自己免疫性炎症の予防又はその改善のために用いられる、請求項1記載のTRAIL発現亢進剤。
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