JP4498260B2 - ガラス化用具のシーリング方法 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物の生殖細胞（***、卵子又は受精卵を含めた胚など）を急速に凍結（ガラス化）し、保存する際に使用するガラス化用具のシーリング方法に関するものであり、このシーリング方法を用いると、生殖細胞を良好な生存状態で保存し、体外受精、胚移植、顕微受精や哺乳動物（ヒトを除く）のクローン作出に利することができる。

急速冷却方法として、高濃度の凍結液の中に胚を浸漬し、液体窒素に滴下して−３７０℃／秒以上の超急速で凍結保存を行う方法が知られている。この方法は凍結液が結晶構造をとらないため、氷晶による細胞傷害が起きないため、融解後の胚の生存性が高い。しかし、この方法は卵子又は胚を再現性よく回収することが困難であり、卵子又は胚の個別識別ができなくなるという不都合があった。

また、急速冷却できる方法として、ストロー状のプラスチック製の凍結容器を引き延ばして極細にして急速冷却できるようにしたものの中に卵子又は胚を含む凍結液を吸い上げ、これを液体窒素に浸漬してガラス化する方法（オープン・プルド・ストロー（ＯＰＳ）法）が採用されてきた。しかし、この方法では、吸入液量が一定しないので、卵子又は胚を安定的にガラス化することは困難であった。

さらに、特許文献１には、筒状の極細管部と、該極細部に続く、吸引及び吐出用器具に装填するための連結部とを含み、前記極細管部の長手方向に対する垂直断面の内空部分において対向する２点間の最短距離が、卵子又は胚の最小外径の２倍よりも短く、且つ卵子又は胚の最大径よりも長いため、当該極細管部の中に入った卵子又は胚が、極細管部の長手方向に対する垂直面上に２個以上並存しえないようにした卵子又は胚のガラス化用具及びガラス化方法、が記載されている。しかし、この方法においては、作業中あるいは保管中にウイルスや雑菌等が進入して、ガラス化用具内を汚染するおそれがあった。
特開２００１−２５２２９３号公報

本発明は、生殖細胞を凍結し、保存容器への保存のための作業中にウイルスや雑菌で汚染されることを防止し、かつ、生殖細胞を直接液体窒素に接触させることなく、急速に冷却可能であり、かつ、凍結保存容器内にて安定した状態を保つことができるガラス化用具のシーリング方法を提供することを目的としている。

上記課題を解決するための本発明は、粘性が高く、毒性がない液体からなるシーリング剤としてのグリセリンを、胚を含む凍結液を収容した凍結容器の先端部に１〜３マイクロリットル吸着させた後、前記凍結容器の先端部を液体窒素へ浸漬することにより速やかにグリセリンを凍結させ、凍結容器の先端部を密閉、シールするとともに、胚を凍結することを特徴とするガラス化用具のシーリング方法である。そして、特に、***の凍結に応用する場合には、凍結容器の先端部において、凍結液とグリセリンとの間に空気層を設けることが望ましい。また、凍結保存後において、凍結容器の先端部に吸着させ凍結させたグリセリンを融解液中で速やかに融解、拡散、除去することが好ましい。

本発明は、前記のように構成されているので、胚を凍結し、凍結容器への保存のための作業中にウイルスや雑菌で汚染されることを防止し、かつ、胚を直接液体窒素に接触させることなく、急速に冷却可能であり、かつ、凍結容器内にて安定した状態を保つことができる。また、特に卵子又は受精卵を含めた胚の凍結ではシーリングしない超高速ガラス化法と同様の高い生存率が得られる。また、シーリング剤としてのグリセリンを少し冷却すると、粘性を高めることができるので、凍結容器の先端部に吸着させることが容易になる。また、凍結容器の先端部内において、凍結液とグリセリンとの間に空気層を設けるとグリセリンと凍結液との接触を完全に防ぐことができて、特に***の凍結保存には適している。また、融解時において、グリセリンを容易に除去することができる。

以下本発明を詳細に説明する。そして以下の説明では、主に生殖細胞として胚を用いた場合について説明する。
本発明で用いるガラス化用具の例を図１に示す。図１において、例えば、ガラス化用具１は、凍結容器２、凍結容器２の先端部を保護するための保護部材３、凍結容器２の後端部を封止するための封止部材４で構成されている。凍結容器２は、胚を保存するための細径部２１、本体部２２、及び後端部２３により構成されており、細径部２１は本体部２２より細径になっている。

胚を凍結容器２に装入するには図３に示すように、胚採取用の吸引具５を用いて、胚を含む凍結液を吸引して凍結容器２の細径部２１内に胚を採取する。細径部２１内に胚を採取したら、図４のＡに示すように凍結容器２の先端部にシーリング剤６を吸着させる。細径部２１の先端部にシーリング剤６を吸着させた後、図４のＢに示すようにシーリング剤が吸着した細径部２１の先端部を−１９６℃の液体窒素に浸漬して、速やかにシーリング剤を凍結させて、凍結容器先端部をシールするとともに胚を凍結する。そして、図６に示すように凍結容器２から胚採取用の吸引具５を外して、凍結容器２の後端部２３に封止部材４を挿入して凍結容器２を封止して液体窒素に浸漬する。その後、図７に示すように、凍結容器２の細径部２１を保護部材３に挿入した後、急速冷凍ボックス７内の液体窒素に浸漬し、その後、急速冷凍ボックス内７から凍結保存容器内に移して−１９６℃で保存する。保護部材３の一端は封止されていて、他端は開口していて、この開口へ凍結容器２の細径部２１を挿入して収納し、細径部２１を保護する。なお、凍結容器２の後端部２３に封止部材４を装入して凍結容器２を封止する作業及び凍結容器２の細径部２１を保護部材３に挿入する作業は、急速冷凍ボックス７の液体窒素上の窒素ガス中で行うと容易になる。

本発明のガラス化用具のシーリング方法を用いた、胚の凍結保存方法は、上述したようにガラス化用具１を用い、凍結用の胚を準備する工程と、凍結容器２の細径部２１内に胚を凍結液とともに採取する採取工程と、胚が装入された凍結容器２の細径部２１の先端部にシーリング剤を吸着させ、シーリング剤を凍結させてシールするとともに胚を凍結する凍結工程と、凍結容器２の他端側を封止部材４で封止する封止工程と、封止された凍結容器２に保護部材３を取り付ける保護部材取付工程と、保護部材３が取り付けられた凍結容器２を急速冷凍ボックス７に浸漬する浸漬工程を含んでいる。そして、前記のようにして胚が装入されたガラス化用具は、凍結保存容器内で胚が必要とされるときまで、凍結保存される。

融解時には、上述したガラス化用具１を凍結保存容器内から急速冷凍ボックス内７に移す。最初に、保護部材３から凍結容器２を取り出し、窒素ガス中で封止部材４を凍結容器２の後端部２３から引き抜くことにより後端部２３を開口させる。次に、シャーレの上の３７℃に加温した０．２５Ｍスクロース液０．５ｍｌのドロップへ、シーリング剤が付着した凍結容器２の細径部２１の先端部を浸漬し、融解液中で細径部２１の先端部を揺り動かす。この作業で、シーリング剤はすみやかに融解液に溶解して、細径部２１の先端部から拡散、遊離することによって、凍結容器細径部２１の先端部の密閉が解除される。次に、液体窒素と接触したシーリング剤からのウイルスや細菌汚染を極力避けるために、別に用意した０．２５Ｍスクロース液１ｍｌのドロップへ凍結容器細径部２１の先端部を移し、凍結容器２の後端部２３の開口部を指で塞ぐことにより、窒素ガスの圧力で細径部２１の先端部に存在する胚は融解液中へ移動する。

それから、０．２５Ｍスクロース液中で１分間保持し、次に、０．１３Ｍスクロース液の１ｍｌへ胚を移し、５分間浸漬後、培養液へ移しかえ、さらに５分間浸漬する。この一連の作業は３７℃に加温して行うことによって、胚から凍結液は完全に除去される。

本発明のガラス化用具のシーリング方法を用いた胚の融解方法は、上述したガラス化用具１を用いる。この場合の胚の融解方法は、保護部材３から凍結容器２を取り出し、窒素ガス中で封止部材４を凍結容器２の後端部２３から引き抜くことにより後端部２３を開口させる工程、シャーレの上の３７℃に加温した融解液へシーリングが付着した凍結容器２の細径部２１の先端部を浸漬し、融解液中で細径部２１の先端部を揺り動かし、シーリング剤を取り除き、凍結容器細径部２１の先端部の密閉を解除させる工程、別に用意した融解液へ凍結容器の細径部２１の先端部を移し、凍結容器２の後端部２３の開口部を指で塞ぐことによって、細径部２１の先端部にある胚を融解液中へ取り出す工程を含んでいる。そして、胚を一連の融解液へ移しかえることによって、胚の凍結液は希釈除去され、培養によって発育を進めることや、移植によって受胎することが可能になる。

凍結容器先端部に吸着させるシーリング剤としては、グリセリン、糖液シロップ（高濃度のブドウ糖液）、６０％シロップの乳酸ナトリウム等が挙げられるが、グリセリンを用いることが好ましい。シーリング剤の吸着量としては１〜３μｌであることが好ましく、特に１．０〜２μｌであることがより好ましい。

また、ここで用いる胚としてはヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の胚が挙げられる。採取用の胚を準備する工程において、平衡液としては１０％エチレングリコール（ＥＧ）と１０％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を添加した２０％代用血清を含む修正ヒト卵管合成培地（ｍ−ＨＴＦ）、１０％ＥＧと１０％ＤＭＳＯを添加した２０％子牛血清を含むダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、１０％ＥＧと１０％ＤＭＳＯを添加した２０％子牛血清を含む組織培養１９９液（ＴＣＭ１９９）等が挙げられるが、１０％ＥＧと１０％ＤＭＳＯを添加した２０％代用血清を含むｍ−ＨＴＦが好ましい。凍結液としては２０％ＥＧ、２０％ＤＭＳＯと０．６Ｍスクロースを添加した２０％代用血清を含むｍ−ＨＴＦ、２０％ＥＧと２０％ＤＭＳＯ、０．６Ｍスクロースを添加した２０％子牛血清を含むＰＢＳ液、２０％ＥＧ、２０％ＤＭＳＯと０．６Ｍスクロースを添加した２０％子牛血清を含むＴＣＭ１９９液等が挙げられるが、２０％ＥＧと２０％ＤＭＳＯと０．６Ｍスクロースを添加した２０％代用血清を含むｍ−ＨＴＦが望ましい。

特に、本発明のガラス化用具のシーリング方法によれば、胚が装入された凍結容器２の細径部２１の先端部がシールされ、本体部２２において凍結容器の他端側も封止されるので、ウイルスや雑菌で胚が汚染されるのを防止できる。また、特に、生殖細胞が***の場合、凍結保存のためには、図５に示すように、最後の凍結液を吸引した後に少量（０．１〜０．３μｌ）の空気を吸って、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けると凍結液とシーリング剤との接触を完全に防ぐことができて、汚染を完全に防止できる。

本発明で用いるガラス化用具１において凍結容器２は、全長４５〜６０ｍｍが好ましく、特に、４５〜５５ｍｍが好ましい。細径部２１の長さは１０〜２０ｍｍが好ましく、特に、１０〜１５ｍｍが好ましい。細径部２１の内径は、１００〜３５０μｍが好ましく、特に１５０〜３００μｍが好ましい。細径部２１の肉厚は５０〜１５０μｍが好ましく、特に９０〜１００μｍが好ましい。本体部２２の長さは３０〜５０ｍｍが好ましく、特に３５〜４５ｍｍが好ましい。本体部２２の内径は２〜３ｍｍが好ましく、特に２．１〜２．８ｍｍが好ましい。また、本体部２２の肉厚は３００〜６００μｍであることが好ましく、特に４００〜６００μｍが好ましい。また、細径部２１の肉厚は、本体部２２の肉厚より薄いことが好ましく、本体部２２と細径部２１との間の切込部は、外径および肉厚の移行領域を形成している。具体的には、切込部において、外径及び内径は細径部２１側に向かって縮径する。

また、凍結容器２の後端部２３を封止するための封止部材４は、全長が４０〜６０ｍｍ好ましく、特に４５〜５５ｍｍが好適である。その外径は凍結容器２の本体部２２の内径に合致するように作製される。そして、その材質はポリエチレン等のプラスチック素材等が用いられる。

保護部材３は、筒状になっていて、その一端は封止されている。保護部材３の他端は開口していて、凍結容器２の細径部２１を挿入して収納するためのものであり、その内径は切込部と嵌合するようになっている。その長さは凍結容器２の切込部から先端部までを挿入できるようになっている。この、保護部材３は、凍結液とともに胚を採取した凍結容器２を、胚の冷却を阻害することなく保護するものである。凍結容器２の細径部２１の先端は保護部材３の底面に当接しないようになっている。保護部材３の材質は、破損の可能性が低い、例えば、ポリエチレン等のプラスチック素材等が用いられる。通常は、保護部材３は胚とは別に液体窒素で冷却され、−１５０℃に冷却された状態で凍結容器２をカバーする。さらに、融解時も、液体窒素−１９６℃に保存された保護部材３は凍結容器２から外される。従って、迅速な冷却加温は重要ではなく、破損しにくく、透明であればよい。

次に本発明の一実施の形態を挙げて、本発明を具体的に説明する。
（凍結のプロセス）
１．凍結用の胚を準備する工程
（１）あらかじめ、恒温槽内でｍ−ＨＴＦ（修正ヒト合成卵管液）と平衡液（１０％ＥＧと１０％ＤＭＳＯを添加した２０％代用血清を含むｍ−ＨＴＦ）と凍結液（２０％ＥＧと２０％ＤＭＳＯと０．６Ｍスクロースを添加した２０％代用血清を含むｍ−ＨＴＦ）を３７℃になるように温めておく。一方、シーリング剤は４℃で冷蔵保存しておく。
（２）３７℃にセットしたウォーマーの上に置いた６０ｍｍシャーレ上に、ｍ−ＨＴＦを滴下して、１００μｌのｍ−ＨＴＦのドロップを３つ作り、ミネラルオイルでカバーする。
（３）平衡液の準備
３７℃にセットしたウォーマーの上に置いた６０ｍｍシャーレ上に、平衡液を滴下して、５０μｌの平衡液のドロップを３つ作る。
（４）ウォーマーを使わず、室温で６０ｍｍシャーレ上に、シーリング剤を滴下して、３００μｌのシーリング剤のドロップを１つ作る。
（５）パスツールピペットの先端に胚を採取し、前記（２）で準備したｍ−ＨＴＦのドロップで胚を洗ってから、胚を前記（３）で準備した平衡液のドロップの中に入れる（図２のＡ）。
（６）タイマーをスタートさせ、順に３つの平衡液のドロップへ胚を移動させながら、胚を平衡化する（図２のＢ）。
（７）凍結液の準備
前記（６）で用いたシャーレ上の３つの平衡液のドロップと平行して、凍結液を滴下して、７μｌの凍結液のドロップを２つ、１〜２μｌの凍結液のドロップを１つ作る（図２のＣ）。
（８）タイマーが１分３０秒になったら平衡液ドロップから胚をパスツールピペットで吸引し、２分で凍結液に移す（図２のＤ）。
（９）パスツールピペットで胚を順に７μｌの凍結液のドロップに移動させ、３回目に１〜２μｌの凍結液のドロップに入れる（図２のＤ）。

２．凍結容器への胚採取工程
（１）一連のガラス化用具のうちストロー（保護部材３）だけ前もって−１９６℃の液体窒素に入れて冷却しておく。ＮＫチップ（凍結容器２）に０．５〜１０μｌの可変吸引ピペット（胚採取用の吸引具）を装着しておく。なお、ピペットの容量は０．６μｌにセットする。
（２）吸引ピペットでＮＫチップに胚を含有する凍結液を吸引する（図３）。最後の凍結液を吸引した後に少量（０．１〜０．３μｌ）の空気を吸って、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けると凍結液とシーリング剤との接触を完全に防ぐことができる。

３．シール工程
（１）タイマーが２分２８秒になったら、ＮＫチップの先端をシーリング剤に瞬時に漬けて、ＮＫチップの先端のシーリング剤を吸着させて、先端を封じる（図４のＡ）。
（２）タイマーが２分３０秒になったら、ＮＫチップの先端部を−１９６℃の液体窒素に浸漬し、シーリング剤を凍結すると共に胚を凍結させる（図４のＢ）。

（融解のプロセス）
（１）３７℃にセットしたウォーマーに置いた６０ｍｍシャーレの中に、０．２５Ｍスクロース液を滴下して、５００μｌのドロップを２つ作り、ウォーマーを設置した顕微鏡のレンズの下に置く。
（２）０．１３Ｍスクロース液１,０００μｌを３７℃にセットしたウォーマー上に置いた４ｗｅｌｌプレートの１箇所に入れる。
（３）ｍ−ＨＴＦ１,０００μｌを同じ４−ｗｅｌｌプレートの他の１箇所に入れる。
（４）一連の胚ガラス化用具を液体窒素から取り出してＮＫチップからストロー、次にスティックを外す。
（５）すばやく前記（１）の０．２５Ｍスクロース液のドロップの一方にＮＫチップの先端を漬け、先端部を揺り動かしてシーリング剤を溶かして洗い落とし、すぐに他方のドロップにＮＫチップの先端部を漬け、後端を指で塞ぎ、強く押す（図８）。
液体窒素から取り出したＮＫチップは、５秒後に指で塞ぐと泡が少なくなる。タイマーは泡を出してからスタートさせる。なお、オートピペットで押し出してもよい。
泡が出たら胚はシャーレに移行している。このとき泡は１〜２個が望ましく、多数作らない。泡に胚が付いている場合があるので、ピペットで泡を押さえたり、泡を動かして探す。
（６）１分後、胚を０．２５Ｍスクロース液から０．１３Ｍスクロース液に移動させる。
（７）５分後（タイマー作動開始から６分後）、胚を０．１３Ｍスクロース液からｍ−ＨＴＦに移動させる。
（８）５分後（タイマー作動開始から１１分後）、胚をｍ−ＨＴＦ（修正ヒト卵管合成液）やアルファーＭＥＭ（最小必須培地）等の媒液に移しかえて培養する。
なお、これらは一般的な実験例であり、実験の環境や諸条件によって、経過が変わってくるので、適宜操作を変える必要がある。

本発明で用いる胚のガラス化用具の例を示す概略側面図である。 図２のＡ〜Ｄは、凍結するための胚を準備する工程を示す図である。 凍結容器内に胚を凍結液とともに採取する工程を示す図である。 図４のＡ，Ｂは、胚を採取した凍結容器の細径部内の胚を凍結すると共に先端部を凍結シールする工程を示す図である。 凍結容器に胚を採取し、シーリング液を吸着させる際の１実施態様を示す図である。 凍結容器の後端部を封止する工程を示す図である。 保護部材が取り付けられた凍結容器を液体窒素容器内に浸漬する工程を示す図である。 凍結容器から胚を取り出す様子を示す図である。

符号の説明

１ ガラス化用具
２ 凍結容器
３ 保護部材
４ 封止部材
５ 吸引具
６ シーリング剤
７ 急速冷凍ボックス

Claims (3)

1. 粘性が高く、毒性がない液体からなるシーリング剤としてのグリセリンを、胚を含む凍結液を収容した凍結容器の先端部に１〜３マイクロリットル吸着させた後、前記凍結容器の先端部を液体窒素へ浸漬することにより速やかにグリセリンを凍結させ、凍結容器の先端部を密閉、シールするとともに、胚を凍結することを特徴とするガラス化用具のシーリング方法。
2. 凍結容器の先端部内において、凍結液とグリセリンとの間に空気層を設けることを特徴とする請求項１に記載のガラス化用具のシーリング方法。
3. 凍結保存後において、凍結容器の先端部に吸着させ凍結させたグリセリンを融解液中で速やかに融解、拡散、除去することを特徴とする請求項１又は２に記載のガラス化用具のシーリング方法。

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