JP5813630B2 - 微量ヒト血漿タンパク質バイオマーカーの新規なパネルを使用した肝線維症の臨床診断 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年５月１４日に出願された米国仮出願第６１／１７８，３３４号からの優先権を主張するものである。

本出願は、極微量肝臓瘢痕化バイオマーカーの新規なパネルを標的とする抗体のパネルを使用した、肝線維症または硬変症を診断するための方法に関する。これらの新規なタンパク質は、肝炎、肝細胞癌（ＨＣＣ）のバイオマーカー、および肝臓瘢痕化、肝炎およびＨＣＣの薬剤標的としても働き得る。

肝線維症。肝線維症（肝臓の線維症）は、肝臓における瘢痕組織（すなわち、細胞外マトリクス）の過剰な蓄積によって特徴付けられる創傷治癒応答である。組織の正常な構造要素が、過剰量の非機能性瘢痕組織に置換される。肝針生検は線維症を診断および評価するための主なツールであるが、患者の不快感、痛み、出血、および稀な場合は死亡を含めた、この技術に対するいくつかの文書で十分に立証された制約および不利点が存在する。さらに、線維症が肝臓全体で均質ではない場合、生検は信頼できない可能性がある。肝線維症は、アルコールおよびウイルスを含めた様々な要因によって引き起こされる可能性がある。

硬変症（cirrhosis）。肝硬変は肝臓瘢痕化の最も重症な形態であり、肝線維症と異なり、不可逆性および結節性であると一般に考えられる。硬変症は英国では毎年６０００例を超える死亡、および米国では約２７，０００例の死亡の原因であり、９番目に多い死因となっている（ＭａｃＳｗｅｅｎら、（２００２）、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ、第４版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。硬変症はＨＣＣの主な危険因子であり、肝臓癌のこの段階では、唯一の治療手法は肝臓移植である。ウイルス誘発性肝臓癌の場合、肝臓瘢痕化およびＨＣＣが移植後に再発する可能性がある。不可逆性硬変症を予防することができるように、可逆性肝臓瘢痕化の初期段階で繊維症を診断することは必須である。

Ｃ型肝炎ウイルス。世界中で約１億７千万人、すなわち世界の人口の３％（例えば、ＷＨＯ、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．１９９９；６：３５〜４７参照）、および米国における約４百万人の人々がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ＨｅｐＣ）に感染している。ＨＣＶは肝線維症および硬変症の主な原因である。ＨＣＶに急性感染した約８０％の個体は慢性感染状態になる。したがって、ＨＣＶは慢性肝炎の主な原因である。慢性感染後、治療を行わずにウイルスが除去されることはほとんどない。稀な場合、ＨＣＶ感染は臨床上急性の疾患およびさらには肝不全を引き起こす。慢性ＨＣＶ感染は個体間で劇的に異なる可能性があり、臨床的に重要でないまたはわずかな肝臓疾患を有し合併症を発症することはない個体もいれば、臨床的に明らかな慢性肝炎を有し、続いて肝線維症および硬変症を発症し得る個体もいる。肝炎を発症しＨＣＶを有する個体の約２０％は末期の肝臓疾患を発症し、原発性肝癌を発症する高いリスクを有する。

患者の肝線維症および硬変症を診断する改良された方法が必要である。

本発明は、線維症および硬変症を検出するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、線維症および硬変症を検出および評価する方法であって、（ａ）患者から得た生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドのレベルを決定するステップ、および（ｂ）前記線維症の陽性または陰性診断を決定するために前記（ａ）のレベルを前記ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの対照レベルと比較するステップを含む方法を提供する。これらのバイオマーカーは、肝線維症、腎線維症、心筋線維化、皮膚線維化、膵線維化などの線維症を示す任意の疾患に適用することができるが、特定の実施形態では、線維症は肝線維症である。本発明は、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ、アディポネクチン、アファミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、完全／切断型補体Ｃ３ｄｇ、コルチコステロイド結合グロブリン、フィブリノゲンガンマ鎖、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＪ鎖、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質、脂質輸送阻害剤タンパク質、レチノール結合タンパク質４、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、性ホルモン結合グロブリンおよび亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質からなる群からポリペプチドを選択する。これらのバイオマーカーは、特にアルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４断片、アルファ１アンチキモトリプシン、アポリポタンパク質Ｌ１、プレアルブミン、アルブミン、ＣＤ５抗原様タンパク質のアイソフォーム、ベータ２糖タンパク質Ｉ、アルファ２マクログロブリンおよび免疫グロブリン成分、ハプトグロビンのアルファ１、アルファ２およびベータ鎖、補体成分（Ｃ３、Ｃ４および因子Ｈ関連タンパク質１）、アディポネクチン、ＡｐｏＥ、プロトロンビン、クラステリン、およびアンギオテンシノーゲンを含めた、ＷＯ／２００８／０３１０５１中のポリペプチドと共に使用することができる。他の実施形態では、線維症はＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの示差的制御を含む。他の実施形態では、試料は血清または血漿から得る。

別の実施形態では、本発明は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを検出するための方法であって、ａ）線維症または硬変症を有する患者から生体試料を単離するステップ、ｂ）線維症を有さない患者から生体試料を単離するステップ、ｃ）２Ｄ−ＰＡＧＥを使用してａ）およびｂ）の試料を分析するステップ、およびｄ）２Ｄ−ＰＡＧＥの結果を比較して線維症または硬変症を有する患者と有さない患者の間で示差的発現を有するポリペプチドを同定するステップを含む方法を提供する。２Ｄ−ＰＡＧＥを使用するとき、ｐＨ３〜１０、ｐＨ３〜１１またはｐＨ４〜７などの一般に使用される広いｐＨ範囲を使用してバイオマーカーを検出することができる。極微量バイオマーカーは、これらには限られないが、ｐＨ３〜５．６、ｐＨ３〜６、ｐＨ３．９〜５．１、ｐＨ４．７〜５．９、ｐＨ５〜８、ｐＨ５．３〜６．５、ｐＨ５．５〜６．７、ｐＨ６〜１１、ｐＨ６．２〜７．５、ｐＨ６．３〜８．３、ｐＨ７〜１０、ｐＨ７〜１１、ｐＨ３．５〜４．５、ｐＨ３〜７、およびｐＨ６〜９などの、ｐＨ３〜１１間の任意の狭いｐＨ範囲を使用して検出することができる。これらの狭いｐＨ範囲を含む２Ｄ−ＰＡＧＥゲルを使用して、他の疾患における新規なバイオマーカーおよび薬剤標的を同定することもできる。

別の実施形態では、本発明は、線維症の重症度を測定するための方法であって、ａ）患者から得た生体試料中の少なくとも１つのＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドのレベルを決定するステップ、およびｂ）前記患者の生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの前記レベルを、線維化なしから硬変までの範囲の患者集団中の前記ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの予め決定されたレベルと比較するステップを含む方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを特異的に検出するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質を含む、未治療個体におけるおよび治療の経過中の線維症の予後評価に有用であるキットを提供する。特定の実施形態では、作用物質はＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドと結合する抗体またはその機能的等価物である。これらの抗体を使用して、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法、ネフェロメトリーなどのイムノアッセイを実施することができる。これらには限られないが、質量分析を使用した多重反応モニタリングなどの非抗体手法を使用して、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを定量化することも可能である。キットは、予後評価指標として有用な別の遺伝子または遺伝子産物を特異的に検出するための少なくとも１つの標的をさらに含むことができる。

別の実施形態では、本発明は、線維症の予後評価を決定する方法であって、（ａ）患者から得た生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドのレベルを決定するステップ、および（ｂ）前記線維症の陽性または陰性診断を決定するために前記（ａ）のレベルを前記ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの対照レベルと比較するステップを含む方法を提供する。

図１〜４は、主な新規バイオマーカーの発現において観察された変化を示す。それぞれの画像は、同定タンパク質の相対位置を丸で囲んだ２Ｄ−ＰＡＧＥゲルの拡大領域を示す。代表的な血漿ゲル画像を、健常個体および硬変症を有する患者に関して示す。脂質輸送阻害剤タンパク質は正常な血漿中には存在するが、硬変症患者由来の血漿中では減少することを示す図である。 亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質は正常な血漿中には存在するが、硬変症患者由来の血漿中では減少することを示す図である。 ｐＨ５．４６〜５．４９でのベータハプトグロビンの特徴の減少を示す図である。上図−正常な血漿と硬変症患者由来の血漿の間の有意な差を示さない、ベータハプトグロビンスポットの等間隔配置。下図−約ｐＨ５．４６〜５．４９で観察されたベータハプトグロビンスポットの拡大画像は、正常な血漿中には存在するが、硬変症患者由来の血漿中では減少することを示す。 硬変症における補体Ｃ３の切断の減少を示す図である。上図−補体Ｃ３ｄｇは正常な血漿中には存在しないが、硬変症患者由来の血漿中には存在することを示す。下図−そのチオエステル部位の前にある補体Ｃ３アルファ鎖の断片は正常な血漿中には存在するが、硬変症患者由来の血漿中には存在しないことを示す。

以下の記載は、上記で要約した本発明を略述する。しかしながら本発明は、記載した特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、構築物、および試薬に限られず、したがって変化し得る。同様に、本明細書で使用する技術用語は単に特定の実施形態を説明するのみであり、本発明の範囲を制限することは目的としない。

本発明者らは、健常個体と比較したとき、ＨＣＶ誘発性硬変症患者のヒト血漿試料において、様々なタンパク質が示差的に発現されることを発見している。この発見は、ゲルマトリクスにおいて二次元でタンパク質を分離する技法を使用してこれらの血漿試料を比較して、別々のタンパク質スポットを与えることによって得た。この手法は、ＷＯ／２００８／０３１０５１中で使用されたｐＨ３〜１０固定ｐＨ勾配ゲルとは異なる、狭域ｐＨ３〜５．６固定ｐＨ勾配ゲルを使用する。

他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書で言及する全ての刊行物および特許は、例えば、現在記載する本発明に関して使用することができる刊行物中に記載される構築物および方法を記載および開示する目的で、ここで参照によって本明細書に組み込む。上記および本文全体において論じる刊行物は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために記載されている。本明細書において、本発明者らが従来の発明によるそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈するべきものはない。

ａ．定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲中で利用する特定の用語および語句の意味を以下に記載する。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。

「２Ｄ−ＰＡＧＥ」は二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を指す。

「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイを指す。

「ＨＣＣ」は肝細胞癌を指す。

「ＨＣＶ」はＣ型肝炎ウイルスを指す。

「ＨＦ」は肝線維症を指す。

「ｋＤａ」はキロダルトンを指す。

「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指す。

「ＰＢＳ−Ｔ」はＰＢＳ溶液を含有するＴｗｅｅｎを指す。

「生体試料」は、診断またはモニタリングアッセイにおいて使用可能である生物から得られる様々な試料の種類を包含する。この用語は、生物起源の血液および他の液体試料、生検材料などの固形組織試料、またはそれらに由来する組織培養物もしくは細胞、およびそれらの子孫を包含する。さらに、この用語は、循環腫瘍または他の細胞を包含することができる。この用語は具体的には臨床試料を包含し、細胞培養中の細胞、細胞縣濁液、細胞溶解液、血清、血漿、尿、羊水、生物体液、および組織試料をさらに含む。この用語は、試薬を用いた処理、可溶化、または特定の構成要素の濃縮などの任意の方法で、調達後に操作された試料も包含する。

「生体分子配列」または「配列」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の全てまたは一部を指す。

「ＢＬＡＳＴ」は、所与のクエリー配列と一致するギャップのない部分配列を検出するための技法である、ベーシックローカルアライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を指す。「ＢＬＡＳＴＰ」は、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較するＢＬＡＳＴのプログラムである。「ＢＬＡＳＴＸ」は、タンパク質配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列（両鎖）の６フレームの概念上の翻訳産物を比較するＢＬＡＳＴのプログラムである。

本明細書で互換的に使用する「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は、細胞増殖制御の相当な消失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す細胞または組織を指す。本発明の方法および組成物は、前癌性（すなわち良性）、悪性、前転移性、転移性、および非転移性細胞に特に適用する。

「線維症がＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの示差的制御によって特徴付けられる」は、瘢痕を示し、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質が示差的発現を有する組織を有する対象を指す。

「線維症の表現型」は、線維症細胞に特徴的である任意の様々な生物学的現象を指す。この現象は線維症の型と共に変わる可能性はあるが、線維症の表現型は一般に瘢痕組織形成の異常によって同定される。

「細胞型」は、所与の供給源（例えば、組織もしくは器官）由来の細胞または所与の分化状態の細胞、または所与の病状または遺伝的構成と関係がある細胞を指す。

「相補的」は、プローブ分子とその標的の相互作用表面の形態的適合性または一致を指す。標的とそのプローブは相補的として記載することができ、さらに、それらの接触表面特性は互いに相補的である。

用語「検出可能」は、本出願中に記載され当業者によく知られている技法を使用して観察することができる、ポリペプチドの発現パターンを指す。例えば、ポリペプチドの発現は、ウエスタンブロットなどのイムノアッセイを含めた標準的な技法によって「検出」することができる。

「診断」および「診断する」は、疾患または障害に対する対象の易罹患性の決定、対象が現在疾患または障害に罹患しているかどうかに関する決定、疾患または障害に罹患した対象の予後評価（例えば、前転移性または転移性癌状態または線維症の同定）、およびセラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、療法の効果もしくは有効性に関する情報を与えるための、対象の状態のモニタリング）を一般に含む。

「示差的発現」は、遺伝子の時間的および組織発現パターンの定量的差異と定性的差異の両方を指す。例えば、示差的に発現される遺伝子は、正常の状態又は疾患状態で活性化または完全に不活性化されるその発現を有しうる。このような定性的に制御される遺伝子は、所与の組織、細胞型、または対象の血清／血漿において、対照もしくは疾患状態の一方で検出可能、または示差的発現をしながら両方で検出可能である発現パターンを示しうる。本明細書で使用する「示差的に発現されるタンパク質」は、試料中で示差的に発現されるタンパク質の検出が、試料中で示差的に発現されるタンパク質の存在と関係があるように、示差的に発現されるタンパク質を特異的に同定するアミノ酸配列を指す。

「発現」は、検出可能なレベルのアミノ酸配列またはタンパク質が発現されるように、ポリヌクレオチド配列が正常な転写および翻訳を経るプロセスを一般に指す。本明細書の特定の文脈では、発現はｍＲＮＡの生成を指す。他の文脈では、発現はタンパク質またはその断片の生成を指す。正常もしくは疾患状態に特徴的な酵素による切断または生物学的プロセスによって、これらの断片が生成され得る。

「発現産物」または「遺伝子産物」は、生物中の遺伝子が転写または翻訳または翻訳後修飾されるときに生成される、タンパク質またはｍＲＮＡなどの生体分子である。

「タンパク質の断片」は、タンパク質の一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離した完全長タンパク質の消化によって得られるポリペプチドを含むことができる。一実施形態では、タンパク質断片は少なくとも約６個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、断片は少なくとも約１０個のアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、タンパク質断片は少なくとも約１６個のアミノ酸を含む。

本出願において、用語「機能的等価物」は、天然ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質の全てまたは一部と実質的に類似した機能または構造特性を有するタンパク質を指す。用語「機能的等価物」は、天然ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質の「断片」、「突然変異体」、「誘導体」、「対立遺伝子」、「ハイブリッド」、「変異体」、「類似体」、または「化学的誘導体」を含むものとする。

免疫グロブリンに関しては、用語「機能的等価物」は、親免疫グロブリンと実質的に類似した免疫結合性を示す免疫グロブリン分子を指す。「免疫結合性」は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的である抗原の間で起こる非共有結合相互作用の型を指す。実際、モノクローナル抗体免疫グロブリンの機能的等価物は、例えば、親モノクローナル抗体とその抗原の結合を阻害することができる。機能的等価物は、免疫グロブリンが親免疫グロブリンの特性を示す限り、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）分子、Ｆｖ断片、ファージ上に提示される単鎖断片可変領域（ｓｃＦｖ）、単鎖ドメイン抗体、キメラ抗体などを含むことができる。

用語「融合タンパク質」は、典型的にはそれらの本来の状態で連結していないが、ペプチド結合を介してそれらの各々のアミノおよびカルボキシル末端により連結して１つの連続したポリペプチドを形成する、２つ以上のポリペプチドで構成されるタンパク質を指す。２つ以上のポリペプチド構成要素は、直接連結させるか、またはペプチドリンカー／スペーサーを介して間接的に連結させるかのいずれかが可能であることは理解される。

「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の生成に必要な制御およびコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドは完全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。遺伝子は連続コード配列を構成することができ、または遺伝子は、適切なスプライス連結によって結合した１つまたは複数のイントロンを含むことができる。さらに遺伝子は、発現産物の生物活性もしくは化学構造、発現率、または発現制御の形式に影響を与え得るコード領域または非翻訳領域中のいずれかに１つまたは複数の修飾を含有することができる。このような修飾には、１つまたは複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換があるが、これらだけには限られない。この点で、このような修飾遺伝子は「天然」遺伝子の「変異体」と呼ぶことができる。

「遺伝子発現」は、それによってポリヌクレオチド配列が、検出可能なレベルのヌクレオチド配列が発現されるように、良好な転写および翻訳を経るプロセスを指す。

本明細書で使用する用語「相同性」は相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。部分的相補配列は、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションから同一配列を少なくとも部分的に阻害する配列であり、それは技術用語を使用して「実質的に相同的」と呼ばれる。完全相補配列と標的配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液中ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下での標的配列と完全相同配列またはプローブの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合し阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件は非特異的結合が許容されるような条件であるということではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的相補度（例えば、約３０％未満の同一性）さえない第二の標的配列の使用によって試験することができ、非特異的結合の非存在下では、プローブは第二の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。

本明細書で互換的に使用する「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象を指す。好ましい一実施形態では、個体、対象、宿主、または患者はヒトである。他の対象には、ＨＣＣおよび肝炎を発症することが知られているウッドチャックおよびアヒルが含まれる。他の対象は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、霊長類、およびマウスを含み得るが、これらだけには限られない。

「単離された」は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、または宿主細胞が本来存在する環境と異なる環境中に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、または宿主細胞を指す。

「標識」は、直接的に、またはシグナル生成系の１つまたは複数の他のメンバーとの相互作用を介したいずれかで、検出可能なシグナルを与えることができる作用物質を指す。直接検出可能であり本発明において用途を見出すことができる標識は、蛍光標識を含む。具体的なフルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素などを含む。本発明は、標識として例えば^３５Ｓ、^３２Ｐ、^３Ｈなどの放射性同位体の使用も企図する。コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス）ビーズなどの比色標識も利用することができる。例えば、米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、同第３，９９６，３４５号、同第３，９３９，３５０号、同第３，８５０，７５２号、および同第３，８１７，８３７号を参照。

用語「正常な生理条件」は、生物または細胞内で典型的である条件を意味する。いくつかの器官または生物は極端な条件をもたらすが、生物内および細胞内環境は通常約ｐＨ７（すなわち、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）で変化し、主な溶媒として水を含有し、０℃を超える５０℃未満の温度で存在する。様々な塩の濃度は、参照として使用する器官、生物、細胞、または細胞内区画に依存する。

本明細書で互換的に使用する「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかを指す。したがって、これらの用語は、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはポリマーを含むが、これらだけには限られない。これらの用語は、イントロン配列を含むｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをさらに含むが、これらだけには限られない。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見ることができる）糖およびリン酸基、または修飾もしくは置換糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格はホスホラミダイトなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホラミダイトまたは混合型ホスホラミダイト−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、ウラシル、他の糖、およびフルオロリボースおよびチオエート、およびヌクレオチド分岐などの連結基などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれる可能性がある。標識構成要素との結合などによって、重合後にポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この定義内に含まれる他の型の修飾は、キャップ、類似体と１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、およびポリヌクレオチドとタンパク質、金属イオン、標識構成要素、他のポリヌクレオチド、または固形担体を結合させるための手段の導入である。用語「ポリヌクレオチド」はペプチド核酸も包含する。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをさらに含むことができる。

本明細書で互換的に使用する「ポリペプチド」および「タンパク質」は、翻訳された、非翻訳の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、および誘導体化アミノ酸を含み得る、任意の長さのポリマー型のアミノ酸を指す。ポリペプチドまたはタンパク質は天然、組換え、または合成、またはこれらの任意の組合せであってよい。さらに、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するタンパク質又はペプチドの断片を含むことができる。ポリペプチドまたはタンパク質は単分子であってよく、または多分子複合体であってよい。さらに、このようなポリペプチドまたはタンパク質は修飾ペプチド骨格を有するものであってよい。これらの用語は、Ｎ末端メチオニン残基有りまたは無しの、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および相同リーダー配列を有する融合タンパク質、免疫タグタンパク質などを含めた、融合タンパク質を含む。

疾患または障害に対する「素因」は、そのような疾患または障害に対する個体の易罹患性を指す。罹患しやすい個体は、正常／野生型個体と比較して、例えば癌または線維症を有する可能性が統計上高い。

用語「予後評価」および「予後評価する」は、疾患の過程を予想する操作または技術を指す。さらにこれらの用語は、その疾患の通常過程から予想される、または個々の症例の特別な特徴によって示される疾患からの生存および回復の見込みを指す。さらにこれらの用語は、その兆候および症状から疾患を確認する操作または技術を指す。

用語「予後評価指標」または「指標」は、予後評価の根拠もしくは基盤として働く、またはそれと関係がある可能性がある全てを指す。これらの用語は、本明細書に記載する遺伝子発現の試験および特徴付けの結果、および類似した症状を示す他の疾患または状態の区別を含めた、鑑別診断の任意の根拠もしくは基盤をさらに指す。さらに、用語「指標」または「予後評価指標」は、考えられる悪性疾患過程を区別するために使用することができる、本明細書に記載する遺伝子発現の試験および特徴付けの結果を含めた、任意の根拠もしくは基盤を指す。

「タンパク質捕捉物質」は、それ自体がタンパク質と結合することができる一分子または多分子複合体を指す。一実施形態では、タンパク質捕捉物質は、実質的に特異的な形式でそれらの結合パートナーと結合する。一実施形態では、タンパク質捕捉物質は約１０^−６未満の解離定数（ＫＤ）を示す可能性がある。タンパク質捕捉物質は、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの生体分子を含むことができる。生体分子は、天然に存在する、組換え、または合成生体分子をさらに含むことができる。タンパク質捕捉物質の例には、免疫グロブリン、抗原、受容体、または他のタンパク質、またはそれらの一部分もしくは断片がある。さらに、タンパク質捕捉物質は、非共有結合相互作用を介してそれらの結合パートナーのみと相互作用する作用物質に限られないと理解される。そうではなく、タンパク質捕捉物質は、それらが結合するタンパク質と共有結合した状態になる可能性もある。例えば、タンパク質捕捉物質は、結合後にその結合パートナーと光架橋することができる。

「配列同一性」は類似性または相補性の程度を指す。部分的同一性または完全同一性が存在し得る。部分的相補配列は、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションから同一配列を少なくとも部分的に阻害する配列であり、それは技術用語を使用して「実質的に同一」と呼ばれる。完全相補配列と標的配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液中ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に同一な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下での標的配列と完全同一配列またはプローブの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合し阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件は非特異的結合が許容されるような条件であるということではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的相補度（例えば、約３０％未満の同一性）さえない第二の標的配列の使用によって試験することができ、非特異的結合の非存在下では、プローブは第二の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。

２つの核酸またはポリペプチド配列に関する配列同一性を調べる別の方法は、特定領域にわたり最大対応性でアラインメントをとるとき同一である２配列中の残基の参照を含む。本明細書で使用する配列同一性の割合（percentage）は、比較ウインドウにわたる２つの最適にアラインメントをとる配列を比較することによって決定した値を意味し、この場合、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分は、２配列の最適アラインメントで（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む可能性がある。この割合は、両配列中の同一核酸塩基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、比較ウインドウ中の位置の総数で一致した位置の数を割ること、およびその結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算する。

「ストリンジェントな条件」は、その条件下でプローブはその標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるが、他の配列とはハイブリダイズすることができない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的である（例えば、より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする）。一般に、定義したイオン強度およびｐＨで特定配列に関して熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いストリンジェントな条件が選択される。Ｔｍは標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（定義したイオン強度、ｐＨ、およびポリヌクレオチド濃度下での）温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．３において少なくとも約０．０１〜約１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０℃である条件である。ホルムアミドなどの不安定化剤を加えることによって、ストリンジェントな条件を得ることもできる。

「実質的に精製された」は、その本来の環境から除去され、それが本来結合していた他の構成要素を少なくとも約６０％含まない、少なくとも約６５％含まない、少なくとも約７０％含まない、少なくとも約７５％含まない、少なくとも約８０％含まない、少なくとも約８３％含まない、少なくとも約８５％含まない、少なくとも約８８％含まない、少なくとも約９０％含まない、少なくとも約９１％含まない、少なくとも約９２％含まない、少なくとも約９３％含まない、少なくとも約９４％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９６％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９８％含まない、少なくとも約９９％含まない、少なくとも約９９．９％含まない、または少なくとも約９９．９９％以上含まない化合物を指す。

「標的タンパク質」は、タンパク質捕捉物質が特異的にハイブリダイズまたは結合する生体試料に由来することが多いポリペプチドを指す。それは検出される標的タンパク質の有無、または定量化される標的タンパク質の量のいずれかである。標的タンパク質は、標的に対する対応するタンパク質捕捉物質によって認識される構造を有する。標的タンパク質またはアミノ酸は、タンパク質捕捉物質が対象とする大きなタンパク質の特異的構造、またはその発現レベルを検出することが望ましい全体構造（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）を指すこともできる。

用語「治療」、「治療すること」、「治療する」などは、望ましい薬理および／または生理効果を得ることを指す。この効果は疾患またはその症状を完全または部分的に予防する点で予防的であってもよく、および／または疾患および／またはその疾患に起因する悪影響を部分的または完全な安定化もしくは治癒する点で治療的であってもよい。「治療」は哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患または症状の素因がある可能性があるがそれを有するとまだ診断されていない対象中の疾患または症状の発生を予防すること、（ｂ）疾患症状を抑制すること、すなわちその発症を抑えること、または（ｃ）疾患症状を軽減すること、すなわち疾患または症状の退行を引き起こすことを含む。

ｂ．ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチド
一態様では、本発明は、その示差的発現が肝線維症と関係があるポリペプチドを含む「ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチド」に関する。ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドは天然に存在するタンパク質の変異体も含み、このような変異体は天然に存在するタンパク質と同一または実質的に類似している。一般に、変異体ポリペプチドは、ＢＬＡＳＴにより測定して、本明細書に記載するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドと少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％、およびより通常は少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を有する。変異体ポリペプチドは、天然または非天然グリコシル化状態である可能性がある。

一般に、本明細書に記載するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの変異体は、ＢＬＡＳＴなどの当技術分野でよく知られている方法により決定して、少なくとも約６５％を超える、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８３％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％または少なくとも約９９．９９％を超える可能性がある配列同一性を有する。

一実施形態では、変異体ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドは突然変異体ポリペプチドであってよい。ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの突然変異は、これらには限られないが、アミノ酸置換、付加または欠失から生じる可能性がある。アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換、または非必須アミノ酸を除去するための置換であってよい。一般に、保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の総電荷、疎水性、親水性、および／または立体的大きさ（bulk）を保持する置換である。

いくつかの突然変異体ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドでは、アミノ酸を置換してリン酸化部位またはアセチル化部位を改変することができる。

重要なことに、変異体ポリペプチドは、タンパク質の特定領域（例えば、機能ドメインおよび／または、ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列と関係がある領域）の高い生物活性を保持または保有するように設計することができる。変異体を生成するためのアミノ酸改変の選択は、アミノ酸のアクセス性（内部対外部）、変異体ポリペプチドの熱安定性、所望のグリコシル化部位、所望のジスルフィド架橋、所望の金属結合部位、およびプロリンループ内の所望の置換に基づくことができる。システイン欠損ムテインはＵＳＰＮ４，９５９，３１４中に開示されたように生成することができる。

変異体は、本明細書で開示するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの断片、特に生物活性断片および機能ドメインに対応する断片も含む。対象の断片は典型的には少なくとも約１０アミノ酸〜少なくとも約１５アミノ酸長、通常は少なくとも約５０アミノ酸長であり、最長では３００アミノ酸長以上である。本明細書で記載するタンパク質変異体は、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドによってコードされる。

本発明のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドは本来存在しない環境で与えられる、例えば、それらの本来存在する環境から分離する。特定の実施形態では、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質が実質的に精製された形で存在する。

ｃ．ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質：モジュレーターおよび結合パートナー
別の態様では、本発明は「ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質」を提供し、これは「ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチド結合パートナー」からなるクラスの分子を指す。

ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチド結合パートナーは、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドと結合する分子である。例示的なポリペプチド結合パートナーは免疫グロブリンである。結合パートナーは、必ずしもそうする必要はないが、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの生物活性を調節することができる。

ｄ．免疫グロブリン
ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質を同定するために使用するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドと特異的に結合する免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの機能的等価物を含む。用語「免疫グロブリン」と「抗体」は、本明細書では互換的かつその最も広い意味で使用する。したがって、それらが望ましい生物活性を示す限り、それらは少なくとも２つの完全抗体から形成される完全モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を包含する。一実施形態では、対象免疫グロブリンは少なくとも１つのヒト定常ドメインを含む。別の実施形態では、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ免疫グロブリン作用物質は、ヒト定常ドメインと少なくとも約９０〜９５％の配列同一性を示しヒトエフェクター機能を依然保持する定常ドメインを含む。免疫グロブリンＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質またはその機能的等価物はヒト、キメラ、ヒト化、マウス、ＣＤＲ移植、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、トランスジェニックマウスで生成、突然変異誘発、およびランダム化することができる。

ｉ．一般的抗体
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、組換え抗体および抗体断片を含めた、抗原と結合することができる完全構築抗体および抗体断片（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）を包含する。免疫グロブリンおよび抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化であることが好ましい。

重鎖および軽鎖の可変ドメインは、同族抗原の特定エピトープを認識し、またはそれと結合する。用語「エピトープ」を使用して、免疫グロブリンの可変末端が結合する抗原上の特異的結合部位または抗原決定基を指す。エピトープは直鎖状であってよい、すなわち一次ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ配列中に見られるアミノ酸残基の配列で構成されてよい。免疫グロブリンがフォールディングしたＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ分子において見られる３−Ｄ構造を認識するように、エピトープは立体構造的であってもよい。エピトープは、直鎖状要素と立体構造要素の組合せであってもよい。さらに、標的含有腫瘍細胞によって発現される分子の炭水化物部分もエピトープであり得る。

１）それらが閾値レベルの結合活性を示す、および／または２）それらが公知の関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、免疫グロブリンは「特異的に結合している」と言える。免疫グロブリンの結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０〜６７２、１９４９）によって、当業者により容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、他のタンパク質より少なくとも１０^３、より好ましくは少なくとも１０^４、より好ましくは少なくとも１０^５、およびさらにより好ましくは少なくとも１０^６倍高くＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤと結合する。

ｉｉ．ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
本発明の免疫グロブリンはポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、当技術分野でよく知られている任意の方法によって作製することができる。

ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの多数回皮下（ｓｃ）、腹腔内（ｉｐ）または筋肉内（ｉｍ）注射によって動物中で産生させることが好ましい。免疫処置する種に免疫原性があるタンパク質と、関連抗原を結合させることは有用であり得る。さらに、ミョウバンおよびその他などの凝集剤を適切に使用して免疫応答を高める。

用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、１つの抗原部位を対象とする。さらに、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の１つの抗原決定基に対するものである。

それらの特異性以外に、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されずに、それらを合成することができる点で有利である。例えば、ハイブリドーマ法によって、または組換えＤＮＡ法によってモノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ作用物質は、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。

ｉｉｉ．キメラおよびヒト化抗体
ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチド結合免疫グロブリンまたは抗体は、可変領域がげっ歯類などの一種に由来する可能性があり、定常領域がヒトなどの第二の種に由来する可能性があるという意味で「キメラ」であり得る。

「ヒト化」型の非ヒトＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質結合抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。その大部分に関して、ヒト化抗体は、その中でレシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中では見られない残基を含むことができる。

一般に、ヒト化抗体は、その中で全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、および典型的には２つの実質的に全ての可変ドメインを含むことができる。一実施形態では、ヒト化抗体は、アクセプター（非ヒト）ＦＲ、例えばマウスＦＲと少なくとも６５％の配列同一性を示すヒト化ＦＲを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、特にヒト免疫グロブリン配列の少なくとも一部分を含むこともできる。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で記載されている。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有することが好ましい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」可変ドメインから典型的に得られる「移入」残基と呼ばれることが多い。超可変領域配列とヒト抗体の対応する配列を置換することによって、ヒト化を本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全未満のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラである。実際、ヒト化抗体は典型的には、その中でいくつかの超可変領域残基、およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体を作製する際に使用するヒト可変ドメイン、軽鎖と重鎖両方の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。

他の方法は一般に、抗体アクセプター可変領域フレームワークにドナーＣＤＲ結合親和性を与えることを含む。１つの方法は、可変領域結合断片の結合親和性を同時に移し最適化することを含む。別の方法は、抗体可変領域の結合親和性の最適化に関する。

ｉｖ．抗体断片
「抗体断片」は、完全抗体の一部分、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）^２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。

パパインによる抗体の消化によって、それぞれ１つの抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残基「Ｆｃ」断片を生成する。Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨＩ）も含有する。

ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し依然として抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）^２断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた、重鎖ＣＨＩドメインのカルボキシ末端に数個の残基を加えることによってＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書では、その中で定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’を示す。Ｆ（ａｂ’）^２抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として最初に作製された。抗体断片の他の化学的カップリングは当技術分野でよく知られている。

「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、堅い非共有結合状態の、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この形状では、それぞれの可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和性ではあるが、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖中に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含むことができる。ＰＬＵＣＫＴＨＵＮ、１１３ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６９〜３１５（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．１９９４）を参照。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５８７，４５８号および同第５，５７１，８９４号も参照。

抗体断片を作製するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は完全抗体のタンパク質消化分解によって誘導された。しかしながら、現在これらの断片は組換え宿主細胞によって直接産生することができる。

ｖ．結合および標識
抗ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤタンパク質抗体はそれらの「裸状態」または非結合型で投与することができ、またはそれらと結合する他の作用物質を有することができる。

例えば、抗体は検出可能に標識された型であってよい。放射性同位体、親和性標識（例えばビオチン、アビジンなど）、酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などを使用することによって抗体を検出可能に標識することができる。このような標識を実施するための手順は当技術分野でよく知られている。

ｖｉ．二重特異性抗体
本発明の二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。それぞれの断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上において２ドメイン間で対形成するのを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を形成する。

二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野でよく知られている。完全長二重特異性抗体の従来の作製は、２本の鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。

別の手法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組合せ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合することができる。具体的には、可変ドメインを、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合させる。一実施形態では、融合タンパク質は第一の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を含む。それが軽鎖結合に必要な部位を含有するからである。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチドを別の発現ベクターに挿入することができ、適切な宿主生物にコトランスフェクトすることができる。これは、構築中に使用する不均等な割合の３つのポリペプチド鎖が最適収率をもたらすときの実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互比を調節する際に高い柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい割合の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすとき、またはその割合が特に有意ではないとき、１つの発現ベクター中に２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。

二重特異性抗体は、ロイシンジッパーおよび単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用しても作製されている。

ｅ．線維症療法の診断、予後評価、および評価
別の態様では、したがって本発明は、本明細書に記載するＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを使用して線維症を診断および予後評価するための方法を提供する。具体的な非制限的実施形態では、これらの方法は、細胞または血清／血漿中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを検出する、対象の線維症および線維症の重症度の診断を容易にする、対象の予後評価の決定を容易にする、対象における線維症に対する易罹患性を決定する、および（例えば、化学療法レジメンの最中またはその後に腫瘍負荷を評価することにより、治療効果の指標を与えることによって）療法に対する対象の応答性を評価するのに有用である。このような方法は、患者の生体試料、例えば血清／血漿または疑わしいもしくは予期される線維症組織もしくは細胞中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドのレベルの検出を含むことができる。本発明の検出法は、単離細胞、または全組織もしくは体液、例えば血液、血漿、血清、尿などにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。一実施形態では、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを使用して線維症を検出および評価することができる。これらのバイオマーカーは、例えば肝線維症、腎線維症、心筋線維化、皮膚線維化、膵線維化などの線維症を示す任意の疾患に適用することができるが、より好ましくは、線維症は肝線維症である。

ｆ．ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの検出
血清または血漿中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを検出するための方法を提供する。コードされるポリペプチドに特異的な抗体を使用したイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法、ネフェロメトリーなど、およびコードされるポリペプチド、例えば生物活性に関する機能アッセイを含むが、これらには限られない、任意の様々な公知の方法を検出に使用することができる。これらには限られないが、質量分析を使用した多重反応モニタリングなどの非抗体手法を使用して、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを定量化することも可能である。

本明細書を読むことによって当業者には容易に明らかになるように、本明細書に記載する検出法および他の方法は容易に変更することができる。このような変更は本発明の意図する範囲内にある。例えば、前述の検出スキームでは、検出において使用するためのプローブを固形担体に固定することが可能であり、試験試料は固定プローブと接触させることが可能である。次いでプローブと試験試料の結合を、様々な方法で、例えば試験試料と結合した検出可能な標識を検出して、試験試料固定プローブ複合体の検出を容易にすることによって検出することができる。

本発明は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドに特異的な抗体を使用して、生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの存在を検出するおよび／またはそのレベルを測定するための方法をさらに提供する。具体的には、生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの存在を検出するための方法は、試料とモノクローナル抗体を接触させるステップ、および試料中の抗体とＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの結合を検出するステップを含むことができる。より具体的には、放射標識、酵素、クロモフォアおよびフルオロフォアを含むが、これらには限られない化合物を使用して、抗体を標識して検出可能なシグナルを生成することができる。

ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドに特異的な抗体、またはその機能的等価物の特異的結合の検出は、適切な対照と比較した場合、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドが試料中に存在するという指標である。適切な対照は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを含有しないことが知られている試料、およびコードされるポリペプチドに非特異的な抗体、例えば抗イディオタイプ抗体と接触した試料を含む。特異的抗体−抗原相互作用を検出するための様々な方法が当技術分野で知られており、これらには限られないが、標準的な免疫組織学的方法、免疫沈降法、酵素イムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイを含めた方法において使用することができる。一般に、特異的抗体は、直接的または間接的のいずれかで検出可能に標識され得る。直接標識には、放射性同位体、その産物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、３−ガラクトシターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリンなど）、蛍光発光金属（例えば、ＥＤＴＡなどの金属キレート基によって抗体と結合した、１１２Ｅｕ、または他のランタノイド系）、化学発光化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など）、生物発光化合物（例えば、ルシフェリン、イクオリン（緑色蛍光タンパク質）など）がある。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズなどの不溶性担体と結合（カップリング）することができる。間接標識には、第二の抗体が上記のように標識された、コードされるポリペプチドに特異的な抗体（「第一の特異的抗体」）に特異的な第二の抗体、および特異的結合対、例えば、ビオチン−アビジンのメンバーなどがある。生体試料は、細胞、細胞粒子、または可溶性タンパク質を固定することができる、ニトロセルロースなどの固形支持体もしくは担体と接触させ固定することが可能である。次いで支持体は、検出可能に標識された第一の特異的抗体との接触後に、適切な緩衝液で洗浄することができる。検出法は当技術分野で知られており、検出可能な標識により発せられるシグナルに応じて適切に選択され得る。検出は一般に、適切な対照および適切な標準と比較して実施される。

ｇ．キット
検出法はキットの一部として提供することができる。したがって本発明は、生体試料中のＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドの存在および／またはレベルを検出するためのキットをさらに提供する。これらのキットを使用した手順は、臨床研究所、実験研究所、医療従事者、または私人によって実施され得る。線維症中に示差的に発現されるＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを検出するための本発明のキット。キットは、これらには限られないが、緩衝液、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、対照試料、標準、説明書、および解釈情報を含めた、手順中に有用である他の構成要素を提供することができる。

(実施例)
正常な健常個体由来の血漿を硬変症患者と比較したときの、示差的に発現されるタンパク質の確立
本発明者らは、健常個体と比較したとき、ＨＣＶ誘発性硬変症患者のヒト血漿試料中で様々なタンパク質が示差的に発現されることを発見している。この発見は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、ゲルマトリクスにおいて二次元でタンパク質を分離して別個のタンパク質スポットを得る技法を使用して、これらの血漿試料を比較することによって得た。広いｐＨ３〜１０範囲を使用した２Ｄ−ＰＡＧＥがＷＯ／２００８／０３１０５１において以前に使用され、肝線維症の血清中でバイオマーカーが同定された。本明細書における本発明の線維症バイオマーカーの同定は、狭域ｐＨ３〜５．６範囲を使用したのでＷＯ／２００８／０３１０５１と異なる。それが３つの最も多量に存在する血漿／血清中タンパク質、すなわち、アルブミン、ＩｇＧおよびトランスフェリンの主要アイソフォームの範囲外にあるため、このｐＨ範囲を選択した。このｐＨ３〜５．６範囲がバイオマーカーの発見に使用されたのはこれが初めてである。

疾患における新規なバイオマーカーの発見は、１０桁に及ぶ血清および血漿中の動的タンパク質濃度範囲によって妨げられる。したがって、非常に多量のタンパク質、特にアルブミン、免疫グロブリンおよびトランスフェリンが微量タンパク質の検出を制限する。バイオマーカーを発見する際のこの問題を克服するために、多くの者が、電気泳動前に試料から多量のタンパク質を除去して微量タンパク質の表示を改善するための、抗体−および色素親和性ベースの事前分画戦略を試みてきた。しかしながら、免疫沈降はこれらの多量のタンパク質を除去するのに必要とされる多量の抗体のため高価であり、色素親和性ベースの方法は、多数の非アルブミンタンパク質の望ましくない除去、およびしたがってプロテオーム解析中に可能性のあるバイオマーカーを除去する可能性があるので、有効性が低く特異性が低い。本発明において使用する多量のタンパク質（２ｍｇ）と異なり、多量のタンパク質の除去中の回収問題および濃縮中の損失のため、多量の試料の除去後に同様の高レベルのタンパク質を充填することは非常に難解である。

血漿中の多量のタンパク質の問題にもかかわらず、ＷＯ／２００８／０３１０５１では２Ｄ−ＰＡＧＥを広いｐＨ３〜１０範囲で使用して、肝臓の線維症のいくつかの新規な候補バイオマーカーを同定することに成功している。本発明では、この肝線維症のバイオマーカーのパネルが、アルブミン、免疫グロブリンおよびトランスフェリンの主要アイソフォームの範囲外に及ぶ狭域ｐＨ３〜５．６で２Ｄ−ＰＡＧＥを使用し、ＷＯ／２００８／０３１０５１の４倍を超えるタンパク質を充填することを可能にすることによって増大する。これによって微量の特徴の表示（representation）を高め、分離を改善することができた。血清と血漿の両方に関する酸性プロテオームの大幅に改善されたゲルベースの分離はこのｐＨ範囲を使用して実施し、広いｐＨ３〜１０範囲を使用したＷＯ／２００８／０３１０５１では見られなかった肝線維症の微量バイオマーカーの同定を可能にした。

二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）
ＨＣＶ誘発性肝臓瘢痕化のバイオマーカーを同定するため、健常個体およびＨＣＶ誘発性硬変症患者（各群中に６個体）の血漿試料を２Ｄ−ＰＡＧＥベースのプロテオミクス試験で分析した。全ての血漿試料はＰ１００チューブ（ＢＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）に回収した。任意の他の血液回収チューブと異なり、これらのＰ１００血漿チューブは血液回収時に即座に可溶化する独自のタンパク質安定化剤を含有し、これによってタンパク質の回収および保存が高まり、それらがプロテオーム解析およびバイオマーカー発見のために理想的となるため、これらのＰ１００血漿チューブを選択した。様々な程度の肝線維症を有する患者由来の血清を分析したＷＯ／２００８／０３１０５１と異なり、本発明は、健常個体および硬変症患者由来の試料間で示差的に発現するタンパク質のみに焦点を当てる。軽度および中等度の線維症において以前に同定された全ての示差的に発現するタンパク質は硬変症でも見られたので、この手法を採用し、この試験におけるこれらの中間段階線維症の分析はさらなる候補線維症バイオマーカーを与えないであろうことが示唆された。２ミリグラムの血漿タンパク質を、一次元ゲルでｐＨ３〜５．６非線形勾配を使用して電荷によって、次に９〜１６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配を使用して二次元で分子量（サイズ）によって分離した。ゲルの電気泳動、蛍光染色およびスキャンはＧａｎｇａｄｈａｒａｎら、（２００７）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、５３、１７９２により記載されたように実施した。

示差的画像解析およびタンパク質同定
生成したスポットの二次元配置を、コンピュータ支援画像解析によって正常血漿試料と硬変症血漿試料の間で比較した。全２Ｄ−ＰＡＧＥゲルのスキャン画像を、Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎら、（２００７）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、５３、１７９２により記載されたコンピュータ支援画像解析によって分析した。２倍以上異なっていた示差的に発現した変化は有意であると考えた。合計５７の示差的に発現した特徴を切除し、トリプシンで消化し、Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎら、（２００７）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、５３、１７９２により記載されたように質量分析法によって分析した。

硬変症が原因である肝線維症のヒト血漿バイオマーカーの同定
示差的画像解析は、可能性がある血漿バイオマーカーの最初の証拠を明らかにした。図１〜４を参照されたい。この解析は、脂質輸送阻害剤タンパク質、亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、レチノール結合タンパク質４、アファミン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、コルチコステロイド結合グロブリン、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質およびフィブリノゲンガンマ鎖の発現は硬変症血清において低下し、一方で完全補体Ｃ３ｄｇ、免疫グロブリンＪ鎖、性ホルモン結合グロブリン、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ、アディポネクチンおよびアルファ−１−アンチトリプシンの発現は増大したことを示した。糖タンパク質ヘモペキシンの翻訳後修飾も観察された。

ＷＯ／２００８／０３１０５１中で既に言及された線維症バイオマーカー、ＣＤ５抗原様タンパク質およびＩｇアルファ／カッパ鎖の増大、アルファ−１−アンチキモトリプシン、クラステリン、補体Ｃ４、インターα−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４およびトランスチレチンの低下も同定された。インターα−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４の場合、質量分析法によるペプチド配列分析によって、以前にＷＯ／２００８／０３１０５１中で３５および７０ｋＤａ切断断片のみが減少すると同定されたとき、このタンパク質の非切断型が減少することが確認された。

全ての前述のタンパク質は、質量分析法によって上位スコアタンパク質として同定した。他の低スコアタンパク質はゲル特徴で同定し、これを排除することはできないが、示差的に発現した変化の原因である可能性は低い。同定したタンパク質の低スコアは、Ｉｇラムダ鎖およびアポリポタンパク質ＡＩで増大し、アルブミン、ＡＭＢＰ、プロトロンビン、色素上皮由来因子および血清アミロイドＰ成分で減少した。

血清／血漿中のこれらの新規なタンパク質の測定は、線維症と硬変症の両方の信頼できる診断を容易にし、これによって肝生検の必要性を排除することができる。これらの測定は、これらのタンパク質を標的とする抗体を用いたイムノアッセイを使用して実施することができる。

補体Ｃ３の断片は硬変症において増大することが分かり、約ｐＩ４．９の等電点で３９ｋＤａにおいて２Ｄ−ＰＡＧＥゲル上で観察された。この断片に関して質量分析法により同定したアミノ酸は９５５から１２０１に及んだ。補体Ｃ３ｄｇに関するアミノ酸は９５５から１３０３に及び、その理論上の分子量および等電点（３９ｋＤａおよびｐＩ５）は観察されたゲル特徴と一致し、特徴内の補体Ｃ３の断片が補体Ｃ３ｄｇであることを裏付ける。補体Ｃ３ｄｇはアミノ酸１０１０から１０１３にチオエステル部位を有することが知られており、これは、繊維素溶解に関与する酵素、プラスミンによって切断され得る。プラスミンは線維症において減少することが知られており、これは硬変症で観察した高レベルの非切断型補体Ｃ３ｄｇと一致する。ＷＯ／２００８／０３１０５１では、補体Ｃ３の断片は線維症および硬変症において減少することが分かり、これは４９ｋＤａ ｐＩ６．９で観察され、質量分析法により同定したアミノ酸はそれがチオエステル部位の前にある補体Ｃ３のアルファ鎖であることを示し、線維症における補体Ｃ３のプラスミン仲介型切断の減少を裏付けた（Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎら、（２００７）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、５３、１７９２）。したがって本発明では、補体Ｃ３のプラスミン切断部位に対する（すなわち、アミノ酸１０１０から１０１３においてチオエステル部位と重複する）抗体は、切断の程度を決定するのに役立つことができる。現在、補体Ｃ３のチオエステル部位の領域に対する市販の抗体は存在しないようである。切断領域に対する抗体は、肝臓瘢痕化における高レベルの非切断型補体Ｃ３を決定するのにより確実に役立つことができる。

全ハプトグロビンは線維症において減少することが知られており、肝臓の線維症を診断するために他のタンパク質と共に現在使用されている（ＷＯ０２１６９４９参照）。本発明では、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビンを含有する２Ｄ−ＰＡＧＥ特徴は硬変症において減少することが分かり、全ハプトグロビンより信頼性が高いようであった。ハプトグロビンは４個の潜在的グリコシル化部位を有することが知られており、これらはいずれもそのベータ鎖上に存在する。ベータハプトグロビンは血漿／血清中では通常グリコシル化状態である。２Ｄ−ＰＡＧＥによって血漿／血清を分離するとき、ベータハプトグロビンはｐＨ４．７と５．８の間の等間隔の特徴の配置として見られ、これは肝臓瘢痕化の減少を示す可能性がある。本発明では、ハプトグロビン、ｐＨ５．４６〜５．４９の２Ｄ−ＰＡＧＥゲル特徴は硬変症において減少し、ｐＨ４．７と５．８の間でのベータハプトグロビンの他の特徴より信頼性が高いようであった。

それぞれの新規なバイオマーカーに関する線維症スコアリングスケールは公式化することができる。様々な段階の肝臓の線維症にわたる、血清中のこれらのバイオマーカーの平均濃度を決定する。０〜６のスケールをここで使用して臨床試験で肝臓の線維症を評価し、この場合０は線維化がないことを表し、１〜５は軽度から中程度／重度まで重症度が増大する中間段階の線維症を表し、６は硬変症である（Ｉｓｈａｋ、（１９９５）、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、２２、６９６）。これらの７段階中の新規なバイオマーカーの濃度範囲を決定することによって、０〜６の同様のスコアリングシステムを割り当てることができる。全ての新規なバイオマーカーのスコアのさらなる結果は、個々のバイオマーカーを調べるより信頼性の高い線維症の程度の指標を与える。

イムノアッセイ
本発明は、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを検出する線維症を評価するためのキットを提供する。これはＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドと結合する抗体を使用して実施する。これらの抗体を使用して、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法、ネフェロメトリーなどのイムノアッセイを実施することができる。これらには限られないが、質量分析を使用した多重反応モニタリングなどの非抗体手法を使用して、ＨＦ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤポリペプチドを定量化することも可能である。

ＥＬＩＳＡの場合、アッセイは９６ウェルプレート中で実施することができる。１つの選択肢は、非競合一部位結合ＥＬＩＳＡを使用することである。このアッセイでは、知られている濃度の抗原（この実施例では、新規なバイオマーカーおよび血清試料）を重炭酸緩衝液中に調製し、９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。次いでウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）の溶液で３回洗浄し、次にウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ溶液でブロッキングする。３７℃で１時間のインキュベーション後、抗原（この実施例では、対象のバイオマーカー）に対する一次抗体を加え、プレートは３７℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次いで、動物起源の一次抗体に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を加え、プレートは３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。最後に、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）などのペルオキシダーゼ基質をそれぞれのウェルに加え、３０分後４０５ｎｍにおいてプレートリーダーで吸光度を読み取る。

代替として、サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用することができる。この型のアッセイでは、１つの抗体がプレートウェルの底部に結合している。抗原、この場合バイオマーカータンパク質を加え、非結合産物は洗浄によって除去する。次いで、第二の、抗原と結合する標識抗体を加える。結合した二次抗体の量は、通常比色定量法を使用して定量化する。新規なバイオマーカー以外に、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによってハプトグロビンを測定することができることを提案する。血清中のハプトグロビンのレベルは、臨床医によって決定された肝機能検査の結果と共に、肝臓の線維症に関するより信頼性の高いスコアを確立する。

前述の記載は特定の好ましい実施形態を指すが、本発明がそのように限定されないことが理解されよう。開示されている実施形態に対して様々な変更形態がなされてもよいこと、およびこのような変更形態が本発明の範囲内にあると考えられることは、当業者には思い当たるはずである。

本明細書中に引用する全ての刊行物、特許出願および特許は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (23)

1. 肝線維症及び／又は硬変症を検出および評価する方法であって、
   ａ）患者から得た生体試料中の少なくとも１つのポリペプチドのレベルを決定するステップであって、前記生体試料は患者の血清又は血漿の試料である前記ステップ、および
   ｂ）前記肝線維症及び／又は硬変症の陽性または陰性診断を決定するために前記決定されたレベルを前記少なくとも１つのポリペプチドの対照レベルと比較するステップを含み、
   前記少なくとも１つのポリペプチドが、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタを含む、
   前記方法。
2. 前記少なくとも１つのポリペプチドが、アディポネクチン、アファミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、完全／切断型補体Ｃ３ｄｇ、コルチコステロイド結合グロブリン、フィブリノゲンガンマ鎖、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＪ鎖、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質、脂質輸送阻害剤タンパク質、レチノール結合タンパク質４、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、性ホルモン結合グロブリンおよび亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質の少なくとも１つをさらに含むものである、請求項１に記載の方法。
3. 肝線維症及び／又は硬変症の重症度をスケーリングするための方法であって、
   ａ）患者から得た生体試料中の少なくとも１つのポリペプチドのレベルを決定するステップであって、前記生体試料は患者の血清又は血漿の試料である前記ステップ、および
   ｂ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのポリペプチドの前記決定されたレベルを、線維化なしから硬変までの範囲の患者集団中の前記少なくとも１つのポリペプチドの予め決定されたレベルと比較するステップを含み、
   前記少なくとも１つのポリペプチドが、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタを含む、
   前記方法。
4. 前記少なくとも１つのポリペプチドが、アディポネクチン、アファミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、完全／切断型補体Ｃ３ｄｇ、コルチコステロイド結合グロブリン、フィブリノゲンガンマ鎖、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＪ鎖、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質、脂質輸送阻害剤タンパク質、レチノール結合タンパク質４、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、性ホルモン結合グロブリンおよび亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質の少なくとも１つをさらに含むものである、請求項３に記載の方法。
5. 肝線維症及び／又は硬変症の予後評価を決定する方法であって、
   ａ）患者から得た生体試料中の少なくとも１つのポリペプチドのレベルを決定するステップであって、前記生体試料は患者の血清又は血漿の試料である前記ステップ、および
   ｂ）前記肝線維症及び／又は硬変症の陽性または陰性診断を決定するために前記決定されたレベルを前記少なくとも１つのポリペプチドの対照レベルと比較するステップを含み、
   前記少なくとも１つのポリペプチドが、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタを含む、
   前記方法。
6. 前記少なくとも１つのポリペプチドが、アディポネクチン、アファミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、完全／切断型補体Ｃ３ｄｇ、コルチコステロイド結合グロブリン、フィブリノゲンガンマ鎖、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＪ鎖、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質、脂質輸送阻害剤タンパク質、レチノール結合タンパク質４、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、性ホルモン結合グロブリンおよび亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質の少なくとも１つをさらに含むものである、請求項５に記載の方法。
7. 前記決定するステップが、前記ポリペプチドに特異的な作用物質を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記作用物質が、前記ポリペプチドと結合する抗体又はその機能的等価物である、請求項７に記載の方法。
9. 前記決定するステップはアッセイ方法を用いて実施される、請求項７に記載の方法。
10. 前記決定するステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法又はネフェロメトリーを用いて実施される、請求項９に記載の方法。
11. 前記決定するステップは、質量分析を使用した多重反応モニタリングによって実施される、請求項１に記載の方法。
12. 前記決定するステップが、前記ポリペプチドに特異的な作用物質を使用することを含む、請求項３に記載の方法。
13. 前記作用物質が、前記ポリペプチドと結合する抗体又はその機能的等価物である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記決定するステップはアッセイ方法を用いて実施される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記決定するステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法又はネフェロメトリーを用いて実施される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記決定するステップは、質量分析を使用した多重反応モニタリングによって実施される、請求項３に記載の方法。
17. 前記決定するステップが、前記ポリペプチドに特異的な作用物質を使用することを含む、請求項５に記載の方法。
18. 前記作用物質が、前記ポリペプチドと結合する抗体又はその機能的等価物である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記決定するステップはアッセイ方法を用いて実施される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記決定するステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ドットブロット、ウエスタンブロット、比濁法又はネフェロメトリーを用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記決定するステップは、質量分析を使用した多重反応モニタリングによって実施される、請求項５に記載の方法。
22. 肝線維症及び／又は硬変症の予後評価のためのキットであって、１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタを含む少なくとも１つのポリペプチドを特異的に検出する作用物質を含むキット。
23. 前記少なくとも１つのポリペプチドが、アディポネクチン、アファミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖、完全／切断型補体Ｃ３ｄｇ、コルチコステロイド結合グロブリン、フィブリノゲンガンマ鎖、ｐＨ５．４６〜５．４９のベータハプトグロビン、ハプトグロビン関連タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＪ鎖、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質、脂質輸送阻害剤タンパク質、レチノール結合タンパク質４、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、性ホルモン結合グロブリンおよび亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質の少なくとも１つをさらに含むものである、請求項２２に記載のキット。