JP5559173B2 - マクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物 - Google Patents
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Description
(1)癌細胞、
(2)抗がん剤により損傷を受けまたは死滅した細胞。
下記のようにしてアウレオバシジウム プルランスM−1(Aureobasidium pullulans M−1)(FERM BP−08615)の培養液を調製した。
5−FUによるJurkat細胞への細胞傷害を検討するため、5−FUをMTT法で検討した。2.0×105cells/mLに調製したJurkat細胞を96穴プレート(Corning)に入れた。そこに、5−FUを終濃度0、10、100、1000μMになるように添加し、37℃のCO2インキュベーターで24時間作用させた。23時間作用させた時点で、3−[4,5−dimethylthiazol−2−yl]−2,5−diphenyltet−razolium bromide(MTT溶液) (Wako)を10μLずつ各穴に添加し、37℃で1時間作用させた。作用後、1200rpmで5分間遠心し、上清を捨て、DMSOを100μLずつ加え、マイクロプレートリーダーを用いて、570nmの吸光度で測定した。テトラゾリウム塩であるMTTは、細胞に取り込まれると、ミトコンドリアにある脱水素酵素の反応によって、MTTとNADHの間に酸化還元反応が起こり、NADHはNAD+に酸化され、MTTはホルマザンに還元される。このホルマザンは非水溶性であり、生成後は沈殿する。そのため、DMSOを加えホルマザン沈殿物を溶解し、この溶液における吸光度である570nmで測定した。細胞が生きていれば、ホルマザンが生成されるので、570nmで測定される。その結果、図2に示すグラフが得られ、そのIC50は450μMであった。
5−FUによるJurkat細胞の細胞傷害がアポトーシスによるものかどうかを検討した。初期アポトーシスでは、細胞膜の内側に局在していたホスファチジルセリン(PS)が外側に露出してくる。PSは、マクロファージによるアポトーシス細胞の認識と貪食にも関係する分子である。このPS露出を測定することで、初期アポトーシスの誘導を確認することができる。また、アポトーシス後期では、細胞膜が壊れ、内部成分が外部に漏出する。そこで、膜不透過化性の蛍光色素、ヨウ化プロピジウム(PI)と合わせて細胞を標識することで、後期アポトーシス細胞と初期アポトーシス細胞を明確に分離することができる(図3参照)。5−FUの作用濃度を250μMと500μMで24時間作用させた結果、250μM作用の際に多くのPS露出を起こすこと、すなわち初期アポトーシスを誘導することが確認された(図4参照)。
試験例1の方法でマクロファージ様細胞に分化させたTHP−1細胞を24穴プレートに用意した。そこに、アウレオバシジウム培養液を500倍希釈になるように添加し、合計7時間インキュベーションした。
アウレオバシジウム培養液のマクロファージ活性化能を相乗的に増強させる化合物を探索した。ここでは、マクロファージに存在する糖鎖認識受容体TLR−7(Toll様受容体)に結合する、イミダゾキノリン誘導体である下記化合物(4−Amino−2−(ethoxymethyl)−a,a−dimethyl−1H−imidazo[4,5−c]quinoline−1−ethanol)(和光純薬工業株式会社製)(以下、「化合物1」という。)を検討した。
アウレオバシジウム培養液または化合物1によるマクロファージ様細胞貪食能の向上は、マクロファージ様細胞が活性誘導を受けた結果であると推察されたので、これを確認した。具体的には、活性誘導を受けたときに放出されるサイトカインの一種のTNF−αに関し、これがアウレオバシジウム培養液、化合物1、もしくはアウレオバシジウム培養液および化合物1を添加したマクロファージ様細胞の培養液中にどの程度分泌されるかを、常法に従いELISAで測定した。
マクロファージ様細胞が活性誘導を受けたときに放出されるサイトカインであるTNF−α、IL−6、IL−12BおよびIL−18に関し、アウレオバシジウム培養液、化合物1またはアウレオバシジウム培養液および化合物1を添加したマクロファージ様細胞においてこれらのmRNAがどの程度発現するかを、常法に従いRT−PCRで測定した。
b群:化合物1 1μM
c群:化合物1 10μM
d群:アウレオバシジウム培養液 500倍希釈
e群:アウレオバシジウム培養液 1000倍希釈
f群:アウレオバシジウム培養液 500倍希釈 + 化合物1 1μM
g群:アウレオバシジウム培養液 1000倍希釈 + 化合物1 1μM
h群:アウレオバシジウム培養液 500倍希釈 + 化合物1 10μM
i群:アウレオバシジウム培養液 1000倍希釈 + 化合物1 10μM
RT反応条件;42℃で30分の反応の後、95℃で5分、5℃で5分の各反応を、サーマルサイクラー(Bio Flux)を用いて1サイクル行った。
センスプライマー;5’−TCCTTCAGACCCTCAACC−3’(配列番号1)
アンチセンスプライマー;5’−AGGCCCCAGTTTGAATTCTT−3’(配列番号2)
IL−6のcDNAの増幅に用いたプライマー:
センスプライマー;5’−TTTTCTGCCAGTGCCAGTGCCTCTTT−3’(配列番号3)
アンチセンスプライマー;5’−TACCCCCAGGAGAAGATTCC−3’(配列番号4)
IL−12BのcDNAの増幅に用いたプライマー:
センスプライマー;5’−CATGGGCCTTCATGGTATTT−3’(配列番号5)
アンチセンスプライマー;5’−TGATGTACTTGCAGCCTTGC−3’(配列番号6)
IL−18のcDNAの増幅に用いたプライマー:
センスプライマー;5’−CAGACCTTCCAGATCGCTTC−3’(配列番号7)
アンチセンスプライマー;5’−TCGGATTCCAGGTTTTCATC−3’(配列番号8)
GAPDHのcDNAの増幅に用いたプライマー:
センスプライマー;5’−ATCATCAGCAATGCCTCCTG−3’(配列番号9)
アンチセンスプライマー;5’−CTGCTTCACCACCTTCTTGA−3’(配列番号10)
PCR反応溶液組成;5×PCR buffer 10μL、milliQ 28.75μL、Ex Taq 0.25μL、センスプライマー 0.5μL、アンチセンスプライマー 0.5μL、各サンプルの鋳型cDNA 全量
PCR反応条件;94℃で2分の反応の後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の各反応を1サイクルとして35サイクル行った。
試験例1の方法でマクロファージ様細胞に分化させたTHP−1細胞を24穴プレートに用意した。そこに、アウレオバシジウム培養液を1000倍希釈、また化合物1を1μM、さらに、アウレオバシジウム培養液1000倍希釈および化合物1が1μMになるように、それぞれ添加し、4時間インキュベーションした。
Claims (2)
- 前記アウレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物は、アウレオバシジウム プルランス M−1(Aureobasidium pullulans M−1)(FERM BP−08615)またはアウレオバシジウム プルランス M−2(Aureobasidium pullulans M−2)(FERM BP−10014)である、請求項1に記載のマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。
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