JP5787756B2 - 3−ヒドロキシアルカン酸の酵素的脱炭酸によるアルケンの製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的プロセスによってアルケンを作製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、3-ヒドロキシアルカノアートタイプの分子から末端アルケン(特に、プロピレン、エチレン、1-ブチレン、イソブチレンまたはイソアミレン)を製造するための方法に関する。
多数の化合物が、現在、石油化学製品から誘導されている。アルケン(例えば、エチレン、プロピレン、種々のブテン、またはペンテン)は、例えばポリプロピレンまたはポリエチレンを製造するために、プラスチック産業において、ならびに化学産業の他の領域および燃料の領域において、使用されている。
[1] デカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって3-ヒドロキシアルカノアートを変換する工程を含むことを特徴とする、末端アルケンを製造するための方法。
[2] 前記アルケンの炭素2における2つの置換基のうちの少なくとも1つが、直鎖または分岐鎖のアルキル基であることを特徴とする、[1]の方法。
[3] 3-ヒドロキシブチラートをプロピレンへと変換する工程を含む、[1]または[2]の方法。
[4] 3-ヒドロキシバレラートを1-ブチレンへと変換する工程を含む、[1]または[2]の方法。
[5] 3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートをイソブチレンへと変換する工程を含む、[1]または[2]の方法。
[6] 3-ヒドロキシ-3-メチルバレラートをイソアミレンへと変換する工程を含む、[1]または[2]の方法。
[7] 前記酵素が、MDPデカルボキシラーゼ活性、EC 4.1.1.33を有する、前記のいずれかの方法。
[8] 前記酵素が、配列番号:1〜16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または該配列の1つに対して少なくとも15%、好ましくは50%、80%、もしくは90%の配列同一性を有する配列を含む、前記のいずれかの方法。
[9] 前記酵素が、配列番号:6の配列の全体もしくは一部を含むか、またはそれに対して少なくとも15%、好ましくは50%、80%、もしくは90%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、前記のいずれかの方法。
[10] 前記酵素が、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを末端アルケンへと変換する活性が増大した突然変異デカルボキシラーゼである、前記のいずれかの方法。
[11] デカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって、好ましくは、配列番号:6の配列の全体もしくは一部を含むか、またはそれに対して少なくとも15%、好ましくは50%、80%、もしくは90%の配列同一性を有する配列を含む酵素によって、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートを変換する工程を含むことを特徴とする、イソブチレンを製造するための方法。
[12] Rが、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基であり、かつ直鎖、分岐鎖、もしくは環式のアルキル基、または任意の他の一価の有機基でもあり得る、一般式R-O-PO 2 H-O-PO 3 H 2 によって表され、リン酸無水物ファミリーに好ましくは由来する補因子が、反応へ添加される、前記のいずれかの方法。
[13] Rが、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基であり、かつ任意の直鎖、分岐鎖、もしくは環式のアルキル基、または任意の他の一価の有機基でもあり得る、一般式R-O-PO 2 H-CH 2 -PO 3 H 2 を有し、メチレンジホスホナートモノエステルのファミリーに好ましくは由来する補因子が、反応へ添加される、前記のいずれかの方法。
[14] 前記変換が補助基質の存在下で起こり、該補助基質が、好ましくは、リン酸無水物を含む化合物であり、かつ好ましくは、ATP、rNTP、dNTP、またはいくつかのこのような分子の混合物、ポリホスファート、またはピロホスファートである、前記のいずれかの方法。
[15] 前記変換する工程が、無細胞系においてインビトロで行われることを特徴とする、前記のいずれかの方法。
[16] 前記変換する工程が、前記デカルボキシラーゼを産生する微生物の存在下で、好ましくは天然のまたは改変された該デカルボキシラーゼを過剰発現する微生物の存在下で、行われることを特徴とする、前記のいずれかの方法。
[17] 炭素源から末端アルケンを直接産生するように、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを内因的に産生しかつ天然のまたは改変された前記デカルボキシラーゼも発現または過剰発現する、天然または人工の特性を有する微生物の使用を特徴とする、前記のいずれかの方法。
[18] 前記微生物が、株アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)もしくはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の細菌であるか、または、好ましくはプラスミドによる染色体改変もしくは形質転換によって、1つもしくは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを過剰産生するように組換えられた、細菌、酵母、もしくは真菌である、[17]の方法。
[19] 前記炭素源が、グルコースもしくは任意の他のヘキソース、キシロースもしくは任意の他のペントース、グリセロールもしくは任意の他のポリオール、または、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、ポリ-3-ヒドロキシアルカノアート、もしくは任意の他のポリマーである、該ポリマーをモノマーへ分解するためのシステムの存在下、例えば好適な酵素(アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ポリ-3-ヒドロキシアルカノアーゼ)および/または特定の化学的条件の存在下で行われる、[17]または[18]の方法。
[20] 溶液中に存在するCO 2 から末端アルケンを直接産生するように、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを内因的に産生しかつ天然のまたは改変されたデカルボキシラーゼも過剰発現する、天然または人工の特性を有する光合成微生物、特にシアノバクテリアまたは微細藻類の使用を特徴とする、[17]の方法。
[21] 炭素源の3-ヒドロキシアルカノアートへの変換を可能にする第1の微生物の使用、および、3-ヒドロキシアルカノアートの末端アルケンへの変換を可能にする、単離されたかまたは第2の微生物によって発現されたデカルボキシラーゼの使用を特徴とする、前記のいずれかの方法。
[22] 3-ヒドロキシアルカノアートの脱炭酸によって末端アルケンを製造するための、植物または非ヒト動物などの、デカルボキシラーゼを発現する多細胞生物の使用を特徴とする、前記のいずれかの方法。
[23] 前記多細胞生物が、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを合成するように特定の代謝経路においてさらに改変されていることを特徴とする、[22]の方法。
[24] 反応から脱気(degas)する末端アルケンのガスを収集する工程を含む、前記のいずれかの方法。
[25] 微好気性条件下で行われるという事実を特徴とする、前記のいずれかの方法。
[26] 3-ヒドロキシアルカノアートから末端アルケン化合物を製造するための、デカルボキシラーゼ酵素またはデカルボキシラーゼを産生する微生物の使用。
[27] 前記酵素が、配列番号:6の配列の全体もしくは一部を含むか、またはそれに対して少なくとも15%、好ましくは50%、80%、もしくは90%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、[26]のデカルボキシラーゼ酵素の使用。
[28] デカルボキシラーゼを産生する微生物、好適な培養培地、および3-ヒドロキシアルカノアート化合物、または、微生物によって3-ヒドロキシアルカノアート化合物へ変換され得る炭素源を含む、組成物。
[29] 炭素源から末端アルケンを直接産生するように、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを内因的に産生しかつ天然のまたは改変されたデカルボキシラーゼも発現または過剰発現する、天然または人工の特性を有する、多細胞生物または微生物。
− 3-ヒドロキシプロピオナートはエチレンへと変換され;または
− 3-ヒドロキシブチラートはプロピレンへと変換され;または
− 3-ヒドロキシバレラートは1-ブチレンへと変換され;または
− 3-ヒドロキシ-3-メチルブチラート(または3-ヒドロキシイソバレラート)はイソブチレンへと変換され;または
− 3-ヒドロキシ-3-メチルバレラートはイソアミレンへと変換される。
「3-ヒドロキシアルカノアート」は、本明細書において使用される場合、共通のモチーフとしての3-ヒドロキシプロピオナート(図1)、および任意で炭素3上に1つまたは2つのアルキル置換を含む任意の分子を意味する。前記アルキル残基または基は、直鎖または分岐鎖であり得る。本明細書において使用される場合、用語「アルコイル」および「アルキル」は、同一の意味を有し、交換可能である。同様に、用語「残基」および「基」は、同一の意味を有し、交換可能である。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基は、前記アルキル基の例である。炭素3は、2つのアルキル置換が異なる場合、キラル中心となる。2つの形態のうちの1つ、例えば、R形態が、天然に産生される主要な形態であったとしても、本定義は、2つのキラル形態を包含する。3-ヒドロキシアルカノアートの例を図3に示す。任意で、アルキル置換基が炭素2上に付加され得、その場合、これはまたキラルとなり得る(2つの置換基が異なる場合)。同様に、本発明における3-ヒドロキシアルカノアート基質の立体配置は、全ての立体異性体を包含する。好ましい様式において、3-ヒドロキシアルカノアートは、3-ヒドロキシプロピオナートまたは3-ヒドロキシプロピオナートの変形もしくは誘導体のいずれかに対応し、ここで、炭素3上に保有される2つの水素原子または2つのうちの1つは、炭素および水素原子のみから構成されるモチーフによって置換されており、該置換基の炭素原子の数は、1〜5個、好ましくは1〜3個の範囲にある(例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基またはイソブチル基)。接尾辞「オアート」は、本明細書において使用される場合、カルボン酸イオン(COO-)またはカルボン酸(COOH)のいずれかを交換可能に意味し得る。それは、エステルを示すためには使用されない。特定の態様において、3-ヒドロキシアルカノアートは、以下の式によって表される:HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OHまたはO--CO-CH2-C(R1)(R2)-OH。
− 「エチレン」は、エテンを示すために使用される。
− 「プロピレン」は、プロペンを示すために使用される。
− 「ブチレン」は、ブテンを示すために使用される。
− 「イソブチレン」は、2-メチルプロペンまたはイソブテンを示すために使用される。
− 「アミレン」は、ペンテンを示すために使用される。
− 「イソアミレン」は、2-メチル-ブタ-1-エンまたはイソペンテンを示すために使用される。
− 「プロピオナート」は、プロパン酸またはプロパン酸イオンを示すために使用される。
− 「ブチラート」は、ブタン酸またはブタン酸イオンを示すために使用される。
− 「バレラート」は、ペンタン酸またはペンタン酸イオンを示すために使用される。
特に、本発明は、3-ヒドロキシアルカノアート化合物の酵素的脱炭酸の工程を含む、末端アルケンを製造するための方法を提供する。本発明はまた、この反応を触媒するためのデカルボキシラーゼの使用、ならびに特に、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼタイプの酵素の使用、ならびに3-ヒドロキシブチラート、3-ヒドロキシバレラート、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラート(または3-ヒドロキシイソバレラート)および3-ヒドロキシプロピオナートなどの基質の使用に関する。本発明は、エチル二リン酸、プロピル二リン酸、メチル二リン酸、該分子のアナログ、およびピロホスファートを含む、補因子の使用を記載する。本発明は、さらに、ATPまたはリン酸無水物結合を含む他の化合物などの、補助基質の使用を記載する。
サッカロマイセス・セレビシエのMDPデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドから合成し、細菌における発現を可能にするpETプラスミド(Novagen)中にクローニングする。次いで、前記プラスミドを、エレクトロポレーションによって細菌株BL21(Invitrogen)中へ形質転換する。アンピシリンを含有するペトリ皿上に細菌を画線培養し、37℃でインキュベーションする。翌日、細菌コロニーを無作為に選択し、アンピシリンを含有するLB培地50 mlに接種するために使用する。振盪しながら培養物を24時間インキュベーションし、その後、培養物を遠心分離し、細菌を超音波処理によって溶解し、総タンパク質抽出物を調製する。抽出物のアリコートを、形質転換されていない同一の株からのタンパク質抽出物および分子量マーカーと共に電気泳動ゲル上にロードする。形質転換された株に対応するレーンは約30 kDの単一バンドを含み、これは予想されるタンパク質のサイズに対応するが、該バンドは、形質転換されていない細菌がロードされたレーン中には存在しない。
3-ヒドロキシ-3-メチルブチラート(Sigma、β-ヒドロキシイソ吉草酸との名称で参照番号55453)を、10 g/lの濃度で懸濁する。従来法によってメバロノラクトンおよび他の試薬(Sigma)からメバロン酸二リン酸を合成し、10 g/lの濃度で再懸濁する。
バイアル1および4:水5μlを添加する(基質無し)。
バイアル2および5:メバロン酸二リン酸調製物5μlを添加する(陽性対照)。
バイアル3および6:3-ヒドロキシ-3-メチルブチラート(HIV)調製物5μlを添加する。
バイアル1、2および3:次に水5μlを添加する(酵素無し)。
バイアル4、5および6:実施例1に記載の酵素調製物5μlを添加する。
前の実施例のバイアル6に記載のものと同一の反応を行うが、試料のうち1つにおいて、注文生産のエチル二リン酸を補因子として添加する。この実施例において3個のバイアルを使用する。第1のバイアルは、前の実施例に記載の量で、緩衝液、ATP、および酵素抽出物を含有する。第2のバイアルは、同一の成分を含有するが、前の実施例に記載の量で3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートもさらに含有する。第3のバイアルは、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートに加えて、10 mg/lエチル二リン酸を10μl含有する。前の実施例におけるように、イソブチレン形成を、赤外線またはフレームイオン化検出を備えるガスクロマトグラフィーによって測定する。エチル二リン酸が存在する場合、経時的に産生されるイソブチレンの量は著しく多くなることが分かる。
MDPデカルボキシラーゼファミリーからの酵素をコードする63個の遺伝子のライブラリーを得、基質としてのHIVに対する活性について試験した。
メバロン酸二リン酸(MDP)デカルボキシラーゼファミリーEC 4.1.1.33をコードする遺伝子を、メチオニン開始コドンの直後のN末端に6-ヒスチジンタグを有する、真核生物遺伝子の場合はpET 25bベクター(Novagen)に、原核生物起源の遺伝子についてはpET 22b(Novagen)に、クローニングした。コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞(Novagen)を、熱ショックによってこれらのベクターで形質転換した。0.5 Mソルビトール、5 mMベタイン(betain)、100μg/mlアンピシリンを含有するTB培地において30℃で振盪(160 rpm)しながら、600 nmでのODが0.8〜1の範囲に達するまで、細胞を増殖させた。次いで、イソプロピルB-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を1 mMの最終濃度まで添加し、タンパク質発現を20℃で一晩(約16時間)継続した。4℃、10,000 rpmで20分間の遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを-80℃で凍結させた。
細胞1.6 gを氷上で解凍し、300 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM DTTを含有する50 mM Na2HPO4 pH 8 5 mlに再懸濁した。20マイクロリットルのリソナーゼ(lysonase)(Novagen)を添加した。細胞を室温で10分間インキュベーションし、次いで、20分間氷へ戻した。0℃の超音波水浴における5分間×3回の超音波処理によって、細胞溶解を完了し;試料をパルス間でホモジナイズした。次いで、細菌抽出物を、4℃、10,000 rpmで20分間の遠心分離によって清澄化した。
清澄化された細菌溶解物を、6-Hisタグタンパク質の吸着を可能にするPROTINO-1000 Ni-IDAカラム(Macherey-Nagel)上にロードした。カラムを洗浄し、関心対象の酵素を、300 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、250 mMイミダゾールを含有する50 mM Na2HPO4 pH 8 4 mlで溶出した。次いで、Amicon Ultra-4 10 kDa細胞(Millipore)内で溶出液を濃縮し、最終体積250μlとした。タンパク質をBradford法によって定量した。
所望の酵素反応(3-ヒドロキシ-3-メチルブチラート、または3-ヒドロキシイソバレラート、またはHIVの変換)を、緩衝液および反応pHが異なる2つの実験条件下で試験した。
実験条件番号1
100 mMクエン酸塩
10 mM MgCl2
10 mM ATP
20 mM KCl
200 mM HIV
最終pHを5.5へ調節する
実験条件番号2
100 mM Tris-HCl pH 7.0
10mM MgCl2
10 mM ATP
20 mM KCl
200 mM HIV
最終pHを7.0へ調節する
反応物上に存在するガスを、使い捨て機構を備えた注射器で収集した。質量分析器(MS)と連結したガスクロマトグラフィー(GC)によって、ガス試料を分析した。様々なイソブチレン濃度を使用して、機器を予め較正した。
カラム:BPX5 (SGE)
GC/MS:MSD 5973 (HP)
Genebankアクセッション番号:CAI97800.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q1GAB2
微生物:ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)(株ATCC 11842 / DSM 20081)
Genebankアクセッション番号:CAJ51653
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q18K00
微生物:ハロクアドラトゥム・ワルスビイ(Haloquadratum walsbyi)DSM 16790
Genebankアクセッション番号:ABD99494.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q1WU41
微生物:ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius)(株UCC118)
Genebankアクセッション番号:ABJ57000.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q04EX2
微生物:オエノコッカス・オエニ(Oenococcus oeni)(株BAA-331 / PSU-1)
Genebankアクセッション番号:ABJ67984.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q03FN8
微生物:ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)ATCC 25745
Genebankアクセッション番号:ABV09606.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:A8AUU9
微生物:ストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus gordonii)(株Challis / ATCC 35105 / CH1 / DL1 / V288)
Genebankアクセッション番号:ABQ14154.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:A5EVP2
微生物:ディケロバクター・ノドーサス(Dichelobacter nodosus)VCS1703A
Genebankアクセッション番号:EDT95457.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:B2DRT0
微生物:ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)CDC0288-04
Genebankアクセッション番号:AAT86835
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q5XCM8
微生物:ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)血清型M6(ATCC BAA-946 / MGAS10394)
Genebankアクセッション番号:AAT43941
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q6KZB1
微生物:ピクロフィラス・トリダスDSM 9790
Genebankアクセッション番号:AAV43007.1
Swissprot/TrEMBLアクセッション番号:Q5FJW7
微生物:ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)NCFM
実施例4に記載されるように、組換え酵素を精製した。図8に示される結果は、最終タンパク質試料中の酵素純度が約90%であったことを示している。
100 mM Tris-HCl pH 7.0
10mM MgCl2
10 mM ATP
20 mM KCl
250 mM HIV
最終pHを6.0へ調節する
3 mg/ml酵素
試験条件
100 mMクエン酸塩
50 mM KCl
10 mM MgCl2
200 mM HIV(指定される)
1 mg/ml精製酵素
pH 5.5
30℃で72時間インキュベーション
試験条件
100 mMクエン酸塩pH 5.5
50 mM KCl
10 mM ATP
200 mM HIV(指定される)
pH 5.5
1 mg/ml精製酵素
30℃で72時間インキュベーション
試験条件
100 mM緩衝液
50 mM KCl
10 mM ATP
200 mM HIV(指定される)
1 mg/ml精製酵素
異なる温度で72時間インキュベーション
試験条件
100 mM緩衝液
50 mM KCl
10 mM ATP
200 mM HIV(指定される)
1 mg/ml精製酵素
30℃で72時間インキュベーション
インキュベーションを50℃で行って、前述の条件で、基質範囲を試験した。酵素のKmは約40 mM HIVである。
下記の条件を保持し、最適な反応条件を求めた。
100 mMクエン酸塩
50 mM KCl
40 mM ATP
200 mM HIV
1 mg/ml酵素
50℃で48時間インキュベーション
精製前にSDS-PAGEでバンドを見るのが困難であったように、大腸菌BL21中の発現の初期レベルは低かった。大腸菌における発現用の天然配列のCodon Optimization Index(CAI)を、SharpおよびLiの方法(1987)に基づいて、http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/で入手可能な「Optimizer」プログラムで測定した。得られた値は僅か0.23であり、大腸菌における該タンパク質の低レベルの発現を反映している。
図15における結果は、最適化された遺伝子に対応するタンパク質が、未精製の細胞溶解物(レーン4)において、ゲル上ではっきりと目に見えたことを示しており、これは、発現の非常に顕著な増加を示している。精製工程後のタンパク質の純度のレベルもまた、最適化された遺伝子の場合により高かった。
実施例3におけるバイアル3と同一の反応を、ガス抽出システムを備えた発酵槽において、1リットル体積で行った。組換え酵素の存在によってイソブチレンへの3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートの変換が誘導され、これは自然に脱気し、これを、発酵槽の上部に配置したガス抽出システムによって回収した。次いで、イソブチレンを使用し、Amberlyst 35wetまたは36wet樹脂(Rohm and Haas)によって触媒される付加によってイソオクテンを製造した。次に、イソオクテンを接触水素化によってイソオクタンへ還元した。
ランダム突然変異誘発技術を使用し、実施例1に記載の遺伝子の突然変異体を何千も含有するライブラリーを作製した。次いで、この突然変異体ライブラリーを、発現プラスミド中にクローニングし、コンピテント細菌株BL21へ形質転換した。
実施例1に記載の酵素をコードする遺伝子を、大腸菌株中での組換えタンパク質の発現を可能にするプラスミドに挿入した。該プラスミドを、前記細菌株中へ形質転換した。形質転換された細菌を、次いで、プロピル二リン酸(10 mg/l)および3-ヒドロキシプロピオナート(1 g/l)の存在下で発酵槽においてインキュベーションした。組換え酵素の存在によって3-ヒドロキシプロピオナートのエチレンへの変換が起こり、これは自然に脱気し、これを、発酵槽の上部に配置したガス抽出システムによって回収した。次いで、エチレンが強く放射するスペクトル部分における赤外線検出を備えるガスクロマトグラフィーによって、ガス試料においてエチレンを測定した。
実施例1に記載の酵素または実施例4に記載の酵素をコードする遺伝子を、大腸菌株中での組換えタンパク質の発現を可能にするプラスミドに挿入した。プラスミドを、前記細菌株中へ形質転換した。形質転換された細菌を、次いで、エチル二リン酸(10 mg/l)および3-ヒドロキシブチラート(1 g/l)(Sigma、参照番号166898)の存在下で、発酵槽においてインキュベーションした。組換え酵素の存在によって、3-ヒドロキシブチラートのプロピレンへの変換が起こり、これは自然に脱気し、これを、発酵槽の上部に配置したガス抽出システムによって回収した。次いで、プロピレンが強く放射するスペクトル部分における赤外線検出を備えるガスクロマトグラフィーによって、ガス試料においてプロピレンを測定した。
実施例1に記載の酵素または実施例4に記載の酵素をコードする遺伝子を、細菌アルカリゲネス・ユートロフス中での組換えタンパク質の発現を可能にするプラスミド中にクローニングした。プラスミドを、前記細菌株中へ形質転換した。形質転換された細菌を、次いで、微好気性条件下において、グルコースおよびエチル二リン酸の存在下で発酵槽においてインキュベーションし、次いで熱ショックへ供し、これによって、大量の3-ヒドロキシブチラートを産生するように誘導した。組換え酵素の存在によって、3-ヒドロキシブチラートのプロピレンへの同時変換が起こり、これは自然に脱気し、これを、発酵槽の上部に配置したガス抽出システムによって回収した。
この実施例は、実施例11のそれと非常に類似している方法を記載する。主な相違は、アルカリゲネス・ユートロフスなどの天然株の代わりに3-ヒドロキシブチラートを産生するように改変された大腸菌株を使用することである。前記株は、3-ヒドロキシブチラートの蓄積をもたらすような代謝経路の操作によって得られた。実施例1または実施例4に記載されるようなMDPデカルボキシラーゼの添加によって、3-ヒドロキシブチラートのプロピレンへの変換が可能になった。
実施例1に記載の酵素をコードする遺伝子を、大腸菌株中での組換えタンパク質の発現を可能にするプラスミド中にクローニングし、大腸菌株もまた、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートを内因的に合成するように代謝改変された。次いで、細菌を、グルコースの存在下において、微好気性条件下で発酵槽においてインキュベーションした。組換え酵素の存在によって、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートのイソブチレンへの同時変換が誘導され、これは自然に脱気し、これを、発酵槽の上部に配置したガス抽出システムによって回収した。
Claims (26)
- MDPデカルボキシラーゼによって3-ヒドロキシアルカノアートを変換する工程を含むことを特徴とする、末端アルケンを製造するための方法(ヒトの体を利用する方法を除く)。
- 前記アルケンの2位の炭素における2つの置換基のうちの少なくとも1つが、直鎖または分岐鎖のアルキル基であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 3-ヒドロキシブチラートをプロピレンへと変換する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- 3-ヒドロキシバレラートを1-ブチレンへと変換する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- 3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートをイソブチレンへと変換する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- 3-ヒドロキシ-3-メチルバレラートをイソアミレンへと変換する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- MDPデカルボキシラーゼによって、3-ヒドロキシ-3-メチルブチラートを変換する工程を含むことを特徴とする、イソブチレンを製造するための方法(ヒトの体を利用する方法を除く)。
- 補因子が、反応へ添加される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記補因子が、一般式R-O-PO2H-O-PO3H2によって表され、リン酸無水物ファミリーに由来し、ここで、Rが、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基であり、かつ任意の直鎖、分岐鎖、もしくは環式のアルキル基、または任意の他の一価の有機基でもあり得る、請求項8記載の方法。
- 前記補因子が一般式R-O-PO2H-CH2-PO3H2を有するメチレンジホスホナートモノエステルのファミリーに由来し、ここで、Rが、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基であり、かつ任意の直鎖、分岐鎖、もしくは環式のアルキル基、または任意の他の一価の有機基でもあり得る、請求項8記載の方法。
- 前記変換が補助基質の存在下で起こる、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記補助基質がリン酸無水物を含む化合物である、請求項11記載の方法。
- 前記補助基質がATP、rNTP、dNTP、もしくはこれらの混合物、ポリホスファート、またはピロホスファートである、請求項11記載の方法。
- 前記変換する工程が、無細胞系においてインビトロで行われることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 前記変換する工程が、天然のまたは改変された前記MDPデカルボキシラーゼを産生する微生物の存在下で、行われることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 炭素源から末端アルケンを直接産生するように、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを内因的に産生しかつ天然のまたは改変された前記MDPデカルボキシラーゼも発現または過剰発現する、天然または人工の特性を有する微生物の使用を特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記微生物が、株アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)もしくはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の細菌であるか、または、1つもしくは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを過剰産生するように組換えられた、細菌、酵母、もしくは真菌である、請求項16記載の方法。
- 溶液中に存在するCO2から末端アルケンを直接産生するように、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを内因的に産生しかつ天然のまたは改変されたMDPデカルボキシラーゼも過剰発現する、天然または人工の特性を有する光合成微生物の使用を特徴とする、請求項16記載の方法。
- 前記光合成微生物がシアノバクテリアまたは微細藻類である、請求項18記載の方法。
- 炭素源の3-ヒドロキシアルカノアートへの変換を可能にする第1の微生物の使用、および、3-ヒドロキシアルカノアートの末端アルケンへの変換を可能にする、単離されたかまたは第2の微生物によって発現されたMDPデカルボキシラーゼの使用を特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- 3-ヒドロキシアルカノアートの脱炭酸によって末端アルケンを製造するための、MDPデカルボキシラーゼを発現する多細胞生物(ヒトを除く)の使用を特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 前記多細胞生物が植物または非ヒト動物である、請求項21記載の方法。
- 前記多細胞生物が、1つまたは複数の3-ヒドロキシアルカノアートを合成するように特定の代謝経路においてさらに改変されていることを特徴とする、請求項21記載の方法。
- 反応から脱気(degas)する末端アルケンのガスを収集する工程を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 微好気性条件下で行われるという事実を特徴とする、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- 3-ヒドロキシアルカノアートから末端アルケン化合物を製造するための、MDPデカルボキシラーゼ酵素またはMDPデカルボキシラーゼを産生する微生物の使用。
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