JP5866274B2 - 関心のあるビタミンk依存性タンパク質を含んでなる組成物中におけるタンパク質混入物の量の減少 - Google Patents
関心のあるビタミンk依存性タンパク質を含んでなる組成物中におけるタンパク質混入物の量の減少 Download PDFInfo
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Description
本発明は、関心のあるビタミンK依存性タンパク質の精製、および特に、そのようなタンパク質を含んでなる精製された組成物についての広範な側面に関する。「関心のある」という用語は、ここでは特定の種を指すものとして適用され(ビタミンK依存性タンパク質)、最も純粋な形態、例えば治療的な状況においてビタミンK依存性タンパク質を使用することを目的として得ることに関連する。
ここで用いられる場合、「組成物」という表現は、水性の液体組成物のような液体組成物、すなわち5%未満の非水性溶媒を含んでなる組成物を意味するものである。
ここで用いられる場合、「タンパク質混入物」等の用語は、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に関して不純物を構成するタンパク質またはポリペプチド構築物を示すものである。それ故、関心のあるビタミンK依存性タンパク質は、タンパク質混入物としては数えないが、「ビタミンK依存性タンパク質」自体および「タンパク質混入物」のそれぞれの定義は、部分的に重複している。1つの実施形態において、前記タンパク質混入物はビタミンK依存性タンパク質である(が、関心のあるビタミンK依存性タンパク質ではない)。
本発明の中心的な側面は、関心のあるビタミンK依存性タンパク質(特に因子VIIポリペプチド)を含んでなる組成物からタンパク質混入物(特にタンパク質S)を除去することができる方法である。
ここで、Z1およびZ2は、独立に、-O-、-S-、-NRH-、および単結合からなる群より選択され、RHは、水素、C1〜4-アルキル、アリール、およびアリールメチルからなる群より選択され、R1およびR2は、独立に、水素、任意に置換されたC1〜6-アルキル、任意に置換されたC2〜6-アルケニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択されるか、または
Z2およびR2は上述した通りであり、-C=N-Z1-R1は複素環の一部を形成するか、または Z1およびR1は上述した通りであり、-C-NH-Z2-R2は複素環の一部を形成するか、または -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2は複素環を形成し、ここでの-Z1-R1-R2-Z2- はビラジカルである。
本発明の側面によると、少なくとも1のタンパク質混入物は、モノクローナル抗体を有する固相物質に結合する。それ故、前記組成物は、固相物質に簡単に接触することができ、続いて固相物質から分離され、少なくともより少ない混入の組成物を得ることができる。
本発明のこの側面によると、少なくとも1のタンパク質混入物は、固定化されたタンパク質Cを有する固相物質に結合する。それ故、前記組成物は前記固相物質と単に接触させるだけでよく、続いて固相物質から分離することにより、少なくともより少ない混入の組成物を得られる。
・陽イオン交換クロマトグラフィー → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・陽イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・陽イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・陰イオン交換クロマトグラフィー → 関心のあるタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 混入物のモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー
・陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陽イオン交換クロマトグラフィー
・陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性 → 陽イオン交換クロマトグラフィー
・陰イオン交換クロマトグラフィー → 関心のあるタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー
・陽イオン交換クロマトグラフィー → ヒドロキシアパタイト → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・陽イオン交換クロマトグラフィー → ヒドロキシアパタイト → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・関心のあるタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー・関心のあるタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー・ヒドロキシアパタイト → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陽イオン交換クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・ヒドロキシアパタイト → タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陽イオン交換クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → ゲル化 → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・タンパク質混入物に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陽イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陰イオン交換クロマトグラフィー
・関心のあるタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫親和性 → 陰イオン交換クロマトグラフィー → 疎水性相互作用クロマトグラフィー → 陽イオン交換クロマトグラフィー。
本発明の方法は、ビタミンK依存性タンパク質の組成物、特に因子VIIポリペプチドを増加させ、それ自体新規であると考えられている。
1.関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物中の1以上のタンパク質混入物の量を減少させる方法であって、前記方法は、(i)第1の組成物を、1以上のタンパク質混入物および/または関心のあるビタミンK依存性タンパク質と結合することができる固相物質と接触させるステップと、(ii)結果として得られた関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる第2の組成物を回収するステップとを少なくとも含んでなり、それにより、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質混入物の量が、前記第1の組成物から前記第2の組成物の間に、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100のように、少なくとも2倍減少する方法。
ここで、Z1およびZ2は、独立に、-O-、-S-、-NRH-、および単結合からなる群より選択され、RHは、水素、C1〜4-アルキル、アリール、およびアリールメチルからなる群より選択され、R1およびR2は、独立に、水素、任意に置換されたC1〜6-アルキル、任意に置換されたC2〜6-アルケニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択されるか、または
Z2およびR2は上記で定義した通りであり、-C=N-Z1-R1は複素環の一部を形成するか、または
Z1およびR1は上記で定義した通りであり、-C-NH-Z2-R2は複素環の一部を形成するか、または
-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2は、-Z1-R1-R2-Z2-がビラジカルである複素環を形成する。
、もしくは少なくとも250倍、もしくは少なくとも500倍、もしくは少なくとも750倍、もしくは少なくとも1000倍、もしくは少なくとも2000倍のように、少なくとも10倍、または少なくとも25倍、または少なくとも50倍減少する方法。
これらの抗体は、SF-因子VIIa生成物から単離されたハムスタータンパク質Sプールで免疫化されたRBFマウスを用いて、RBF脾細胞に対する融合パートナーとしてのFoxNy骨髄腫に関する融合技術を用いて発生した。前記モノクローナル抗体は、トロンビン切断部位の外側ならびにC4BP結合領域の外側のエピトープを認識する。さらに、前記モノクローナル抗体は、Ca2+非依存性ならびにCa2+依存性であってよい。前記モノクローナル抗体は、クラスIgであってよい。
ハムスタータンパク質Sの相対的な量は、2つの異なるモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAにより検出される。前記抗体は、CHO細胞に由来する精製したタンパク質Sを用いて、マウス中で産生される。
ハムスタータンパク質Sの量を、ポリクローナル抗体に基づくサンドイッチELISAにより検出した。
例1
タンパク質Sの減少は、ハムスタータンパク質Sに対してマウス中で産生されるモノクローナル抗体(MAb)と共役したAmersham HiTrap NHS 活性化カラム(1 ml カラム容積(CV))上で行われる(充填カラムml当りMAb 0.4mg)。カラムを10 CV 10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl pH 7.5で平衡化し、1.49 mg/ml の因子VIIaおよび300 ppmより多い量のタンパク質Sを含有し、14 mS/cmの伝導率を有する100CVの溶液を負荷し(カルシウムはクエン酸とキレートする)、10 CV 10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl pH 7.5で洗浄する。全体のステップは、流速60 CV/hおよび温度5℃で操作される。微量のタンパク質Sおよび因子VIIaを、20 mM Na2HPO4, 2 M NaCl pH 7.2を用いて溶出し(SDS-PAGE/銀染色により確認)、続いて、結合タンパク質Sを50 mM クエン酸塩 pH 3.0を用いて溶出し、わずかな量の因子VIIa (負荷した量の<1%)を、50 mM グリシン pH 2.0を用いて脱着する。カラムを、10 CVのNa2HPO4, 150 mM NaCl pH 7.5を用いて再び平衡化する。30ppm以下の量、すなわち少なくとも10倍減少したタンパク質Sを、流出液(run-through)中においてELISAにより測定した。
タンパク質Sの減少は、ハムスタータンパク質Sに対してマウスで産生されたモノクローナル抗体(MAb)と共役したAmersham HiTrap NHS 活性化カラム(1 ml カラム容積(CV))を用いて行われる(充填カラムml当りMAb 0.4mg)。カラムを10 CV 15 mM トリス、150 mM NaCl pH 7.5で平衡化し、12 mS/cmの伝導率を有し、150ppmより多い量のタンパク質Sを含有する108CVの溶液を負荷し(10 mM カルシウム存在下)、10 CV 15 mM トリス, 150 mM NaCl pH 7.5で洗浄する。前記負荷および洗浄は流速24 CV/h、残りの工程は60 CV/hrで行い、温度は5℃にする。カラムを15 CV 50 mM クエン酸塩 pH 3.0で洗浄した後、10 CV 15 mMトリス, 150 mM NaCl pH 7.5で再び平衡化し、最後に12 CV 50 mM グリシン pH 2.0で洗浄し、15 mM トリス, 150 mM NaCl pH 7.5で再び平衡化する。15 ppm未満、すなわち少なくとも10倍減少したタンパク質量を、流出液中においてELISAにより測定する。
タンパク質Sの減少は、ハムスタータンパク質Sに対してマウス中で産生されたモノクローナル抗体(MAb)を用いて固定化された、GEヘルスケアからのCNBr-活性化セファロース 4 FF 媒質を用いてで行われた(媒質ml当り0.8 mgのタンパク質S MAb)。カラムを(1 ml)10 CV 75 mM トリス, 30 mM トリ-Na-クエン酸塩 pH 7.5で平衡化し、タンパク質S含量が665 ng/ml = 485 ng/mg rFVIIaである32 CVの溶液を負荷し、20 CVの75 mM トリス, 30 mMトリ-Na-クエン酸塩 pH 7.5で洗浄した。カラムを、10 CV 50 mM グリシン pH 2.0で再生し、8 CVの75 mM トリス, 30 mM トリ-Na-クエン酸塩 pH 7.5で再び平衡化した。2.6 ng/ml = 3 ng/mg rFVIIaのタンパク質Sの量、すなわち少なくとも160倍の減少を、流出画分においてELISAにより測定した。前記負荷および洗浄は流速7.2 CV/h、残りの工程は40 CV/hで行った。温度は5℃であった。
充填された吸着カラムの代わりとして、タンパク質Sの減少は、ハムスタータンパク質Sに対してマウスで産生されたモノクローナル抗体(MAb)を用いて固定化されたSartoriusエポキシ活性化膜ユニット(膜容積 = 2.1 ml)上で行われた(膜ユニット当り1 mgのタンパク質S MAb )。前記膜を10 MV (膜容積) 75 mM トリス, 30 mM トリ-Na-クエン酸塩 pH 7. 5で平衡化し、タンパク質含量が683 ng/ml = 502 ng/mg rFVIIa である14 MVの溶液を負荷し、8 MVの75 mM トリス, 30 mM トリ-Na-クエン酸塩 pH 7.5で洗浄した。膜を10 MV 50 mM グリシン pH 2.0を用いて再生し、8 MVの75 mM トリス, 30 mM トリ-Na-クエン酸塩pH 7.5で再び平衡化した。9.1 ng/ml = 8 ng/mg rFVIIaのタンパク質Sの量、すなわち少なくとも62倍の減少を、流出画分においてELISAにより測定した。膜による方法は、流速143 MV/h、温度5℃で行った。
タンパク質Sの減少は、ハムスタータンパク質Sに対してマウス中で産生されるモノクローナル抗体(MAb)と共役したアマシャム NHS 活性化セファロース FF カラム (0.9 ml カラム容積(CV))を用いて行われる(充填カラムml当り0.8 mg MAb)。カラムを10 CV 15 mMトリス, 150 mM NaCl, pH 7.5で平行化する。パッケージリーフレットに記載された通りに、BeneFIX (1000 IE; Batch no. LE 07D002AF)を10 mLの水に懸濁する。約2mgのFIXを含有する5 mLのこの溶液をカラムに負荷した。タンパク質S含量をモノクローナルELISAにより測定すると230 ng/mLであり、タンパク質Sの全量は約1150 ngであった。カラムを10 CVの平衡化緩衝液で洗浄し、15 mM トリス, 2 M NaCl, pH 7.5で溶出した。洗浄および溶出画分においてFIXが見られた。タンパク質Sの含量は、洗浄画分および溶出画分それぞれにおいて、モノクローナルELISAにより26および52 ngと測定された。
例6−pH 8.6での陰イオン交換クロマトグラフィーの実施
陰イオン交換クロマトグラフィーは、アマシャム Q-セファロース FF が充填され、5 CV 10 mM グリシルグリシン, 175 mM NaCl, 8.6 で平衡化されたカラム(内径1 cm×長さ1. 3 cm = 1.0 ml カラム容積(CV))を用いて行われた。300ppmより多い量のタンパク質Sを含有する35 mlの溶液を負荷した。7 CV 10 mM グリシルグリシン, 175 mM NaClおよび4 CV 10 mM グリシルグリシン, 50 mM NaClでカラムを洗浄した。溶出は、50 mM NaCl を含有するグリシルグリシンで緩衝した0 mM CaCl2 〜15 mM CaCl2の直線勾配20 CVを用いて行った。精製は、流速40 CV/hおよび温度5℃で行った。貯留液に含まれるタンパク質Sの量は30 ppm未満、すなわち少なくとも10倍の減少であった。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、アマシャム Q-セファロースFFが充填され、10 CV 10 mM トリス, 175 mM NaCl, 8.6で平衡化されたカラム(内径0.5 cm×長さ5 cm=1.0 ml カラム容積(CV))を用いて行った。パッケージリーフレットに記載された通りに、BeneFIX (1000 IE; Batch no. LE 07D051AD)を10 mLの水に懸濁した。約1.2mgのFIXを含有する3 mLのこの溶液をカラムに負荷した。タンパク質Sの量をポリクローナルELISAにより測定し、280 ng/mL、負荷溶液中において全量が840 ngであった。カラムを7 CVの平衡化緩衝液で洗浄し、続いて3 CV の15 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 8.6で洗浄した。5 CVのイソクラティックステップの間、CaCl2の量を増加させる(3-5-7-9 mM)ながら前記洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、続いて10 CVの15 mM トリス, 50 mM NaCl, 15 mM CaCl2で洗浄した。FIXの溶出は、10 mM トリス, 1 M NaClにより行った。SDS-PAGEは、15 mM CaCl2を含有する緩衝液を含有する最後の洗浄画分において弱いバンドを示した。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、アマシャム Q-セファロース FF が充填され、10 CV 10 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 8 で平衡化されたカラム(内径1 cm ×長さ3.2 cm = 2.5 ml カラム容積 (CV))を用いて行った。P10Q, K32E 変異を伴うFVIIの変種を含有する150 mLの培養液上清を、2.2 mLの0.5 M EDTA 溶液に加えた。伝導率は、260 mL WFI (注入のための水)の添加により調節した。タンパク質Sの含量はELISAにより測定され、284 ng/mLまたは全体で97μgであった。カラムを10 CVの10 mM トリス, 175 mM NaCl, pH 8で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、10 mM トリス, 50 mM NaCl, 35 mM CaCl2, pH 8により行った。タンパク質Sの量はポリクローナルELISAにより測定し、溶出貯留液において18μgであった。精製は、流速24 CV/hおよび室温で行った。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、アマシャム Q-セファロース FF が充填され、10 CV 10 mM ヒスチジン, 175 mM NaCl, pH 6で平衡化されたカラム(内径1 cm × 長さ3.2 cm = 2.5 ml カラム容積(CV))を用いて行った。1.6 mg/mL のFVIIを含有する8 mLの溶液をカラムに負荷した。タンパク質Sの量はELISAにより測定し、360 ng/mLまたは全体で2900 ngであった。カラムを10 CVの平衡化緩衝液で洗浄し、続いて、5 CVの洗浄緩衝液10 mMヒスチジン, 50 mM NaCl, pH 6で洗浄した。溶出は、洗浄緩衝液から10 mM ヒスチジン, 50 mM MgCl2, pH 6の勾配により行った。タンパク質Sの量はポリクローナルELISAにより測定し、溶出貯留液において790 ngであった。精製は、流速24 CV/hおよび5℃で行った。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、pH 9.0において、Amersham Source 30Qが充填され、10 CV 10 mM トリス, 2mM CaCl2で平衡化されたカラム(内径0.5 cm×長さ5.5 cm = 1.0 mlカラム容積(CV))を用いて行った。1 mg/ml FVIIおよび10ppmより多い量のタンパク質Sを含有する溶液を8ml負荷した。5 CV 10 mM トリス, 2mM CaCl2でカラムを洗浄した。溶出は、2mM CaCl2を含有するTrisを用いて緩衝した0 mM NaCl〜600 mM NaClの直線勾配50 CVを用いて行った。回収された画分中のタンパク質Sの量は、タンパク質S ELISAを用いて評価した。タンパク質Sは、99%より多いFVIIを含有する主要なピークのリーディングエッジに溶出された。精製は、流速60 CV/hおよび温度5℃で行った。
例11−疎水性相互作用クロマトグラフィーの実施
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、pH 6.0において、Toso Haas TSK-ゲル フェニル5 PWが充填され、10 CV 10 mM クエン酸塩, 1.7 M NH4-アセテートで平衡化されたカラム(内径2.6 cm × 長さ8.5 cm = 45.1 ml カラム容積(CV))を用いて行った。約700 μg/ml FVIIおよび200ppmより多い量のタンパク質Sを含有する溶液を215 ml負荷した。負荷溶液に1.7 M NH4-アセテートを添加した。カラムを5 CV 10 mM クエン酸塩, 1.7 M NH4-アセテートで洗浄した。溶出は、クエン酸塩で緩衝された1.7 M NH4-アセテート〜0 M NH4-アセテートの直線勾配20 CVを用いて行った。貯留液は、100ppm未満、すなわち少なくとも2倍減少した量のタンパク質Sを含んでいた。精製は、流速20 CV/hおよび温度5℃で行った。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、Toyopearl MD-G ブチル樹脂が充填されたカラム(内径1 cm × 長さ7 cm = 5.5 ml)を用いて行う。10 CV’s の35 mM CaCl2, 1.5 M NaCl, 10 mM ヒスチジン, pH 6.0でカラムを平衡化する。平衡化の後、0.1 mg/ml FVIIaを含有する溶液42 mlをカラムに負荷する。負荷の後、カラムを10 CV’s の平衡化緩衝液で洗浄する。結合FVII(a)を、20 mM EDTA, 50 mM ヒスチジン, pH 6.0を用いて溶出する。減少した量のタンパク質Sを含むFVII(a)含有貯留液を回収する。
例13−pH 6における免疫親和性捕捉の実施
CHO K1培養液の上清の1500mlを、10 mM Ca2+の濃度までカルシウムを添加することおよび10mMの濃度までヒスチジン緩衝液を添加することにより安定化し、HClを用いてpH 6.0に調節し、.45 ミクロンのデッドエンド(dead-end)フィルターを通してろ過した。安定化された培養液の上清を、Ca2+-依存性抗FVIIaモノクローナル抗体が充填され、ファルマシアセファロース(Pharmacia Sepharose) 4B上に安定化されたカラム(内径1.6 cm × 長さ10 cm = 20 ml CV)に負荷した。負荷の前に、5 CV’s の10 mM CaCl2, 10 mM ヒスチジン, pH 6.0を用いてカラムを平衡化した。負荷の後、カラムを10 CV’s の2 M NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM ヒスチジン, pH 6.0で洗浄した。結合FVII(a)を10 CV’s の30 mM EDTA, 50 mM ヒスチジン, pH 6.0を用いて溶出した。FVII(a)含有貯留液は、約0.1 AU (280 nm)の主要ピークのリーディングエッジから約0.1 AU (280 nm)のテーリングエッジにおいて回収された。精製の間、流速12 CV/h および温度5℃が使用された。タンパク質Sの量はポリクローナル抗huPSに基づくタンパク質S ELISAにより測定した。
例14−固定化されたベンズアミジンアナログを使用した、FVIIアナログの親和性精製
1 mLカラム容積(CV)の NHS 活性化HiTrap (GE ヘルスケア)を、ベンズアミジンアナログ(式1または式2)と共役させた。5 CVの50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01%ツイーン80, pH 7,5を用いて平衡化した。FVIIアナログおよび20mg/Lのタンパク質Sを含有するpH 7.5の溶液0.5 CVを負荷した。負荷の後、6 CVの平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。溶出は、5 CV 50 mM HAc, 100 mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% ツイーン 80, pH 4.4および 4 CV 50 mM Gly-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01% ツイーン 80, pH 3.0を用いて行った。溶出の後すぐに、溶出液をpH 6に調節した。流速は30 CV/hであり、操作は室温で行った。タンパク質Sの大部分は樹脂に結合せず、流液および洗浄液中に見られた。ほとんどが樹脂に結合するFVIIについては逆のことが見られ、pHを低下させることにより溶出された。溶出画分中のタンパク質Sの量は、モノクローナルELISAにより測定され、式1または式2の化合物を用いて固定化されたカラムを用いた場合、それぞれ約150 ng および180 ngであった。
精製は、ACL 5/5 (ProMetic) が充填され、10 CVの20 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,5で平衡化されたカラム(内径1 cm × 長さ6.2 cm = 5 mL カラム容積(CV))を用いて行った。40000ppmより多い量のタンパク質Sを含有する溶液43 mLを負荷した。カラムを2 CVの20 mM トリス, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,5で洗浄した。溶出は、20 mM トリス, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,5から20 mM トリス, 1 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,5の直線勾配40CVを用いて行った。FVII含有貯留液は、7000ppm未満のタンパク質Sを含有する溶出液として回収された。
例16−アマシャムからのカタログ番号 11-0010のObelix CIE 陽イオン交換体
培養媒質は、陽イオン交換樹脂に付加された。カラムを30 mM NaAc pH 7.0で平衡化した。流速は48 CV/H 、室温で行った。負荷の後、樹脂を平衡化緩衝液で洗浄し、5〜10カラム容積の1M NaAc pH 7で洗浄した。10カラム容積の平衡化緩衝液を再び適用した。生成物は、30 mM NaAc, 2M NaCl, pH 6.3 またはより高いpHのトリス緩衝液およびNaClを用いて溶出された。貯留液は、UV-基盤上に回収し、すぐに冷却した。タンパク質Sは、洗浄ステップにおいて溶出された。使用後、カラムを1M NaOHで洗浄した。
カラムを50 mM Mes, 50 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, pH 5.75で平衡化した。印加を10 mS/cmより未満に調節した。非結合性の物質を、平衡化緩衝液を用いて洗い流し、濃度を増大させたNaClにより生成物を溶出した。流速は48カラム容積/hであり、精製は低温室で行った。
約25 mg/lのFVIIおよび25 mg/lのタンパク質Sを含んでなる混合物からのタンパク質Sの減少は、1mlのToyopearl SP 650 M カラム(Tosoh Bioscience) (内径0.5 cm × 土台高さ5 cm)を用いて行った。カラムを10カラム容積(CV)の10 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で平衡化し、FVIIおよびタンパク質Sを含んでなる0.5mlの混合物をカラムに負荷した。カラムを1 CVの10 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で洗浄/溶出し、10 mM ヒスチジン緩衝溶液pH6中の0〜1 M NaClの勾配により洗浄/溶出した。全体の精製ステップは、流速48 CV/h、室温で操作した。タンパク質Sは、フロースルー(flow through)中に溶出され、FVIIは勾配による溶出の間に溶出される。タンパク質SとFVIIの分離は、銀染色を用いた標準的な、ネイティブSDS-PAGE分析およびFVII標準物質を同様に負荷して精製することにより、同定ならびに確認された。カラムを3 CVの0.1 M NaOHで平衡化し、続いて10 CVの1.5 M NaCl + 25 mM ヒスチジン緩衝液, pH 6で平衡化した。
約25 mg/lのFVIIおよび25 mg/lのタンパク質Sを含んでなる混合物からのタンパク質Sの減少は、1 ml(内径0.5 cm× 土台高さ5 cm )のCM セファロース FF (GE ヘルスケア)カラムを用いて行った。カラムを10カラム容積(CV)の40 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で平衡化し、FVIIおよびタンパク質Sを含んでなる混合物0.5 mlをカラムに負荷した。カラムを1 CVの40 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で洗浄/溶出し、続いて40 mMのヒスチジン緩衝溶液, pH 6中の0〜0.35 M NaCl勾配で洗浄/溶出した。全体の精製ステップは、流速48 CV/h、室温で操作した。タンパク質Sはフロースルー中に溶出され、FVIIは勾配による溶出中に溶出された。タンパク質SとFVIIの分離は、銀染色を用いた標準的なネイティブSDS-PAGEにより同定および確認された。カラムを3 CVの0.1 M NaOHで平衡化し、続いて10 CVの1. 5 M NaCl + 25 mM ヒスチジン緩衝液, pH 6で平衡化した。
約25 mg/lのFVIIおよび25 mg/lのタンパク質Sを含んでなる混合物からのタンパク質Sの減少は、1 ml (内径0.5 cm×土台高さ5 cm)のCM セファロース FFカラム (GE ヘルスケア)を用いて行った。カラムを10カラム容積(CV)の10 mMヒスチジン緩衝溶液, pH 6で平衡化し、FVIIおよびタンパク質Sを含んでなる混合物0.5 mlをカラムに負荷した。カラムを1 CVの10 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で洗浄/溶出し、10mMヒスチジン緩衝溶液, pH 6中における0〜0.35 M NaCl勾配により洗浄/溶出した。全体の精製ステップは、流速48 CV/h、室温で行った。タンパク質Sはフロースルー中に溶出され、FVIIは勾配溶出の間に溶出された。タンパク質SとFVIIの分離は、銀染色を用いた標準的なネイティブSDS-PAGE分析により同定および確認した。カラムを3 CVの0.1 M NaOHで平衡化し、続いて10 CVの1.5 M NaCl + 25 mM ヒスチジン緩衝液, pH 6で平衡化した。
約25 mg/lのFVIIおよび25 mg/lのタンパク質Sを含んでなる混合物からのタンパク質Sの減少は、1 ml (内径0.5 cm×土台高さ5 cm)の Toyopearl SP 650 M (Tosoh Bioscience)カラムを用いて行った。カラムを10カラム容積(CV)の10 mMヒスチジン緩衝溶液, pH 6で平衡化し、FVIIおよびタンパク質Sを含んでなる混合物0.5 mlをカラムに負荷した。カラムを1 CVの10 mMヒスチジン緩衝溶液, pH 6を用いて洗浄/溶出し、続いて10 mM ヒスチジン緩衝溶液pH 6.0中における0〜0.35 M NaClの勾配を用いて洗浄/溶出した。全体の精製ステップは、流速48 CV/h、室温で行った。タンパク質Sはフロースルー中に溶出され、FVIIは勾配溶出の間に溶出された。タンパク質SとFVIIの分離は、銀染色を用いた標準的なネイティブSDS-PAGE分析により行われた。カラムを3 CVの0.1 M NaOHで平衡化し、続いて10 CVの1.5 M NaCl + 25 mM ヒスチジン緩衝液, pH 6で平衡化した。
クロマトグラフィーの媒質は、直径1.6 cm、土台高さ10 cmのカラム中に充填された。精製は、流速20カラム体積/h、5℃で行った。カラムを150 mM NaCl, 5 mM CaCl2および20 mM ヒスチジン, pH 6.0で平衡化した。FVIIを含んでなる培養液の上清に、それぞれ5および10mMの濃度までCaCl2およびヒスチジンが加えられ、pH 6.0に調節し、カラムに負荷した。特異的なカラム負荷は、充填された吸着層ml当り1.3mgのFVIIであった。負荷の後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、0.8 M NaCl, 10 mM CaCl2, 20 mM ヒスチジン, pH 6. 6で洗浄し、平衡化緩衝液で洗浄し、0.5 M NaCl, 25 mM ヒスチジン, pH 5.8で洗浄した。FVIIは、0.5 M NaCl, 25 mM ヒスチジン, pH 6.8を用いてカラムから溶出され、タンパク質Sは、負荷の間のフロースルーおよび0.8 M NaCl, 10 mM CaCl2, 20 mM ヒスチジン, pH 6.6を用いた洗浄画分中に多く見られた。
例23−ヒドロキシアパタイトカラムBioRad カタログ番号 157-0085 タイプ I 80um
pHを調節した後、予め平衡化された樹脂に直接適用した。流速は42カラム容積/hであり、温度は4〜20℃であった。ベースラインまで平衡化緩衝液(水)を用いて流し出し、pH 6. 2において、400mMまで増加させたK2HPO4/KH2PO4 緩衝液の勾配を用いて生成物を溶出した。貯留液をUV-基盤上に回収し、すぐに冷却した。
例24−Toyopearl ヘパリン 650 M
約25 mg/lのFVIIおよび25 mg/lのタンパク質Sを含んでなる混合物からのタンパク質Sの減少は、1 ml (内径0.5 cm×5 cm吸着層高さ)のToyopearl ヘパリン 650 M (Tosoh Bioscience)カラムを用いて行った。カラムを10カラム容積(CV)の10 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で平衡化し、FVIIおよびタンパク質Sを含んでなる混合物0.5 mlをカラムに負荷した。カラムを1 CV の10 mM ヒスチジン緩衝溶液, pH 6で洗浄/溶出し、10mMヒスチジン緩衝溶液, pH 6中における0〜0.35 M NaClの勾配により洗浄/溶出した。全体の精製ステップは、流速48 CV/h、室温で行った。勾配による溶出の間に、タンパク質SはFVIIの前に溶出された。タンパク質SとFVIIの分離は、銀染色を用いた標準的なネイティブSDS-PAGE分析により同定および確認した。カラムを3 CVの0.1 M NaOHで平衡化し、続いて10 CVの1.5 M NaCl + 25 mM ヒスチジン緩衝液, pH 6で平衡化した。
Claims (24)
- 細胞培養条件下で産生された関心のある組み換えビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物中のタンパク質Sの量を減少させる方法であって、前記方法は、ステップ(A)と(B)の組み合わせに前記組成物をかけることを含み、
(A)組成物を、関心のある組み換えビタミンK依存性タンパク質と結合することができる関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対するモノクローナル抗体を担持する固相物質と接触させるステップと、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物を回収するステップ、
(B)タンパク質Sと結合することができるタンパク質Sに対するモノクローナル抗体を担持する固相物質と、ステップ(A)にかけられた組成物とを接触させ、関心のあるビタミンK依存性タンパク質が前記固相に結合せず、クロマトグラフカラムを流出するステップと、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物を収集するステップ、
ここで、細胞培養条件下で産生された関心のある組み換えビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物は、細胞培養浮遊物であり、前記細胞培養浮遊物は、精製ステップなしで、ステップ(A)の固相物質に適用され、
それにより、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質Sの量が、前記細胞培養浮遊物からステップ(B)の結果として得られる前記組成物までに、少なくとも2倍減少する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質Sの量が、前記細胞培養浮遊物からステップ(B)の結果として得られる前記組成物までに、少なくとも5倍減少する方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記関心のあるビタミンK依存性タンパク質が因子IXポリペプチドである方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記関心のあるビタミンK依存性タンパク質が因子Xポリペプチドである方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記関心のあるビタミンK依存性タンパク質が因子VIIポリペプチドである方法。
- 請求項1〜2,5のいずれか1項に記載の方法であって、前記関心のあるビタミンK依存性タンパク質が、野生型ヒト因子VIIaである方法。
- 請求項5に記載の方法であって、因子VIIポリペプチドがP10QおよびK32Eから選択されるアミノ酸置換を含んでなる方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記タンパク質Sは、ハムスタータンパク質Sである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも10倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも25倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも50倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも100倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも250倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも500倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも750倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも1000倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも2000倍減少する方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、関心のあるビタミンK依存性タンパク質に対する100万分率として表したタンパク質S量が、少なくとも5000倍減少する方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、未精製細胞培養浮遊物中のタンパク質S混入物の量が少なくとも500ppmである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる精製された組成物中のタンパク質混入物の全量が、多くとも100ppmである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる精製された組成物中のタンパク質混入物の全量が、多くとも50ppmである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる精製された組成物中のタンパク質混入物の全量が、多くとも5ppmである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる精製された組成物中のタンパク質混入物の全量が、多くとも2ppmである方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、結果として得られる関心のあるビタミンK依存性タンパク質を含んでなる精製された組成物中のタンパク質混入物の全量が、多くとも1ppmである方法。
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