JP5429723B2 - 大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、レジスチン様分子β（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ β：以下ＲＥＬＭβと称することがある）を分析する大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

糖尿病、高脂血症、高血圧、高尿酸血症、動脈硬化症、がん（例えば、大腸癌）などは、生活習慣が主な発症原因であると考えられており、生活習慣病と呼ばれている。また、肥満に加え、高脂血症、高血圧、高血糖などを複合する状態を、医学的にはメタボリックシンドロームと総称するようになってきている。これらの疾患又は症状の発症には、生活習慣（食事習慣、運動習慣、肥満、喫煙、飲酒など）が深く関わると考えられているが、生活習慣を改善することにより予防することが可能である。従って、早期にこれらの疾患や症状の徴候を発見し、生活習慣を改善する指導を行うことによって、生活習慣病を予防することが期待されている。しかしながら、これらの疾患や症状を検出することのできるよいバイオマーカーは見つかっていなかった。

インスリン抵抗性を惹起するタンパク質として、脂肪細胞由来の分泌タンパク質であるレジスチン（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ）が同定された。また、レジスチンのアイソフォームとして、ヒトではＲＥＬＭβが報告されている。レジスチンは、前記のようにインスリン抵抗性を惹起するタンパク質として同定され、肥満とインスリン抵抗性及びII型糖尿病との関連が推測されていたが、それらの疾患との関連性は、明確には証明されていない。
一方、レジスチンのアイソフォームであるＲＥＬＭβは、約１４ｋＤａのタンパク質であり、生体内では２量体又は６量体を形成していると考えられている。また、正常組織では、小腸と大腸に発現が見られ、気管支上皮にも発現が認められる。
ＲＥＬＭβについて、最近、その発現を調節することによって、患者におけるアレルギー反応を減少させることが可能であることが示されている（特許文献１）。更に、肥満マウスでＲＥＬＭβの血中濃度が上昇することが報告されている（非特許文献１）。更に、ＲＥＬＭβを肝臓において過剰発現するトランスジェニックマウスは、高血糖、高脂血症、脂肪肝といったメタボリック症候群を呈することも報告されている（非特許文献２）。これらの報告は、ＲＥＬＭβがメタボリック症候群の発症と関連していることを強く示唆するものである（非特許文献３）。しかしながら、ＲＥＬＭβの生体内における生理活性は、未だ明確には解明されていない。

特表２００６−５１７９６２号公報

「ダイアベトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）」、２００５年、（イギリス）第４８巻、ｐ．９８４−９９２ 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００５年、（アメリカ合衆国）第２８０巻、ｐ．４２０１６−４２０２５ 「カレント・ダイアベティス・レビュー（Current Diabetes Reviews）」、２００６年（オランダ）第２巻、ｐ．4４９−４５４

本発明者は、ＲＥＬＭβの生体内における役割について鋭意研究したところ、驚くべきことに、ＲＥＬＭβが大腸癌の癌組織及び動脈硬化症の病変部において発現していることを見出した。そして、大腸癌、動脈硬化症、及びメタボリックシンドロームのバイオマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明の課題は、大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法及び検出キットを提供することにある。

本発明は、レジスチン様分子βを分析することを特徴とする、大腸癌の検出方法に関する。
本発明による大腸癌の検出方法の好ましい態様においては、前記レジスチン様分子βの分析が免疫学的分析方法であり、特には免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、及び酵素免疫測定法である。
また、本発明は、レジスチン様分子βを分析することを特徴とする、動脈硬化症の検出方法に関する。
本発明による動脈硬化症の検出方法の好ましい態様においては、前記レジスチン様分子βの分析が免疫学的分析方法であり、特には免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、及び酵素免疫測定法である。
更に、本発明は、レジスチン様分子βを分析することを特徴とする、メタボリックシンドロームの検出方法に関する。
本発明によるメタボリックシンドロームの検出方法の好ましい態様においては、前記レジスチン様分子βの分析が免疫学的分析方法であり、特には免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、及び酵素免疫測定法である。
また、本発明は、レジスチン様分子βに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、大腸癌の検出用キットに関する。
また、本発明は、レジスチン様分子βに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、動脈硬化症の検出用キットに関する。
更に、本発明は、レジスチン様分子βに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、メタボリックシンドロームの検出用キットにも関する。

本発明によれば、大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームを検出することが可能である。特には、大腸の組織において、ＲＥＬＭβが高発現している大腸癌を検出することが可能である。更に、動脈硬化症の組織において、ＲＥＬＭβが高発現している血管組織を検出することが可能である。

大腸癌を併発した潰瘍性大腸炎の生検組織の癌部、及び正常大腸癌組織における、ＲＥＬＭβタンパク質の発現を免疫組織染色によって、検出した顕微鏡写真であり、ＲＥＬＭｂ（３Ａ６）を５０倍希釈して、大腸癌を合併している潰瘍性大腸炎の症例を染色したものである。（Ａ）及び（Ｂ）は、いずれも大腸癌の部分を拡大したものであり、（Ｃ）は正常大腸組織のものである。ＲＥＬＭｂは大腸癌の細胞質に一致して陽性像を認められる。また、腫瘍細胞は管腔面で強く染まっており、管腔内にも茶色物質が見られることから、ＲＥＬＭｂを分泌している可能性が高いと考えられる。 大動脈粥状硬化病変組織における、ＲＥＬＭβタンパク質の発現を免疫組織染色によって、検出した顕微鏡写真である。ＲＥＬＭｂ（３Ａ６）を５０倍希釈して、大動脈粥状硬化病変の染色を行った。（Ａ）は弱拡大で、（Ｂ）はその拡大像を示す。バックグラウンドが強く出ておらず、染色状態は良好である。（Ａ）に示すとおり、大動脈の粥腫内の組織球の集族層に一致してＲＥＬＭｂの陽性像が認められ、（Ｂ）はその拡大であるが、組織球の細胞質が染色されている。この他に、数症例の病変を検討したが、いずれも同様の結果が得られた。 大動脈粥状硬化病変組織における、ＲＥＬＭβタンパク質の発現を免疫組織染色によって、検出した４００倍の顕微鏡写真である。図２の症例と別症例の大動脈粥状硬化巣内の免疫染色の拡大であるが、すべての組織球にＲＥＬＭｂが発現しているわけではなく、特に集族傾向の強い部分の組織球に高い発現が見られ、ＲＥＬＭβタンパク質が動脈硬化の成因に密接に関与している可能性が示唆された。 ＲＥＬＭβとレジスチンのアミノ酸配列を比較した図である。レジスチンは１０８アミノ酸、ＲＥＬＭβは１１１アミノ酸である。 モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いたＲＥＬＭβタンパク質のサンドイッチＥＬＩＳＡの検量線を示したグラフである。

［１］大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法
生活習慣病には、糖尿病、高脂血症、高血圧、高尿酸血症、動脈硬化症、がん（例えば、大腸癌）などが含まれ、生活習慣病が発症する背景として、肥満に加えて、高脂血症、高血圧、高血糖などの病態が複合した状態を、メタボリックシンドロームと呼んでいる。

前記の生活習慣病のうち、大腸癌は、結腸癌、直腸癌、肛門癌に分けることができる。生活習慣における大腸癌のリスク要因としては、過体重及び肥満が結腸癌のリスク要因として、飲酒及び加工肉（ベーコン、ハム、ソーセージなど）が大腸癌のリスク要因であると考えられている。
大腸癌による死亡者数は年々増加しており、女性では２００３年に悪性新生物による死亡原因のうちの第一位となり、男性でも２００３年に２万人以上が死亡しており（第４位）、大腸癌は大きな健康問題となっている。
大腸癌の診断方法として、遺伝性大腸癌については多くの遺伝子診断が行われているが、健康診断などで実施されている一般的な診断方法としては、便潜血反応でヘモグロビンを生化学的又は免疫学的に検出する便潜血検査が用いられている。しかしながら、便潜血検査では、大腸癌以外の出血も検出するため、大腸癌の検出率としては必ずしも満足できるものではなかった。また試料に病原菌が含まれる可能性もあり、検査をする人は検体の取り扱いに注意する必要がある。
一方、新しい診断法として、血漿中の抗原又は酵素などを腫瘍マーカーとして測定することも多く検討されていて、その代表的なものとしてＣＡ１９−９、ＣＥＡが大腸癌のバイオマーカーとて使用されている。しかし、ＣＡ１９−９は糖鎖抗原を認識しており、他の腫瘍マーカーと認識抗原がオーバーラップし、膵癌、胆管系の癌をはじめとする消化器癌の患者血中で上昇し、大腸癌に特異なマーカーではない。ＣＥＡも消化器癌に特異的ではあるが、正常人の大腸粘膜でも産生されていて大腸癌に特異的なマーカーになり得ない。このように、安全で簡便で検出精度の高い大腸癌の検出方法は今までなかった。
また、生検、内視鏡による肉眼分類、及び病理組織学的診断については、診断基準が整備されてきており、従来あった病理医の間における診断結果の相違は、解消されてきている。しかし、国際的には消化管上皮性腫瘍の診断には大きな格差があり、確定診断の可能な病理診断用の腫瘍マーカーもなかった。

また、動脈硬化症は、動脈硬化症のおき方や起きる部位によって、下記の３つのタイプに分けることができる。
アテローム（粥状）硬化：大動脈、脳動脈、及び冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールなどの脂肪からなる粥状物質が付着し、アテロームプラック（粥状硬化斑）ができるものである。
細動脈硬化：高血圧による変化で、脳や腎臓の細い動脈に起きやすく、梗塞を起こしたり、血管壁全体が破裂して出血したりする。
メンケルベルグ型（中膜）硬化：動脈の中膜にカルシウムが溜って、硬化し中膜がもろくなるものである。
動脈硬化症は、脳動脈で起きた場合、脳梗塞及び脳出血の原因となり、冠動脈で起きた場合、心筋梗塞及び狭心症などの虚血性心疾患の原因となり、大動脈で起きた場合、大動脈瘤及び大動脈解離の原因となり、腎動脈で起きた場合、腎硬化症及びそれによる腎不全の原因となり、末梢動脈で起きた場合、閉塞性動脈硬化症の原因となる。

メタボリックシンドロームは、動脈硬化性疾患（例えば、心筋梗塞及び脳梗塞）のリスクを高める複合型リスク症候群として規定されてきた概念であり、ＷＨＯ、アメリカ、及び日本においてその診断基準は、若干異なっているが、例えば、日本において日本肥満学会、日本動脈硬化学会などの８つの学会がまとめた診断基準は、以下の通りである。
まず、必須項目として、内臓脂肪蓄積（内臓脂肪面積が１００平方ｃｍ以上）のマーカーとして、ウエスト周囲径が、男性で８５ｃｍ以上、女性で９０ｃｍ以上である。この必須項目に加え、下記の３項目のうちの２項目以上に該当する場合は、メタボリックシンドロームと診断される。
血清脂肪異常（高脂血漿）：トリグリセリド値（血清中性脂肪）が１５０ｍｇ／ｄＬ以上か、血清ＨＤＬコレステロール値が４０ｍｇ／ｄＬ未満のいずれか、又は両方を満たすもの。
高血圧：最高（収縮期）血圧が１３０ｍｍＨｇ以上か、最低（拡張期）血圧が８５ｍｍＨｇ以上のいずれか、又は両方を満たすもの。
高血糖：空腹時血糖が１１０ｍｇ／ｄＬ以上。
これらのメタボリックシンドロームの状態を長期間持続させることにより、合併症が発生する確率が高まるため、メタボリックシンドロームを解消することにより、合併症を予防することが重要となっている。

本発明の検出方法では、ＲＥＬＭβを分析することにより、大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームを検出する。
本明細書におけるレジスチン様分子β（ＲＥＬＭβ）は、レジスチンのアイソフォームである。マウスではレジスチンのアイソフォームとして、ＲＥＬＭα、β、γの３つのアイソフォームが発見されており、ＲＥＬＭαは脂肪組織、心臓、肺及び舌での発現、ＲＥＬＭβは腸での発現、ＲＥＬＭγは造血組織での発現が確認されている。一方、ヒトでは前記のように、ＲＥＬＭβのみが発見されており、その生理的意義はまだ解明されていなかった。
ＲＥＬＭβは、約１４ｋＤａのタンパク質であり、生体内では２量体又は６量体を形成していると考えられている

本発明の検出法においては、ＲＥＬＭβの組織における発現を分析することも可能であるが、体液、例えば、血液（血清、血漿を含む）、髄液、尿、唾液中のＲＥＬＭβを分析することも可能である。また、単量体のＲＥＬＭβを分析することも可能であるが、ＲＥＬＭβに対する抗体を用いることで２量体、又は６量体のＲＥＬＭβをそのまま分析することも可能である。

本発明の検出方法において、ＲＥＬＭβを分析する方法としては、ＲＥＬＭβを定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＲＥＬＭβの存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗ＲＥＬＭβ抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。

ＲＥＬＭβの分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＲＥＬＭβに対するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＲＥＬＭβを用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）方法に従って、作成することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＲＥＬＭβのタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単独あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。

前記抗体、例えばポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を取得するための免疫抗原は、特に限定されるものではなく、生体試料から精製したＲＥＬＭβ抗原、遺伝子工学的に作成した組換えＲＥＬＭβ抗原、又は化学的に合成したＲＥＬＭβの部分ペプチドなど用いることが可能である。
但し、ヒトのＲＥＬＭβタンパク質は、レジスチンと相同性を有するため、相同性の低いＮ末端側の約半分のペプチドを用いることが好ましく、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６番〜６６番のアミノ酸配列からなるペプチドの全部又は一部を免疫抗原として用いることが好ましい。図４にレジスチンとＲＥＬＭβのアミノ酸配列の相同性を記載しているが、レジスチンは１０８アミノ酸、ＲＥＬＭβは１１１アミノ酸からなるタンパク質である。
また、大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、様々なＴａｇなどを結合させて発現させることもできる。

本発明に用いることのできるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫を行った動物から取得することができる。例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ＲＥＬＭβの１６番〜６６番のアミノ酸配列からなるペプチドにより、前記のように定期的に、免疫を行う。抗体価の上昇を確認し、尾静脈からリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に溶解したＲＥＬＭβの１６番〜６６番のアミノ酸配列からなるペプチドを接種する。その２〜３日後に、マウスから抗体を産生するリンパ球を含む脾臓を無菌的に摘出する。このリンパ球を、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、ミエローマ細胞と細胞融合させる方法により、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして樹立可能である。

細胞融合を行う場合は、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、リンパ球及びミエローマ細胞を融合させる。ミエローマ細胞は、各種の公知の細胞を用いることができるが、例えば、ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１又はＳＰ２／０−Ａｇ１４などの細胞が挙げることができる。融合した細胞は、選択培地、例えばＨＡＴ培地を用いて、融合しなかった細胞を死滅させることによって選択する。次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中の抗体産生の有無をスクリーニングする。スクリーニングは、前記ペプチドに対する特異抗体の産生を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定することによって実施することができる。

前記ハイブリドーマは、公知の任意の培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０で継代培養することができる。モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマを培養することによって、調製することができるが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ胎児血清を加え、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養することによって、培養上清中に抗体が産生される。また、マウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を回収することによって、腹水中に抗体を産生させることが可能である。モノクローナル抗体は、公知の方法により精製することができるが、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いた精製法、ＲＥＬＭβ抗原を結合させたアフィニティーカラムを用いる方法、又はイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる方法などで精製することができる。

免疫学的分析方法として、免疫組織染色法を用いる場合は、ＲＥＬＭβに対する抗体を用いることを除いては、公知の免疫組織染色法に従って検出を行うことが可能である。例えば、大腸癌、動脈硬化症の疑われる患者のバイオプシーから得られる種々の組織切片を常法により調製し、ＲＥＬＭβに対するマウスモノクローナル抗体を結合させる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として本発明の抗体に結合させ、３，３’−ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidine）処理を施して染色する。染色後顕微鏡観察を行い、褐色に染色された領域がＲＥＬＭβの発現している領域であることを判断することができる。

免疫学的分析方法として、ウエスタンブロット法を用いる場合も、ＲＥＬＭβに対する抗体を用いることを除いては、公知のウエスタンブロット法に従って検出を行うことが可能である。例えば、大腸癌、動脈硬化症の疑われる患者から得られる被検試料を定法に従って調製し、電気泳動を行う。電気泳動されたタンパク質を、ＰＶＤＦ膜などのブロット膜に転写する。ブロット膜を、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）でブロッキングする。その後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識したＲＥＬＭβに結合する抗体を接触させ、ＲＥＬＭβに結合させる。ブロット膜を洗浄し、酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。

また、免疫学的分析方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用して行うこともできる。例えば、まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＲＥＬＭβに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、ＲＥＬＭβが含まれる可能性のある被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とＲＥＬＭβを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＲＥＬＭβと結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＲＥＬＭβ−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。

前記の免疫組織染色に用いる抗体、ウエスタンブロッティングに用いる抗体、及びサンドイッチ法に用いる一次抗体又は２次抗体の種類は、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗体フラグメントなどを挙げることができる。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。

本発明の大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法において、ＲＥＬＭβの分析に用いる被検試料としては、ＲＥＬＭβを含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、便、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、大腸、血管の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、あるいは大腸、又は血管の生検標本が好ましい。
特に、前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる被検試料としては、血液、血清、血漿、便などを用いることが好ましい。

本発明の検出方法では、ＲＥＬＭβの存在の有無、あるいはＲＥＬＭβの量を測定することにより、大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームを検出することが可能である。例えば、被検試料として大腸の生検試料を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色法により、大腸組織でのＲＥＬＭβの発現を確認し、正常大腸組織との閾値を設定し比較することにより、大腸癌であるか否かを判定することができる。
また、被検試料として血管を用いる場合にも、前記免疫組織染色で、血管のＲＥＬＭβの発現を確認し、正常血管組織との閾値を設定し比較することにより、動脈硬化症であるか否かを判定することができる。
なお、大腸癌患者の癌組織と正常組織との閾値、及び動脈硬化症患者の血管組織と正常組織との閾値は、種々の条件、例えば、組織の調製状態、又は患者の状態などに応じて異なるため、一概には規定することはできないが、当業者であれば、正常組織と癌組織の染色性の差を比較することによって、決定することができる。

また、被検試料として血液等を用いる場合、生活習慣病の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＲＥＬＭβの量を測定し、健常者から採取した血液等中のＲＥＬＭβの量と比較することにより、前記患者が生活習慣病であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＲＥＬＭβの量の平均値と比べて、前記患者のＲＥＬＭβの量が有意に多い場合に前記患者は生活習慣病であると判定することができる。

［２］大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出用キット
本発明の検出用キットは、ＲＥＬＭβに特異的に結合する抗体又はその断片を含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる前記抗体断片としては、ＲＥＬＭβへの特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖを用いることができる。

本発明の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態で抗ＲＥＬＭβ抗体、あるいはその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として^３Ｈ、^１４Ｃ、又は^１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。

以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ＲＥＬＭβ抗体の作製》
本実施例１では、ＲＥＬＭβの抗原を作製し、その抗原をマウスに免疫し、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
（Ａ）ＲＥＬＭβタンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、すなわち、ＲＥＬＭβタンパク質の１６番〜６６番のペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ヒト大腸がん細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞からのｍＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより取得した。このＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１の制限酵素サイトＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ。得られたベクターｐＧＥＸ−ｈＲＥＬＭｂｅｔａ１６−６６により、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、ＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）を発現させた。ＲＥＬＭβタンパク質の発現した菌体を回収し、Glutathione Sepharose ４Ｂカラムを用いて精製し、１０ｍｇのＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）を得た。

（Ｂ）抗ＲＥＬＭβモノクローナル抗体の作製
前記の工程（Ａ）で得られた、ＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）を用いて、モノクローナル抗体の作製を行った。
ＰＢＳに溶解したＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）（２ｍｇ／ｍＬ）を、等量の完全フロイントアジュバントと混合し、０．１ｍＬを６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内に接種した。１週間後に、ＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）（２ｍｇ／ｍＬ）を、等量の不完全フロイントアジュバントと混合し、同様に免疫を行い、この追加免疫を３回繰り返した。合計５回の免疫を行った３日後に、ＰＢＳに希釈したＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）（０．１ｍｇ／ｍＬ）を尾静脈から注射した（最終免疫）。

最終免疫から３日後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、培地の入ったシャーレに回収した。脾臓をハサミで細切し、脾臓細胞をメッシュに通過させ、遠心チューブに回収した。ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、遠心操作により３回洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。この脾細胞を、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と混合し、遠心してペレットとした。このペレットに、５０％ポリエチレングリコール１ｍＬを、滴下し、穏やかに撹拌した。更に、ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、遠心により細胞を洗浄した。９６ウェル細胞培養プレートを用いてＨＡＴ培地により培養した。約１０日間の培養後に、ハイブリドーマのスクリリーニングを行った。

９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに、ＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）１μｇ／ｍＬを各１００μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを０．５％カゼインナトリウムを含むＰＢＳで３０分ブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ハイブリドーマの培養上清１００μＬをウェルに添加した。室温で６０分放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体１００μＬ（０．０８μｇ／ｍＬ）を加え、室温で１時間放置した後、３回洗浄を行った。ＯＰＤ基質溶液１００μＬを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、陽性のウェルを選択した。同時に、コントロールとして融合タンパク質であるＧＳＴタンパク質に対しても同様のスクリーニングを行い、陽性のウェルを非選択とし、ＲＥＬＭβのみに作用するウェルを選択した。このスクリーニングにより、３株のハイブリドーマ１Ｃ１、３Ａ６、１Ｅ１を取得した。以下、各ハイブリドーマから産生される抗体を、それぞれ１Ｃ１抗体、３Ａ６抗体、１Ｅ１抗体と称する。

《実施例２：大腸癌組織からのＲＥＬＭβの発現の検出》
本実施例２では、大腸癌組織において、ＲＥＬＭβの検出を行った。
被検材料として、大腸癌を併発した潰瘍性大腸炎の生検組織を用い、定法に従い、固定し、パラフィン包埋した。被検材料を、緩衝ホルマリン［組成：１０％ホルマリン原液，リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）］で固定した後、エタノールで脱水し、続いて、クロロホルムで置換した後、融点５６〜５８℃のパラフィンを用いて包埋した。得られたパラフィン包埋標本から、ミクロトームを用いて、連続薄切切片（約１０μｍ）を作製し、この切片をスライドガラスに貼布し、充分に乾燥させた。次に、得られたスライドグラスを、キシレン×３回、１００％エタノール×２回、９５％エタノール×１回、及び８０％エタノール×１回の工程を各３分間ずつ行い脱パラフィンし、精製水で洗浄した。

免疫染色は、ＤＡＫＯ ＥＮＶＩＳＩＯＮ Ｋｉｔ（ＤＡＫＯ社）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。脱パラフィン操作を実施した前記スライドグラス標本を、３％過酸化水素水で５分間処理後、ＴＢＳＴで５分間、続いて２％ブタ血清を含むＴＢＳＴで１０分間ブロッキングを行った。ブタ血清を含むＴＢＳ−Ｔで２ｍｇ／ｍＬに希釈した一次抗体（３Ａ６抗体）で３０分間インキュベート後、ＴＢＳＴで５分間×３回洗浄し、ポリマー試薬を加え、更に３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴで５分間×３回洗浄後、ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を滴下し、染色した。その後、ヘマトキシリン・エオジン液で核染色を行い、透徹工程として、８０％エタノール×１回、９５％エタノール×１回、１００％エタノール×２回、及びキシレン×３回の各工程を１分ずつ行った。組織切片をエントランニューで封入後、顕微鏡下でＲＥＬＭβの発現を観察した。ＲＥＬＭβが発現している細胞は、茶褐色に染色された。

図１Ａ及び図１Ｂは、潰瘍性大腸炎において大腸癌を発症した症例の癌部を拡大したものである。ＲＥＬＭβは、大腸癌の細胞質に一致して、強く発現している。特に腫瘍細胞の管腔面において、ＲＥＬＭβの発現が強く、管腔内にも褐色の色素が見られることから、ＲＥＬＭβが消化管内に分泌している可能性が示唆された。図には示していないが、潰瘍性大腸炎（非癌部）においては、ＲＥＬＭβの発現は、後述の正常大腸癌組織と同じように、非常に低い発現量であった。
同様に、８０症例の大腸癌患者から得られた大腸癌の組織について、免疫組織染色を行った。全ての症例から得られた組織において、癌部ではＲＥＬＭβの発現の強い発現が見られ、正常組織や潰瘍性大腸炎などの非癌部においては、ＲＥＬＭβの発現は非常に低いものであった。

《比較例１：ＲＥＬＭβの正常小腸及び正常大腸での発現の検出》
本比較例１は、正常大腸でのＲＥＬＭβの発現の検出を行った。
被検材料として、正常大腸組織を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。図１Ｃの正常大腸癌におけるＲＥＬＭβの発現は、図１Ａ及びＢの大腸癌の癌部と比較すると、非常に低い発現量であった。

《実施例３》
本実施例３では、動脈硬化症の組織においてＲＥＬＭβの検出を行った。
被検材料として、大動脈粥状硬化病変組織を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。図２Ａは弱拡大像であり、図２Ｂは、組織球の集族層の強拡大像である。組織球の細胞質にＲＥＬＭβの発現が強く見られた。また、図３Ａ及びＢは、図２の症例と異なる症例の４００倍拡大像である。ＲＥＬＭβは、すべての組織球に発現しているわけではなく、集族傾向の強い部分の組織球にＲＥＬＭβの強い発現が見られた。
この他に、全部で１０症例の動脈硬化を起こしている患者の動脈硬化巣について、免疫組織染色を行ったが、全ての症例において組織球の細胞質に、ＲＥＬＭβの強い発現が見られた。

《実施例４》
本実施例４では、ＲＥＬＭβに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による免疫学的分析方法の構築を行った。
ポリクローナル抗体は、以下のように作成したものを用いた。実施例１で作成したＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）１００μｇ／ｈｅａｄを、２週間おきに完全フロイントアジュバント、又はフロイントアジュバントを用いてウサギの背部及び足しょに免疫した。４回以上の免疫を行った後に、血清を採取した。ポリクローナル抗体の精製は、免疫に用いたＧＳＴ融合ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）のＧＴＳを除くため、トロンビンでＧＳＴ部分を切断し、ＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）を得た。このＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）をアフィニティーカラム（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ１０）に結合させ、抗血清中の抗ＲＥＬＭβ抗体を精製した。
免疫学的分析は、まずＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した３Ａ６モノクローナル抗体１００μＬを、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＣ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に加え、４℃、一晩で、固相化した。Ｐｉｅｒｃｅ社Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｔ２０（ＴＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで、２５℃１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に１％ＢＳＡを添加した希釈液で、標準物質として前記のＧＳＴを切断したＲＥＬＭβタンパク質（１６−６６）を１００ｎｇ／ｍＬから１．５ｎｇ／ｍＬまで、段階希釈し、１００μＬずつ添加した。２５℃、２時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。０．１μｇ／ｍＬの精製したラビット抗ＲＥＬＭβポリクローナル抗体１００μＬを加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ標識抗ラビットＩｇ抗体（０．３μｇ／ｍＬ：ＧＥ社）を加え、２５℃、１時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで、４回洗浄した後、１００μＬのＰＯＤ基質溶液［２．２ｍＭ−ｏ−フェニレンジアミン、０．０３％過酸化水素水を含む０．０７５Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１００μＬを加え、２５℃で１５分間反応させ、１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。図５に示すように、Ｌｏｇｉｓｔｉｃ５ＰＬ（Ｃｏｏｋ）ＣｕｒｖｅによくフィットしＲＥＬＭβの量をよく反映する検量線を得ることができた。

本発明の検出方法及び検出キットは、大腸癌、動脈硬化症、及びメタボリックシンドロームの検出の用途に適用することができる。

Claims (3)

1. レジスチン様分子βを分析することを特徴とする、動脈硬化症の検出方法。
2. 前記レジスチン様分子βの分析が免疫学的分析方法である、請求項１に記載の動脈硬化症の検出方法。
3. レジスチン様分子βに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、動脈硬化症の検出用キット。