CN102161701A - 从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法,依次包含以下步骤:先原料经亲和层析纯化并收集含有凝血七因子的洗脱液,而后加入凝血酶及镁离子活化凝血七因子,最后对活化产物浓缩并进行病毒灭活获得最终产物。本发明通过亲和层析的方法可以一步纯化凝血七因子,凝血酶活化过程简单高效,可从细胞培养液或血浆组分中分离纯化七因子,大大提高了血浆的综合利用率,并可提供更安全高效的高纯度七因子蛋白药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,是一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法。
背景技术
凝血七因子(FVII)是一种依赖维生素K的糖蛋白,合成于肝脏,在血液中以很低的浓度存在(0.5mg/L),并且主要以非活化的单链酶原形式存在,仅1%处于被活化状态。七因子酶原可以被活化的凝血第十二因子、十因子、九因子、七因子或者凝血酶激活而形成活化七因子(FVIIa)。七因子是启动外源凝血途径所必须的酶原,它的激活是外源性凝血途径的开始。活化七因子本身仅具有很低的蛋白酶解活性,而组织因子(TF)是活化七因子高度亲和的受体,一旦活化七因子与组织因子相结合,则具有很高的活性。当创伤破坏了细胞屏障,在创伤或炎症部位表达的组织因子进入血液循环,并与活化七因子相结合,进而凝血第十因子(FX)被激活为活化十因子(FXa),导致少量凝血酶的产生,促使血小板在创伤部位凝集。活化七因子在血小板表面将凝血第十因子转化为活化十因子,经过一系列复杂的步骤,活化十因子在损伤部位形成血凝块。这种酶促反应局限在创伤部位,可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险。这一外源凝血途径也成为解释活化七因子能够有特异性地快速发挥止血作用的原因。
临床上活化七因子已经被广泛应用于七因子缺乏症的预防和由于七因子缺乏导致的出血病症,以及存在有凝血因子八和九因子抗体(抑制物)的先天性血友病和继发性血友病患者的自发性或手术性出血。目前市场上仅有丹麦诺和诺德公司(Novo Nordisk)的诺琪(Novo Seven),主要用于治疗先天性七因子缺乏症导致的出血病症,外科手术的出血,血友病等,2005年的销售额达到了近10亿美元,2006年上半年销售又增长19%。诺琪是利用基因重组技术在哺乳动物细胞中表达活化形式的凝血七因子。而且诺和诺德公司公司还在积极地不断拓展诺琪的临床适应症,国内外很多医院和临床医生已经将其广泛地应用在很多手术中,比如肝脏手术,肾移植,***手术等。诺和诺德公司已经包括急性创伤性出血,烧伤性出血出血性休克,脑内出血和手术后出血进行了临床试验,因此活化七因子的市场前景非常广阔。
七因子可以用基因工程的方法用工程细胞表达,如CHO或BHK细胞等。这些工程细胞将七因子以单链酶原的形式分泌到细胞培养液中,需要进行进一步的分离纯化步骤已取得活化七因子纯品。
在用低温乙醇法生产血制品的过程中,非活化的七因子被富积在组分III中,由于工艺原因,不能将其单独分离纯化,最终加工成凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrate,PCC),其中主要含有凝血因子II,VII,IX和X,它们都属于依赖维生素K的凝血因子。凝血酶原复合物目前被广泛应用于凝血因子II,VII,IX和X的缺乏症,肝病出血,维生素K缺乏症,外科手术异常出血,凝血因子八抑制物血友病和弥散性血管内凝血(DIC)。但由于PCC是几种凝血因子的混合物,在临床应用中很容易产生不良反应,如血栓栓塞等。因此,进一步分离纯化得到高纯度的凝血七因子,提高用药效率和安全性有着很重要的意义。与基因重组的七因子相比,从血浆中分离纯化七因子在成本上会具有较大优势。因此,开发新工艺,从血浆组分中分离七因子并制成活化的活化七因子制剂,将有广泛的市场前景,同时有利于提高血浆资源的综合利用率,减少血浆资源浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子(FVIIa)的方法。
本发明的方法包含以下步骤:
A.原料亲和层析纯化:
原料过亲和层析柱,并收集含有凝血七因子的洗脱液,所述亲和层析柱中的亲和层析介质上偶联有凝血七因子单克隆抗体,所述原料为:表达重组凝血七因子的细胞培养液或者将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分。
B.活化:
将经步骤A亲和层析纯化获得的含有凝血七因子的洗脱液在4℃-15℃温度条件下加入凝血酶及镁离子,共同孵化18-24小时实现凝血七因子的活化。所述凝血酶的浓度为1-100IU/ml洗脱液,所述镁离子的浓度为1-50mmol/l洗脱液。镁离子来源于含镁化合物,含镁化合物优选MgCl2。最优选的,所述凝血酶的浓度为15IU/ml,MgCl2的浓度为10mmol/l。
本发明方法的关键在于对凝血七因子的活化方法进行了改进,镁离子的添加与传统的只加凝血酶活化相比,有活化率高,活化时间短的优点,而且在活化过程中不容易产生七因子的过度活化现象,即不易产生过度活化后的小分子片段。
C.将步骤B的活化产物浓缩并进行病毒灭活获得最终产物。
本发明的步骤A中,所述亲和层析柱中的亲和层析介质为常规的亲和层析介质,可以是多糖类高分子亲水性物质,如葡聚糖、琼脂糖、或其它多孔性的多糖类高分子亲水性物质,或者也采用多孔刚性支撑、表面覆盖为多糖类高分子亲水性物的介质。
所述亲和层析介质在与凝血七因子单克隆抗体偶联前,其羟基经化学修饰引入了高反应活性的小分子化学基团,所述的高反应活性的小分子化学基团可以是溴化氰、环氧基团或巯基。引入高反应活性的小分子化学基团的亲和层析介质可经市购途径获得,如为GEHealthcare公司的CNBr-activated Sepharose 4Fast Flow或CNBr-activated Sepharose4B产品等。
本发明中,对所述表达重组凝血七因子的细胞培养液没有特殊限制,其获得为现有技术,可以通过将凝血七因子的基因克隆入合适的表达载体,并转化入合适的宿主细胞后培养获得。已有多篇文献报道过这样的细胞培养液。
本发明中的原料之一是由血浆在常规的低温乙醇法条件下沉淀获得的富含七因子的组分,通常为组分II+III或III。
本发明中,亲和层析介质可采用下列偶联条件实现与单克隆抗体的偶联:将合适的单克隆抗体蛋白溶液进行透析、超滤、浓缩、缓冲液置换后,调节pH至8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到亲和层析介质中进行偶联;在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,完成共价偶联;洗涤去除游离、未参与偶联的凝血七因子单克隆抗体,封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再对层析介质进行稳定化处理后,得到可用于纯化七因子的亲和层析介质。
所述凝血七因子单克隆抗体可采用各种途径获得的凝血七因子单克隆抗体。进一步改进的,所述凝血七因子单克隆抗体与凝血七因子的亲和系数Ka为1.65×108L/mol,且在洗脱液存在下的解离系数Kd为6.06×10-9M。研究表明,符合上述条件的凝血七因子单克隆抗体用于凝血七因子的纯化,可保证收率在90%以上。
符合上述条件的凝血七因子单克隆抗体一方面可通过试验在已知的凝血七因子单克隆抗体中筛选,另一方面,也可以用已知的单克隆抗体制备方法如杂交瘤技术自行制备凝血七因子单克隆抗体后,从中筛选。
优选的,所述凝血七因子单克隆抗体包括重链与轻链,其中重链氨基酸序列为:SEQ IDNO:1,轻链氨基酸序列为:SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:1:
MATTMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEAQLQQSGPYLIKPGASVKMSCKASGYTFTNYVVYWVKHKPGQGPEWIGYNNPYNDEIKYNEKFKVKATLTSDKSS STAYMEFSSLTSEDSAVYYCARGYYGSFYWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF P A VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH ED PE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT
SEQ ID NO:2:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSHKFMSTSLGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGADFTFTVSTVQAEDLAVYYCQQHYGTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在获知上述凝血七因子单克隆抗体的重链及轻链序列后,本技术领域的技术人员能很容易通过常规的基因重组技术改造现有凝血七因子单克隆抗体,并通过已知的蛋白表达技术获得上述单克隆抗体;或者也可以通过化学合成的方法获得上述单克隆抗体。
优选的,所述原料亲和层析纯化主要包括下列步骤:
1)原料前处理:
表达重组凝血七因子的细胞培养液的处理:细胞培养液经超滤浓缩后将pH调至7.0-8.0;
血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分的处理:组分用pH7.0-8.0的样品缓冲液复溶,调节溶液pH为7.0-8.0;
2)上样:亲和层析柱平衡,而后将经步骤1)处理后的原料上样,上样流速为每分钟0.5-100毫升;
3)洗脱:用pH2.0-pH5.0的洗脱缓冲液洗脱,收集凝血七因子组分。
较佳的,所述样品缓冲液为pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液或pH7.4三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液;所述洗脱缓冲液为pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液或pH2.5的醋酸/醋酸钠缓冲液。
本发明的步骤C中,对活化产物浓缩可采用常规方式浓缩。活化产物浓缩后的浓度范围为蛋白浓度每毫升1-200毫克。病毒灭活优选两步病毒灭活,第一步为纳米膜过滤,第二步病毒灭活为干热法。纳米膜可经市购途径获得,如使用Pall公司生产的DV50过滤膜。较佳的,第一步病毒灭活后的样品以10-50mM的柠檬酸盐进行透析,然后加入1-5%终浓度的人血白蛋白作为保护剂,分装为高纯度凝血七因子。第二步病毒灭活为干热法,即将冻干的七因子样品放置于65℃温箱中48-60小时。
凝血七因子有文献报道是通过疏水层析,肝素亲和层析,或者离子交换层析纯化的,但这些报道的方法都不能一步层析达到纯化要求。本发明所用的制备亲和介质由七因子抗体以共价键方式连接在层析材料基质上而成,具有安全性好、亲和力高的特点。本发明通过亲和层析的方法可以一步纯化凝血七因子,连接后面的凝血酶活化过程简单高效。本发明通过用亲和层析的方法从血浆或其组分中来分离纯化七因子,将大大提高血浆的综合利用率,并提供更安全高效的高纯度七因子蛋白药物。
附图说明
图1,七因子凝血酶活化时添加不同浓度MgCl210度条件下经过10小时活化后的结果。实验结果表明添加10mmol/l MgCl2后,10小时7因子活化率已达90%以上,而未添加的只有50%左右,说明MgCl2的添加大大提高了活化效率。
图2七因子不同时间活化的12%SDS-PAGE电泳银染结果,M:蛋白质分子量标准;1:活化24小时后结果;2:活化12小时后结果;3:活化6小时后结果;4:亲和层析洗脱液未活化。活化条件统一添加的凝血酶浓度为15IU/ml,氯化镁浓度为10mmol/l,活化温度10摄氏度。
具体实施方式
实施例分别列举了从细胞培养液及血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,主要包括下列步骤:
A.将表达重组七因子(rFVII)的细胞培养液或者将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分作为原料;
B.以含有多糖类高分子亲水性物质为基质,对基质上羟基进行化学修饰引入高反应活性的小分子化学基团,得到层析基质悬浮液;
C.将含有七因子抗体的溶液,加入到层析基质悬浮液中进行偶联,得到可用于纯化七因子的亲和层析介质;
D.将步骤A中的血浆混合后经冷乙醇沉淀得到富含七因子的组分(通常为组分II+III或III),或表达重组七因子的细胞培养液作为生产纯化七因子的原料;
E.以步骤C中的亲和层析介质,收集步骤D中的原料中的七因子组分;
F.用凝血酶将七因子原酶进行活化,即通过在4℃-15℃温度条件下与凝血酶及镁离子共同孵化18-24小时实现的;
G将纯化后的FVII溶液浓缩后进行两步病毒灭活,第一步为纳米膜过滤,第二步病毒灭活为干热法。
所述的基质是采用葡聚糖、琼脂糖、或其它多孔性的多糖类高分子亲水性物质;或采用多孔刚性支撑、表面覆盖为多糖类高分子亲水性物的介质。
所述的高反应活性的小分子化学基团是溴化氰、环氧基团或巯基。
在步骤C中,七因子抗体经透析、超滤、浓缩、缓冲液置换,调节pH至8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到步骤B中的层析基质悬浮液中进行偶联;在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,七因子抗体活化基团与层析基质完成共价偶联;洗涤去除游离、未参与偶联的七因子抗体,封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再对层析介质进行稳定化处理,得到可用于纯化七因子的亲和层析介质。
将富积七因子的血浆组分用pH7.0-8.0的缓冲溶液复溶,调节样品溶液pH7.0-8.0后,上样连接了七因子抗体的亲和层析柱。细胞培养液经超滤浓缩后将pH调至7.0-8.0,直接上样亲和层析柱。上样流速为每分钟0.5-100毫升,然后用pH2.0-pH5.0缓冲盐溶液洗脱,收集洗脱液。
用凝血酶将七因子原酶进行活化,即通过在4℃-15℃温度条件下与凝血酶共同孵化18-24小时实现的。
将纯化后的FVII浓缩到至蛋白浓度每毫升1-200毫克后进行两个病毒灭活步骤。第一步为纳米膜过滤,即使用Pall公司生产的DV50过滤膜进行过滤。第一步病毒灭活后的样品以10-50mM的柠檬酸盐进行透析,然后加入1-5%终浓度的人血白蛋白作为保护剂,分装为高纯度血浆来源七因子。第二步病毒灭活为干热法,即将冻干的七因子样品放置于65℃温箱中48-60小时。
实施例1亲和层析介质的制备
亲和层析介质:为GE Healthcare公司的CNBr-activated Sepharose 4Fast Flow或CNBr-activated Sepharose 4B产品。
七因子单克隆抗体的制备:
按常规方法构建杂交瘤细胞,筛选出的能产生抗活化凝血第七因子的杂交瘤细胞并提取RNA,在逆转录反应中将RNA转化成为单链DNA,再用两对设计好的引物分别扩增轻链和重链可变区序列,将所得产物分别克隆到pMD18-T载体中。将所得到的轻链和重链序列进行测序,按测序结果设计轻链和重链的全基因序列:
轻链DNA序列:(SEQ ID NO:3)
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCACTAGGAGACAGGGTCTCCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGACTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTCGGCATCCTATCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGGCGGATTTCACTTTCACCGTCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATGGTACTCCATTCACATTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA
重链DNA序列:(SEQ ID NO:4)
ATGGCCACAACCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGCGAGGCCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTTACCTGATAAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTGTGTACTGGGTGAAGCACAAGCCTGGGCAGGGCCCTGAGTGGATTGGATATAATAATCCTTACAATGATGAAATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGTCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGATACTACGGTAGCTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTAA
上述DNA序列所对应的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:1,轻链氨基酸为SEQ ID NO:2。按照设计序列进行基因合成。轻链序列两端分别为NheI和EcoRI内切酶位点,重链序列两端分别为XbaI和NotI内切酶位点。将所得到的轻链和重链DNA片段内切酶水解后,分别***质粒pIRES的IRES位点的上游和下游。对所得到的质粒目的基因片段进行测序,确认序列正确无误后进行大规模质粒抽提,并转染CHO细胞,转染72小时后用G418进行筛选,将用这种方法筛选出的有G418抗性的CHO细胞进行单克隆扩增,收集培养上清液,调pH至6.0-7.0,用0.45微米滤膜过滤,再用rProtein A层析柱纯化获得七因子特异性单克隆抗体。对工程细胞收集后对基因组DNA进行抽提并测序,根据测得序列推测获得抗体的氨基酸序列,重链序列为SEQ ID NO:1,轻链序列为SEQ ID NO:2。
单抗的亲和系数和解离系数的测定
试验方法:七因子单抗分子对于活化七因子分子的亲和系数和解离系数的测定是通过应用表面等离子共振技术(SPR)测定的。实时SPR检测所用的是BIACORE公司Biacore3000仪器。先将活化七因子蛋白作为配体固定在实验用CMG生物传感器芯片上,缓冲体系为10mMHEPES,150mM NaCl,pH7.4。用pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠的平衡缓冲液平衡芯片,20微升纯化的七因子单抗以每分钟10微升的速度注射到生物芯片内并流过包被有七因子蛋白的芯片表面。用pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠的平衡缓冲液进行清洗后,用pH2.5-5.0的甘氨酸/盐酸洗脱缓冲液进行洗脱,共振信号以共振单位(RU)形式从仪器中读出并记录在RU曲线上,分析软件再根据RU曲线计算出亲和系数和解离系数.
试验结果:
3次实验的RU结果如下:
第一次实验(RU) | 第二次实验(RU) | 第二次实验(RU) | |
芯片平衡 | 1222.4 | 1031.5 | 1317.0 |
清洗 | 1294.6 | 897.8 | 1242.2 |
洗脱 | 104.7 | 34.7 | 42.1 |
三次结果平均得到七因子单抗的亲和系数Ka为1.65×108L/mol,在盐酸磷酸盐洗脱环境下解离系数Kd为6.06×10-9M。
选取上述筛选的七因子单克隆抗体,调节pH8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到活化好的层析基质悬浮液中进行偶联。在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,七因子抗体通过活化基团与层析基质完成共价偶联。采用碳酸钠缓冲液洗涤去除游离、未参与偶联的七因子抗体,采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液在弱碱性条件下封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再采用柠檬酸缓冲液在酸性条件下对层析介质进行稳定化处理,得到可用于纯化七因子的亲和层析介质。
实施例2组分II+III亲和层析分离七因子
蛋白含量为10%的血浆组分II+III样品100ml,加入100ml pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液稀释均匀,作为亲和层析纯化前样品。七因子抗体亲和层析柱50ml经pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液平衡5个柱体积,流速5ml/min,上样组分II+III稀释液200ml,控制流速3ml/min,收集穿透峰300ml。上样完毕后,用磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液淋洗至基线。采用pH2.5-5.0的甘氨酸/盐酸缓冲溶液洗脱七因子(优选pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液洗脱七因子),洗脱流速5ml/min,收集洗脱七因子组分峰80ml。从血浆组分纯化七因子活性单位的比较,请参考表一。
表一、亲和层析从血浆组分纯化七因子活性
实施例3以七因子细胞培养液为原料用亲和层析分离七因子
用生物反应器在无血清培养基中对七因子细胞进行悬浮培养液,当细胞密度达到1X107细胞/毫升,七因子浓度达到10毫克/升时收集培养液上清样品20升,以pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液进行超滤浓缩至2000ml后作为亲和层析纯化前样品。七因子抗体亲和层析柱50ml经pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液平衡5个柱体积,平衡流速5ml/min,上样血浆样品2000ml,收集穿透峰2150ml,上样流速10ml/min。上样完毕后,用磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液淋洗至基线。采用pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液洗脱七因子,收集洗脱七因子组分峰94ml。从血浆纯化七因子活性单位的比较,请参考表2。
表2、从细胞培养液中纯化七因子活性单位比较
实施例4七因子凝血酶活化及病毒灭活工艺
分别将实施例2和3获得的亲和层析洗脱溶液,用凝血酶将七因子原酶进行活化,溶液体积100ml,蛋白浓度0.5mg/ml,总活性80000IU,4℃-15℃温度条件下与1-100IU/ml浓度的凝血酶共同孵化10-24小时。在添加凝血酶的同时添加了1-50mmol/l的MgCl2,MgCl2的添加与传统的只加凝血酶活化相比,有活化率高,活化时间短的优点,而且在活化过程中不容易产生七因子的过度活化现象,即不易产生过度活化后的小分子片段,我们优选15IU/ml的凝血酶加10mmol/l的MgCl2为活化条件,具体数据可参见图1。不同活化时间和活化温度对七因子的活化率也有显著影响,我们优选10摄氏度24小时为最优的活化条件,此条件下七因子活化率达到100%,可参考电泳附图2。
活化后的七因子浓缩到至蛋白浓度每毫升1-200毫克后进行两个病毒灭活步骤。蛋白浓缩采用截留分子量10KD的超滤膜浓缩(截留分子量30KD,5KD也可以)第一步为纳米膜过滤,即使用Pall公司生产的DV50过滤膜进行过滤。第一步病毒灭活后的样品以10-50mM的柠檬酸盐进行透析,然后加入1-5%终浓度的人血白蛋白作为保护剂,分装为高纯度血浆来源七因子。细胞培养液来源的七因子可以不做此步灭活工艺,直接冻干后干热。第二步病毒灭活为干热法,即将冻干的七因子样品放置于65℃温箱中48-60小时。活化及病毒灭活的数据见表3
表3血浆组分来源的七因子活化及病毒灭工艺对七因子比活及得率的影响
步骤 | 比活(IU/mg) | 得率(%) |
亲和洗脱 | 2100 | 92 |
凝血酶活化 | 42000 | 65 |
DV50过滤 | 46000 | 80 |
干热灭活 | 480 | 70 |
以上对本发明所提供的从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度凝血七因子的方法进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (14)
1.一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,包含以下步骤:
A.原料亲和层析纯化:
原料过亲和层析柱,并收集含有凝血七因子的洗脱液,所述亲和层析柱中的亲和层析介质上偶联有凝血七因子单克隆抗体,所述原料为:表达重组凝血七因子的细胞培养液或者将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分;
B.活化:
将经步骤A亲和层析纯化获得的含有凝血七因子的洗脱液在4℃-15℃温度条件下加入凝血酶及镁离子,共同孵化18-24小时实现凝血七因子的活化;
C.将步骤B的活化产物浓缩并进行病毒灭活获得最终产物。
2.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤B中,所述凝血酶的浓度为1-100IU/ml,所述镁离子的浓度为1-50mmol/l。
3.如权利要求2所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤B中,所述凝血酶的浓度为15IU/ml,Mg离子的浓度为10mmol/l。
4.如权利要求1或3所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤B中,所述镁离子来源于MgCl2。
5.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤A中,所述亲和层析柱中的亲和层析介质为多糖类高分子亲水性物质,或者为采用多孔刚性支撑且表面覆盖有多糖类高分子亲水性物质的介质。
6.如权利要求5所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,所述多糖类高分子亲水性物质为葡聚糖或琼脂糖。
7.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤A中,所述亲和层析介质在与凝血七因子单克隆抗体偶联前,其羟基经化学修饰引入了高反应活性的小分子化学基团。
8.如权利要求7所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,所述的高反应活性的小分子化学基团为溴化氰、环氧基团或巯基。
9.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分为组分II+III或者为组分III。
10.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤A中,所述凝血七因子单克隆抗体与凝血七因子的亲和系数Ka为1.65×108L/mol,在洗脱液存在下的解离系数Kd为6.06×10-9M。
11.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤A中,所述凝血七因子单克隆抗体包括重链与轻链,其中重链氨基酸序列为:SEQ ID NO:1,轻链氨基酸序列为:SEQ ID NO:2。
12.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤A具体包括下列步骤:
1)原料前处理:
表达重组凝血七因子的细胞培养液的处理:细胞培养液经超滤浓缩后将pH调至7.0-8.0;
血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分的处理:组分用pH7.0-8.0的样品缓冲液复溶,调节溶液pH为7.0-8.0;
2)上样:亲和层析柱平衡,而后将经步骤1)处理后的原料上样,上样流速为每分钟0.5-100毫升;
3)洗脱:用pH2.0-pH5.0的洗脱缓冲液洗脱,收集凝血七因子组分。
13.如权利要求12所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,所述样品缓冲液为pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液或pH7.4三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液;所述洗脱缓冲液为pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液或pH2.5的醋酸/醋酸钠缓冲液。
14.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法,其特征在于,步骤C中,病毒灭活为两步病毒灭活,第一步为纳米膜过滤,第二步病毒灭活为干热法病毒灭活。
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