JP7341847B2 - 凍結保存用治具の固定具 - Google Patents

Description

本発明は、凍結した細胞又は組織の融解時において好適に利用される凍結保存用治具の固定具に関する。

細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じたりすることから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

細胞又は組織の凍結保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

また、細胞又は組織の凍結保存方法として、ガラス化凍結法も知られている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。

前述した緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。これに対し、上記したガラス化凍結法では、操作の時間は短時間であり、特別な装置又は治具を必要としないプロセスである。加えて、ガラス化凍結法は、氷晶を生じさせないことによって高い生存率が得られる。

ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存方法については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。

適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結保存後の融解工程時においても、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。

適切なガラス化凍結を成し得るための重要な因子である凍結速度と融解速度のうち、特に重要なのは、融解速度とされている。例えば、非特許文献２に記載されるように、迅速に凍結された細胞であっても、融解速度が遅い場合には生存率が低くなることが知られている。また特許文献３には、凍結したサンプルを急速融解法により融解することで、融解後のヒトｉＰＳ細胞由来神経幹細胞／前駆細胞の生存率が向上することが記載されている。

一般に、ガラス化凍結法に関わる凍結方法としては、特許文献４において、哺乳動物胚または卵子を凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに十分な最少量のガラス化液で貼り付け、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却する方法が提案されている。該凍結方法の後に行われる融解方法は、前記した方法で保存した凍結保存用容器を液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３～３９℃の希釈液を注入し、凍結した胚または卵子を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウィルスや細菌に感染されるおそれがなく高い生存率で保存及び融解希釈することができるとされている。しかしながら、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子を貼り付ける工程の難易度が高く、確実に胚または卵子を凍結保存用容器に載置されたことを確認することが難しかった。

特許文献５では、熱伝導性部材を有した細胞保持部材と筒状収納部材を有した細胞凍結保存用具が記載されており、特許文献４の凍結融解方法における問題がある程度解決されている。特許文献５に記載されている凍結保存用具の使用方法として、顕微鏡下において、卵子を細胞保持部材に付着させ、細胞保持部材を筒状収納部材に収納した後に、液体窒素に浸漬してガラス化凍結する。その後に、筒状部材の開口部に蓋部材を装着し、液体窒素タンク内で保管する方法が記載されている。また特許文献６では、卵付着保持用ストリップ上に卵子を少量のガラス化液と共に載置し、凍結保存用治具全体を筒状の収納容器に収納した後に液体窒素に浸漬することで、ガラス化凍結が行われる。

よりプロセスの少ないガラス化凍結法に関わる凍結方法として、特許文献７、特許文献８に記載されるような、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ（登録商標）法という方法が開示されている。これら方法において凍結操作は、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを備えた卵凍結保存用具を使用し、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、卵子が付着したフィルムを液体窒素に浸漬することで、ガラス化凍結が行われる。そして凍結した卵子又は胚が載置された卵付着保持用ストリップはキャップ等で保護された後、液体窒素タンク内で保存される。

これらの方法によって凍結された卵子や胚などの融解は、卵付着保持用ストリップを保温された融解液に浸漬することによって行われ、該融解液中でストリップ上に載置された卵子や胚などは回収される。

他方、凍結保存方法における融解操作の作業性を高めるために、特許文献９に記載されるような液体窒素容器が知られている。該液体窒素容器はフタ部にスリット部が形成されており、筒状の収納部材に収納された凍結保存用治具は、該スリット部に一旦立てかけられる。

このようにして凍結された細胞又は組織を液体窒素の液面より下に位置する状態になるように一旦保持しておけば、例えば特許文献５や特許文献６に記載される方法においては、液体窒素の液面より上に位置する蓋部材を容易に取り外すことが可能となり、細胞又は組織を融解液中へ迅速に移動させることで、融解速度の低下を防ぐことができる。また特許文献７や特許文献８に記載される方法においては、該キャップから凍結保存用治具を引き抜くことで、細胞又は組織を融解液中へ迅速に移動でき、融解速度の低下を防ぐことができる。

特許第３０４４３２３号公報 特開２００８－５８４６号公報 特開２０１７－１０４０６１号公報 特開２０００－１８９１５５号公報 特許第５７９８６３３号公報 国際公開第２０１９／００４３００号パンフレット 特開２００２－３１５５７３号公報 特開２００６－２７１３９５号公報 米国意匠登録第６４２，６９７号公報

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０－１７２（１９９０） 僧都博著 「生細胞の凍結による障害と保護の機構」 化学と生物 第１８巻（１９８０）２号 Ｐ．７８～８７ 日本農芸化学会発行

しかしながら上記した特許文献９に記載される液体窒素容器を用いた方法では、フタ部に形成されたスリット部に凍結保存用治具を立てかけた際に安定に保持することは可能であっても、凍結保存用治具の載置部が液体窒素の液面よりも下に位置し、確実に細胞又は組織の凍結状態が維持されているかを確認することが困難であった。また筒状の収納部材の長さは、液体窒素容器の底部からフタ部が設置された位置までの長さよりも長い必要があり、このような場合、該筒状の樹脂部材の内部から細胞保持部材本体部を取り出す作業は煩雑であり、迅速な融解操作を行う観点で改善が望まれていた。

本発明は、細胞又は組織のガラス化凍結保存の融解操作時において、好適な作業性を実現するための固定具を提供することを主な課題とする。より具体的には、凍結保存用治具を安定に保持することが可能で、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、該細胞又は組織が確実に冷却された状態にあることを容易に確認でき、また凍結された細胞又は組織を、保温された融解液中に迅速に移すことが可能な凍結保存用治具の固定具を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する凍結保存用治具の固定具（以下、「本発明の固定具」ともいう。）によって、上記課題を解決できることを見出した。

上面、側面及び底面を有する基材からなる凍結保存用治具の固定具であって、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を基材の上面に有し、該スリット部内部の側面に凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部を少なくとも有することを特徴とし、該凹凸構造部は、凍結保存用治具が有する筒状の収納部材の先端部が有する凹凸構造部、あるいはキャップ部材の先端部が有する凹凸構造部がはまり込む構造部である、凍結保存用治具の固定具。

本発明によれば、凍結保存用治具を安定に保持することが可能であり、かつ凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、該細胞又は組織が確実に冷却された状態にあることを容易に確認可能な、凍結保存用治具の固定具を提供することができる。また本発明の固定具によれば、凍結された細胞又は組織を保温された融解液中に迅速に移すことが可能となる。

本発明の固定具の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具が有する凹凸構造部の一例を示す側面概略図である 本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。 本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。 本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。 本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。 本発明の固定具の別の一例を示す側面概略図である。 本発明の固定具を用いて凍結保存用治具を固定した状態の一例を示す概略図である。 本発明の固定具を用いて凍結保存用治具を固定した状態の別の一例を示す概略図である。 本発明の固定具を用いて凍結保存用治具の本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬した状態を示す概略図である。

本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存用治具を固定するために用いられるものである。また本発明の固定具は、細胞又は組織をいわゆるガラス化凍結保存法において凍結保存する際に、好適に用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明の固定具は卵子又は胚の凍結保存において、特に好適に用いることができる。

本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定具、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定用具、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定器具、細胞又は組織の凍結保存用具の固定具、細胞又は組織の凍結保存器具の固定具と言い換えることができる。

以下に本発明の固定具について詳細に説明する。

本発明の固定具は上面（天面）、側面及び底面を有する基材からなり、基材の上面には、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を有する。即ち、基材の上面に溝状構造を有する。基材の側面部にある該スリット部の開口位置から、凍結保存用治具が有する凹凸構造部（例えば前述した筒状の収納部材の先端部が有する凹凸構造部、あるいはキャップ部材の先端部が有する凹凸構造部）を、該スリット部に沿わせる形態で挿入し、凍結保存用治具を固定する。

本発明の固定具が有する、凍結保存用治具を固定・保持するためのスリット部は、基材上面の１ヶ所に有していても良いし、複数ヶ所に有していても良い。

本発明の固定具が有するスリット部は、該スリット部の内部の側面に、凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部を有する。該凹凸構造部には、前述した凍結保存用治具が有する凹凸構造部がはまり込むことで、凍結保存用治具を確実に固定することができる。スリット部が有する凹凸構造部は、スリット部内部の側面において、固定具の底面に平行な方向に凹凸構造部の凹部及び／または凸部が延びた形状であることが好ましい。

本発明の固定具が有する凹凸構造部は、固定される凍結保存用治具の先端部の形状、好ましくはキャップ部材の先端部の形状に合わせて、任意の形状の凹型構造及び／または凸型構造を有することができる。また、固定具が有する凹凸構造部の断面形状は、固定される凍結保存用治具の先端部の凹凸構造部の断面形状と同じ形状であることがより好ましい。

本発明の固定具が有する凹凸構造部は、前記した少なくとも片端が開口したスリット部内部の側面の少なくとも一ヶ所に有していれば良い。凍結保存用治具の固定安定性を高める観点から、該スリット部内部の互いに向かい合った側面の両面に凹凸構造部を有していることがより好ましい。ここで互いに向かい合った側面の両面とは、本発明の固定具を上方から見た際の上面概略図において、互いに向かい合っている側面の両面を意味する。なおこれら側面の両面に位置するスリット部は連続して繋がっていても良い。

本発明の固定具の形状（基材にスリット部が設けられていないとみなした際の概略形状）は、三角柱、四角柱、六角柱等の角柱構造の他、上面を設けた三角錐、四角錐等の角錐の部分構造が挙げられる。好ましくは、角柱構造であり、より好ましくは四角柱構造である。また、上記した以外にも円柱構造や円錐構造も例示することができる。

本発明において基材は液体窒素耐性材料で形成されることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、さらにはガラス、ゴム素材などを好適に用いることができる。特に金属は、優れた耐久性を有することに加えて、自重が大きく、凍結保存用治具を良好に固定できる観点から好ましい。中でも加工性の観点からアルミが好ましい。本発明の固定具は、一種類の素材から構成されていても良いし、複数の素材から構成されていても良い。

次に、本発明の固定具を用いた凍結融解方法について詳細に説明する。

本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスにおいて、特に、液体窒素タンクから一旦取り出された後の保冷操作、及び細胞又は組織を融解する際の融解操作において好適に用いることができる。一般に、細胞又は組織をいわゆるガラス化凍結法で保存する際、短冊状のストリップを有する凍結保存用治具を用いて凍結保存が行われる。このような凍結保存用治具は、前述した特許文献７、特許文献８以外にも例えば、国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット、国際公開第２０１５／０６４３８０号パンフレット等において開示されている。凍結保存～融解の一連のプロセスとしては、第一に、凍結保存用治具のストリップに、平衡化処理のなされた細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させ、次いで液体窒素を用いて細胞又は組織を冷却し、凍結操作を行う。第二に、凍結操作を行った細胞又は組織を極低温の環境を保ったまま、長期間保存する保冷操作を行う。第三に、凍結された細胞又は組織を、極低温の環境からいわゆる融解液と呼ばれる溶液中に移し、融解液中で融解・解凍する融解操作を行う。本発明の固定具は、前記した保冷操作及び融解操作において、液体窒素中で凍結保存用治具を固定・保持するために好適に用いることができる。

本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスで、細胞又は組織が液体窒素に接触しない、いわゆる閉鎖型の凍結保存～融解のプロセスに好ましく用いることができる。

閉鎖型の凍結保存～融解のプロセスでは、凍結操作の際に、ストリップに対し細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させた後に、端部が完全に閉塞された筒状の収納部材により凍結保存用治具を被包し、外界から遮断する。あるいはストリップに対し細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させた後に、キャップ部材により該ストリップを被包し、外界から遮断する。かかる遮断の後、該凍結保存用治具を液体窒素に浸漬して、細胞又は組織を冷却・凍結する。前記した閉鎖型の凍結操作及び保管等の際には、筒状の収納部材あるいはキャップ部材を介して、細胞又は組織周辺の空気及び保存液が冷却され、ガラス化状態が維持される。

本発明の固定具を用いた閉鎖型の凍結保存～融解のプロセスにおける融解操作では、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、前記した筒状の収納部材の先端部、あるいはキャップ部材の先端部が有する凹凸構造部を、本発明の固定具が有するスリット部内部の側面に有する凹凸構造部にはめ込むことで、凍結保存用治具を固定する。このように固定することで、細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方になる位置に固定することが可能となり、かつ細胞又は組織は液体窒素に触れず、液体窒素を介して汚染されることはない。

その後、液体窒素の液面上に位置する筒状の収納部材に固定された蓋を取り外すことで、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を、液体窒素に触れることなく迅速に取り出し、融解液中に浸漬することができる。あるいは凹凸構造部により固定されているキャップ部材から、細胞又は組織が載置されたストリップを有する凍結保存用治具を引き抜くことで、細胞又は組織を液体窒素に触れることなく迅速に取り出し、融解液中に浸漬することができる。より迅速な操作が可能になるとの観点から、後者の方法が好ましい。

上記した操作により融解液中に浸漬された細胞又は組織は、筒状の収納部材より蓋部材が取り外されてから５分以内に融解液に浸漬することが好ましく、より好ましくは１分以内である。またキャップ部材から細胞又は組織が載置されたストリップを有する凍結保存用治具を引き抜くにあたり、一旦嵌合が緩められてから、５分以内に融解液に浸漬することが好ましく、より好ましくは１分以内である。筒状の収納部材から蓋部材を取り外してから、あるいは凍結保存用治具を引き抜く際のキャップ部材との嵌合が緩められてから等の、いわゆる密閉状態が開放された期間が長い場合、空気中の窒素や酸素等の気体が、筒状の収納部材内、あるいはキャップ部材内に入り込み、次いで冷却されて、液化することがある。上記した時間が長い場合、液化された気体が載置部に付着し、融解操作の際に融解液中に持ち込まれ、融解液の温度を下げる場合がある。

本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスで、細胞又は組織が液体窒素に接触する、いわゆる開放型の凍結保存・融解のプロセスにも用いることができる。開放型のプロセスにおいても、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、本発明の固定具を用いて、凍結保存用治具を固定・保持しておくと、細胞又は組織を液体窒素中から融解液に迅速に移すことができるため、好ましい。

以上、本発明の固定具を用いた凍結融解方法について説明した。次に、本発明の固定具について、図面に沿ってさらに詳細に説明する。

図１は、本発明の固定具の一例を示す上面概略図である。図１において、固定具１は、基材２０の上面に凍結保存用治具が挿入される溝状構造であるスリット部２を１ヶ所有している。スリット部２は一方が基材２０の側面部にスリット開口部４で開口しており、もう一方は上面の中央部側で閉塞している。そして、スリット部２は凍結保存用治具を固定するために、その内部の側面に凹凸構造部３を有する。なお、図１には凸型の凹凸構造部３を図示している。図示しない凍結保存用治具をスリット部２に挿入する際には、凍結保存用治具をスリット開口部４の側からスリット部２に沿って基材上面の中央部に向かって挿入する。

図１に示すＴ１は固定具１のスリット部２の長さ（奥行）を示す。Ｔ１は、凍結保存用治具を挿入後に保持できる長さであれば特に制限されないが、前述したクライオトップ法により細胞又は組織を凍結及び融解する場合、Ｔ１は３～５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５～４０ｍｍである。なお以下の説明において記載する、固定具１の各寸法はいずれも、クライオトップ法による凍結及び融解作業を意図した寸法である。

図１に示すＴ２は固定具１のスリット部２の幅方向の長さを示す。本発明においてＴ２は凍結保存用治具を挿入し、固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、１～１０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２～５ｍｍである。

図１に示すＴ４は、固定具１のスリット部２が有する凹凸構造部３により狭まった部分の幅方向の長さを示す。本発明においてＴ４は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、０．５～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．５～４ｍｍである。

図２は、本発明の固定具（図１の固定具）が有する凹凸構造部の一例を示す側面概略図である。図２において固定具１は、基材２０の上面（天面）に凍結保存用治具が挿入されるスリット部２を有し、スリット部２は凍結保存用治具を固定するために、その内部の側面に凹凸構造部３を有する。図２の固定具が有する凹凸構造部３は、凸型構造である。図１と同様に、スリット部２の幅方向の長さをＴ２として、スリット部２が有する凸型の凹凸構造部３により狭まった部分の幅方向の長さをＴ４としてそれぞれ示した。

図２に示すＴ３は、固定具１のスリット部２の深さ方向の長さを示す。本発明においてＴ３は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、３～５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５～２０ｍｍである。

図３は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図３において固定具１が有するスリット部２は、凍結保存用治具を固定するため、その内部の側面に凹凸構造部３を有する。図３の固定具が有する凹凸構造部３は凹型である。

図３に示すＴ５は固定具１のスリット部２が有する凹型の凹凸構造部３により拡張された幅方向の長さを示す。Ｔ５は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、本発明においてＴ５は２～１１ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２．５～５．５ｍｍである。図３に示すように、凹型の凹凸構造部３を有する場合、凹型の凹凸構造部３により拡張された幅方向の長さＴ５は、スリット部２の幅方向の長さＴ２よりも大きくなる。

図４は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図４において固定具１が有するスリット部２は、凍結保存用治具を固定するため、スリット部２の内部の側面に、複数の凸型構造を凹凸構造部３として有する。このような構造を有する固定具を用いると、凍結保存用治具をより確実に固定・保持することができる。図４に示したスリット部２が有する凸型の凹凸構造部３により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は、複数の凸型構造において同一である必要はなく、それぞれで異なる長さであっても良い。

図５は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図５において固定具１が有するスリット部２は、凍結保存用治具を固定するため、その内部の側面に、凸型構造の凹凸構造部３ａと凹型構造の凹凸構造部３ｂを有する。

図６は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図６において固定具１が有するスリット部２は、凍結保存用治具を固定するため、スリット部２の内部の片側の側面のみに、凸型構造の凹凸構造部３を１ヶ所有する。このような形状の固定具を用いると、凍結保存用治具を固定具のスリット部２に沿わせて挿入する際の作業が容易である。なお、図２～図６においては基材側面の形状のみを示しており、スリット内部に見える閉塞面などは省略している。

図７は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図７において、固定具１は、基材２０の上面に、それぞれ異なる側面部にスリット開口部４を有する２つのスリット部２を有する。個々のスリット部２は、凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部３を有する。図７の固定具では、図示しない複数の凍結保存用治具をそれぞれのスリット部２が有するスリット開口部４からスリット部２に沿って挿入し、複数の凍結保存用治具を固定・保持することができる。

図８は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図８において、固定具１は、基材２０の上面に、同一の側面部にスリット開口部４を有する独立したスリット部２を２つ有する。個々のスリット部２は、凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部３をそれぞれ有する。図示しない凍結保存用治具をそれぞれのスリット部２が有するスリット開口部４からスリット部２に沿って挿入し、複数の凍結保存用治具を固定・保持することができる。本実施形態では複数のスリット部２が基材２０の同一の面にあるため、良好な作業性が得られ、好ましい。

図９は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図９において、固定具１は、基材２０の上面に、複数の独立したスリット部２を有する。スリット部２は、それぞれ、凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部３を有する。本実施形態によれば、基材２０の上面により多くのスリット部２が設けられているため、一度に数多くの凍結保存用治具を固定・保持することができる。

図１０は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１０において、固定具１は、基材２０の上面に凍結保存用治具が挿入されるスリット部２を１ヶ所有し、該スリット部２は凍結保存用治具を固定するための、凹凸構造部３を有する。図１０において凹凸構造部３は、スリット部２の内部の互いに向かい合った側面の両面に加え、スリット２の内部の奥側の面にも凹凸構造部３を有している。このため３方向から図示しない凍結保存用治具を保持することから、より強固な固定・保持が可能となり、好ましい。

図１１は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１１において、固定具１は、途中で９０度曲がった形状のスリット部２を有する。このような形状の固定具を用いると、スリット開口部４から凍結保存用治具をスリット部２に挿入し、９０度曲がった先まで凍結保存用治具を押し込むことで、固定・保持した凍結保存用治具がスリット開口部４から不意に脱落することを防止できるので好ましい。

図１２は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１２において、固定具１が有するスリット開口部４は、スリット部２の幅よりも広く開口しているため、凍結保存用治具を挿入する際の作業性に優れる。

図１３は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１３において、固定具１が有するスリット部２の幅方向の長さＴ２は、スリット開口部４から挿入方向に進むにつれ、徐々に減少する構造となっている。一方、スリット部２の内部の両側面に形成された凸型の凹凸構造部３により狭まった幅Ｔ４は一定である。図１３に示す固定具１を用いると凹凸構造部３に沿って挿入された凍結保存用治具は、凹凸構造部３に加えて、奥に挿入するほど幅が狭まるスリット部２の壁面によっても固定されることから、より強固な固定・保持が可能となる。

図１４は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１４において、固定具１が有するスリット部２の幅方向の長さＴ２は、スリット開口部４から挿入方向に進むにつれ、徐々に減衰する構造となっている。また、図１４に示す固定具１のスリット部２の内部の両側面に形成された凸型の凹凸構造部３により狭まった幅Ｔ４も、Ｔ２と同様に、スリット開口部から挿入方向に進むほど、徐々に狭まった構造となっている。図１４に示す固定具１を用いると凹凸構造部３に沿って挿入された凍結保存用治具をより強固に固定・保持することが可能となる。

図１５は、先に示した図１０と同様、スリット部２の内部の側面の３方向から図示しない凍結保存用治具を保持することができるが、凹凸構造部３は、互いに向かい合った側面の両面に加え、スリット２の内部の奥側の面で半円形の凹凸構造部３で接続されているため、図示しない凍結保存用治具の固定部位の断面形状が円形である場合、特に強固な固定・保持が可能となり、好ましい。

図１６は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１６において、固定具１は、凹凸構造部３を有する１つのスリット部２に対して、スリット開口部４を２ヶ所有する。図１６のような形状であると、図示しない凍結保存用治具をスリット部２の両端どちらからでも挿入できるため、作業性に優れた固定具が得られる。

図１７は、本発明の固定具の別の一例を示す側面概略図である。図１７において固定具１はスリット部２の内部の側面に凸型構造からなる凹凸構造部３を有する他、空洞構造部５を有する。固定具１が空洞構造部５を有すると、固定具１が有する熱的な容量が抑制され、固定具１を液体窒素に浸漬した際に、液体窒素の揮発量を抑えられるため、好ましい。

次に、本発明の固定具を用いた、細胞又は組織の凍結、融解方法について説明する。

本発明において、載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉した後、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持し、その後、該細胞又は組織を融解する際に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織は、冷却溶媒の液面よりも下方に位置させ、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持することは、本体部材とキャップ部材を素早く分離し、載置部を融解液中に迅速に浸漬できるため、好ましい。

また、上記した載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具に代えて、卵子や胚等が付着可能な細胞保持部材を有し、該細胞保持部材を筒状収納部材に収納した凍結保存用治具を利用して、卵子や胚等を冷却溶媒の液面よりも下方に位置させ、筒状収納部材の一端が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持した場合、冷却溶媒の液面よりも上方に位置する筒状収納部材に装着された蓋部材を取り外すことにより、本体部材が有する載置部を、融解液中に迅速に浸漬できるため、好ましい。

図１８は、前者の状態における、本発明の固定具を用いて凍結保存用治具を固定した状態の一例を示す概略図である。図１８において凍結保存用治具６は本体部材７と、該本体部材７に着脱自在なキャップ部材８を少なくとも有する凍結保存用治具６のストリップ９に、極少量の保存液１１と共に細胞１０が載置されている。

極少量の保存液１１と共に細胞１０が載置されたストリップ９は、キャップ部材８で密閉されており、該ストリップ９に載置された細胞１０は液体窒素１３の液面１４よりも下方に位置することで冷却され、凍結された細胞１０は凍結状態が維持されている。凍結された細胞１０を融解する際には、キャップ部材８と本体部材７の接合部１２が、液体窒素１３の液面１４よりも上方に位置するため、本体部材７をキャップ部材８から素早く引き抜き、分離することが可能であり、載置部を融解液中に迅速に浸漬できるため、好ましい。また本発明の本体部材６を用いれば、液面１４の位置を作業者は把握しやすく、作業性が向上する。

図１９は、本発明の固定具を用いて凍結保存用治具を固定した状態の別の一例を示す概略図である。図１９において固定具１は液面ゲージ１６を有しており、該ゲージ１６は上限マーキング部１７と下限マーキング部１８を有する。液体窒素１３の液面１４が、該上限マーキング部１７と該下限マーキング部１８の間に位置している。このように固定具１の液面ゲージ１６を利用して液面１４を管理すれば、凍結された細胞又は組織の不意な融解を防止できるため、好ましい。

次に、本発明の固定具を用いて固定される凍結保存用治具について説明する。

本体部材７が有するストリップ９は、短冊状であることが好ましい。短冊状であると該ストリップ９をキャップ部材あるいは筒状収納部材に収納することが容易であり、好ましい。

本発明において凍結保存用治具が有するストリップ９としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また、ストリップ９の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。

またストリップ９としては、熱伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ～１０ｍｍであることが好ましい。また目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面を、例えばコロナ放電処理のような電気的な方法や、あるいは化学的な方法により親水化することもでき、さらには粗面化することも可能である。

また上記したストリップ９としては保存液吸収体を用いることもできる。ストリップ９に保存液吸収体を用いると、余分な保存液１１を効果的に除去することができるため、凍結速度が向上する。保存液吸収体としては、例えば金網、紙等や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが例示される。その他の保存液吸収体として、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体が例示される。該多孔質構造体により、細胞１０の周囲に存在する保存液１１を効率的に除去することができる。また、透過型の光学顕微鏡観察下において、細胞１０を載置し凍結する操作及び凍結後に融解する操作を、良好な視認性にて容易かつ確実に行うことができる。

上記した多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳ Ｋ ００６２：１９９２、ＪＩＳ Ｋ ７１４２：２０１４に準じて測定できる。多孔質構造体を形成する屈折率が１．４５以下の素材としては、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリビニリデンジフロライド樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂などのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料が挙げられる。

多孔質構造体による保存液吸収体の細孔径は５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。これにより光学顕微鏡観察下における細胞又は組織の視認性を高めることができる。保存液吸収体の厚みは、１０～５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５～１５０μｍである。なお、保存液吸収体の細孔径は、プラスチック樹脂材料の多孔質構造体の場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また金属酸化物あるいは無機材料の多孔質構造体の場合には、該多孔質構造体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。

保存液吸収体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称 Ａｕｔｏｐｏｒｅ ＩＩ ９２２０ 製造者 ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ^２）
Ｔ：厚み（μｍ）

本発明において凍結保存用治具が有するキャップ部材８あるいは上述した筒状の収納部材は、例えば、各種樹脂、金属等の液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材を用いて形成することができる。キャップ部材は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂は射出成型等のプロセスにより、テーパー構造やねじ切り構造を容易に形成できるため、好ましい。樹脂の具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂が挙げられる。また、キャップ部材の全光線透過率が８０％以上であると、キャップ部材を篏合後に、キャップ内部の載置部の様子を容易に確認することができるため好ましい。

本発明において凍結保存用治具が有する本体部材７は、作業性の観点から把持部を有することが好ましく、その場合、把持部は、把持のしやすさや、操作性の向上を目的として、角柱状であることが好ましい。該把持部は、液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材により形成された部材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミニウム、鉄、銅、ステンレスなどの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。

本発明の固定具を用いて細胞又は組織を融解する場合、保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有する保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。融解液についても、通常卵子、胚等の細胞の融解のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に、浸透圧調整のために１Ｍのスクロースを含有する融解液を使用することができる。

本発明において凍結保存及び融解される細胞としては、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、***等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存・融解することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
アルミを用いて金属切削加工により、図１及び図２に示す、１ヶ所のスリット部２に凸型の凹凸構造部３を有する形態の実施例１の固定具を作製した。なお、スリット部の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部２の長さＴ１は基材２０の側面部から１０ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。凹凸構造部はスリット部の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凸型の凹凸構造部３により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍである。

（実施例２）
アルミを用いて金属切削加工により、図１３に示す、１ヶ所のスリット部２に凸型構造を凹凸構造部３として有し、スリット開口部から挿入方向に進むほど、スリット部２の幅Ｔ２が徐々に狭まった構造となっている形態の実施例２の固定具を作製した。なお、スリット部２の長さＴ１は基材２０の側面部から１０ｍｍであり、スリット部２の深さＴ３は１０ｍｍである。スリット部の幅Ｔ２はスリット開口部４で４ｍｍであり、スリット開口部４から挿入方向に向かって、基材上面中央部側のスリット部２の閉塞部で３ｍｍまで一定に減少する構造とした。凹凸構造部の幅Ｔ４は２．７ｍｍで一定とした。

（実施例３）
アルミを用いて金属切削加工により、図６に示す、スリット部の内部の片側の側面にのみ凸型構造の凹凸構造部を有する形態の実施例３の固定具を作製した。なお、スリット部の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部の長さＴ１は基材２０の側面部から１０ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。凹凸構造部はスリット部の内部の側面から０．２５ｍｍの凸型構造であり、１ヶ所の凸型構造の凹凸構造部３により狭まった部分の長さＴ６は２．９５ｍｍである。

（実施例４）
ＡＢＳ樹脂を用いて積層型の３Ｄプリンターで加工を行った以外は実施例１と同様にして実施例４の固定具を作製した。

（実施例５）
ＡＢＳ樹脂を用いて積層型の３Ｄプリンターで加工を行い、図１１に示す形態のスリット部の内部の側面に凸型の凹凸構造部３を有する実施例５の固定具を作製した。なお、スリット部２の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。スリット部２の長さは挿入方向から２０ｍｍ直進した後に９０度右側に向きを変えて１０ｍｍ直進した形態とした。凹凸構造部３はスリット部２の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凹凸構造部の幅Ｔ４は２．７ｍｍである。

＜凍結保存用治具の固定具合の評価＞
実施例１～５の固定具について、凍結保存用治具の固定具合を評価するために、図１８に図示されるような凍結保存用治具を作製した。凍結保存用治具は、短冊状（幅１．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚み１９０μｍ）のポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムをストリップ９とし、ＡＢＳ樹脂の把持部と接着し本体部材７を作製した。キャップ部材８をＡＢＳ樹脂で作製した。キャップ部材８の外形は３．１ｍｍの四角柱であり、先端部近くに０．３ｍｍの深さの凹部を有する構造である。上記凍結保存用治具を用いて、平衡化処理したマウス８細胞期胚を保存液０．１μＬと共に、透過型顕微鏡下で滴下付着させた。なお、保存液は、シグマアルドリッチ社製 Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、１７質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。次いで、透過型顕微鏡下で、載置部を含むストリップをキャップ部材に挿入し、その後液体窒素に浸漬して凍結操作を行った。保冷操作の後に、液体窒素下で、上記凍結保存用治具のキャップ部材側を、キャップ部材の先端部が有する凹部が凍結保存用治具が有する凹凸構造部にはまり込む状態で、実施例１～５の固定具のスリット部に挿入し、図１８に示す形態で、固定・保持した際の様子を以下の基準で評価した。これらの結果を表１に示す。

◎：強固に固定ができ、安定感があった。
○：安定して固定ができた。
△：固定ができたが、やや不安定であった。

＜融解操作時の作業性の評価＞
上記の「凍結保存用治具の固定具合の評価」と同様の方法により、図１８に示す形態で、実施例１～５の固定具を用いて凍結保存用治具をそれぞれ固定・保持した。その後、図２０に示す形態のように、凍結保存用治具の本体部材とキャップ部材を分離する際の作業性を評価したが、実施例１～５の固定具はいずれも迅速な融解操作が可能であり、高い作業性を有することが示された。また実施例１～５の固定具を用いた融解作業では、細胞又は組織が液体窒素中に位置することを容易に確認できた。

上記の結果から、本発明の固定具を用いると、細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、凍結保存用治具を安定的に固定・保持することが可能である。本発明の固定具を用いて、凍結保存用治具を固定・保持すると、細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、凍結保存用治具を固定・保持した際に、凍結保存用治具のストリップ上に載置された細胞又は組織が確実に液体窒素の液面よりも下に位置することを容易に確認できることに加え、迅速な融解操作を行うことが可能であることが分かる。

本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存及びその融解に用いることができる。

１ 固定具
２ スリット部
３ 凹凸構造部
４ スリット開口部
５ 空洞構造部
６ 凍結保存用治具
７ 本体部材
８ キャップ部材
９ ストリップ
１０ 細胞
１１ 保存液
１２ 接合部
１３ 液体窒素
１４ 液面
１５ 凍結容器
１６ 液面ゲージ
１７ 上限マーキング部
１８ 下限マーキング部
１９ 融解液
２０ 基材

Claims (1)

1. 上面、側面及び底面を有する基材からなる凍結保存用治具の固定具であって、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を基材の上面に有し、該スリット部内部の側面に凍結保存用治具を固定するための凹凸構造部を少なくとも有することを特徴とし、該凹凸構造部は、凍結保存用治具が有する筒状の収納部材の先端部が有する凹凸構造部、あるいはキャップ部材の先端部が有する凹凸構造部がはまり込む構造部である、凍結保存用治具の固定具。