JP5887265B2 - Gip受容体活性グルカゴン化合物 - Google Patents
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Description
本発明を記載及び請求するに際して、以下の用語は、下記に示した定義に従って使用されるものとする。
I.小型の脂肪族、無極性、又は微極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性、負荷電の残基並びにそれらのアミド及びエステル:
Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸、及びホモシステイン酸;
III.極性、正荷電の残基:
His、Arg、Lys;オルニチン(Orn)
IV.大型の脂肪族、無極性の残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン(Nle)、ホモシステイン
V.大型の芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン
本発明は、グルカゴン受容体、又はGLP−1受容体、又は両受容体に対する活性の増加又は減少を示すグルカゴンペプチドを提供する。本発明は、GLP−1受容体と比べてグルカゴン受容体に対する選択性が変更されたグルカゴンペプチドも提供する。
(A)例えば、1、2、又は3個以上荷電アミノ酸を天然グルカゴンのC末端部分に、好ましくは27位のC末端側の位置に導入することによる溶解度の向上。そのような荷電アミノ酸は、例えば28又は29位の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、又はその代わりに荷電アミノ酸を、例えば27、28、又は29位の後に付加することにより導入することができる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の1個、2個、3個、又は全てが、負に荷電されている。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の1個、2個、3個、又は全てが、正に荷電されている。そのような修飾は、溶解度を増加させ、約5.5〜8の所定のpH、例えばpH7にて、25℃で24時間後に測定した場合に、天然グルカゴンと比べて少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、又は30倍以上の溶解度を提供する、
(B)本明細書に記載のように、ポリエチレングリコール鎖等の親水性部分を、例えばペプチドの16、17、20、21、24、若しくは29位、又はC末端アミノ酸に付加することによる、溶解度及び作用持続時間又は血中半減期の増加、
(C)15位のアスパラギン酸の修飾による、例えば、欠失又はグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸での置換による増加。そのような修飾は、5.5〜8の範囲内のpHで分解又は切断を低減することができ、例えば、25℃で24時間後に元々のペプチドの少なくとも75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%を保持する、
(D)27位のメチオニンの修飾による、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換よる安定性の増加。そのような修飾は、酸化的分解反応を低減することができる。安定性は、20又は24位のGlnの修飾によっても、例えばAla、Ser、Thr、又はAIBでの置換によっても増加させることができる。そのような修飾は、Glnの脱アミド化により生じる分解を低減することができる。安定性は、21位のAspの修飾により、例えばGluでの置換によっても増加させることができる。そのような修飾は、Aspが脱水されて環式スクシンイミド中間体が形成され、その後イソ−アスパラギン酸へと異性化することより生じる分解を低減することができる、
(E)本明細書に記載の1又は2位のアミノ酸の修飾による、ジペプチジルペプチダーゼ−IV(DPP IV)切断に対する耐性の増加、
(F)活性に影響を及ぼさない保存的又は非保存的置換、付加、又は欠失、例えば、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、又は29位の1個所又は複数個所での保存的置換;27、28、又は29位の1個所又は複数個所の欠失;又はC末端カルボキシル酸基の代りのC末端アミド又はエステルと随意に組み合わせたアミノ酸29の欠失、
(G)本明細書に記載のC末端延長部分の付加、
(H)例えば、本明細書に記載のように、グルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化による、血中半減期の増加及び/又は作用持続時間の延長及び/又は作用開始の遅延、
(I)本明細書中に記載のホモ二量体化又はヘテロ二量体化。
2位のSerをAlaで置換すること、
10位のTyrをVal又はPheで置換すること、
12位のLysをArgで置換すること、
15位のAspをGluで置換すること、
16位のSerをThr又はAIBで置換すること。
本発明のグルカゴンペプチドは、生理学的なpHの水溶液中でのペプチドの溶解度及び安定性を向上させると共に、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持するように更に修飾することができる。PEG基等の親水性部分は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の好適な条件下でグルカゴンペプチドに結合させることができる。PEG部分の反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、又はヒドラジノ基)よる、標的化合物の反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、又はヒドラジノ基)に対する、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加反応、チオールアルキル化、又は他の化学選択的な結合/連結方法を含む、当技術分野で公知の任意の手段を使用することができる。水溶性ポリマーを1つ又は複数のタンパク質に結合するために使用することができる活性基には、限定ではないが、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート(tresylate)、アジジリン、オキシラン、5−ピリジル、及びアルファ−ハロゲン化アシル基(例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸)が含まれる。還元的アルキル化によりペプチドに結合される場合、選択されたポリマーは、重合度が制御されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477−485 (2002);Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459−476 (2002);及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157−182 (1995)を参照されたい。
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが、随意に共有結合により、及び随意にリンカーにより、結合部分に結合されている他の結合体も包含する。結合は、共有結合化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールス、又は疎水性若しくは親水性相互作用等の物理学的力により達成することができる。様々な非共有結合結合系を使用することができ、それらには、ビオチン−アビジン、リガンド/受容体、酵素/基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー、又は互いに対して親和性を有する任意の結合パートナー又はそれらの断片が含まれる。
本開示は、第2のペプチド又はポリペプチドが、グルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されたグルカゴン融合ペプチド又はタンパク質も包含する。より詳しくは、融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸29に結合された配列番号26(GPSSGAPPPS)、配列番号27(KRNRNNIA)、又は配列番号28(KRNR)のアミノ酸配列を更に含む配列番号55、配列番号9、又は配列番号10のグルカゴンアゴニストを含んでいてもよい。1つの実施形態では、配列番号26(GPSSGAPPPS)、配列番号27(KRNRNNIA)、又は配列番号28(KRNR)のアミノ酸配列は、ペプチド結合によりグルカゴンペプチドのアミノ酸29に結合される。本出願人らは、エキセンディン−4(例えば、配列番号26又は配列番号29)のC末端延長ペプチドを含むグルカゴン融合ペプチドにおいて、29位の天然トレオニン残基をグリシンに置換することにより、GLP−1受容体活性が劇的に増加されることを発見した。このアミノ酸置換を、本明細書で開示された他の修飾と共に使用して、GLP−1受容体用のグルカゴン類似体の親和性を増強することができる。例えば、T29G置換は、本明細書に記載のように、S16E及びN20Kアミノ酸置換と、随意にアミノ酸16及び20間のラクタム架橋と、及び随意にPEG鎖の付加と組み合わせて使用することができる。1つの実施形態では、配列番号64の配列を含むグルカゴン/GLP−1受容体同時アゴニストが提供される。1つの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号55、配列番号2、配列番号3、配列番号4、及び配列番号5からなる群から選択され、PEG鎖は、17、21、24位、又はC末端アミノ酸に、又は21及び24位の両方に存在する場合、500〜40,000ダルトンの範囲から選択される。より詳しくは、1つの実施形態では、グルカゴンペプチドセグメントは、配列番号7、配列番号8、及び配列番号63からなる群から選択され、PEG鎖は、500〜5,000の範囲から選択される。1つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号55及び配列番号65の配列を含む融合ペプチドであり、配列番号65のペプチドは、配列番号55のカルボキシ末端に結合されている。
1つの実施形態によると、配列番号10のグルカゴンペプチドの追加的化学修飾は、グルカゴン及びGLP−1受容体に対する相対的活性が事実上同じになるまで、GLP−1受容体効力の増加をもたらす。従って、1つの実施形態では、本発明のグルカゴンペプチドの末端アミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボキシル酸基の代りのアミド基を有するグルカゴン/GLP−1受容体同時アゴニストが提供される。それぞれのグルカゴン及びGLP−1受容体に対するグルカゴン類似体の相対的活性は、グルカゴンペプチドを更に修飾して、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の約40%〜約500%以上を示し、GLP−1受容体に対する天然GLP−1活性の約20%〜約200%以上、例えばGLP−1受容体に対するグルカゴンの通常の活性と比べて50倍、100倍以上の増加を示す類似体を生成することにより調整することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の最大約100%、1000%、10,000%、100,000%、又は1,000,000%を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、GLP−1受容体に対する天然GLP−1活性の最大約100%、1000%、10,000%、100,000%、又は1,000,000%を示す。
更なる実施形態では、ペプチドのカルボキシ末端の3次元構造を安定化させるために、2個のアミノ酸側鎖間に分子内架橋が形成されている、GLP−1受容体アゴニスト活性の増加を示すグルカゴン類似体が提供される。これら2個のアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩橋の形成等のイオン性相互作用により、又は共有結合により互いに結合することができる。これら2個のアミノ酸側鎖が1つ又は複数の共有結合により互いに結合されている場合、本明細書では、ペプチドは共有結合性分子内架橋を含むとみなすことができる。これら2個のアミノ酸側鎖が、非共有結合、例えば水素結合、イオン性相互作用により互いに結合されている場合、本明細書では、ペプチドは非共有結合性分子内架橋を含むとみなすことができる。
本発明の1つの実施形態によると、GLP−1活性が増強されたグルカゴンペプチドは、(a)大型芳香族アミノ酸による1位のHisのアミノ酸置換、及び(b)この分子のC末端部分にあるそのアルファヘリックス(例えば、12〜29位付近)を安定化させる分子内架橋を含む。特定の実施形態では、1位のアミノ酸は、Tyr、Phe、Trp、アミノ−Phe、ニトロ−Phe、クロロ−Phe、スルホ−Phe、4−ピリジル−Ala、メチル−Tyr、又は3−アミノ−Tyrである。特定の態様では、分子内架橋は、3個の介在アミノ酸により隔てられている2個のアミノ酸の側鎖間、つまりアミノ酸i及びi+4位の側鎖間にある。幾つかの実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。本発明のより特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、1位に大型芳香族アミノ酸、並びにペプチドの16及び20位のアミノ酸間のラクタム架橋を含む。そのようなグルカゴンペプチドは、本明細書に記載の他の修飾の1つ又は複数(例えば、2、3、4、又は5つ以上)を更に含んでいてもよい。例えば、グルカゴンペプチドは、C末端カルボキシラートの代りにアミドを含んでいてもよい。従って、1つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号555のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態によると、グルカゴンペプチドは、アシル基、例えば天然アミノ酸に対して非天然であるアシル基を含む。アシル基は、ペプチドが、(i)血中半減期の長期化、(ii)作用開始の遅延、(iii)作用持続時間の延長、(iv)DPP−IV等のプロテアーゼに対する耐性の向上、並びに(v)GLP−1受容体、GIP受容体、及び/又はグルカゴン受容体に対する効力増加のうちの1つ又は複数を示すことの原因となる。本明細書に示されているように、アシル化グルカゴンペプチドは、対応する非アシル化グルカゴンペプチドと比較して、グルカゴン受容体、GIP受容体、及び/又はGLP−1受容体に対する活性減少を示さない。むしろ、幾つかの場合では、アシル化グルカゴンペプチドは、実際に、GLP−1受容体、GIP受容体、及び/又はグルカゴン受容体に対する活性増加を示す。従って、アシル化類似体の効力は、増強されない場合でも、グルカゴン同時アゴニスト類似体の非アシル化型と同等である。
幾つかの実施形態によると、グルカゴンペプチドは、アルキル基、例えば、天然ではアミノ酸に生じないアルキル基(例えば、天然アミノ酸に対して非天然であるアルキル基)を含むように修飾される。任意の特定の理論に束縛されないが、グルカゴンペプチドのアルキル化は、同じではないとしても、グルカゴンペプチドのアシル化と同様の効果、例えば、血中半減期の長期化、作用開始の遅延、作用持続時間の延長、DPP−IV等のプロテアーゼに対する耐性の向上、及びGLP−1及びグルカゴン受容体に対する効力の増加を達成することになると考えられる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのC末端の1個又は2個のアミノ酸(つまり、29及び/又は28位)の切断又は欠失により、グルカゴン及びGLP−1受容体に対する活性及び/又は効力に影響を及ぼすことなく更に修飾される。この点で、グルカゴンペプチドは、随意に本明細書に記載の1つ又は複数の修飾を有する天然グルカゴンペプチド(配列番号1)のアミノ酸1〜27又は1〜28を含むことができる。
配列番号20のグルカゴンペプチドの溶解度は、例えば、1、2、又は3個以上の荷電アミノ酸を、配列番号20のグルカゴンペプチドのC末端部分に、好ましくは27位のC末端側の位置に導入することにより更に向上させることができる。そのような荷電アミノ酸は、例えば28又は29位の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、又はその代わりに荷電アミノ酸を、例えば27、28、又は29位の後に付加することにより導入することができる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の1個、2個、3個、又は全てが、負に荷電されている。或いは、溶解度は、ポリエチレングリコール等の親水性部分を共有結合でペプチドに結合することにより増強することができる。
1つの実施形態によると、配列番号55の配列を含むグルカゴン類似体であって、前記類似体が、1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、及び29位から選択される1〜3個のアミノ酸で配列番号55と異なっており、前記グルカゴンペプチドが、GLP−1受容体に対して天然GLP−1の活性の少なくとも20%を示す類似体が提供される。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Xaa−Arg−Arg−Ala−Xaa−Asp−Phe−Val−Xaa−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号33)、配列中、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、16位のXaaは、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20位のXaaは、Gln又はLysであり、24位のXaaは、Gln又はGluであり、28位のXaaは、Asn、Lys、又は酸性アミノ酸であり、29位のXaaは、Thr、Gly、又は酸性アミノ酸であり、Rは、COOH又はCONH2であり、但し16位がセリンである場合、20位はLysであるか、又はその代わりに16位がセリンである場合、24位はGluであり、20位又は28位のいずれかはLysである。1つの実施形態では、グルカゴン/GLP−1受容体同時アゴニストは、28位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、29位のアミノ酸がグルタミン酸である配列番号33の配列を含む。別の実施形態では、28位のアミノ酸は天然アスパラギンであり、29位のアミノ酸は、グリシンであり、配列番号29又は配列番号65のアミノ酸配列が、配列番号33のカルボキシ末端に共有結合で結合されている。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Xaa−Arg−Arg−Ala−Xaa−Asp−Phe−Val−Xaa−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号34)、配列中、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、16位のXaaは、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20位のXaaは、Gln又はLysであり、24位のXaaは、Gln又はGluであり、28位のXaaは、Asn、Asp、又はLysであり、Rは、COOH又はCONH2であり、29位のXaaは、Thr又はGlyであり、Rは、COOH、CONH2、配列番号26、又は配列番号29であり、但し16位がセリンである場合、20位はLysであるか、又はその代わりに16位がセリンである場合、24位はGluであり、20位又は28位のいずれかはLysである。1つの実施形態では、RはCONH2であり、15位のXaaはAspであり、16位のXaaは、Glu、Gln、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20及び24位のXaasは、各々Glnであり、28位のXaaは、Asn又はAspであり、29位のXaaはThrである。1つの実施形態では、15及び16位のXaaは、各々Gluであり、20及び24位のXaaは、各々Glnであり、28位のXaaは、Asn又はAspであり、29位のXaaはThrであり、RはCONH2である。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号66)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号67)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号68)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Xaa−R(配列番号69)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−R(配列番号16)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Thr−R(配列番号17)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Thr−R(配列番号18)
実施例において詳細に記載されているように、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然ペプチドと比べて生物活性の増強を示すと共に、生物物理学的な安定性及び水溶解度の増強を示す。従って、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて以前に記述されているあらゆる使用に好適であると考えられる。従って、本明細書に記載の修飾グルカゴンペプチドを使用して、低血糖症を治療するか又は血糖レベルを増加させることができ、放射線医学的使用のために腸の一時的麻痺を誘導するか、又はグルカゴンの血中レベル低下に起因する他の代謝疾患を治療することができる。本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、体重の低減若しくは維持、又は高血糖症の治療、又は血糖レベルの低下、又は血糖レベルの正常化にも使用することができると予測される。
本開示は、本明細書で開示された修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。当業者に公知の標準的結合剤及び手順を使用して、2つ以上の修飾グルカゴンペプチドを一緒に結合させることができる。例えば、特に、システイン、リシン オルニチン、ホモシステイン、又はアセチルフェニルアラニン残基で置換されたグルカゴンペプチド(例えば、配列番号3及び配列番号4)の場合、二官能性チオール架橋リンカー及び二官能性アミン架橋リンカーを使用することにより、2つの修飾グルカゴンペプチド間で二量体を形成することができる。二量体はホモ二量体であってもよく、又はその代わりにヘテロ二量体であってもよい。ある実施形態では、2つの(又はより多くの)グルカゴンペプチドを接続するリンカーは、PEG、例えば5kDa PEG、20kDa PEGである。幾つかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である。例えば、二量体の各単量体は、Cys残基(例えば、端末又は内部に位置するCys)を含んでいてもよく、各Cys残基の硫黄原子は、ジスルフィド結合の形成に寄与する。本発明の幾つかの態様では、単量体は、末端アミノ酸(例えば、N末端又はC末端)により、内部アミノ酸により、又は少なくとも1つの単量体の末端アミノ酸及び少なくとも1つの他の単量体の内部アミノ酸により接続される。特定の態様では、単量体は、N末端アミノ酸によっては接続されていない。幾つかの態様では、多量体の単量体は、各単量体のC末端アミノ酸が一緒に結合される「尾−尾」配向性で共に結合される。
本発明の修飾グルカゴンペプチドは、1つの実施形態によると、キットの一部として提供することができる。1つの実施形態では、グルカゴンアゴニストをその必要性のある患者の投与するためのキットが提供され、キットは、1)配列番号20、配列番号9、配列番号10、又は配列番号11の配列を含むグルカゴンペプチド;2)配列番号11、配列番号20、又は配列番号55のグルカゴンアゴニスト類似体、及びグルカゴンペプチドのアミノ酸29に結合された配列番号26(GPSSGAPPPS)、配列番号27(KRNRNNIA)、又は配列番号28(KRNR)のアミノ酸配列を含むグルカゴン融合ペプチド;及び3)グルカゴンペプチドのアミノ酸29に結合された配列番号26(GPSSGAPPPS)、配列番号27(KRNRNNIA)、又は配列番号28(KRNR)のアミノ酸配列を更に含み、17、21、又は24位に共有結合で結合されたPEG鎖が、約500〜約40,000ダルトンの分子量を有する、配列番号11又は配列番号51のペグ化グルカゴンペプチドからなる群から選択される修飾グルカゴンペプチドを含む。1つの実施形態では、キットは、グルカゴン/GLP−1同時アゴニストを含み、ペプチドは、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列を含む。
1つの実施形態によると、組成物が本開示のグルカゴンペプチド、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される成分を含むことができ、それらには、例えば、以下のものが含まれる:酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴霧体、空気置換剤(air displacement agent)、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝血剤、抗菌保存剤、酸化防止剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、被膜形成剤、香味強化剤、流動促進剤(flow enhancer)、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤(mucoadhesive)、軟膏基剤、軟膏剤、油性媒体、有機基剤、香錠基剤、色素、可塑剤、研磨剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味料、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性作用剤、増粘剤、水吸収剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は湿潤剤。
本明細書に記載のグルカゴン類似体、グルカゴンアゴニスト類似体、グルカゴン同時アゴニスト、及びグルカゴン/GLP−1同時アゴニスト分子を含むグルカゴンペプチドはいずれも、3位における修飾、例えばGluによるGlnの置換を含むように修飾して、グルカゴン受容体に対する選択性と比較して、GLP−1受容体に対する高い選択性、例えば10倍の選択性を有するペプチドを生成することができる。
本発明の化合物は、標準的合成法、組換えDNA技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する任意の他の方法により調製することができる。標準的組換えDNA技術により、特定の非天然アミノ酸を発現させることはできないが、それらを調製するための技術は当技術分野で公知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、適用可能な場合、標準的ペプチド化学反応に加えて、標準的有機化学反応により合成することができる。
基本合成プロトコール:
グルカゴン類似体は、改良型Applied Biosystem社製430Aペプチド合成機を用いて、0.2ミリモルのBoc Thr(OBzl)Pamレジンから開始し、HBTU活性化「Fast Boc」単一カップリング法を使用して合成した。Bocアミノ酸及びHBTUは、Midwest Biotech社(フィッシャー、イリノイ州)から取得した。使用した側鎖保護基は、以下の通りだった:Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl−Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br−Z)、及びTrp(CHO)。N末端Hisの側鎖保護基は、Bocだった。
典型的には、グルカゴンCys類似体を、リン酸緩衝生理食塩水に溶解し(5〜10mg/ml)、0.01Mエチレンジアミン四酢酸を添加する(全容積の10〜15%)。過剰(2倍)マレイミドメトキシPEG試薬(Nektar社製)を添加し、反応物を室温で撹拌しつつ、HPLCで反応進行をモニターする。8〜24時間後に、反応混合物を酸性化し、分取用逆相カラムに負荷して、0.1%TFA/アセトニトリル勾配を使用して精製する。適切な画分を混合し凍結乾燥して、所望のペグ化類似体を得た。
グルカゴンCys17(1〜29)及び類似のモノCys類似体の合成
0.2ミリモルのBoc Thr(OBzl)Pamレジン(SynChem社製)を60ml反応槽に投入し、下記の配列を入力し、FastBoc HBTU活性化単一カップリング法を使用して、改良型Applied Biosystems430Aペプチド合成機で実行した。
グルカゴン−Cex及び他のC末端延長類似体の合成
285mg(0.2ミリモル)のメトキシベンズヒドリルアミンレジン(Midwest Biotech社製)を60ml反応槽に投入し、下記の配列を入力し、FastBoc HBTU活性化単一カップリング法を使用して、改良型Applied Biosystems430Aペプチド合成機で実行した。
グルカゴンCys17Mal−PEG−5K
15.1mgのグルカゴンCys17(1〜29)及び27.3mgのメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド 平均分子量5000(mPEG−Mal−5000、Nektar Therapeutics社製)を、3.5mlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をHPLC分析でモニターした[0.46×5cm Zorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間で10%から80%B]。.
グルカゴンCys21Mal−PEG−5K
21.6mgのグルカゴンCys21(1〜29)及び24mgのmPEG−MAL−5000(Nektar Therapeutics社製)を、3.5mlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した。反応物を室温で撹拌した。2時間後、更に12.7mgのmPEG−MAL−5000を添加した。8時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取用逆相カラムに負荷し、Pharmacia社製FPLCを用いてアセトニトリル勾配を4ml/分で実施しながら、5分間の画分を収集した。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。勾配=450分間で30%Bから80%B。
グルカゴンCys24Mal−PEG−5K
20.1mgのグルカゴンC24(1〜29)及び39.5mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics社製)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを添加した。反応物を室温で7時間撹拌し、その後更に40mgのmPEG−Mal−5000を添加した。およそ15時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取用逆相カラムに負荷し、Pharmacia社製FPLCを使用してアセトニトリル勾配を実施した。5分間の画分を、214nmのUVをモニター(2.0A)しながら収集した。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、勾配=450分間で30%Bから100%B。産物に対応する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して45.8mgを得た。MALDI質量スペクトル解析は、グルカゴンC24(3457.8)よりおよそ5,000a.m.u.大きな、最大9175.2の典型的なPEG広域シグナルを示した。
グルカゴンCys24Mal−PEG−20K
25.7mgのグルカゴンC24(1〜29)及び40.7mgのmPEG−Mal−20K(Nektar Therapeutics社製)を、3.5mlのPBSに室温で撹拌しながら溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを添加した。6時間後、産物に対する出発物質の比率は、HPLCで決定したところ、およそ60:40だった。更に25.1mgのmPEG−Mal−20Kを添加し、反応物を更に16時間撹拌させた。産物比率が著しくは向上しなかったため、反応混合物を、2.2×25cmのKromasil C18分取用逆相カラムに負荷し、450分間で30%Bから100%Bの勾配を使用して、Pharmacia社製FPLCで精製した。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、流速=4ml/分、214nmのUVをモニター(2.0A)しながら、5分間の画分を収集した。均質な産物を含有する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して、25.7mgを得た。分析HPLCで決定した純度は約90%だった。MALDI質量スペクトル解析は、23,000〜27,000の広域ピークを示し、これは、グルカゴンC24(3457.8)よりおよそ20,000a.m.u.大きかった。
グルカゴンCys29Mal−PEG−5K
20.0mgのグルカゴンC29(1〜29)及び24.7mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics社製)を、3.5mlのPBSに室温で撹拌しながら溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを添加した。4時間後、更に15.6mgのmPEG−Mal−5000を添加して、反応を完了へと推進した。8時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取用逆相カラムに負荷し、Pharmacia社製FPLCでアセトニトリル勾配を実施した。5分間の画分を、214nmのUVをモニター(2.0A)しながら収集した。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。画分75〜97を混合し、凍結し、凍結乾燥して、HPLCで回収した出発物質(画分58〜63)と異なる40.0mgの産物を得た。この産物の分析HPLCによる分析[0.46×5cm Zorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間で10%Bから80%B]は、95%超の純度を示した。MALDI質量スペクトル解析は、出発物質(3484.8)よりも5,540a.m.u.大きい8,000〜10,000(最大9025.3)の質量範囲を有するPEG成分が存在することを示した。
グルカゴンCys24(2−ブチロラクトン)
24.7mgのグルカゴンCys24(1〜29)に、4mlの0.05M重炭酸アンモニウム/50%アセトニトリル、及び5.5μlの2−ブロモ−4−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトン溶液(900μlアセトニトリル中100μl)を添加した。室温で3時間撹拌した後、更に105μlのラクトン溶液を反応混合物に添加し、それを更に15時間撹拌した。反応混合物を10%酢酸水溶液で10mlに希釈し、2.2×25cmのKromasil C18分取用逆相カラムに負荷した。アセトニトリル勾配(450分間で20%Bから80%B)をPharmacia社製FPLCで実施しながら、5分間の画分を収集し、214nmのUVをモニターーした(2.0A)。流速=4ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分74〜77を混合し、凍結し、凍結乾燥して、7.5mgを得た。HPLC分析は、95%の純度を示し、MALDI質量スペクトル解析は、3540.7の質量、つまり出発物質よりも84質量単位だけ大きな質量を示した。この結果は、単一のブチロラクトン部分の付加と一致する。
グルカゴンCys24(S−カルボキシメチル)
18.1mgのグルカゴンCys24(1〜29)を、9.4mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=9.2)に溶解し、0.6mlのブロモ酢酸溶液(アセトニトリル中1.3mg/ml)を添加した。反応物を室温で撹拌し、反応進行を分析HPLCで追跡した。1時間後、更に0.1mlのブロモ酢酸溶液を添加した。反応物を更に60分間撹拌し、その後酢酸水溶液で酸性化し、2.2×25cmのKromasil C18分取用逆相カラムに負荷して精製した。アセトニトリル勾配をPharmacia社製FPLCで実施しながら(流速=4ml/分)、5分間の画分を収集し、214nmのUVをモニターした(2.0A)。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。画分26〜29を混合し、凍結し、凍結乾燥して、数mgを得た。分析HPLCは、90%の純度を示し、MALDI質量スペクトル解析は、所望の産物の3515の質量を確認した。
グルカゴンCys24マレイミド、PEG−3.4K−二量体
16mgのグルカゴンCys24及び1.02mgのMal−PEG−Mal−3400、ポリ(エチレングリコール)−ビス−マレイミド 平均分子量3400(Nektar Therpeutics社製)を、3.5のリン酸緩衝生理食塩水及び0.5mlの0.01M EDTAに溶解し、反応物を室温で撹拌した。16時間後、更に16mgのグルカゴンCys24を添加し、撹拌を継続した。およそ40時間後に、反応混合物をPharmcia社製PepRPC 16/10カラムに負荷し、アセトニトリル勾配をPharmacia社製FPLCで実施しながら、2分間の画分を収集し、214nmのUVをモニターした(2.0A)。流速=2ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分69〜74を混合し、凍結し、凍結乾燥して、10.4mgを得た。分析HPLCは、90%の純度を示した。MALDI質量スペクトル解析は、所望の二量体と一致する9500〜11,000の範囲の成分を示す。
グルカゴンラクタムの合成
285mg(0.2ミリモル)のメトキシベンズヒドリルアミンレジン(Midwest Biotech社製)を60mL反応槽に投入し、下記の配列を、Boc DEPBT活性化単一カップリング法を使用して、改良型Applied Biosystems430Aペプチド合成機で構築した。
グルカゴン溶解度アッセイ:
グルカゴン(又は類似体)の溶液(1mg/ml又は3mg/ml)を、0.01NのHCl中に調製する。100μlの原液を、0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度(276nm)を決定する。残りの原液のpHを、200〜250μlの0.1M Na2HPO4(pH9.2)を使用してpH7に調整する。溶液を4℃で一晩静置させておき、その後遠心分離する。その後100μlの上清を0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度を決定する(重複して)。
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体に対するペプチドの親和性は、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイで測定した。シンチレーション接近アッセイ緩衝液(0.05M Tris−HCl、pH7.5、0.15M NaCl、0.1重量/容積%のウシ血清アルブミン)で製作されたペプチドの連続3倍希釈物を、96ウエル白色/透明底プレート(Corning Inc.社製、アクトン、マサチューセッツ州)中で、1ウエル当たり1〜6マイクログラム0.05nM(3−[125I]−ヨードチロシル)Tyr10グルカゴン(Amersham Biosciences社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現する細胞から調製された原形質膜断片、及び1mg/ウエルのポリエチレンイミン処理小麦胚芽凝集素A型シンチレーション近接アッセイビーズ(Amersham Biosciences社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)と混合する。回転振とう器で5分間800rpmにて振とうした後、プレートを室温で12時間インキュベートし、その後MicroBeta1450液体シンチレーション計数器(Perkin Elmer社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)で測定した。非特異的結合(NSB)放射能を、検査試料の最高濃度よりも4倍高い濃度の「コールド」天然リガンドを有するウエル中で測定し、総結合放射能は、競合体を有していないウエル中で検出した。特異的結合パーセントは、以下のように計算した:特異的結合%=((結合−NSB)/(総結合−NSB))X100。IC50値は、Originソフトウェア(OriginLab社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州)を使用することにより決定した。
機能的アッセイ−cAMP合成
グルカゴン類似体がcAMPを誘導する能力を、ホタルルシフェラーゼに基づくリポーターアッセイで測定した。グルカゴン受容体又はGLP−1受容体のいずれか、及びcAMP反応性エレメントに結合されたルシフェラーゼ遺伝子で同時形質移入されたHEK293細胞を、0.25%のウシ増殖血清(HyClone社製、ローガン、ユタ州)で補完されたDMEM(Invitrogen社製、カールズバッド、カリフォルニア州)中で16時間培養することにより血清除去し、その後、96ウエルポリ−D−リシンでコーティングされた「Biocoat」プレート(BD Biosciences社製、サンノゼ、カリフォルニア州)中で、グルカゴン、GLP−1、又は新規グルカゴン類似体のいずれかの連続希釈物と共に、37℃、5%CO2にて5時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、100マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬(Perkin Elmer社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)を、各ウエルに添加した。プレートを手短に振とうし、暗所で10分間インキュベートし、光出力を、MicroBeta−1450液体シンチレーション計数器(Perkin Elmer社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)で測定した。有効50%濃度を、Originソフトウェア(OriginLab社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州)を使用することにより計算した。結果は、図3〜9及び表2〜10に示されている。
グルカゴンCys−マレイミドPEG類似体の安定性アッセイ
各グルカゴン類似体を水又はPBSに溶解し、初期HPLC分析を実施した。pH(4、5、6、7)を調整した後、試料を、指定の期間にわたって37℃でインキュベートし、HPLCにより再分析してペプチドの完全性を決定した。指定の目的ペプチドの濃度を決定し、完全性を維持しているパーセントを、初期分析と比べて計算した。グルカゴンCys21−マレイミドPEG5Kの結果は、図1及び2に示されている。
上記の実施例1〜11で一般的に述されているように、以下のグルカゴンペプチドを構築する:
以下の配列の全てにおいて、「a」は、C末端アミドを意味する。
X1=His、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、又はアルファ,アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)、N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、又はイミダゾール酢酸であり、
X2=Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリン、又はアミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニン、及びD−アラニンであり、
X3=Ala、Gln、又はCys−PEGであり、
X4=Thr−CONH2又はCys−PEG又はGGPSSGAPPPS(配列番号515)又はGGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)であり、
但し、X3がCys−PEGである場合、X4は、Cys−PEG又はGGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)ではなく、X2=Serの場合、X1はHisではない。
X5=Ala又はArgである。
X1=His、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、又はアルファ,アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)、N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、又はイミダゾール酢酸であり、
X2=Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリン、又はアミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニン、及びD−アラニンであり、
X3=Ala、Gln、又はCys−PEGであり、
X4=Thr−CONH2又はCys−PEG又はGGPSSGAPPPS(配列番号515)又はGGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)であり、
但し、X3がCys−PEGである場合、X4は、Cys−PEG又はGGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)ではなく、X2=Serの場合、X1はHisではない。
X5=Ala又はArgである。
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LXNTa(配列番号554)、式中、27位のXはノルロイシンであり、29位のアミノ酸はアミノ化されている。
グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合された配列番号26のc末端延長部分を含むように修飾された以下のグルカゴンペプチドを、上記の実施例1〜11に一般的に記述されているように構築し、実施例14に記載のin vitroアッセイを使用してGLP−1及びグルカゴン受容体に対する活性をアッセイした。
表12は、グルカゴン及びGLP−1受容体に対するそれらの相対活性を比較する、種々のグルカゴンペプチドについて蓄積されたin vitroデータを表す。
アシル化及び/又はペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドを、CS Bio4886型ペプチド合成機又はApplied Biosystems社製430Aペプチド合成機のいずれかを使用して、固体担体レジンで合成した。In situ中和化学を、Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180−193 (1992)に記載のように使用した。アシル化ペプチドの場合、アシル化する標的アミノ酸残基(例えば、10位)を、Nε−FMOCリジン残基で置換した。完成したN末端BOC保護ペプチドを、DMF中20%のピペリジンで30分間処理して、FMOC/ホルミル基を除去した。遊離ε−アミノLys残基への結合は、DMF/DIEA中で、10倍過剰モル量のFMOC保護スペーサーアミノ酸(例えば、FMOC−(N−BOC)−トリプトファン−OH)又はアシル鎖(例えば、C17−COOH)のいずれか及びPyBOP又はDEPBT結合試薬を結合することにより達成した。その後スペーサーアミノ酸のFMOC基を除去した後で、アシル鎖との結合を繰り返す。100%TFAで最終的処理することにより、あらゆる側鎖保護基及びN末端BOC基の除去がもたらされた。ペプチドレジンを、5%DIEA/DMFで中和し、乾燥し、その後HF/p−クレゾール95:5を0℃で1時間使用して担体から切断した。エーテル抽出した後、5%HOAc溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和した。その後、この溶液の試料が正しい分子量のペプチドを含有していることを、ESI−MSにより検証した。正しいペプチドを、10%CH3CN/0.1%TFA〜100%CH3CN中0.1%TFAの線形勾配を使用してRP−HPLCにより精製した。精製には、Vydac社製C18 22mm×250mmタンパク質カラムを使用した。アシル化ペプチド類似体は、一般的に20:80の緩衝液比率で溶出を完了させた。部分を一緒に貯溜して、分析RP−HPLCで純度を検証した。純粋な画分を凍結乾燥して、白色固形ペプチドを得た。収率は、典型的には、合成に応じて10mg〜100mgの範囲だった。
種々のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例19に記載のように製作し、in vivo活性を試験した。特に、ペプチドA(2位にAIB、16位にGlu、17位にGln、18位にAla、20位にLys、21位にGlu、23位にIle、24位にCysを含有するように修飾され、Cysが40K PEGと結合されており、C末端がアミドである配列番号1)を、10位にLysを含むように更に修飾した。Lys10を、C8脂肪酸鎖、C14脂肪酸鎖、C16脂肪酸鎖、又はC18脂肪酸鎖でアシル化した。
以下のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例19に記載のように製作した。
(A)「キメラ−2 Aib2 Lys10−C18 Cys24(40K)」:以下の修飾:16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、及び24位のAla、及びC末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列(配列番号1)(「キメラ2」)を、2位のAIB、C18脂肪酸でアシル化されたLys10、及び40K PEG基でペグ化された24位のCysで更に修飾した;
(B)「キメラ−2 Aib2 Lys10−C16 Cys24(40K)」:キメラ2を、2位のAIB、C16脂肪酸でアシル化されたLys10、40K PEG基でペグ化されたCys24で更に修飾した;
(C)「グルカゴン Lys10−C18 E16 K20 Cys24(40K)」:以下の修飾:16位のGlu、20位のLys、及びC末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列(配列番号1)(「E16K20−グルカゴン−NH2」)を、C18脂肪酸でアシル化されたLys10、及び40K PEG基でペグ化されたCys24で更に修飾した;
(D)「グルカゴンLys10−TrpC16 E16 K20 Cys24(40K)」:E16K20グルカゴン−NH2を、C16脂肪酸でアシル化されたTrpスペーサーに結合されたLys10で更に修飾した;
(E)「グルカゴンLys10−TrpC18 E16 K20 Cys24(40K)」:E16K20グルカゴン−NH2を、C18脂肪酸でアシル化されたTrpスペーサーに結合されたLys10で更に修飾した。
以下のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例19に記載のように製作した。
(A)ペプチドA:以下の修飾:16位のGlu、20位のLys、及びC末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列(配列番号1)(「E16K20−グルカゴン−NH2」);
(B)ペプチドB:C16脂肪酸でアシル化されたLys10を更に含むE16K20−グルカゴン−NH2;
(C)ペプチドC:C18脂肪酸でアシル化されたLys10を更に含むE16K20−グルカゴン−NH2;
(D)ペプチドD:C16脂肪酸でアシル化されたGlu(スペーサー残基)に結合されたLys10を更に含むE16K20−グルカゴン−NH2;
(E)ペプチドE:C18脂肪酸でアシル化されたTrp(スペーサー残基)に結合されたLys10を更に含むE16K20−グルカゴン−NH2。
以下の修飾:16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、24位のAla、27位のVal、28位のLys、及びC末端アミドを有する配列番号1のアミノ酸配列を含むグルカゴン同時アゴニストペプチド(「キメラ1」)を製作した。キメラ1のC末端切断型を、キメラ1(「Chi1(1〜28)」)の29位のアミノ酸を欠失することにより、又はキメラ1(「Chi1(1〜27)」)の28及び29位のアミノ酸を両方とも欠失することにより製作した。
食餌誘導性肥満(DIO)マウスに、以下のうちの1つを、0.2、2、20、又は70nmol/kgで約15分の時点にて腹腔内に注射した:
(A)媒体のみ、
(B)以下の修飾:16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、及び24位のAla、及びC末端アミドを含み(「キメラ2」)、2位のAIB、及び40K PEG基でペグ化されている24位のCysを含むように更に修飾されている天然グルカゴンアミノ酸配列(配列番号1)(「キメラ−2 AIB2 Cys24−40kD」)、
(C)2位のAIB、C8脂肪酸でアシル化されている10位のLys、及び40K PEGでペグ化されている24位のCysを含むように更に修飾されているキメラ2(「キメラ−2 AIB2 K10−C8 Cys24−40kD」)、又は
(D)2位のAIB、C16脂肪酸でアシル化されている10位のLys、及び40K PEGでペグ化されている24位のCysを含むように更に修飾されているキメラ2(「キメラ−2 AIB2 K10−C16 Cys24−40kD」)。
DIOマウスに、以下のうちの1つを70nmol/kgで約24時間の時点にて腹腔内注射した:
(A)媒体のみ、
(B)上記の実施例24に記載のキメラ−2−AIB2 Cys24−40kD
(C)上記の実施例24に記載のキメラ−2 AIB2 K10−C8 Cys24−40kD、又は
(D)上記の実施例24に記載のようなキメラ−2 AIB2 K10−C16 Cys24−40kD。
DIOマウスに、媒体のみ、又は以下のうちの1つを15若しくは70nmol/kgで腹腔内注射した:
(A)上記の実施例24に記載のキメラ−2−AIB2 Cys24−40kD
(B)上記の実施例24に記載のキメラ−2 AIB2 K10−C8 Cys24−40kD、又は
(C)上記の実施例24に記載のキメラ−2 AIB2 K10−C16 Cys24−40kD。
1位のチロシン、並びにE16及びK20間のラクタム架橋(並びにC末端カルボキシラートの代りにアミド)を含む配列番号555のペプチドを、本質的に上述のように合成し、実施例14によりGLP−1及びグルカゴン受容体に対する活性についてin vitroで試験した。各受容体に対するペプチドのEC50は、図18に示されている。
配列番号1(グルカゴン(l〜29))のペプチド、C末端カルボキシラートを置換したアミドを有する配列番号1のペプチド(グルカゴン(1〜29a))、並びに2及び16位の各々にAIBを有し、C末端カルボキシラートを置換したアミドを有する配列番号1のペプチド(グルカゴン(1〜29a)Aib2 Aib16)を、本質的に上述のように合成した。その後、これらペプチドを、GLP−1受容体及びグルカゴン受容体に対する活性について、実施例14に記載の方法によりin vitroで試験した。各ペプチドのEC50は、図19に示されている。
以下のペプチドを、本質的に上述のように合成した:
(1)実施例28に記載のグルカゴン(1〜29)、
(2)24位のCys、及びC16脂肪酸を含むTrpに共有結合で結合された10位のLysを有するグルカゴン(1〜29a)Aib2 Aib16(実施例28に記載)(「グルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Cys24」)、
(3)Cysが40kD PEG基を含むグルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Cys24(「グルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Cys24−40kD」)、
(4)20位のAibを含むグルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Cys24(「グルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Aib20 Cys24」)及び、
(5)Cysが40kD PEG基を含むグルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Aib20 Cys24(「グルカゴン(1〜29a)Aib2 Lys10−Trp−C16 Aib16 Aib20 Cys24−40kD」)。
その後、これらペプチドを、GLP−1受容体及びグルカゴン受容体に対する活性について、実施例14に記載の方法によりin vitroで試験した。各ペプチドのEC50は、表20に示されている。
アシル化及びペグ化グルカゴンペプチドのin vivo効果をDIOマウスで試験した。特に、各群が58gの平均初期体重を有する6群のDIOマウス(1群当たり8匹のマウス)に、10、20、40、又は80nmol/kgのアシル化及びペグ化グルカゴンペプチド又は媒体対照を、週1回で2週間腹腔内に注射した。この研究で使用したアシル化及びペグ化グルカゴンペプチドは、キメラ−2 AIB2 K10−C8 Cys24−40kD(実施例26に記載)及びペプチドA K10−C14(実施例20に記載)だった。
共有結合性分子内架橋を含むか又は欠如するアシル化グルカゴン類似体ペプチドを、固相合成により製作し、グルカゴン及びGLP−1受容体に対するin vitro活性について試験した。各受容体に対するEC50(nM)、及び対応する受容体に対する天然ペプチドと比べたペプチドの活性%は、表21に示されている。
各々が48.7gの平均体重を有するDIOマウス(1群当たり8匹のマウス)に、媒体のみ、30nmol/kg又は100nmol/kgのアシル化グルカゴン類似体ペプチド、又は長期間作用性GLP−1類似体であるリラグルチド(Novo Nordisk社製、デンマーク)を、7日間毎日皮下注射した。アシル化グルカゴン類似体は以下の通りだった:
10位のTyrがアシル化Lys残基に修飾された野生型のグルカゴン(配列番号1)のアミノ酸配列を含み、アシル化LysがC16脂肪酸アシル基を含み、C末端カルボキシラートがアミド基で置換された「(C16)グルカゴンアミド」、
C16脂肪酸アシル基が、ガンマ−Glu−ガンマ−Gluジペプチドスペーサーを介して10位のLys(下記のアシル化Lysの構造を参照)に結合されたことを除いて、C16グルカゴンアミドと同じ構造を含む「γE−γE−C16グルカゴンアミド」、
C16脂肪酸アシル基が、β−Ala−β−Alaジペプチドスペーサーを介して10位のLysに結合されたことを除いて、C16グルカゴンアミドと同じ構造を含む「βAβA−C16グルカゴンアミド」。
GLP−I活性を有するグルカゴン類似体ペプチドのアシル化を、以下のように評価した。2位のAIB及び24位のCys(40kDa PEG分子を含む)を有するキメラ2の構造を含む非アシル化グルカゴン類似体ペプチドを、10位のアシル化Lys残基を含むように修飾した。非アシル化グルカゴン類似体ペプチドは、配列番号580のアミノ酸配列を含んでいた。10位のLysは、C8、C14、C16、又はC18脂肪酸アシル基でアシル化されており、アシル化ペプチドは、それぞれ配列番号534〜537の構造を含んでいた。非アシル化ペプチド及びそのアシル化型のGLP−1受容体に対するin vitro活性を、本質的に本明細書に記載のように試験した。GLP−1受容体に対する各ペプチドのEC50は、表24に示されている。
グルカゴン類似体ペプチドを、本明細書に記載のように固相ペプチド合成により製作し、ペプチドの10又は30位のいずれかをアシル化した。ペプチド及びそれらの構造は以下の通りだった:
アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK−アミド(配列番号581)を含み、式中2位のXがd−Serであり、30位のLysがC14脂肪酸アシル基でアシル化されており、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドdS2E16K20K30−C14Glucアミド」;
アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT−アミド(配列番号582)を含み、式中2位のXがd−Serであり、10位のLysがC14脂肪酸アシル基でアシル化されており、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドdS2K10(C14)E16K20−Glucアミド」;
アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK−アミド(配列番号583)を含み、式中2位のXがd−Serであり、30位のLysがC16脂肪酸アシル基でアシル化されており、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドdS2E16K20K30−C16Glucアミド」;
アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT−アミド(配列番号584)を含み、式中2位のXがd−Serであり、10位のLysがC16脂肪酸アシル基でアシル化されており、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドdS2K10(C16)E16K20−Glucアミド」;
アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT−アミド(配列番号585)を含み、式中2位のXがAIBであり、10位のKがC18脂肪酸アシル基でアシル化されており、24位のCysが40kDa PEG分子を含み、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドキメラ2−AIB2−K10アシル化」;及び
アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK−アミド(配列番号586)を含み、式中2位のXがAIBであり、10位のKがC18脂肪酸アシル基でアシル化されており、24位のCysが40kDa PEG分子を含み、C末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドキメラ2−AIB2−K30−アシル化」。
固相ペプチド合成を使用して、X=DMIAである配列XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT−NH2を構築した(配列番号587)。16位のGlu及び20位のLysを選択的に脱保護した後、ペプチドをラクタム架橋によりレジン上で環化した。その後、切断後の粗ペプチドを分取用RP−HPLCにより精製し、MSにより特徴付けた([M+H]の計算値:3479.9;実測値3480.9)。ペプチド前駆体及びヨードアセチル官能化40kDa PEG(NOF)(1:1)を、7M尿素/50mM Tris緩衝液、pH8.5中で45分間室温にて混合することにより、ペグ化を実施し、PEGとペプチドのCysとの間に共有結合性チオエーテル結合を形成した。
固相ペプチド合成を使用して、X=AIBであるペプチド前駆体HXEGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT−NH2(配列番号589)を調製した。その後、粗ペプチドを分取用RP−HPLCにより精製し、MSにより特徴付けた([M+H]の計算値:3412.8;実測値3413.9)。ペプチド前駆体及びヨードアセチル官能化40kDa PEG(NOF)(1:1)を、7M尿素/50mM Tris緩衝液、pH8.5中で45分間室温にて混合することにより、ペグ化を実施し、PEGとペプチドのCysとの間に共有結合性チオエーテル結合を形成した。
ペプチドJ
種々のグルカゴン類似体骨格に3位のDab(Ac)を含むグルカゴン類似体ペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作し、グルカゴン受容体に対するin vitro活性を試験した。各ペプチドの構造及び活性は、表27に示されている。
配列番号1を含み、2及び16位にAIB及び10位にLysを有し、10位のLysがC16脂肪酸アシル基に共有結合で結合され、C末端カルボキシラートの代りにアミドを有する第1のグルカゴン類似体ペプチド(AIB2、AIB16、K10(C16)Glucアミド)を、本質的に本明細書に記載のように製作した。第2のグルカゴン類似体ペプチド(AIB2、AIB16、K10(C16)、K30 Glucアミド)は、LysがC末端に付加されたことを除いて、第1のグルカゴン類似体ペプチドと同じ構造を有する。ペプチドのin vitro活性を、本質的に実施例14に記載のように試験し、20%ヒト血漿を含む溶液中で更に試験した。各受容体に対するペプチドのEC50(nM)は、表28に示されている。
レプチンの発見は、エネルギーバランス及び体脂肪過多を制御する内分泌系の存在を明らかにした。また、レプチンの発見により、世界的流行疾患となったものを管理するための環境的及び薬理学的手法を特定する手段として、肥満研究に関心及び投資が集まった。十分に効果的で安全な肥満の薬理学的治療はまだ出現しておらず、持続的に体重を減少させることが証明された唯一の選択肢は、外科手術である。作用持続時間が持続的な単一ペプチドの強力な満腹誘導効果及び脂肪分解効果を達成する2つの内分泌ホルモン受容体に対する受容体アゴニズムのコンビナトリアル効能が本明細書で報告されている。天然GLP−1と同等なGLP1−Rに対する活性を有するが、それらのグルカゴン受容体アゴニズムのレベルが互いに異なる2つの特異的なグルカゴン類似体を、げっ歯動物肥満モデルで薬理学的に研究した。異なるグルカゴン及びGLP−1活性を有する一連の高効力類似体から選択されたそれらペグ化ペプチドを週1回投与することにより、食餌誘導性肥満マウス(平均体重約50g)の脂肪過多及び糖耐性レベルが1か月以内に正常化された。体重減少は、食物摂取量の減少及びエネルギー消費量の増加に起因する体脂肪減少の結果であり、グルカゴン受容体アゴニズムのレベルと共に増加した。これら同時アゴニスト化合物は、肝臓脂肪症を含むグルコース及び脂質代謝も正常化した。効果は用量依存的であり、食餌誘導性肥満ラットで繰り返すことに成功した。これら前臨床研究は、完全なGLP−1アゴニズムが、適切な度合いのグルカゴン受容体活性化により増強される場合、体脂肪低減を実質的に及び安全に加速することができることを示す。本明細書に示されている知見は、臨床検査の根拠を確立し、メタボリック症候群に対する魅力的な新規治療選択肢を示唆する。
以下の物質及び方法は、実施例42〜51に記載の実験に関する。
ペプチド合成は、改良型Applied Biosystems社製430Aペプチド合成機で、0.2mmolの4−メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)レジン(Midwest Biotech社製、フィッシャーズ、インディアナ州)を使用して実施した。固相ペプチド合成には、Boc−化学の場合、in situ中和を使用した(Schnolzer, M. et al., International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 13:31−44 (2007))。完成したペプチジルレジンを、0℃で1時間HF/p−クレゾール(10:0.5容積/容積)で処理した。HFを減圧下で除去し、脱保護したペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄した。ペプチドを20%アセトニトリル/1%酢酸に溶解し、凍結乾燥した。ほとんどのペプチドは、Boc化学により調製した。以下の側鎖保護基を、Boc−アミノ酸(Midwest Biotech社製)に使用した:Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Glu(OcHex)、His(BOM)、Lys(2−Cl−Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CH0)、Tyr(Br−Z)。ペプチド分子量を、エレクトロスプレーイオン化又はMALDI−TOF質量分析により確認し、別記のように精製した。
i及びi+4ラクタム形成を有する環化ペプチドをレジン上で合成した。Glu(OFm)−OHガンマエステル(Peptides International社製、ルーイビル、ケンタッキー州)及びLys(Fmoc)−OH(Peptides International社製)を、ラクタム形成に関与する位置のGlu(OcHex)及びLys(2−Cl−Z)の代わりに用いた。完全に保護されたペプチジルレジンをDMF中20%ピペリジンで45分間処理して、Fmoc及びOFm保護基を除去した。レジン上でのラクタム形成は、DMF/DIEA中で、5当量のベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)(Fluka社製)で5時間処理した後に達成された。ラクタム形成は、ニンヒドリン分析及び開環形態のペプチドと比べて18の質量低減により確認した。
レジンから切断した後、粗ペプチド抽出物を、分析的逆相HPLCにより分析した。分析的分離を、Zorbax C8カラム(0.46×5cm)を用いて、0.1%TFA中でアセトニトリル勾配により実施した。分析的解析の後、粗抽出物を、Vydac社製C4又はC18カラム(2.2×25cm)を用いて、0.1%TFA中でアセトニトリル勾配により半分取用クロマトグラフィーにより精製した。同じ条件を使用してペグ化ペプチドを精製した。分析的分離用に列挙した条件を使用した分析的逆相HPLCにより、分取画分の純度を分析した(>95%)。ペプチド質量及び純度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析により確認した。ペグ化ペプチドは、MALDI−TOFにより、43400にわたる幅の広い質量範囲を示した。精製ペプチドを凍結乾燥し、4℃で保管した。
精製ペプチドを、7M尿素/50mM Tris、pH8.0中で、メトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド−プロピオンアミド−40K(Chirotech Technology Ltd社製、ケンブリッジ)と1:1モル比で混合した。反応進行を分析的逆相HPLCによりモニターし、遊離ペプチドは、30分以内に消費された。反応を0.1%TFAで停止させ、別記のように精製及び特徴付けた。
各ペプチド類似体を、グルカゴン(Gcg)及びGLP−1受容体を介してcAMP産生を刺激するその能力について試験した。HEK293細胞を、GcgR又はGLP−1R cDNA、及びcAMP応答エレメント(CRE)に結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子で同時形質移入した。0.25%ウシ増殖血清(HyClone社製、ローガン、ユタ州)で補完されたDMEM(Invitrogen社製、カールズバッド、カリフォルニア州)中で培養することにより、細胞を16時間血清除去した。グルカゴン及びGLP−1類似体の連続希釈物を、同時形質移入されたHEK293細胞を含有する96ウエルポリ−D−リジンコーティングプレート(BD Biosciences社製、サンホゼ、カリフォルニア州)に添加し、プレートを37℃、5%CO2にて5時間インキュベートした。インキュベーションした後、当量容積(100μL)のLucLiteルミネセンス基質試薬(Perkin Elmer社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)を、各ウエルに添加し、プレートを800rpmで3分間振とうした。プレートを、暗所で10分間インキュベートし、光出力を、MicroBeta−1450液体シンチレーション計数器(Perkin Elmer社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)で定量化した。有効50%濃度(EC50)を、Originソフトウェア(OriginLab社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州)により計算した。
ペプチドを、TFE濃度を増加させながら10mMリン酸緩衝液pH5.9に溶解し、ペプチド濃度を定量化した。CD測定用に各試料を10μMに希釈した。CDデータは、窒素を常に流動させ、温度調節を25℃に設定した1mm光路長セルを備えたJASCO社製J−715円偏光二色性分光旋光計で収集した。スペクトルデータは、100nm/分の走査速度及び1nm波長ステップで、270〜190nmの走査を5回蓄積した。JASCOスペクトルマネージャーソフトウェアで、溶媒シグナルを減算し、データを滑らかにした(Savitzky and Golay, Anal. Chem. 36: 1627 (1964))。得られたミリ度値を、degcm2dmol−1の単位を有する平均残基楕円率に変換した。計算した平均残基楕円率値を、DICHROWEB(Whitmore and Wallace, Biopolymers 89:392− 400 (2008);Whitmore and Wallace, Nucleic Acids Research 32:W668−W673 (2004))に入力して、ヘリシティパーセント値を得た。
C57BI/6マウスを、Jackson Laboratories社から取得し、脂肪から58%kcalを有する高スクロース餌であるResearch Diets社製の糖尿病誘発餌を与えた。マウスを、22℃の12:12時間明暗サイクルで食餌及び水を自由に摂取させ、単一で又は集団で飼育した。研究は全て、シンシナティ大学の組織内動物実験委員会により承認され、それに従って実施された。
全体組成(脂肪及び除脂肪体重)をNMR技術(EchoMRI社製、ヒューストン、テキサス州)を使用して測定した。
エネルギー摂取量及び消費量並びにホームケージ活性を、混合型間接熱量測定システム(TSE Systems社製、バートホンブルク、ドイツ)を使用することにより評価した。酸素消費量及びCO2産生量を、45分毎に合計120時間(12時間の順応期含む)測定して、呼吸商及びエネルギー消費量を決定した。食餌及び水分摂取量並びに食事パターンを、尺度を密閉ケージ環境に統合することにより、間接熱量測定評価と同時に120時間連続して決定した。食事は、最短期間が60秒間の食餌摂取事象であり、食餌摂取事象間には300秒間の中断があると定義した。ホームケージ自発運動活性を、光線がケージの底部及び上部レベルを走査する多次元赤外線光線システムを使用して決定し、活性は光線の中断として表された。静止運動活性(そわそわすること)は、ケージ底部レベルにおける1本の単一光線の連続した中断として定義し、歩行運動は、ケージ底部レベルの任意の2本の異なる光線の中断として定義し、立ち上がりは、ケージ底部及び上部レベルの両方における光線の同時中断として定義した。
6時間の断食後に、EDTAをコーティングしたMicrovetteチューブ(Sarstedt社製、ニュルンベルク、ドイツ)を使用して、血液を尾部静脈から採取し、直ちに氷上で冷却した。3,000g及び4℃で15分間遠心分離した後、血漿を−80℃で保管した。血漿インスリンを、Linco社製のラジオイムノアッセイ(感受性ラットインスリンRIA;Linco Research社製、セントチャールズ、ミズーリ州)により定量化した。血漿TG及びコレステロール値を、酵素アッセイキット(Thermo Electron社製、ウォルサム、マサチューセッツ州)により測定した。試料は、5匹の動物/群に由来する貯留試料(0.25ml)を、リポタンパク質分離用に直列に接続した2つのSuperose6カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(FPLC)ゲルろ過にかけたことを除いて、個々に分析した。アッセイは全て、製造業者の説明書に従って実施した。
糖耐性の決定の場合、マウスを6時間断食させ、グルコース負荷試験(GTT)用に、体重1kg当たり2gのグルコース(0.9%生理食塩水中50%D−グルコース(Sigma社製))を腹腔内(i.p.)注射した。尾部血糖レベル(mg/dl)を、注射前(0分)及び注射の15、30、60、90、及び120分後に、携帯型グルコメーター(TheraSense Freestyle)を使用することにより測定した。
脂肪組織を1.5mlの微量遠心チューブに配置し、組織溶解器(Retsch,Inc.社製、ニュータウン、ペンシルバニア州、カタログ番号85210)を30hzで3分間使用して、氷冷RIPA緩衝液(50mM NaF、0.5Mフェニルメチルスルホニルフルオリド、0.1mMバナジン酸Na、20μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチンを有する1×PBS、1%ノニデットP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)中で溶解した。試料を12,000rpmで15分間(4℃)遠心し、その際にインターナタント(internatant)を新しいチューブに取り出し、氷上で15秒間超音波処理した。試料を14,000rpmで10分間(4℃)遠心し、インターナタントを新しいチューブに収集した。試料を再び19,000rpmで10分間(4℃)遠心し、インターナタントを新しいチューブに収集した。その後、等量の試料をタンパク質アッセイのために取り出した。その後、試料を4×SDS/DTT緩衝液中で2分間沸騰させた。細胞溶解産物に由来する50μgのタンパク質を、9%(重量/容積)アクリルアミド分離ゲルのSDS/PAGEにかけ、Hybond ECL nictroセルロース膜に移した。膜をブロッキングし、Cell Signaling社製の目的一次抗体(HSL(4107);Cell Signaling社製のホスホ−HSL(ser660)(4126))で探索した。洗浄した後、HRP結合抗(ウサギIgG)又は抗(マウスIgG)(HRP結合抗ウサギ及び抗マウス二次抗体は、Bio−Radから購入した(170−6515及び170−6516))のいずれかを使用して、一次抗体検出を実施し、高感度化学ルミネセンス(Amersham Biosciences社製)を使用して検出し、CL−Xposureフィルム(Pierce社製)に露光させた。
白色精巣上体脂肪組織のパラフィン包埋切片(5μm)を、記載のようにヘマトキシリン/エオシンで染色した(Ogden, C. L. et al. JAMA 295: 1549−1555 (2006))。個々のマウス組織ブロックの各々について、3つの異なる高倍率視野の各々からの100個の細胞の脂肪細胞サイズを、Image Pro Plus5.1ソフトウェア(Media Cybernetics社製、ベセスダ、メリーランド州、米国)を使用して、面積測定値として定量化した。
肝臓組織中の脂質蓄積を視覚化するために、犠牲時に回収した肝臓の4〜8mm断面をオイルレッドO染料で染色した。20×及び40×の両倍率での画像を[複合レンズ]顕微鏡を使用して得た。
給餌状態(午前給餌の1〜4時間後)で断頭することにより動物を犠牲にし、種々の組織を試料採取し、凍結クランプし、後にリアルタイム定量PCR(icycler、BioRad社製)によりPEPCK、G6P、及びHPRT(ハウスキーピング)のmRNA発現を測定するために−80℃で保管した。
PEPCK、G6P、及びHPRTのプライマー配列は、NIHウェブサイトから取得し、プライマーはIDT DNA社により生成された。
CD68 mRNA発現を、記載のようにリアルタイムRT−PCRにより定量化した(Nomiyama, T. et al. Journal of Clinical Investigation 117:2877−2888 (2007))。手短かに言えば、犠牲時に、100mgの精巣上体脂肪組織をTRIZOLでホモジナイズし、全mRNAをcDNAに逆転写した。PCR反応は、iCycler(Bio−Rad社製)及びSYBR Green I系(Bio−Rad社製)を使用して実施した。各試料を三重反復で分析し、TFIIB mRNA発現の値に対して正規化した。使用したマウスプライマー配列は以下の通りだった:CD68、5’−CAAGGTCCAGGGAGGTTGTG−3’(順方向)(配列番号638)、5’−CCAAAGGTAAGCTGTCCATAAGGA−3’(逆方向)(配列番号639);及びTFIIB、5’−CTCTCCCAAGAGTCACATGTCC(配列番号640)、5’−CAATAACTCGGTCCCCTACAAC−3’(逆方向)(配列番号641)。
別様の指示がない限り、統計分析は全て、GraphPad Prismの一元配置ANOVA及びカラム統計を使用して実施した。記載のP値は、一元配置分散分析用である。結果は全て、平均±SEとして示されている(受容体活性化データは、±S.Dである)。.
アミノ酸修飾を有する配列番号1のアミノ酸配列を含む2つのグルカゴンペプチド、ペプチドX及びYを本明細書に記載のように製作した。両ペプチドは、2位のAIB、16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、及び24位のCysを含んでいた。24位のCysにおける部位特異的な40−kdペグ化を、マレイミド官能化直鎖pegとの反応により達成し、ペプチドX−PEG及びY−PEGを得た。ペプチドY及びY−PEGは、二次構造を安定化し、グルカゴンアゴニズムを増強させるために、単一の側鎖ラクタム架橋がペプチドY又はペプチドY−PEGの中間部分に導入されていた点で、それぞれペプチドX及びX−PEGとは異なっていた。16位のGlu及び20位のLysの2つの側鎖を、ペプチド構築中に側鎖アミドとして共有結合で結合した。ペプチドのこの大環状化は、21個原子のラクタムを表す。ペプチドX−PEG及びY−PEGの溶解度を試験し、生理学的緩衝液中に25mg/mlを超える濃度で溶解することが見出され、ペプチドX−PEG及びY−PEGは、1週間の血漿とのex vivoインキュベーションに対して完全に耐性であることが判明した。
種々の濃度のトリフルオロエタノール(TFE)水溶液に可溶化された際のペプチドの二次立体構造を、円偏光二色性により分析した(図25)。グルカゴンは、試験した中で最もヘリックス性の少ないペプチドであり、0、10、及び20%のTFE溶液中でそれぞれ10、15、及び33%のヘリシティ計算値を有した(表29)。同じ実験条件下で、GLP−1は、14、29、及び55%のヘリシティ増強を示し、これら2つのペプチドが、一次構造並びに二次構造において異なることを示した。ペグ化部分が、分子の90%を超える質量に相当するという事実にも関わらず、ペグ化の際にペプチドX及びYのヘリシティに著しい変化はなかった(表29)。対照的に、TFEの非存在下におけるリン酸緩衝液中のペプチドYの見かけ上のヘリシティは、ペプチドXのおよそ2倍であり、17%〜36%だった。結果的に、これら2つのキメラペプチド(ペプチドX−PEG及びペプチドY−PEG)のペグ化形態は、二次構造がかなり異なっており(図25)、生物学的特性の違いは、これら二次構造の違いの結果である可能性が高い。
2つのペプチド(ペプチドX及びY)及びそれらの40−kdペグ化誘導体(ペプチドX−PEG及びY−PEG)を、細胞に基づくCREル−シフェラーゼリポーターアッセイにおいてcAMP合成を刺激するそれらの能力について評価した(図26)。表30に示されているように、天然グルカゴンは、0.055±0.014nMの有効濃度(EC50)で、GLP−1受容体(GLP−1R)は、はるかにより高い濃度である3.29±0.39nMのEC50で、グルカゴン受容体を最大半量に活性化した。対照的に、GLP−1は、0.028±0.009nMのEC50でその受容体を活性化し、グルカゴン受容体(GcgR)に対する相互作用が1μMを超えるEC50で生じたという点で高度に特異的であることが判明した。それらの受容体に対する天然リガンドの特異性のダイナミックレンジは、100万を超えている。GLP−1Rに対するペプチドX−PEGの効力は、天然GLP−1の効力の2倍であり、相対的な意味で、GcgRに対して更により増強された。しかしながら、GcgR活性は、天然グルカゴンのおよそ10%に過ぎなかった。ラクタムを導入することにより、グルカゴンアゴニズムは完全に回復したが、GLP−1Rに対しては変化がなかった。結果的に、ペプチドY−PEGは、2つのそれぞれの受容体に対する天然リガンドと比較して、十分に強力な、ほとんどバランスのとれた同時アゴニストである。各ペプチドのペグ化により、GcgRに対しては10倍ほど、GLP−1Rに対しては5倍ほど効力が低減された。GcgRに対する活性喪失がわずかに増強されたのは、C末端配列が、グルカゴン受容体相互作用に対してより大きな相対的重要性を持つことの結果である可能性がある。ペグ化ペプチド(ペプチドX−PEG及びY−PEG)は、GLP−1Rに対して、天然GLP−1よりわずかに強力ではなかったが、依然としてナノモル以下のEC50を示した。ペプチドX−PEGは、GLP−1Rに対して、このペプチド、つまりペプチドY−PEGのラクタム型より7倍選択的である。従って、これら2つのDPP−4耐性ペプチドは、持続性in vivo時間−作用実験に好適であり、GLP−1Rアゴニズムは良好に一致するが、グルカゴンアゴニズムは異なっている。
40−kdペグ化ペプチドであるペプチドX−PEG及びY−PEGを、食餌誘導性肥満(DIO)C57B6マウスに対する週1回の皮下(s.c)注射剤として使用した。325nmol/kgのペプチドY−PEGの単回注射は、1週間で体重を50.9±1.4gから37.8±0.8gへと25.8%減少させた(p<0.0001、n=8/群)。ペプチドX−PEGの同様な投与は有効だったが、効力がかなり低く、体重減少は9%だった(49.1±1.51g〜44.68±1.38g)。生理食塩水注射対照マウスに、体重変化はなかった(以前:50.61±1.32g、以後:50.87±1.46g、図27A)。体重変化は、体脂肪量減少の結果であり(ラクタムペプチドの場合は41.9%、開環形態の場合は22.2%、対照の場合は2.3%、p<0.001、図27B)、平均毎日食物摂取量の有意な減少と一致した(ペプチドY−PEG:0.40±0.29g/日、ペプチドX−PEG:1.83±0.81g/日、生理食塩水:2.70±0.78g/日、p<0.0001、図27C)。血糖は、対照と比較して両ペプチドで有意に減少し、ペプチドY−PEGでわずかにより減少した(ペプチドY−PEG:−90.1mg/dL、ペプチドX−PEG:−79.6mg/dL、対照:−23.9g/dL、p=0.0433、図27D)。2つのペプチド(ペプチドX−PEG及びペプチドY−PEG)間の相対的な違いは、統計的に有意ではなかった。
別の実験では、6つの異なる用量(0、7、14、35、70、350nmol/kg)のペプチドY−PEG及びペプチドX−PEGの単回皮下注射は、体重及び血糖の線形応答性で用量依存的な減少を示した(図28A、28B、28C、及び28D)。これは、観察された効果が、急速で過度な体重減少の間接的影響以外に、薬理学的に明白な毒性とは関連しないことが示唆される。効果の大きさは、ペプチドY−PEGがより顕著であり、グルカゴンアゴニズムの追加的要素が、ペプチドの効力を向上させることを示す。
別の実験では、70nmol/kgのペプチドY−PEG又はペプチドX−PEGの毎週皮下注射は、DIOマウスの体重をそれぞれ28.1%及び20.1%減少させた(p<0.0001、n=7〜8/群、図29A)。体重変化は、体脂肪量の減少と関連していた(ペプチドY−PEGの場合は−62.9%、ペプチドX−PEGの場合は−52.2%、及び対照の場合は5.1%、p<0.0001、図29B)。食物摂取量に対するこれらより低用量の長期的効果(p=0.95、図29C)は、より高用量での短期的効果(図27C)ほど高くなかった。エネルギー消費量は、媒体(12.71±0.45kcal/[kg*h]、p=0.0187)と比較して、ペプチドY−PEG(14.60±0.69kcal/[kg*h])及びペプチドX−PEG(17.19±1.49kcal/[kg*h])で増加したが、呼吸商は、減少する傾向があり(図29D及び29E;ペプチドY−PEGの場合は0.719±0.01、ペプチドX−PEGの場合は0.725±0.01、及び媒体の場合は0.755±0.01、p=0.1028)、熱発生の増加及び栄養素配分の変更が、全体的に負のエネルギーバランスを説明することができることを示した。自発運動活性が処置群及び対照間で変わらなかったため、エネルギー消費量の増加は、自発的身体活動誘導性熱発生(NEAT)の変化と関連しなかった(p=0.4281、図29F)。急性摂食の自動オンラインモニタリング及び食物摂取量の長期モニタリングはいずれも、カロリー摂取量のいかなる違いも明らかにしなかった(自動p=0.667、長期p=0.9484、図30A)。
ペプチドX−PEG及びペプチドY−PEGによる27日間にわたる長期皮下処置は、媒体と比べて(254.0 25.33mg/dL、p=0.0441;図31A)、DIOマウスの総コレステロールを減少させた(それぞれ、106.9±6.3mg/dL及び200.8±29.58mg/dL)。別の実験では、0日目及び7日目に70nmol/kgのペプチドX−PEG、ペプチドY−PEG、又は媒体を皮下で受容したDIOマウスを、9日目に評価した。ペプチドY−PEGは、血漿トリグリセリド、LDLコレステロール、及び総コレステロールを減少させ(媒体177.7±11.8mg/dLと比較して、総コレステロールは63.0 2.49mg/dL)(p<0.0001)、LDLからHDLコレステロールへの切替を引き起こした可能性がある(図31B)。ペプチドX−PEGは、LDL及びHDLコレステロールを両方とも減少させたが、トリグリセリドには著しい影響を及ぼさなかった(図31C)。レプチンは有意に減少した(ペプチドY−PEGの場合は3343±723.3pg/ml;ペプチドX−PEGの場合は7308±2927、及び媒体の場合は18,642±6124、p=0.0426、図31D、31E、31F)。27日間の長期処置は、肝臓脂質含有量も正常化したが、対照DIOマウスは著しい脂肪肝を維持した(データ非表示)。
ペプチドX−PEG又はペプチドY−PEGによる1か月間の処置は、DIOマウスの白色脂肪組織(WAT)におけるホルモン感受性リパーゼ(HSL)のリン酸化の増加をもたらし(ペプチドX−PEG:1.135±0.315;ペプチドY−PEG:1.625±0.149;媒体:0.597±0.204;p=0.0369;図32B)、WAT脂肪分解に対するグルカゴン特異的直接効果を示唆した。用量が35nmol/kg/週のペプチドY−PEG及びペプチドX−PEGで2週間処置したマウスの体脂肪量が減少したと同時に、精巣上体脂肪組織中の脂肪細胞サイズが、対照マウスと比較して著しく低減した(データ非表示)。しかしながら、体脂肪量を減少させ、脂肪細胞をより小さくしたにも関わらず、ペプチドY−PEG及びペプチドX−PEGによるこの2週間の短期処置は、CD68のリアルタイムRT−PCRにより定量化したところ、脂肪組織マクロファージ含有量の著しい低減とは関連しなかった(図33C)。褐色脂肪組織(BAT)の脱共役タンパク質I(UCP1)レベルは、ペプチドX−PEGにより増加されたが、ペプチドY−PEG処置では増加せず(ペプチドX−PEG 2.167±0.429、ペプチドY−PEG 1.287±0.1558、及び媒体1.0±0.118;p=0.0264;図32A)、BATに対するGLP−1の、熱発生を停止させる特異的作用と一致した。肝臓グルコース新生を反映する肝臓遺伝子発現は、ペプチドX−PEG又はペプチドY−PEG(図30H及び30I)のいずれによっても影響を受けなかった。組織学的検査は、膵島が、ペプチドX−PEG処置後に、より小さくなる傾向があることを示した(データ非表示)。
ペプチドX−PEG及びY−PEGのGLP−1R及びGcgRアゴニスト成分の寄与を精査するために、高脂肪食で飼育したGLP−1受容体ノックアウト(GLP−1R−/−)マウスに、各々を1か月間投与した。ペプチドX−PEGは、生理食塩水と比較して、体重(p>0.05;図34A及び34B)及び体脂肪量(p>0.05;図34C)の低減を引き起こした。ペプチドY−PEGは、GLP−1R−/−マウスの体重(p=0.0025)及び体脂肪量(p=0.0025)の有意な減少を引き起こした(図34A〜34C)。ペプチドX−PEGは、GLP−1R−/−マウスの食物摂取量に影響を及ぼさなかったが、ペプチドY−PEGは、食物摂取量を有意に抑制した(p=0.017)(図34D)。ペプチドY−PEGは、機能性GLP−1Rの非存在下でのグルコース負荷試験において血糖を増加させる傾向を有し(しかし、ペプチドX−PEGはその傾向を有しない)(p=0.03)(図34E及び34F)、グルカゴン誘導性高血糖症を防御するために同時アゴニストのGLP−1成分が必要であることが示唆された。
グルカゴンアゴニズムに寄与することができるペプチドX−PEG及びY−PEGの効果に関する独立した評価として、同等なGLP−1R効力を有するが、著しく異なるGcgR活性を有する2つの追加的なペプチドアゴニストを研究した。2つのペプチド(ペプチドU及びV)は、ペプチドX−PEG及びY−PEGに関する。ペプチドU及びVは、以下の修飾:16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、及び24位のCysを有する配列番号1のアミノ酸配列を含むが、24位のCysに20−kdペグ化を含み、2位のAIBを含んでいない。ペプチドVは、グルカゴンアゴニズムを10倍を超えて選択的に低減したGluによるGln3の置換を更に含んでいた。ペプチドU及びペプチドVはいずれも、ラクタム架橋を含んでいなかった。DIOマウスを50nmol/kgのペプチドVにより毎日皮下で1週間処置することにより、ペプチドUと比べて体重低下に対する効果が低減することが明らかになった(それぞれ、−9.09±0.80対−13.71±0.92g、p<0.0001;図35A)。
γ−Gluスペーサー又はγ−Glu−γ−Gluジペプチドスペーサーを介してLys残基に結合されたC16脂肪酸アシル基を含み、Lys残基が10位又はC末端(29位)に位置するグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。グルカゴン及びGLP−1受容体に対するin vitro活性について、ペプチドを本明細書に記載のように試験した。結果は表31に示されている。
表32に示されているペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した:
最大15個のアミノ酸修飾、1〜21個アミノ酸のC末端延長部分を有する配列番号1を含み、(a)延長部分がアシル化又はアルキル化されており、及び/又は(b)延長部分が1〜6個の正荷電アミノ酸を含むグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。グルカゴン、GLP−1、及びGIP受容体に対するin vitro活性について、ペプチドを、本質的に実施例14に記載のように試験した。ペプチド及びそれらのin vitro活性の構造は、表34に要約されている。
mt−345(配列番号657の構造を有する)のin vivo効果は、他のアシル化ペプチド(リラグルチド、mt−261(配列番号670)、及びmt−347(配列番号659))、及び非アシル化ペプチド(mt−348;配列番号660)の効果と比較した。ペプチドmt−345、mt−261、及びmt−347は、アミノ酸修飾を有するグルカゴンのアミノ酸配列(配列番号1)を含み、29位のアミノ酸のC末端側のGPSSGAPPPS(配列番号26)の延長部分、その後に40位のアシル化Lysを更に含んでいた。ペプチドmt−345は、2位のAIB、16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、24位のCys、29位のGly、29位のGlyのc末端側の配列番号26、及び40位のアシル化Lysを含んでいた。mt−345のアシル基は、C14脂肪酸アシル基だった。ペプチドmt−261は、mt−261が、1位のTyr、3位のGlu、12位のIle、16位のLys、20位のAIB、23位のVal、24位のAsn、27位のLeu、28位のAla、及び40位のC16脂肪酸アシル基を含んでいたことを除いては、mt−345と同様の構造を有していた。mt−347及びmt−348の構造は、mt−347及びmt−348が16位のAIBを含んでいたことを除いては、mt−345の構造と同一だった。mt−347の構造は、mt−347が40位のC14脂肪酸アシル基を含み、mt−348がアシル基を欠いたことを除いては、mt−348の構造と同じだった。
アシル化C末端延長部分を含むグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。ペプチドmt−278、mt−261、mt−297、及びmt−358は、以下のアミノ酸修飾:1位のTyr、2及び20位のAIB、16位のLys、12位のIle、17位のGln、18位のAla、21位のGlu、29位のGly、29位のアミノ酸のC末端側の配列番号26のアミノ酸配列、及び40位のアシル化Lysを有する配列番号1のアミノ酸配列を含んでいた。ペプチドmt−364は、1位のHis、16位のGlu、及び20位のLysを含むことにより他のペプチドと構造が異なっていた。これらペプチドの構造の詳細な説明は、本明細書に添付した配列表に記述されている:mt−364(配列番号669)、mt−261(配列番号270)、mt−278(配列番号271)、mt−297(配列番号272)、及びmt−358(配列番号673)。
C末端アルファカルボキシラートの代りにC末端アミドを有するグルカゴンの類似体を、本質的に本明細書に記載のように製作した:
ペプチド83は、2位のAIB、16位のAIB、及び10位のLysを有し、Lysが、γ−Glu−γ−Gluジペプチドスペーサーを介してC16脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号1の構造を含んでいた。
ペプチド900は、2位のAIB、16位のAIB、及び配列番号26を含むC末端延長部分、及び40位のLysを有し、Lysが、γ−Glu−γ−Gluジペプチドスペーサーを介してC16脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号1の構造を含んでいた。
ペプチド901は、2位のAIB、16位のAIB、及び配列番号26を含むC末端延長部分、及び10位のLysを有し、Lysが、γ−Glu−γ−Gluジペプチドスペーサーを介してC16脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号1の構造を含んでいた。
ペプチドmt−364は、配列番号669の構造を含んでいた。
Claims (22)
- GIP受容活性を示すグルカゴン(配列番号1)の一つの類似体であって、該類似体は以下の修飾を備える配列番号1を含むものであり、
(i)前記類似体の2位にイソ酪酸(AIB)があり、
(ii)前記類似体の16位にGluがあり、
(iii)前記類似体の17位にGlnがあり、
(iv)前記類似体の18位にAlaがあり、
(v)前記類似体の20位にLysがあり、
(vi)前記類似体の21位にGluがあり、
(vii)前記類似体の23位にIleがあり、
(viii)前記類似体の24位にAlaがあり、
(ix)前記類似体の29位にGlyがあり、
ここで、前記類似体は、前記類似体の29位においてアミノ酸に共有結合しているGPSSGAPPPS(配列番号26)のアミノ酸配列、およびさらに一つの付加的なアミノ酸であって、前記類似体の40位においてGPSSGAPPPS(配列番号26)のC末端側に共有結合している、天然アミノ酸に対して非天然であるアシル基又はアルキル基を含むアミノ酸を含み、
前記アシル基又はアルキル基は、前記40位のアミノ酸の側鎖に直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して共有結合しており、
さらに、前記類似体は、前記GIP受容体に対する天然GIPの活性の少なくとも10%を示し、
前記類似体のGLP−1受容体に対する選択性は、GIP受容体の選択性の100分の1より大きく、且つ100倍より小さい範囲内にある類似体。 - 16位のGlu及び20位のLysの間にラクタム架橋を含む、請求項1に記載の類似体。
- 一つのC末端アミドを含む、請求項1又は2に記載の類似体。
- 前記式Iのアミノ酸がLysである、請求項4に記載の類似体。
- 前記アシル基が、C4〜C30脂肪酸アシル基である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の類似体。
- 前記アシル基が、C12〜C18脂肪酸アシル基である、請求項6に記載の類似体。
- 前記アシル基が、C14〜C16脂肪酸アシル基である、請求項7に記載の類似体。
- 前記アシル又はアルキル基が、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の類似体。
- (I)前記スペーサーが、(A)3〜10個の原子長であるか、(B)アミノ酸若しくはジペプチドであるか、(C)6−アミノヘキサン酸であるか、又は(D)Ala−Ala、β−Ala−β−Ala、Leu−Leu、及びPro−Proからなる群から選択されるジペプチドであるか、あるいは(II)前記スペーサー及び前記アシル基の全長が、14〜28個の原子長である、請求項9に記載の類似体。
- 前記類似体が、(A)親水性部分を含まない場合、前記類似体が、前記GLP−1受容体に対するGLP−1(配列番号2)の活性の少なくとも4%を示すか、(B)前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、前記グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の少なくとも20%を示すか、(C)前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、3位のアミノ酸修飾を含み、前記グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の1%未満を示すか、(D)前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、7位のアミノ酸修飾を含み、前記GLP−1受容体に対するGLP−1の活性の10%未満を示すか、又は(A)および(B)若しくは(C)のいずれかの組み合わせであるか、又は(B)および(D)の組み合わせである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の類似体。
- 親水性部分が、前記類似体の16、17、20、21、24位のアミノ酸、又はC末端のいずれかに共有結合で結合されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の類似体。
- 前記親水性部分がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項12に記載の類似体。
- 前記PEGが、1,000ダルトン〜40,000ダルトンの分子量を有する、請求項13に記載の類似体。
- GIP受容体活性化に対する前記類似体のEC50が、10nM以下である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の類似体。
- 前記類似体が、前記GIP受容体に対する野生型GIP(配列番号4)の活性の少なくとも20%を示す、請求項12〜15のいずれか一項に記載の類似体。
- 前記類似体の前記GIP効力が、前記類似体の前記GLP−1効力の75倍以内であり、および/また前記類似体の前記GIP効力が、前記類似体のグルカゴン効力の500倍以内である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の類似体。
- 配列番号669の前記アミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の類似体。
- 2つのグルカゴンペプチドを含む二量体であって、前記グルカゴンペプチドの少なくとも1つが、請求項1〜18のいずれかに記載の類似体であり、リンカーを介して互いに結合されている二量体。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の類似体が共役部分に結合された共役体であって、
前記共役部分が、異種性ペプチド又は血漿タンパク質を含むポリペプチド、標的化剤、免疫グロブリン又はそれらの免疫グロブリン断片であって、免疫グロブリン可変領域、CDR、若しくはFc領域から成るそれらの免疫グロブリン断片、診断標識、あるいは水溶性ポリマーを含むポリマーから選ばれる一つである、共役体。 - 請求項1〜18のいずれか一項に記載の類似体、請求項19に記載の二量体、請求項20に記載の共役体、又はそれらの組み合わせ、及びそれらの薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 体重増加を低減又は体重減少を誘導する糖尿病治療薬剤又は肥満治療薬剤の製造において、請求項1〜18のいずれか一項に記載の類似体、請求項19に記載の二量体、請求項20に記載の共役体、又はそれらの組み合わせを使用する方法。
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