JP2016518855A - 融合プロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
X-Y-Z(I)又はZ-Y-X(II)
(式中、
Xは、ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体であり、
Yは、任意選択のリンカーであり、
Zは、Xaa-Pro-ジペプチジルアミノペプチダーゼ(XaaProDAP)又はその機能的変異体である)
のタンパク質を含み、2つのタンパク質分解活性のうち少なくとも一方を低下させることができる自己切断活性を実質的に有さない、二機能性融合プロテアーゼが提供される。
X-Y-Z(I)又はZ-Y-X(II)
(式中、
Xは、ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体であり、
Yは、任意選択のリンカーであり、
Zは、Xaa-Pro-ジペプチジルアミノペプチダーゼ(XaaProDAP)又はその機能的変異体である)
のタンパク質を含み、2つのタンパク質分解活性のうち少なくとも一方を低下させることができる自己切断活性を実質的に有さない、二機能性融合プロテアーゼが提供される。
a)タンパク質表面上にアクセス可能なQG部分配列を有さない、XaaProDAP又は機能的変異体を提供するステップ、
b)ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体を提供するステップであって、該プロテアーゼ又はその機能的変異体が二機能性融合プロテアーゼのN末端にある場合に、そのN末端にXaaProDAP切断部位を有さず、且つそのC末端での切断によってそれ自体を削除させ得る切断部位を有さない、ステップ、及び
c)単一の核酸配列から発現させることができる二機能性融合プロテアーゼが構成されるように、任意選択のアミノ酸リンカー配列を介してXaaProDAP及びピコルナウイルス3Cプロテアーゼを接続するステップ
が行ってもよい。
細菌宿主細胞における核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターの例は、大腸菌における発現では、全て大腸菌に由来する、lacオペロン、trpオペロン、並びにそれらのハイブリッドtrc及びtacから得られるプロモーターである(DeBoerら、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21〜25頁)。大腸菌において用いるための他の更に強力なプロモーターは、T7及びT5ファージに由来するバクテリオファージプロモーターである。T7プロモーターは、大腸菌宿主におけるT7ポリメラーゼの存在を要する[Studier及びMoffatt、J. Mol. Biol. 189、113頁(1986)]。全てのこれらのプロモーターは、IPTG、ラクトース、又はトリプトファンでの誘発によって、細菌の成長期間における戦略点で転写を開始するように調節される。大腸菌はまた、連続的発現のための強力なプロモーター、例えば、Dalbogeら、1987、Biotechnology 5、161〜164頁における、hGHを発現するために用いられる合成プロモーターを有する。
X-Y-Z(I)又はZ-Y-X(II)
(式中、
Xは、ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体であり、
Yは、任意選択のリンカーであり、
Zは、Xaa-Pro-ジペプチジルアミノペプチダーゼ(XaaProDAP)又はその機能的変異体である)
のタンパク質を含み、2つのタンパク質分解活性のうち少なくとも一方を低下させることができる自己切断活性を実質的に有さない、実施形態1に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
HRV14/XaaProDAP変異体又はXaaProDAP/HRV14変異体のプラスミド構築物及び発現
pET系は、大腸菌においてタンパク質を発現させるための強力なアプローチを提供することから、この系を酵素の発現に用いた。pETベクターにおいて、強力なバクテリオファージT7の転写及び翻訳シグナルの制御下で標的遺伝子をクローニングし、宿主細胞においてT7 RNAポリメラーゼ源を提供することによって発現を誘発する。
発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)に形質転換し、小規模で発現させた。
トランケートされた形態の融合プロテアーゼを説明し得る最終的な切断部位の発生の観察は、製造者に指示に従った通常の設定でのUV215nmでのDiodeアレイ測定を可能にする、Dionex UltiMate3000(商標)液体比色計(Dionex社)を備えた、MaXis Impact超高分解能飛行時間型(UHR-TOF)質量分析計(Bruker Daltonics社)を用いる質量分析によって検出した。酵素を、45℃のカラム温度及び0.2ml/分の流量を用いて、1.7μmの孔サイズを有するWaters Aquity BEH300 C4逆相1.0×100mmカラム上で分離した。用いた溶媒は以下の通りであった。
溶媒A: H2O内の0.1%ギ酸
溶媒B:99.9%MeCN、0.1%ギ酸(v/v)
時間(分) %A %B
0 90 10
2 90 10
10 10 90
11 10 90
12 90 10
13 90 10
14 50 50
NH2-HRV14-XaaProDAP-COOH融合プロテアーゼのHRV14ドメインにおけるC末端Q182の除去
Table 1に示される融合プロテアーゼ変異体では、断片が、サイズにおいて、融合パートナーとHRV14 3Cドメイン配列とを合わせたものに対応することが多いことが観察された。切断についてのこの可能性を除去するために、新たなリンカーを、His6、RL9、又はTrx融合パートナーを含む融合プロテアーゼにおけるHRV14 3CドメインとXaaProDAPドメインとの間の元のGSリンカー(配列番号3)(Table 1、実施例1)の代わりに設計した。HRV14酵素の連結部分内のGln/Gly切断部位及び配列番号3の最初を、Ser-Glyによって置き換えた。したがって、HRV14 3Cプロテアーゼドメイン内の最後のアミノ酸(Gln182)を除去して、以下の配列
完全長二機能性NH2-HRV14-XaaProDAP-COOHプロテアーゼの設計
実施例2においてXaaProDAP配列内のGln241とGly242との間で観察された切断部位を除去するために、2つのアミノ酸をGlu241及びThr242で置換した。Glu241-Thr242置換がGln241-Gly242の置き換えに選択されたが、それは、この置換が、ラクトコッカス・ラクティスの異なる単離体に由来するXaaProDAPのオルソログの相同性サーチに基づいて天然のアミノ酸バリエーションとして生じるためである。望ましくない切断もまた融合パートナーのC末端内のHAV部位において生じたため、HAV部位を小さなGS含有配列で置き換えた。これらの融合パートナーは、以下の配列を有していた。
完全長二機能性NH2-XaaProDAP-HRV14-COOHプロテアーゼの設計
実施例1及び実施例3Aに記載されている通常の設計、クローニング、及び発現手順を用いて、本発明者らは、また、C末端内にHRV14 3Cを含む機能性且つ可溶性の融合プロテアーゼを得ることができるかどうかを評価した。C末端HRV14 3Cドメイン及びN末端XaaProDAP(Q241E、G242T)を含む3つの融合プロテアーゼの発現を、先に記載された3つの異なるN末端タグ(His6、RL9、Trx)を用いて評価した。HRV14 3CドメインがC末端内に位置する3つの構築物全ては、誘発されていない、誘発された、可溶性の、及び不溶性の画分のSDS-PAGEによって決定したところ、不溶性タンパク質として発現した(詳細なデータは示していない)。このことは、HRV14 3CプロテアーゼをN末端内に、及びラクトコッカス・ラクティスXaaProDAPをC末端内に含む融合プロテアーゼ変異体が、驚くべきことに、生産がより容易であり且つ非常に費用のかかるいかなる再フォールディングステップも要しない可溶性且つ安定な融合プロテアーゼをもたらす、更に最適なフォールディング動態を有することを実証する。結論として、タンパク質設計の特定の仕様によって、HRV14 3C及びXaaProDAPプロテアーゼを含む無傷の融合プロテアーゼを生産することが可能となった。
NH2-His-des182HRV14-LLXaaProDAP(Q241E、G242T)-COOH(タンパク質20986)の発現及び精製のスケールアップ
より大量の完全長融合プロテアーゼを調製するために、プロテアーゼ20986を活性のさらなる試験のためにスケールアップさせた。
さらなる分析のために、精製された二機能性融合プロテアーゼを得るために、2つの連続的な精製ステップを行って、プロテアーゼ20986を精製した。
緩衝液A:50mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、pH7.5
緩衝液B:50mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、300mMのイミダゾール、pH7.5
緩衝液C:50mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、30mMのイミダゾール、pH7.5
塩基性タグを含有するモデル融合タンパク質のプラスミド構築物及び発現。
二機能性融合プロテアーゼがN末端タグの除去に用いられ得るかどうかを試験するために、3つの異なるモデル融合タンパク質をタンパク質基質として用いるために調製した。WO2008/043847において先に記載されている、サーモトガ・マリティマ(T. maritima)に由来するリボソームタンパク質L27を含む塩基性タグを融合パートナーとして用い、これは、配列MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(配列番号16)を有している。融合タンパク質を、RL27融合パートナーがHRV14 3C酵素によって除去され得、残りのGP配列がXaaProDAPによって除去され得るように設計した。
PYY(3-36):IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY(配列番号18)
グルカゴン:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(配列番号19)
GLP-1(7-37、K34R):HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(配列番号20)
RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)の発現は、基本的に、実施例4においてプロテアーゼ20986について記載したように行った。簡潔に述べると、RL27_EVLFQGP_グルカゴン及びRL27_EVLFQGP_GLP-1(7-37、K34R)の発現を、以下のように行った:大腸菌BL21(DE3)をプラスミドで形質転換し、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上に播種し、一晩培養物を10mlのLB培地内に溶解し、振とうフラスコ内の50mg/mlのカルベニシリンを有する750mlのLBに接種するために用いた。振とうフラスコを、100rpmで、37℃でインキュベートした。OD600が0.4に達すると、タンパク質の発現を0.3mMのIPTGを添加することによって誘発し、細胞を、37℃で3時間のインキュベーションの後に、遠心分離によって採取した。
簡潔に述べると、細胞破壊の結果生じた上清からの融合タンパク質の捕捉を、4ml/分の流量でのAKTA Express上のSP FF HiTrap 5ml(GE Healthcare社)カラム、及び以下の緩衝液を用いて、基本的に以前に記載されているような(WO2008/043847)陽イオン交換クロマトグラフィーによって行った。
緩衝液A:50mMのリン酸ナトリウム、pH7.0
緩衝液B:50mMのリン酸ナトリウム、1000mMのNaCl、pH7.0
プロテアーゼ20986及びモデルタンパク質基質としてのRL27_EVLFQGP_PYY(3-36)を用いる酵素反応。
RL27-HRV14-PYY(3-36)の濃度を1×PBS、pH7.4内で0.5mg/mlの濃度に調整した。酵素反応を、酵素反応緩衝液としてPBS、pH7.4を用いて、22μlの反応容積で設定した。プロテアーゼ20986とRL27-EVLFQGP-PYY(3-36)基質とのインキュベーションを、それぞれ1:20又は1:40の酵素対基質のモル比率を用いて設定し、反応を、3時間、37℃で行った[Table 6(表6)に示す]。精製された、WO2008/043847において記載されているN末端タグ(サーモトガ・マリティマに由来するリボソームL9)を有するHRV14 3Cプロテアーゼの変異体もまた、この実験に含めた。RL9-HRV14 3Cという名のこのプロテアーゼは、プロテアーゼ20986と同じモル比率で用いたが、HRV14 3C活性のみを有している。RL9-HRV14 3Cは、以下の配列を有している。
酵素反応のLC-MS分析を、基本的に実施例1に記載されているように行ったが、評価対象のより小さなペプチドを十分に分離及び分解させるために、1.7μmの孔サイズを有するC18 Aquity BEH300 C4逆相1.0×100mmカラムを用いた。機器を、製造者の指示に従って、質量範囲(2000〜17000Da)及び分解能(>20000)の設定に調整した。UV215nmのクロマトグラム及び総イオン数(TIC)クロマトグラムを平行して評価して、ペプチドの得られたMSデータとUV215nmのトレースとの間の一致があることを確認した。以下の実施例で示される実験的に決定された質量は、最も豊富な質量、例えば、検出されたタンパク質の同位体の天然量に基づく最も多く現れる同位体分布を有する分子の質量を指す。以下、質量分析のデータは、100ppm未満の質量精度で得られた。
他の種に由来する代替的な3Cドメイン及びXaaProDAPドメインを含む完全長二機能性融合プロテアーゼの設計。
他の3Cプロテアーゼ及びXaaProDAP酵素が、プロテアーゼ20986で観察されたものと同一の特性を有する機能性融合プロテアーゼを得るために融合され得ることを実証するために、ヒトコクサッキーウイルスB3に由来する3Cプロテアーゼ配列(CVB3 3C)又はブタ連鎖球菌に由来するXaaProDAP(ブタ連鎖球菌XaaProDAP)を用いて、HRV14 3C配列及びラクトコッカス・ラクティスのXaaProDAP(LLXaaProDAP)配列を置き換え、新たな融合プロテアーゼ変異体を生成した。ヒトライノウイルス14 3Cの3Cプロテアーゼ配列のように、ヒトコクサッキーウイルスB3 3Cプロテアーゼ配列もまたC末端のQを含有し、これを欠失させて以下の配列を有するCVB3 3C(des183)を得た。
3C及びXaaProDAPの新たなドメインを含むプロテアーゼ28994、28996、及び28997のスケールアップ発現及び精製。
プロテアーゼ28994、28996、及び28997の発現を、BL21(DE3)を発現宿主として用いて、実施例4に記載されているように行った。精製は、捕捉のためのIMACステップと、その後のゲル濾過ステップを用いて、基本的に実施例4に記載されているように行った。プロテアーゼ28994、28996、及び28997は全て、実施例4に記載されているような2段階プロトコルによってうまく精製された。酵素の純度は、SDS-PAGEゲルの検査によって、及びLC-MS分析の間のRP分離HPLCから得られたUV215nmプロファイルの評価によって、少なくとも90%と推定された。MS分析は実施例1に記載されているように行い、プロテアーゼ28994が予想質量(110798.1Da、平均同位体質量)とほぼ一致する107797.8Daの推定質量を有することを示した。プロテアーゼ28996は、予想質量(107687.4Da、平均同位体質量)とほぼ一致する107686.9Daの質量を有し、プロテアーゼ28997は予想質量(107964.8、平均同位体質量)と一致する107964.8Daの決定された質量を有していた。UV280吸光度の測定値を用いて、融合タンパク質の濃度を決定した(NanoDrop社)。
プロテアーゼ20986、28994、28996、及び28997を用いる酵素反応
酵素反応を、酵素反応緩衝液として1×PBS、pH7.4を用いて、30μlの反応容積で設定した。切断特異性の評価に用いたモデルタンパク質基質は融合タンパク質を含んでおり、酵素によるその後の正確なプロセシングは、ヒトPYY(3-36)(配列番号18)、wtグルカゴン(配列番号19)、及びGLP-1(7-37、K34R)(配列番号20)をもたらした。モデルタンパク質基質の濃度を、実施例6に記載されているように1×PBS、pH7.4で0.5mg/mlに調整した。反応条件のバリエーションを、酵素対基質比率と、酵素反応の時間及び温度との両方に関して評価した。酵素(1×PBS、pH7.4)を有さない対照又はRL9-HRV14 3C(配列番号21)を有する対照を含めた。反応を、>0.5MのAcOHを実験の最後に添加することによって停止させた。酵素反応のLC-MS分析を、実施例6に記載されている条件及び通常の設定を用いて行った。
プロテアーゼ28994、28996、及び28997とRL27-EVLFQGP-PYY(3-36)基質とのインキュベーションを、それぞれ1:20又は1:100の酵素対基質のモル比率を用いて設定し、反応を、3時間、37℃で行った[Table 8(表8)に示す]。LC-MSによる無傷の質量の分析は、プロテアーゼ28994、28996、及び28997が、1:20の酵素対基質モル比率を用いた場合、37℃で3時間のインキュベーションの後に、RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)を成熟PYY(3-36)(配列番号18)に完全にプロセシングし得ることを示した(実施例6において20986について観察されように)。1:100の酵素対基質比率では、より少量のPYY(3-36)及びGP-PYY(3-36)が検出され(反応6、反応8、及び反応10)、反応は、無傷の融合タンパク質が検出されたため、常には完了していなかった。1:100の比率では、プロテアーゼ28996及び28997は、成熟PYY(3-36)のピークの強度のそれぞれ約25%又は約50%の相対強度を伴う、最少量の残りのGP-PYY(3-36)での最も効率的な切断をもたらした。RL9-HRV14 3C(配列番号21)を有する対照はGP_PYY(3-36)のピークのみをもたらし、このことは、XaaProDAPドメインがPYY(3-36)の非変性N末端をもたらすための反応の完了に寄与していること、及び酵素を添加しないと、プロセシングされていない融合タンパク質がもたらされるにすぎないことを示す。この実験は、ヒトライノウイルス又はヒトコクサッキーウイルスに由来する3Cプロテアーゼと、ラクトコッカス・ラクティス又はブタ連鎖球菌に由来するXaaProDAPとを組み合わせる異なる融合プロテアーゼ変異体が、RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)を、Ileが正確なN末端アミノ酸残基である成熟PYY(3-36)にプロセシングするためにうまく用いられ得ることを示す。
プロテアーゼ20986、28994、28996、及び28997とRL27-EVLFQGP-グルカゴン基質とのインキュベーションを、上記のように設定した。LC-MSによる無傷の質量の分析は、プロテアーゼ20986、28994、28996、及び28997が全て、RL27_EVLFQGP_グルカゴンを成熟グルカゴンにプロセシングし得ることを示したが、1:100又は1:500の酵素対基質比を用いて、4℃又は37℃のインキュベーション温度で、全体的な効率及び特異性において差が観察された(図6〜図9)。プロテアーゼ20986、28996では、1:500の酵素対基質比率及び4℃のインキュベーション温度[Table 9(表9)、反応11及び反応16]によって、融合タンパク質の完全なプロセシングを伴い、顕著な非特異的切断を伴わない、最適な切断条件がもたらされた(図6及び図8)。放出されたグルカゴンの決定された質量は、ヒトwtグルカゴン(ピーク番号1)での計算上の質量3482.8Daと一致した。プロテアーゼ28994及び28997はあまり効率的ではなく、全ての融合タンパク質を試験対象条件では完全にプロセシングせず、プロテアーゼ28994では、強度の低いピーク(ピーク番号3及びピーク番号4)が、非常に限られた非特異的切断を示した[Table9(表9)、反応13(図7)、反応14、及び反応17(図9)]。RL9-HRV14 3C(配列番号21)を有する対照はGP_グルカゴンをもたらしたにすぎず(反応18、図10)、このことは、XaaProDAPドメインが、グルカゴン(配列番号19)における非変性N末端ヒスチジンをもたらすための反応の完了に関与していることを示す。酵素を添加しないと、イニシエーターであるメチオニンを有さないRL27_EVLFQGP_グルカゴンでの計算上の質量13787.1Daと一致する決定された質量を有するプロセシングされていない融合タンパク質がもたらされるにすぎなかった。このことは、ヒトライノウイルス又はヒトコクサッキーウイルスに由来するピコルナウイルス3Cプロテアーゼとラクトコッカス・ラクティス又はブタ連鎖球菌に由来するXaaProDAPとを組み合わせる異なる融合プロテアーゼ変異体が、RL27_EVLFQGP_グルカゴンを、正確なN末端アミノ酸残基としてのHisを有し、且つ融合タンパク質に関連する不純物の生成がないか又は非常にわずかである、成熟グルカゴンにプロセシングするためにうまく最適化され得ることを示す。
プロテアーゼ20986、28994、28996、及び28997とRL27_EVLFQGP_GLP-1(7-37、K34R)基質とのインキュベーションを、上記のように設定した。LC-MSによる無傷の質量の分析は、プロテアーゼ20986、28994、28996、及び28997が全て、RL27_EVLFQGP_GLP-1を、計算上の質量3382.7Daに対応する決定された分子量を有する成熟GLP-1(7-37、K34R)に完全にプロセシングし得ることを示した[Table 10(表10)、図11〜図14]。わずかな差異が、1:100又は1:500の酵素対基質比率を用いて、4℃又は37℃のインキュベーション温度で、全体的な効率及び特異性において観察された。観察された非特異的断片は、主にGLP-1(9-37、K34R)(計算上の質量3174.6Da)であり、これにおいて、さらなるジペプチドがGLP-1配列から除去されていた。この実験設定において、融合タンパク質の完全なプロセシングを伴い、非特異的切断をほとんど又は全く伴わない、最適な切断条件は、4℃で得られた。プロテアーゼ28994は、あまり効率的ではなく[反応21(図12)及び反応22、Table 10(表10)]、それは、残りの融合タンパク質がインキュベーション後に観察されたためである。プロテアーゼ28996は、37℃で3時間を用いて、非特異的切断が観察されない、融合タンパク質の完全な切断及び成熟GLP-1(7-37、K34R)の放出をもたらした(示していない)。
Claims (15)
- ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ及びXaaProDAPの触媒性ドメインを含む二機能性融合酵素。
- 式:
X-Y-Z(I)又はZ-Y-X(II)
(式中、
Xは、ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体であり、
Yは、任意選択のリンカーであり、
Zは、Xaa-Pro-ジペプチジルアミノペプチダーゼ(XaaProDAP)又はその機能的変異体である)
のタンパク質を含み、2つのタンパク質分解活性のうち少なくとも一方を低下させることができる自己切断活性を実質的に有さない、請求項1に記載の二機能性融合プロテアーゼ。 - 式(I)を有する、すなわち、前記ピコルナウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体が前記二機能性融合プロテアーゼのN末端部分にある、請求項1又は2に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Xがヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ又はその機能的変異体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Xが配列番号2又はその機能的変異体を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Zが、E.C.3.4.14.11酵素又はその機能的変異体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Zが、乳酸菌に由来する酵素又はその機能的変異体である、請求項6に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Zが配列番号1又はその機能的変異体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Zがストレプトコッカス属種に由来する酵素又はその機能的変異体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- Zが配列番号24又はその機能的変異体である、請求項10に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- 前記機能的変異体が、対応する天然タンパク質又はタンパク質の天然部分配列と比較して1〜15アミノ酸の置換、欠失、又は付加を含む、請求項2から10のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- リンカーYを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- N末端に結合したタグタンパク質を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼ。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼを調製するための方法であって、宿主細胞中で二機能性融合プロテアーゼを含むタンパク質を組換え発現させ、続いて二機能性融合プロテアーゼを単離することを含む、方法。
- N末端ペプチド又はタンパク質をより大きなペプチド又はタンパク質から除去するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の二機能性融合プロテアーゼの使用。
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