WO2016111217A1 - 中空糸凍結保存用具及び細胞凍結保存方法 - Google Patents
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Definitions
- FIG. 1 is a perspective view showing an embodiment of a hollow fiber cryopreservation device according to the present invention.
- the hollow fiber cryopreservation tool 1 includes a long support 10 for placing a hollow fiber, and a rod-shaped handle 20 serving as a handle is formed at one end of the support 10.
- the side wall parts 12 and 13 are formed in both the both ends in the transversal direction of the support tool 10.
- the side walls 12 and 13 formed at both ends of the bottom 11 serve as a guide for the hollow fiber, thereby preventing the hollow fiber from protruding from the support.
- the hollow fiber containing cells in the internal space is placed on the support 10 and then the support on which the hollow fiber is placed is housed in a cylindrical protective container, the hollow fiber and the protective container are stored. Since the contact with the equipment is prevented, the hollow fiber can be better accommodated in the protective container.
- the support 10 has the side wall parts 12 and 13, the rigidity of the whole support can be improved. As shown in FIG. 2, since the side walls 12 and 13 are formed on the support tool 10, the rigidity of the whole support tool is improved, so that it is hollow compared to the support tool 10 that does not have a side wall part. It is possible to set the thickness of the bottom 11 on which the yarn can be placed thinner. By reducing the thickness of the bottom 11, the cells included in the hollow fiber can be cooled or heated more quickly.
- FIG. 3A is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
- the support is illustrated in which the bottom and the side wall are perpendicularly connected and the cross-sectional shape is a U-shape.
- the cross-sectional shape of the support is U-shaped, V-shaped, or a concave cross-sectional shape such as a graphic shape consisting of a trapezoidal leg and an upper base.
- the support which has can be illustrated.
- the concave cross-sectional shape includes one having a recess at the center of the support section and one where the recess is closer to the end than the center of the support section.
- the angle formed by the bottom and the side wall of the support section is more than 0 degree, preferably 90 degrees or less, preferably 20 degrees or more. More preferably, it is 90 degrees or less. As shown in FIGS.
- the support 10 has the side walls 12 and 13 to improve the handleability of the hollow fiber, and in addition, the cells can be cooled or heated in a better state. Can be done.
- the hollow fiber When the hollow fiber is placed on the hollow fiber cryopreservation tool 3 of the present embodiment, the hollow fiber can be placed on the support 10 so that the longitudinal direction of the support 10 and the longitudinal direction of the hollow fiber are substantially the same direction. It is. As shown in FIG. 4, the through holes are formed in the thickness direction of the plate of the plate-like support tool because the through holes are formed in a direction facing the hollow fiber placed on the support tool. It is understood that
- the hollow fiber 30 may be previously immersed in a cryopreservation solution before being placed on the support 10.
- a cryopreservation solution is a liquid suitable for cryopreservation.
- the cell cryopreservation method of the present invention can be applied to any freezing method.
- the hollow fiber can be frozen in a low-temperature or ultra-low-temperature gas phase atmosphere, It is preferable to freeze the hollow fiber by exposing it to liquid nitrogen vapor.
- Process D The hollow fiber 30 in which the protective container 40 and the support 10 are integrated and sealed is frozen and stored in a freezer, liquid nitrogen, or liquid helium (step D).
- the support 10 and the hollow fiber 30 placed thereon are used.
- the entire protective container 40 accommodated may be put into liquid nitrogen to cool the hollow fiber 30, and then the cells may be stored frozen.
- the protective container is a test tube having an inner diameter larger than the diameter of the outer peripheral edge of the handle 20, and the handle 20 and the support After housing 10 and the hollow fiber 30, the entire hollow fiber cryopreservation device may be sealed by closing the opening of the test tubular protective container 51 by a technique such as heat sealing (FIG. 11).
- a hollow fiber cryopreservation device capable of easily cryopreserving a hollow fiber, and a hollow fiber including cells such as germ cells in an internal space can be easily cryopreserved.
- a cell cryopreservation method can be provided, and can be widely used in biology-related fields, medical-related fields, particularly in the field of reproductive medicine.
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Abstract
Description
本願は、2015年1月9日に、日本に出願された特願2015-003070号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
しかし、中空糸は比較的もろい素材のため、中空糸をピンセットなどでつまんでそのまま凍結保存用の容器に収めようとすると、凍結保存用の容器と中空糸が接触して中空糸が折れてしまうおそれがある。中空糸凍結保存法の利点は既に報告されているが、中空糸が折れやすいなど取扱いに難があり、熟練した研究者に使用者が限られている。
また、本発明者らは、細菌汚染などをさらに効果的に抑制するため、液体窒素に一部を浸漬させた凍結保存用の容器中に、中空糸をピンセットで保持しながら導入し、凍結させる手法も考案したが、本手法においても、中空糸が軽く、比較的もろい素材であることから、上記と同様の理由により、熟練した研究者に使用者が限られている。
このように、中空糸を凍結保存するための適切な器具が存在しないことも、中空糸凍結保存法の普及の妨げとなっている。
そこで、本発明者らは中空糸を保持し、中空糸を容易に扱うことを可能とする中空糸凍結保存用の支持器具が必要であることに思い至った。
(2)前記支持具には、載置される中空糸側と該中空糸側の反対側とを貫通する貫通孔が形成されている前記(1)に記載の中空糸凍結保存用具。
(3)前記貫通孔が、前記支持具の長手方向の略中央に形成されている前記(2)に記載の中空糸凍結保存用具。
(4)前記支持具は、中空糸を載置するための底部と、前記支持具の長手方向に沿って前記底部から立ち上がる側壁部とを有する前記(1)~(3)のいずれか一つに記載の中空糸凍結保存用具。
(5)前記支持具が樹脂製又は金属製である、前記(1)~(4)のいずれか一つに記載の中空糸凍結保存用具。
(6)前記(1)~(5)のいずれか一つに記載の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に細胞を包含する中空糸を載置する工程と、
該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程と、
を有する細胞凍結保存方法。
(7)前記支持具に、前記中空糸を載置する工程の後に、前記中空糸が載置された前記支持具を保護容器に収容する工程を有する前記(6)に記載の細胞凍結保存方法。
(8)前記支持具に、前記中空糸を載置する工程の後に、前記中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程を有する、前記(6)又は(7)に記載の細胞凍結保存方法。
(9)前記細胞が生殖細胞及び/又は幹細胞である前記(6)~(8)のいずれか一つに記載の細胞凍結保存方法。
本発明の中空糸凍結保存用具は、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は、耐低温性材料からなるものである。以下、本実施形態の中空糸凍結保存用具について、図面を参照しつつ、例を挙げて説明するが、本発明の中空糸凍結保存用具は以下の実施形態に限定されない。
本実施形態の中空糸凍結保存用具は、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備える。
また、中空糸凍結保存用具の使用にあたっては、内部空間に細胞を包含する中空糸が支持具10に載置された後、前記中空糸が載置された支持具を筒状の保護容器に収容する作業を行うことも想定される(後述の図10など参照)。このような作業を行う際、例えば支持具10と保護容器40が接触して支持具10に若干の荷重がかかった場合でも、支持具10が変形して中空糸を破損させてしまわない程度に、支持具10が剛性を示すことが好ましい。
なお、ここで、低温の気相雰囲気中とは-20℃~-269℃の気相雰囲気を指し、超低温の気相雰囲気中とは-80℃~絶対零度の気相雰囲気を指し、例えば低温又は超低温の窒素蒸気雰囲気やフリーザー内などが挙げられる。
また、中空糸凍結保存用具の使用にあたっては、内部空間に細胞を包含する中空糸を支持具10と共に加熱する作業を行うことが想定される。この時、中空糸の温度を瞬時に上昇させて、中空糸に包含される細胞を瞬時に加熱することが、細胞の状態にとって好ましい場合がある。
金属としては、例えば、チタン、アルミ、ステンレスなどが挙げられ、これらに制限されない。樹脂としては、合成樹脂であっても天然樹脂であってもよく、合成樹脂としては、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリイミド、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリスチレン、ポリウレタン、ABS樹脂、AS樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素樹脂などが挙げられるが、これらに制限されない。上記に挙げた合成樹脂のなかでは、ポリカーボネートが好ましい。
したがって、支持具10の厚みは特に制限されないが、支持具10が樹脂製又は金属製の場合、支持具10の厚みは0.01mm以上1mm以下に形成されること好ましく、0.1mm以上0.7mm以下に形成されることがより好ましく、0.3mm以上0.5mm以下に形成されることがさらに好ましい。
同一の体積当たりの熱容量を比較すると、通常、樹脂より金属の方が大きくなり、樹脂と金属を比較するならば、樹脂のほうがより好ましい。
本実施形態の中空糸凍結保存用具は、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は、耐低温性材料からなり、前記支持具は、中空糸を載置するための底部と、前記支持具の長手方向に沿って前記底部から立ち上がる側壁部とを有するものである。前記第1の実施形態の中空糸凍結保存用具と共通する点については説明を省略する。
中空糸の取扱いの容易さの観点から、支持具断面の底部と側壁部のなす角度(以下「立ち上がり角度」という。)は、0度超であり90度以下であることが好ましく、20度以上90度以下であることがより好ましい。図3(b)~(c)に示すような、支持具断面の底部が点である支持具の場合の立ち上がり角度は、二つの側壁部が形成する角度の二等分線に対して垂直であって、底部を通る直線に対する側壁部の角度をいう。なお、側壁部が曲線の場合の立ち上がり角度は、側壁部の端部と底部の中央部を結ぶ直線が底部となす角度をいう。
支持具の形状は、その断面形状がコの字状、U字状又はV字状が好ましい。断面形状がU字状や、V字状の場合には、支持具がほぼ側壁部から構成されるため、中空糸を載置した際に、中空糸が支持具10の底部ではなく側壁部のみに接触することとなってもよい。
本実施形態の中空糸凍結保存用具は、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は、耐低温性材料からなり、前記支持具は、中空糸を載置するための底部と、前記支持具の長手方向に沿って前記底部から立ち上がる側壁部とを有し、前記支持具に貫通孔が形成されているものである。前記第1及び第2の実施形態の中空糸凍結保存用具と共通する点については説明を省略する。
ここで、支持具に形成されている貫通孔Hが、中空糸が載置される中空糸側と該中空糸側の反対側とを貫通するように形成されていることにより、外部からの冷気又は熱が中空糸に直接伝わりやすくなるため、中空糸に包含される細胞をより迅速に冷却又は加熱することが可能となる。
本実施形態の中空糸凍結保存用具3に中空糸を載置する場合、支持具10の長手方向と中空糸の長手方向とがほぼ同じ方向となるよう、中空糸を支持具10に載置可能である。
図4に示されるように板状の支持具の板の厚み方向に貫通孔が形成されていることは、支持具に載置される中空糸に対して対向する向きに貫通孔が形成されていることが理解される。
本実施形態の中空糸凍結保存用具は、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は、耐低温性材料からなり、前記支持具は、中空糸を載置するための底部を有する。前記支持具には、載置される中空糸側と該中空糸側の反対側とを貫通する貫通孔が形成されている。前記第1~第3の実施形態の中空糸凍結保存用具と共通する点については説明を省略する。
本発明の細胞凍結保存方法は、本発明の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に細胞を包含する中空糸を載置する工程(工程A)と、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程(工程D)と、を有する。以下、本実施形態の細胞凍結保存方法について説明するが、本発明の細胞凍結保存方法は以下の実施形態に限定されない。
本実施形態の細胞凍結保存方法は、中空糸凍結保存用具の支持具に、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を載置する工程(工程A)と、前記工程Aの後に、前記中空糸が載置された支持具を保護容器に収容し(工程B)、前記内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程(工程C)と、前記工程A、B及びCの後に、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程(工程D)とを有する。なお、本発明の細胞凍結保存方法において、前記工程B及び工程Cは必須の工程ではない。
卵母細胞とは、卵子となる過程における前駆細胞をいう。初期胚とは、着床前の受精卵をいう。幹細胞としては、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞などが挙げられる。
細胞は、細胞塊や細胞組織の状態で中空糸の内部空間に包含されていてもよく、例えば、スフェロイドやオルガノイド、初期胚の状態であってもよい。スフェロイドとは、細胞が多数凝集して3次元状態になったものをいう。オルガノイドとは、細胞を制御された空間内に高密度に集積することにより自己組織化した細胞組織体をいう。
内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を得る方法は公知であり、例えば、特許第5051716号公報に記載の方法に沿って、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を得ることができる。
図6に示すように、中空糸凍結保存用具4の支持具10に、内部空間に生殖細胞31を包含し、凍結保存溶液に浸漬された中空糸30を載置する(工程A)。中空糸30は目視によりピンセットなどを用いて操作することができる。
前記工程Aの後に、前記内部空間に生殖細胞31を包含する中空糸30を冷却する(工程C)。図7に示すように、中空糸の冷却は、支持具10とその上に載置された中空糸30とを、予め冷却されている筒状の保護容器40内に導入する(工程B)ことで行う。筒状の保護容器40は、予め筒状の保護容器40の一部を液体窒素60が溜められた容器61に投入して、筒状の保護容器40内の気体を冷却して超低温の気相雰囲気としておく。
筒状の保護容器40内の超低温の気相雰囲気により、中空糸30内にガラス化溶液と共に包含されている生殖細胞31が凍結される。例えば、ヒトの細胞のように、容易に取得できず、細菌汚染の防止を抑制する観点からは、本実施形態に示すように、低温又は超低温の気相雰囲気中で中空糸を凍結させるか、中空糸を液体窒素蒸気に暴露させて凍結させることが好ましい。
保護容器40と支持具10とが一体となり、密閉状態とされた中空糸30は、フリーザー、液体窒素中又は液体ヘリウム中に凍結保存する(工程D)。
第2の実施形態の細胞凍結保存方法は、本発明の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を載置する工程(工程A)と、前記工程Aの後に、前記中空糸が載置された支持具を筒状の保護容器に収容する工程(工程B)と、前記工程Bの後に、前記内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程(工程C)と、前記工程A、B及びCの後に、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程(工程D)とを有する。
たとえば、前記支持具10に中空糸30を載置し、中空糸30が載置された支持具10を保護容器に収容した後に、支持具10とその上に載置された中空糸30とを収めた保護容器40ごと、液体窒素に投入して中空糸30を冷却し、その後、細胞を凍結保存してもよい。
第3の実施形態の細胞凍結保存方法は、本発明の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を載置する工程(工程A)と、前記工程Aの後に、前記内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程(工程C)と、前記工程Cの後に前記中空糸が載置された支持具を筒状の保護容器に収容する工程(工程B)と、前記工程A、B及びCの後に、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程(工程D)とを有する。
たとえば、中空糸凍結保存用具2を用いた場合を例示すると、前記支持具10に中空糸30を載置し、中空糸30が載置された支持具10を直接液体窒素に投入して中空糸を冷却して細胞を凍結させ(図9)、凍結後に中空糸30を筒状の保護容器50に収容し(図10)、その後、細胞を凍結保存してもよい。又は、中空糸30が載置された支持具10を液体窒素蒸気に暴露させて中空糸を冷却して細胞を凍結させ、凍結後に中空糸30を筒状の保護容器50に収容し、その後、細胞を凍結保存してもよい。
第4の実施形態の細胞凍結保存方法は、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程(工程C)と、前記工程Cの後に、本発明の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を載置する工程(工程A)と、前記工程C及びAの後に、前記中空糸が載置された支持具を筒状の保護容器に収容する工程(工程B)と、前記工程A、B及びCの後に、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程(工程D)とを有する。
たとえば、内部空間に生殖細胞を包含する中空糸を予め冷却して生殖細胞を凍結させた後、該中空糸を支持具に載置し、該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存しても構わない。
なお、第1~第4の実施形態の細胞凍結保存方法の説明において図7~11を参照し、中空糸凍結保存用具4又は中空糸凍結保存用具2を用いる場合を例示したが、本発明の細胞凍結保存方法において、中空糸凍結保存用具は、本発明の中空糸凍結保存用具であればよく、例えば、上記実施形態の中空糸凍結保存用具1や、中空糸凍結保存用具3を用いてもよい。
また、本発明の一実施形態として、本発明の中空糸凍結保存用具の、前記中空糸凍結のための使用を提供する。即ち、本発明の一実施形態として、中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は耐低温性材料からなる保存用具の、前記中空糸凍結のための使用を提供する。
保護容器の形状としては特に限定されず、丸筒状や角筒状などの筒状や、袋状などの形状が挙げられる。筒状の場合、先に例示した保護容器40,50のように、筒の一方の端が開口した開口部が形成され、他方の端が閉じられた試験管状の形状であることが、密閉性の観点から好ましい。袋状の場合も同様に、袋の一部に開口部が形成され、該開口部以外は閉じた形状であることが好ましい。特にヒトの細胞を凍結保存するような場合には、密閉性の観点から、保護容器の形状は、丸筒状や角筒状などの試験管状が好ましい。多数の中空糸を一度に密閉するような場合には、袋状が好ましい。
保護容器の開口部は、図8に例示したように、蓋体によって閉じられてもよく、図10に例示したように、中空糸凍結保存用具の挿嵌によって閉じられてもよい。また、図8に例示したように中空糸凍結保存用具全体が密閉されることで中空糸が密閉されてもよく、図10に例示したように中空糸凍結保存用具の一部が密閉されることで中空糸が密閉されてもよく、更には、支持具の一部が密閉されることで中空糸が密閉されてもよい。密閉性の観点から、中空糸凍結保存用具全体が密閉されることが好ましい。
また、柄20と支持具10および中空糸30全体を内包した状態でより容易に密閉するため、保護容器を柄20の外周縁の径よりも大きな内径を有する試験管状とし、柄20と支持具10および中空糸30を収容した後に、試験管状の保護容器51の開口部をヒートシールなどの手法により閉じることで、中空糸凍結保存用具全体を密閉してもよい(図11)。
Claims (9)
- 中空糸を載置するための長尺状の支持具を備え、前記支持具は、耐低温性材料からなる中空糸凍結保存用具。
- 前記支持具には、載置される中空糸側と該中空糸側の反対側とを貫通する貫通孔が形成されている請求項1に記載の中空糸凍結保存用具。
- 前記貫通孔が、前記支持具の長手方向の略中央に形成されている請求項2に記載の中空糸凍結保存用具。
- 前記支持具は、中空糸を載置するための底部と、前記支持具の長手方向に沿って前記底部から立ち上がる側壁部とを有する請求項1~3のいずれか一項に記載の中空糸凍結保存用具。
- 前記支持具が樹脂製又は金属製である、請求項1~4のいずれか一項に記載の中空糸凍結保存用具。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の中空糸凍結保存用具の前記支持具に、内部空間に細胞を包含する中空糸を載置する工程と、
該中空糸が該支持具に載置された状態で、該細胞を凍結保存する工程と、
を有する細胞凍結保存方法。 - 前記支持具に前記中空糸を載置する工程の後に、前記中空糸が載置された前記支持具を保護容器に収容する工程を有する請求項6に記載の細胞凍結保存方法。
- 前記支持具に前記中空糸を載置する工程の後に、前記中空糸を冷却して前記細胞を凍結する工程を有する、請求項6又は7に記載の細胞凍結保存方法。
- 前記細胞が生殖細胞及び/又は幹細胞である請求項6~8のいずれか一項に記載の細胞凍結保存方法。
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