JP5908888B2 - 改変された植物のシステインプロテアーゼ及びその使用 - Google Patents
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Description
a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
b.位置110のシステインがセリンに置換されている、
c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及び
e.位置211のシステインがセリンに置換されている、
からなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号1に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。
a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
b.位置110のシステインがセリンに置換されている、
c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及び
e.位置211のシステインがセリンに置換されている、
からなる群から選択される置換を有する、配列番号1に示される配列を有する、ポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。
NIa変異体の作製及び特性評価
クローニング及び突然変異誘発
親和性精製のためのN−末端ポリヒスチジンタグを含む、配列番号1に示されるジャガイモウイルスA NIaプロテアーゼのアミノ酸配列(Genbankアクセッション番号CAB58238、アミノ酸残基2032〜2263)を、コドン使用頻度を最適化したcDNA配列に逆翻訳した。配列をより小さな断片にし(parsing)、GENEWRITER(商標)技術を用いてオリゴヌクレオチドとしてこれらを合成し、RP HPLC(Dionex,Germany)により精製することにより完全長cDNAを作製した。次いで、米国特許第6,670,127号及び同第6,521,427号に記載の通り、精製オリゴヌクレオチドを完全長の二本鎖cDNA断片に組み立てた。
表1のNIaプロテアーゼ変異体のcDNAをコードするプラスミドをBL21細胞に形質転換し、形質転換体からの単一コロニーを、37℃で一晩100μg/mLのカナマイシンを含むLB培地中で培養した。培養物のOD600が0.6〜0.8に達したとき、1mMのIPTGを用いて、又はTB自動誘導培地(Overnight Express Autoinduction Media,EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)中で細胞を培養することにより誘導を行った。25℃又は18℃で細胞を更に培養し、遠心分離し、−80℃で保存した。野性型C19残基を有する全てのNIaプロテアーゼ変異体が、調べた全ての表面スルフヒドリル変化の組み合わせにおいて非常に良好に発現した(表3)。
還元剤である2mMのTCEPの存在下で、標準的な方法を用いてタンパク質の精製を行った。簡潔に述べると、0.1U/mLのベンゾアーゼ及び0.3mg/mLのリゾチームを添加したバッファA(20mM tris−HCl,pH 7.5,500mM NaCl,2mM TCEP)に細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で超音波処理し、濾過し、AKTA Explorer精製システム(GE Lifesciences,Piscataway,NJ)を用いてバッファAで予め平衡化された5mLのHisTrap HP(GE Biosciences,Piscataway,NJ)カラムに清澄化された(cleared)溶解物をロードした。バッファA中50〜500mMのイミダゾールのイミダゾール段階勾配を用いてタンパク質を溶出した。SDS−PAGEにより画分を分析し、対象タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、濾過し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により更に精製した。濃縮及び精製されたサンプルを、バッファAで予め平衡化されたSuperdex75 SECマトリクス(GE Lifesciences,Piscataway,NJ)に直接ロードし、1mL/分の流速で均一濃度で分離した。SDS−PAGEにより画分を分析し、タンパク質を含有する画分をプールし、酵素活性について試験した。精製された変異体は全て良好に発現し、95%を超える純度まで精製されていた。
野性型認識配列EXVXXQX(配列番号74)を用いて、PVAのポリタンパク質配列を探して、NIaプロテアーゼのコンセンサス認識配列を決定した。これは、PVAポリタンパク質内のプロセシング分岐点を同定する、公開されている研究(Mertis et al.,J.General Virol.,83:1211〜1221,2002)とは独立して行った。公開されている及び潜在的な認識配列、並びにこの研究で求められたコンセンサス配列を表4に列挙する。選択認識配列に相当する合成ペプチドを、固相ペプチド化学(Anaspec,San Jose,CA)を用いて合成し、野性型NIaプロテアーゼによる切断について試験した。5μM PVA NIaプロテアーゼ及び500μMペプチドを含有する20mM tris−HCl、pH 8.0、150mM NaCl、及び1mMジチオスレイトール(DTT)中で反応を実施し、逆相HPLC及びLC−MSにより分析した。
野性型NIaプロテアーゼ及び活性部位及び表面システイン変異体を、フルオロフォア/クエンチャー基質ペプチド4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)ベンゾイル(DABCYL)−YGENVTFQGSK−5−[(2−アミノエチル)アミノ]ナフタレン−1−スルホン酸(EDANS)(Anaspec,San Jose,CA)に対する活性について試験した。励起波長340nm及び発光波長490nmを用いてSpectramax M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において反応速度測定を行った。2mMの酵素及び0.1〜300μMの基質を含む50mM Tris−HCl、pH 8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT中で反応を実施し、37℃で30分間反応させた。計算された理論的吸光係数から酵素濃度を求めた。それぞれについて初期速度を求め、表5に示す。
本発明は、以下の態様を包含する。
[1]
NIaプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、且つ活性を保持する、単離ポリペプチド。
[2]
前記NIaプロテアーゼ変異体における少なくとも1つのシステイン残基が置換される、上記[1]に記載の単離ポリペプチド。
[3]
前記少なくとも1つのシステイン残基が、セリン、バリン、又はアラニンに置換される、上記[2]に記載の単離ポリペプチド。
[4]
単離ポリペプチドであって、
a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、
b.位置110のシステインがセリンに置換されている、
c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、
d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及び
e.位置211のシステインがセリンに置換されている、
からなる群より選択される置換を有する配列番号1に示す配列を有するポリペプチドを
含む、単離ポリペプチド。
[5]
前記ポリペプチドが異種アミノ酸配列に融合する、上記[1]又は[4]に記載の単離ポリペプチド。
[6]
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常ドメイン若しくはその断片、リンカー、又はタグである、上記[5]に記載の単離ポリペプチド。
[7]
配列番号28に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
[8]
上記[4]に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[9]
配列番号28に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[10]
配列番号42に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
[11]
上記[4]に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[12]
配列番号42又は47に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[13]
上記[11]又は[12]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[14]
ポリペプチドを発現させる方法であって、
a.上記[11]に記載の宿主細胞を提供する工程と;
b.上記[4]に記載の少なくとも1つのポリペプチドの発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
を含む、方法。
Claims (9)
- 配列番号38の残基1〜233のアミノ酸配列または配列番号33のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが異種アミノ酸配列に融合する、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常ドメイン若しくはその断片、リンカー、又はタグである、請求項2に記載の単離ポリペプチド。
- 配列番号38の残基1〜233のアミノ酸配列または配列番号33のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、ジャガイモウイルスA(PVA)核封入タンパク質(NIa)プロテアーゼ変異体をコードし、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、且つ活性を保持する、単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号42に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 配列番号42又は47に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項6又は7に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
- ポリペプチドを発現させる方法であって、
a.請求項8に記載の宿主細胞を提供する工程と;
b.少なくとも1つのポリペプチドの発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、前記少なくとも1つのポリペプチドは、配列番号38の残基1〜233のアミノ酸配列または配列番号33のアミノ酸配列を含む、工程と、
を含む、方法。
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