CN101368969A - Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肝纤维化程度相关IV型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。根据本发明试剂盒包括：1)IV型胶原蛋白校准品；2)亲和素包被的固相载体；3)IV型胶原蛋白的抗体酶标记物；4)生物素化的IV型胶原蛋白的抗体；5)化学发光底物；以及6)浓缩洗涤液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以IV型胶原蛋白纯品配制校准品；2)以亲和素包被固相载体；3)以酶标记IV型胶原蛋白的抗体；4)使IV型胶原蛋白的抗体生物素化；5)配制化学发光底物；6)配制浓缩洗涤液；7)分装上述校准品、标记物和化学发光底物和洗涤液；以及6)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肝纤维化早期的检测指标IV胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝脏是人体消化***中最大的消化腺，又是新陈代谢的重要器官。肝纤维化是指肝脏纤维***的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果，各种原因引起的肝细胞脂肪变、淤胆及炎症等，达到一定严重程度均可刺激肝内局部的贮脂细胞、静止的纤维母细胞增生并形成胶原纤维，增多的纤维组织形成细小的条索和菲薄的间隔，使肝脏纤维化变导致肝功能受损的综合症。肝纤维化是肝硬化的早期阶段，对它早期诊断、及时抗纤维化治疗，对肝硬化的防治、延缓、逆转等都起到极大的作用。

随着肝纤维化研究的深入，不断地揭示了胶原结构、功能与病理学的内在关系。尤其对IV型胶原蛋白(英文缩写CL-IV)的研究更加深入，在肝纤化的早期诊断上更有价值，因此检测血液中的IV胶原蛋白的含量对肝纤维化的诊断、治疗效果和愈后的判断具有重要意义。到目前为止，经肝穿刺或经腹腔镜肝活检，进行组织病理学检查仍是诊断肝纤维化和肝硬化的“金标准。但是肝活检技术也有其局限性，因为慢性肝炎等病变虽然是弥漫性的，但很难保证一次取材能反映整个肝脏的全貌，尤其是肝纤维化和肝硬化时细针负压肝穿刺难以获得足够的标本给诊断带来一定的困难。

目前，肝纤维化的血清学检测指标IV型胶原蛋白的检测方法主要有放免法和酶联免疫法。放射免疫分析法操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等问题；而酶联免疫分析法灵敏度低，线性范围窄等缺点。

化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，是在抗原-抗体特异性识别基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术--化学发光免疫分析技术，由于这种方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，仪器设备简单，试剂价格低廉，方法稳定、快速等优点，更易推广应用。

发明内容

本发明的目的正是为了克服上述已有技术上的缺点与不足，采用抗人IV型胶原蛋白单抗包被微孔板的一种双抗体夹心一步法测定人血清中IV型胶原蛋白含量的抗人IV型胶原蛋白化学发光定量测定试剂盒，其特点是操作简便、快速、灵敏、稳定，可迅速、准确的判断和监控病程。

本发明提供了一种肝纤维化的指标IV型胶原蛋白(CL-IV)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备的方法。

根据本发明试剂盒包括：

1)IV型胶原蛋白校准品；

2)已包被亲和素的固相载体；

3)酶标记的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；

4)生物素化的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；以及

5)上述酶所作用的化学发光底物；

6)浓缩洗涤液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。

优选地，上述试剂盒中，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)以IV型胶原蛋白纯品配制校准品；

2)以亲和素包被固相载体；

3)以酶标记IV型胶原蛋白的单抗或多抗；

4)使IV型胶原蛋白的单抗或多抗生物素化；

5)配制化学发光底物；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述IV型胶原蛋白的校准品、生物素化的IV型胶原蛋白单抗或多抗、酶标记的IV型胶原蛋白的抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

在根据本发明的方法中，其中所述包被固相载体的步骤2)包括以下方法：

用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。

当IV型胶原蛋白的单抗或多抗酶标记物为辣根过氧化物酶时，采用过碘酸钠法进行标记，其具体原理为：辣根过氧化物酶为一种分子量为44,000的糖蛋白，含糖量达到18％。本发明使用过碘酸钠氧化与酶活性无关的糖基，生成的醛基与抗体上的氨基形成Sciff’s碱，接着加入硼氢化钠将其还原成稳定的结合物，最后往加入酶标记抗体中加入等量的甘油进行保存。

当IV型胶原蛋白的单抗或多抗酶标记物为碱性磷酸酶标记时，采用戊二醛法联接。

具体的上述包被方法剂盒可以包括IV型胶原蛋白校准品、亲和素包被板、生物素化的抗体、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述IV型胶原蛋白校准品为标准级，纯度不低于90％、亲和素包被板为48或96孔的微孔板条、过氧化物酶标记IV型胶原蛋白单抗或多抗、生物素标记IV型胶原蛋白单抗或多抗、化学发光底物液为鲁米诺、浓缩洗涤液为Tris-HCl。

本发明“IV型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可定量检测IV型胶原蛋白的含量，根据IV型胶原蛋白含量的多少对肝纤维化、糖尿病和矽肺等疾病的诊断及其病程的进行监控。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

本发明“IV型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的各项指标均达到或优于酶联免疫分析法。本发明的检测***为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的IV型胶原蛋白单抗与载体上包被的IV型胶原蛋白单抗或多抗和被测样品的IV型胶原蛋白抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。另外，这种模式还便于操作和生产。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度大大提高，可为肝纤维化早期诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

附图说明

图1为本发明的IV胶原蛋白定量测定试剂盒临界值的确定。

图2为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。

图3本发明试剂盒和酶联免疫试剂盒相关性。

具体实施方式

实施例1 制备本发明的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒

一、酶标抗体制备和生物素偶联抗体的制备

1、辣根过氧化物酶标记IV型胶原蛋白抗体的制备

溶解4.4mg HRP于1mL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min，经1mmol/L醋酸钠缓冲液，pH值为4.4透析后加入8mgIV型胶原蛋白单抗，搅拌2h，最后用200mmol/L NaBH4进行还原，经0.02MPB缓冲液透析后，加等体积甘油，—20℃以下保存。

2、生物素偶联IV型胶原蛋白抗体的制备

(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL；

(2)用0.1mol/LpH值为9.0的NaHCO₃将纯化的IV型胶原蛋白抗体稀释为1～2mg/mL；

(3)按BNHS与抗体容积比为1：8或重量比1：7左右混合，室温搅拌下反应2～4h；

(4)装入透析对0.05mol/L pH值为7.2的PBS，4℃透析过夜，结合物加等体积甘油，小量分装，—20℃以下保存备用。

3、生物素化抗体、酶标记IV型胶原蛋白抗体稀释液的配制

Tris              12.120g

BSA               5g

Proclin 300       1mL

双蒸水            1000mL

4、生物素化抗体和酶标记IV型胶原蛋白抗体工作液的配制

将制备的生物素化抗体、酶标记IV型胶原蛋白抗体用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为分别为1:4000、1:5000。

二、IV型胶原蛋白校准品的制备

用动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入IV型胶原蛋白纯品配制而成，制备的最终浓度为0、20、60、180、400、800ng/ml。

三、亲和素固相包被板的制备

(1)包被

无水碳酸钠            0.795g

碳酸氢钠              1.47g

双蒸水                500mL

溶解混匀后，调整PH至9.6，加入适量亲和素混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔130μL，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

NaH₂PO₄·2H₂O           0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O          2.9g

BSA                    5g

Proclin300             1ml

双蒸水                 定容至1000ml

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调整pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3-4小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

四、化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

1)化学发光底物A液

鲁米诺       10mM        1.7716g

4-羟基联苯   0.3mM       0.051g

4-碘苯硼酸   0.05mM      0.012g

硼酸                     11.4g

硼砂                     4.9g

双蒸水       定溶        1000mL

pH           8.0～10.0

2)化学发光底物B液

过氧化脲     3.5mM        0.329g

Tween20      0.1％        1ml

Na₂HPO₄·12H₂O             51.58g

NaH₂PO₄·2H₂O              8.74g

双蒸水       定溶         1000mL

pH           7.0～7.6

使用时A液与B液等比例混合。

五、20倍洗涤液

Tris             24g

NaCl             160g

KCl              4g

HCl              15ml

去离子水         1000ml

调整PH至7.4

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成IV型胶原蛋白定量测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与生物素化抗体的活性、亲和素包被载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液，找到最佳的浓度条件，并且，配制出了能够使生物素偶联抗体和酶标记物长期保持活性的稀释液，通过多次方阵交叉试验确定了生物素化的抗体与酶标记物混合的适当比例为1:5000、1:3000。

本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明：在加入化学发光底物液后5-30分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。

实施例2～3  制备本发明的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒

除以塑料珠、塑料管作为载体其余均以与实施例1相同的方法制备IV型胶原蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例4  制备本发明的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒

除以磁性颗粒作为包被载体，采用戊二醛方法与亲和素偶联其余均与实施例1相同的方法制备IV型胶原蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例5  制备本发明的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒

除以碱性磷酸酶标记IV型胶原蛋白单抗或多抗、以AMPPD作为化学发光底物外，其余均以与实施例1相同的方法制备IV型胶原蛋白定量测定试剂盒。

1)碱性磷酸酶标记的制备

IV型胶原蛋白单抗或多抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，用PBS充分透析后，加等体积甘油，—20℃以下保存。

2)化学放光底物AMPPD配方

Tris                24g

HCl                 15mL

NaCl                160g

KCl                 4g

Proclin 300         1mL

双蒸水              1000mL

AMPPD               200mL

溶解后混合均匀。

实施例6  本发明的IV型胶原蛋白定量试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒的具体操作如下：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，***板架上。

3)反应孔中分别加各浓度校准品每孔加0、20、60、180、400、800ng/ml各25μl，每次实验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶标记物(生物素化抗体50μl；酶标记抗体50μl)100μl，用微量震荡器充分振荡混匀，37℃温育1小时。

4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5)各孔加化学发光底物液100μl(A：B按1：1混合)，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

6)必须于加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量。

7)使用Log(x)-Log(y)的双对数数据拟合方式，进行标准曲线的建立，计算实验测定结果。

实施例7  正常人的IV型胶原蛋白含量及临界值的确定

取300例健康人血清用实施例1中制备的“IV型胶原蛋白定量测定试剂盒(化学发光法)”测定结果如下：

300例健康人血清，求得出健康人测定值的平均值为31.88ng/ml，标准偏差为19.63ng/ml，计算出的平均值加上2.5倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值，其结果为80.95ng/ml。

实施例8  本发明的试剂盒酶联免疫试剂盒对比试验

正常人血样样本300份，确诊急性肝炎样本21例，慢性肝炎样本33例，肝纤维化样本66例，诊断符合1995年中华医学会《病毒性肝炎防治方案》中的肝纤维化标准。

采用上述两种IV胶原蛋白测定试剂盒平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。

对上述两种IV胶原蛋白检测试剂盒分别进行精密性、特异性、灵敏度、准确性(回收率)等性能指标评价。检测结果如表1-3：

表1 两种IV胶原蛋白检测试剂的性能指标评价

表2 两种IV胶原蛋白检测试剂临床样本含量检测结果(单位：ng/ml)

 

	本发明试剂盒	IV胶原蛋白酶联免疫检测试剂盒
			正常对照样本(n＝300)	31.88±49.06	22.51±57.10
急性肝炎样本(n＝21)	23.76±11.47	20.06±14.98
			慢性肝炎样本(n＝33)	157.82±31.95	122.47±39.04

 

肝纤维化样本(n＝66)

417.85±77.09

355.61±51.26

表3 两种IV胶原蛋白检测试剂的检测结果汇总

表1-3所述数据表明，本发明试剂盒精密性、特异性、回收率和灵敏度优于市场主流IV胶原蛋白酶联免疫检测试剂盒，灵敏度显著优于市场主流酶联免疫检测试剂盒。酶联免疫检测试剂盒检出5份假阳性、2份假阴性，而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符，与酶联免疫检测试剂盒的临床符合率为98.65％、相关系数为R²＝0.9418(见图2)。

Claims (9)

1.一种抗人IV型胶原蛋白定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)IV型胶原蛋白校准品；

2)亲和素包被的固相载体；

3)酶标记的IV型胶原蛋白单抗或多抗；

4)生物素化的IV型胶原蛋白单抗或多抗；

5)上述酶所作用的化学发光底物；以及

6)浓缩洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁白色微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢。

5.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以IV型胶原蛋白纯品配制校准品；

2)以亲和素包被固相载体；

3)以酶标记IV型胶原蛋白的单抗或多抗；

4)使IV型胶原蛋白的单抗或多抗生物素化；

5)配制化学发光底物；

6)浓缩洗涤液；

7)分装上述IV型胶原蛋白的校准品、生物素化的IV型胶原蛋白单抗或多抗、酶标记的IV型胶原蛋白的单抗或多抗、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤2)采用以下方法：用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

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