JP5723768B2 - 髄膜炎菌性多価未変性外膜小胞ワクチン、その作製方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本願は、「Meningococcal Multivalent Native Outer Membrane Vesicle Vaccine」と題された、米国仮特許出願第61/057,462号(2008年5月30日出願)に対する優先権を主張する。この仮特許出願の全開示および全内容は、参照により、それらの全体が本明細書に援用される。
合衆国政府は、本発明の権利を有する。
髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)は、世界的な髄膜炎および敗血症の主な原因である。髄膜炎菌性髄膜炎は、髄膜(脳および脊髄を裏打ちする膜)の炎症である。髄膜炎菌性敗血症および髄膜炎菌性髄膜炎の両方において、損傷は、局在化または全身性の宿主炎症反応の無制御に起因する。B群髄膜炎菌性疾患は、現在、多数の国(北米、南米、および欧州が含まれる)での全髄膜炎菌性疾患の少なくとも半分を占める。B群髄膜炎菌の新規の病毒力の強いクローン(ET5として公知、70年代後半にノルウェーで発見)の出現により、その後に長期にわたってノルウェー、キューバ、ブラジル、およびチリで流行病となっている。これらの流行病は、深刻な公衆衛生上の問題を生じ、いくつかの発生国(affected country)では有効なB群ワクチンを開発するための集中的な取り組みがなされている。18ヶ月未満の小児におけるA型およびC型莢膜ポリサッカリドドワクチンの能力が不十分であることに加えて、米国で承認されているB群ワクチンが存在しないことが、髄膜炎菌性疾患に対する日常的な小児期ワクチン接種を深く考慮するための障壁となっている。
ほぼ全ての侵襲性髄膜炎菌性疾患を引き起こす髄膜炎菌の血清群A、C、Y、およびW135に対するワクチンは、利用可能であり、日常的使用によって優れた結果がもたらされる。髄膜炎菌のB群菌株に対する適切なワクチンは、種々の理由によって開発がより困難になっている。例えば、血清群を定義する莢膜ポリサッカリドは、一定のヒト細胞、具体的には血液細胞上で見出されるポリシアル酸と同一の構造を有するので、ワクチンでの使用は無効且つ潜在的に危険である。
1つの態様では、本発明のテクノロジーは、広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも2つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞(NOMV)を含むワクチンを提供する。未変性の外膜小胞はPorA、LOS、および保存外膜タンパク質に基づいた3つの異なる抗原組を含み、遺伝子改変菌株はlpxL1遺伝子、synX遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されている。2つの髄膜炎菌株は、ともに異なるLOSコア構造を有するLOSを発現し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有することができる。各菌株は、B群分離菌のうちで最も一般的なPorA亜型に基づいて選択される少なくとも2つの異なるPorA亜型タンパク質または亜型エピトープを発現することができる。さらに、ワクチンは、殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質(各菌株で過剰発現する)をさらに含むことができ、このタンパク質は、FHBP(GNA1870)バリアント1、FHBPバリアント2、およびFHBPバリアント3、NadA、App、NspA、TbpAおよびTbpBからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも2つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞を含むワクチンであって、前記未変性の外膜小胞が、PorA、LOS、および保存外膜タンパク質に基づいた3つの異なる抗原組を含み、前記遺伝子改変菌株が、lpxL1遺伝子、synX遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されている、ワクチン。
(項目2)
各菌株によって発現された前記LOSが異なるLOSコア構造を有し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有する、項目1に記載のワクチン。
(項目3)
各菌株がB群分離菌のうちで最も一般的なPorA亜型に基づいて選択される少なくとも2つの異なるPorA亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、項目1に記載のワクチン。
(項目4)
殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質が各菌株で過剰発現され、FHBP(GNA1870)バリアント1、FHBPバリアント2、およびFHBPバリアント3、NadA、App、NspA、TbpAおよびTbpBからなる群から選択される、項目1に記載のワクチン。
(項目5)
3つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌株由来のNOMVの組み合わせであって、少なくとも1つの菌株が、以下:
(1)以下の遺伝子改変または特徴を有するH44/76 HOPS−DL:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子(亜型P1.7−1,1)の挿入、
NadA発現の増加、および
OpcおよびPorAの安定化された高発現、
(2)以下の遺伝子改変または特徴を有する8570 HOPS−G A L:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
H因子結合タンパク質バリアント1発現の増加、および
PorAおよびOpcの安定化された高発現、および
(3)以下の遺伝子改変または特徴を有するB16B6 HPS−G 2 A:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
H因子結合タンパク質バリアント2発現の増加、および
PorAおよびOpcの安定化された高発現
から選択される、組み合わせ。
(項目6)
菌株H44/76 HOPS−DLがET−5野生型菌株H44/76(B:15:P1.7,16:L,3,7:P5.5,C)に由来した、項目5に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
(項目7)
菌株8570 HOPS−G I LがET−5野生型菌株8570(B:4:P 1.19,15:L3,7v:P5.5,11,C)に由来した、項目5に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
(項目8)
菌株B16B6 HPS−G 2 LがET−37野生型菌株B16B6(B:2a:P 1.5,2:L2:P5.1,2,5)に由来する、項目5に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
(項目9)
前記NOMVを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、項目1に記載のワクチン。
(項目10)
前記ワクチンを賦形剤としての5%グルコースに懸濁する、項目1に記載のワクチン。
(項目11)
前記NOMVを、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、MF59、CPG−ODN、またはMPLAを含む1つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、項目1に記載のワクチン。
(項目12)
髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および/または鼻腔内に投与する項目1に記載のワクチンの使用方法。
(項目13)
B群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および/または鼻腔内に投与する項目1に記載のワクチンの使用方法。
(項目14)
髄膜炎菌の1つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞(NOMV)を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチン組成物であって、前記1つまたは複数の遺伝子改変菌株が、
i.synX遺伝子の不活化,
ii.lpxL1遺伝子の不活化、
iii.ラクト−N−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド(LOS)が発現される各菌株中でのlgtA遺伝子の不活化、および
iv.opa遺伝子の代わりの少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子の挿入
によって改変された、ワクチン組成物。
(項目15)
前記遺伝子改変菌株が少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現をさらに含む、項目14に記載のワクチン組成物。
(項目16)
前記遺伝子改変菌株が少なくとも1つの外膜タンパク質の安定化された発現をさらに含み、前記外膜タンパク質がOpcおよびPorAを含む群から選択される、項目14から15のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目17)
前記少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子が髄膜炎B群分離菌の最も一般的なPorA亜型から選択される少なくとも1つのPorA亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、項目14から16のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目18)
前記少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質が、FHBP(GNA1870)バリアント1、FHBPバリアント2、FHBPバリアント3、NadA、App、NspA、TbpA、およびBからなる群から選択される、項目15から17に記載のワクチン組成物。
(項目19)
菌株H44/76 HOPS−Dを含む髄膜炎菌亜型B菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目20)
以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaD遺伝子の代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
v)未変性菌株H44/76と比較して増加したNadA発現、および
vi)Opcタンパク質およびPorAタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む菌株H44/76由来の髄膜炎菌亜型Bからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目21)
菌株H44/76 HOPS−DLがET−5野生型菌株H44/76(B:15:P1.7,16:L,3,7:P5.5,C)に由来した、項目19または20に記載の遺伝子改変菌株。
(項目22)
菌株8570 HOS−G1を含む髄膜炎菌亜型Bからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目23)
以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
v)H因子結合タンパク質バリアント1発現の増加、および
vi)PorAタンパク質およびOpcタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む8570由来の髄膜炎菌亜型B菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目24)
前記遺伝子改変菌株がET−5野生型菌株8570(B:4:P 1.19,15:L3,7v:P5.5,11,C)に由来した、項目22または23に記載の遺伝子改変菌株。
(項目25)
菌株B16B6 HPS−G 2 Aを含む髄膜炎菌亜型Bからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目26)
以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaDの代わりの第2のporA遺伝子(亜型P1.22−1,4)の挿入、
v) H因子結合タンパク質バリアント2発現の増加、および
vi)PorAタンパク質およびOpcタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含むB16B6由来の髄膜炎菌亜型Bからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
(項目27)
前記遺伝子改変菌株がET−37野生型菌株B16B6(B:2a:P 1.5,2:L2:P5.1,2,5)に由来する、項目25または26に記載の遺伝子改変菌株。
(項目28)
前記菌株を鉄欠損培地で生育させる、項目19から27のいずれか1項に記載の遺伝子改変菌株。
(項目29)
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、またはlgtA遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、項目19から28のいずれか1項に記載の遺伝子改変菌株。
(項目30)
項目20から29のいずれか1項に記載の1つまたは複数の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含むワクチン組成物。
(項目31)
前記ワクチン組成物が2つ以上の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含む、項目30に記載のワクチン組成物。
(項目33)
前記ワクチン組成物が3つ以上の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含む、項目30に記載のワクチン組成物。
(項目34)
前記NOMVを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、項目1から18および30から33のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目35)
前記ワクチン組成物を賦形剤としての5%グルコースに懸濁する、項目1から18および30から33のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目36)
前記NOMVを1つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、項目1から18および30から33のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目37)
前記遺伝子改変した菌株を鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる、項目1から18および30から33のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
(項目38)
種々の未変性の外膜小胞(NOMV)を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチンであって、少なくともいくつかのNOMVがリポオリゴサッカリド(LOS)の発現またはシアル酸化を本質的に含まず、ペンタ−アシル構造を有する脂質Aを含むLOSを含み、発現レベルの増加した少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質を含み、前記微量保存外膜タンパク質が殺菌抗体を誘導するタンパク質から選択される、ワクチン。
(項目39)
前記微量保存外膜タンパク質が、NadA、H因子結合タンパク質(FHBP)バリアント1、およびFHBPバリアント2からなる群から選択される、項目38に記載のワクチン。
(項目40)
少なくともいくつかのNOMVがラクト−N−ネオテトラオース(LNnT)テトラサッカリドを本質的に含まない短縮されたか、または切り詰められたLOSを含む、項目38に記載のワクチン。
(項目41)
少なくともいくつかのNOMVが2つ以上の異なるPorAタンパク質を含む、項目38に記載のワクチン。
(項目42)
前記少なくとも2つ以上の異なるPorAタンパク質が、髄膜炎菌(N.meningitides)亜群B菌株の最も一般的な菌株から選択される、項目43に記載のワクチン。
(項目43)
髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために項目1から18および30から33のいずれか1項に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む該動物または該ヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発する方法。
(項目44)
前記ワクチンをB群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために使用する、項目43に記載の方法。
(項目45)
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンで用いる髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を調製する方法であって、
a)遺伝子改変することができる髄膜炎菌B型菌株を選択する工程、
b)synX遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程,
c)lpxL1遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、
d)lgtA遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、および
e)1つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって前記菌株を遺伝子改変する工程
を含む、方法。
(項目46)
opa遺伝子の読み取り枠への少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子の挿入によって前記菌株を遺伝子改変する工程をさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
少なくとも1つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−C配列をGヌクレオチドおよびCヌクレオチドを含む配列で置換することによって前記菌株を遺伝子改変して少なくとも1つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む、項目45または46に記載の方法。
(項目48)
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法であって、
a)以下:
i.synX遺伝子の不活化,
ii.lpxL1遺伝子の不活化、
iii.IgtA遺伝子の不活化、
iv.opa遺伝子の代わりの少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子の挿入、
v.少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質の増加した発現または安定した発現、および
vi.少なくとも1つの外膜タンパク質の安定化させた発現
からなる群から選択される1つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、
b)前記a)の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、
c)前記発酵培養物を不活化する工程、
d)連続フロー型遠心分離によって髄膜炎菌培養細胞を採取し、そして細胞ペーストを回収する工程、
e)前記細胞ペーストからNOMVを単離する工程、および
f)ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにNOMVを再懸濁する工程
を含む、方法。
遺伝子改変菌株8570 HOPS−G1を、菌株を得た研究所によって多座酵素電気泳動により分析し、ET−5クローン複合体に属することが決定された親菌株8570由来の5つの遺伝子改変によって改変した(Caugantら)。PorA変異領域を配列決定し、分類し、遺伝子改変を行う前にLOS免疫型を検証した。菌株8570は、ET−5クローン4:P1.19、15:L7v、ProB3(ST4)Tbp2 II型であった。一連の5つの連続的な遺伝子改変を、下記のように菌株に対して行った。
次いで、遺伝子改変菌株を用いて、図1〜5の流れ図に詳述するようなワクチン製造に用いるためのマスター・セル・バンクおよびプロダクション・セル・バンクを生産し、NOMVの組成物を生産した。NOMV培養物を、外膜タンパク質およびLOSの発現について試験する。
実施例2から得た最終生成物を、マウスおよびウサギにおける品質管理試験ならびに前臨床安全性および免疫原性試験に供した。
タンパク質 2001ag/ml
リポオリゴサッカリド 36tg/ml
核酸 2.5μg/ml
塩化ナトリウム 0.9%
トリス-HCI緩衝液 0.01MpH7.6
ワクチン組成物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによってさらに分析した。図6は、コントロール(レーン2)および濾過バルクロット(レーン3)と比較したワクチン(レーン4)中のタンパク質含量を示すクマシー・ブルー染色ゲルを示す。図7は、コントロール(ML5 LPS、レーン(land)1)および濾過バルクワクチンロット(レーン2)と比較した、ワクチン(レーン3)のリポサッカリド成分を示す銀染色ゲルを示す。図8は、表3に列挙の抗体によるNOMVワクチンの主成分についてのワクチンの同一性試験の結果を示す。
ワクチンを、21 CFR 610.11に規定の一般安全性試験で試験した。ワクチンの結果を表4に示す。
遺伝子改変ワクチン8570HOPS−G NOMVのみおよび水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させたワクチンの内毒素活性についてのウサギ発熱物質試験の結果を、表3に示す。示した値は、ウサギにおいて発熱(0.5℃超の体温上昇)を誘導しなかった最も高い試験量であり、その結果を表5に示す。
ワクチンを、新鮮なヒト全血由来から炎症性サイトカインTNF−αおよびIL−6を誘導する能力の測定によって内毒素含量について試験した。結果を図9および10に示す。データは、3試験(E.Coli LPS標準およびlpxL2 LOSを有するNOMVワクチンロット1119)または5試験(野生型LOSを有するロット0832 NOMVおよびlpxLl LOSを有するロット1289 NOMVワクチン)の平均値である。エラーバーは、平均値の標準誤差である。NOMV濃度はタンパク質に基づくが、E.Coli標準LPSはLPS重量に基づく。いかなる特定の理論にも拘束されないが、これらの結果により、現在のワクチンがlpxL2 LOS含有ワクチン(髄膜炎菌性44/76 MOS 5D NOMVワクチン、ロット番号1119、BB−IND 12687)に類似のヒトボランティアにおける安全性プロフィールを有し得ることが示唆される。
水酸化アルミニウムアジュバント(Rehydragel LV)に吸着させたか、または吸着させなかった遺伝子改変ワクチン菌株8570 HOPS−Gを、マウスに4週間間隔で3回投与した。10匹のマウスからなる群に、0.1、0.3、1.0、または3.0μgのNOMVを、0、4、および8週間目に腹腔内にワクチン接種した。ワクチン群を表6に列挙する。0、7、および10週目に血清を採取した。補体供給源として正常なヒト血清を使用して、4つの異なる菌株に対する殺菌抗体、ワクチン菌株の親、およびいくつかの関連菌株について血清を試験した。ワクチン接種前の血清は、細菌活性を一様に欠いていた。
ワクチンを、ウサギにおける免疫原性についても試験した。4つのウサギ群に、水酸化アルミニウムアジュバントをに吸着させたか、または吸着させていない異なる用量のワクチンを筋肉内に接種した。6週間間隔で3回投与し、最後の注射の2週間後採血した。4つの試験菌株に対するウサギの殺菌抗体応答を決定した。試験菌株は、異なるPorAタンパク質およびL3,7v LOSを発現する8570の3つの同質遺伝子バリアントならびに異なるコア構造を有する異種PorAおよびLOSを有する菌株44/76を含んでいた。PorAタンパク質P1.19,15およびP1.22,14はワクチン中に存在していたが、P1.22−1,4は存在しなかった。殺菌試験の結果を図15に示す。菌株44/76に対する交差反応性殺菌活性を、マウス血清と同一の様式で分析し、結果は本質的に同一であった。ほとんどの交差反応性殺菌抗体を、試験菌株に相同な精製LOSによって除去することができた。
上記実施例に記載した菌株8570 HOPS−Glに加えて、2つの更なるワクチン菌株を選択し、遺伝子改変した。第1は菌株B16B6(B:2a:P1.5,2:L2)であった。この菌株は、遺伝子群ET−37に属し、クラス2 PorBタンパク質およびI型トランスフェリン結合タンパク質Bを有する。第2は菌株44/76(B:15:P1.7,16:L3,7)であった。これは、遺伝子群ET−5に属し、1970年代および1980年代のノルウェーにおいてB群髄膜炎菌性流行病を担った代表的な流行菌株である。これは、クラス3 PorBタンパク質およびII型トランスフェリン結合タンパク質Bを発現する。
3つの遺伝子改変菌株を使用して、NOMVワクチン組成物の実験室ロットを調製した。菌株を、回転式震盪機上のフェルンバッハフラスコ中の1リットルの培養物としてCatlin改変培地中で増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、秤量し、細胞ペーストを凍結した。細胞ペーストを解凍し、これを使用して、実施例2に記載のように菌株8570 HOPS−G1由来のワクチンの臨床ロットについて記載の手順と本質的に同一の手順にしたがってNOMVを調製した。この過程をスケールダウンし、2〜8℃にて225,000×gで60分間の超遠心分離を2回行って核酸および全ての可溶性の非小胞物質を除去した。
10匹のCD−1マウスからなる群に、それぞれの遺伝子の改変されたワクチン菌株由来の2pgのNOMVワクチン(3菌株由来のNOMVとの混合ワクチンについて全部で6pg)を腹腔内に接種した。3回の投与を、0、4、および8週間目に投与した。ワクチン接種前および最後のワクチン接種から2週間後(10週目)に採血した。
Claims (35)
- 広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも2つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞を含む免疫応答を誘発するための組成物であって、前記未変性の外膜小胞が、PorA、LOS、および保存外膜タンパク質に基づいた3つの異なる抗原組を含み、前記遺伝子改変菌株が、lpxL1遺伝子、synX遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されており、前記遺伝子改変菌株の各々が、少なくとも2つの異なるPorA亜型タンパク質または亜型エピトープを発現し、各菌株の第2のPorA亜型タンパク質または亜型エピトープが、P1.7−1,1、P1.22,14およびP1.22−1,4からなる群から選択される、組成物。
- 各菌株によって発現された前記LOSが異なるLOSコア構造を有し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有する、請求項1に記載の組成物。
- 殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質が各菌株で過剰発現され、FHBPバリアント1、FHBPバリアント2、およびFHBPバリアント3、NadA、App、NspA、TbpAおよびTbpBからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 3つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌ワクチン株由来のNOMVの組み合わせ物であって、ワクチンの菌株の前記組み合わせ物が、以下:
(1)以下の遺伝子改変または特徴を有するH44/76:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
NadA発現の増加、および
OpcおよびPorAの安定化された高発現、
(2)以下の遺伝子改変または特徴を有する8570:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
H因子結合タンパク質バリアント1発現の増加、および
PorAおよびOpcの安定化された高発現、および
(3)以下の遺伝子改変または特徴を有するB16B6:
synX遺伝子、lpxL1遺伝子、およびlgtA遺伝子の不活化、
opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
H因子結合タンパク質バリアント2発現の増加、および
PorAおよびOpcの安定化された高発現
を含む、組み合わせ物。 - 遺伝子改変された菌株H44/76がET−5野生型菌株H44/76に由来した、請求項4に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
- 遺伝子改変された菌株8570がET−5野生型菌株8570に由来した、請求項4に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
- 遺伝子改変された菌株B16B6がET−37野生型菌株B16B6に由来する、請求項4に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
- 前記NOMVを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく細胞ペーストまたは液体培養物から調製する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物を賦形剤としての5%グルコースに懸濁する、請求項1に記載の組成物。
- 前記NOMVを、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、MF59、CPG−ODN、またはMPLAを含む1つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項1に記載の組成物。
- 髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための請求項1に記載の組成物であって、前記組成物は、筋肉内および/または鼻腔内に投与されるものであることを特徴とする、組成物。
- B群髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための請求項1に記載の組成物であって、前記組成物は、筋肉内および/または鼻腔内に投与されるものであることを特徴とする、組成物。
- 髄膜炎菌の1つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞(NOMV)を含む髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、前記1つまたは複数の遺伝子改変菌株が、
i.synX遺伝子の不活化,
ii.lpxL1遺伝子の不活化、
iii.ラクト−N−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド(LOS)が発現される各菌株中でのlgtA遺伝子の不活化、および
iv.opa遺伝子の代わりの少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子の挿入によって改変されており、前記少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子が、P1.7−1,1、P1.22,14およびP1.22−1,4からなる群から選択される少なくとも1つのPorA亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、組成物。 - 前記遺伝子改変菌株が少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現をさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記遺伝子改変菌株が少なくとも1つの外膜タンパク質の安定化された発現をさらに含み、前記外膜タンパク質がOpcおよびPorAを含む群から選択される、請求項13から14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質が、FHBPバリアント1、FHBPバリアント2、FHBPバリアント3、NadA、App、NspA、TbpA、およびBからなる群から選択される、請求項14から15のいずれか1項に記載の組成物。
- 以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaD遺伝子の代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
v)未変性菌株と比較して増加したNadA発現、および
vi)Opcタンパク質およびPorAタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む菌株H44/76由来の髄膜炎菌亜型Bの遺伝子改変された菌株。 - 以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
v)H因子結合タンパク質バリアント1発現の増加、および
vi)PorAタンパク質およびOpcタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む8570由来の髄膜炎菌亜型B菌株の遺伝子改変された菌株。 - 前記遺伝子改変菌株がET−5野生型菌株8570に由来した、請求項18に記載の遺伝子改変菌株。
- 以下:
i)synX遺伝子の不活化、
ii)lpxL1遺伝子の不活化、
iii)lgtA遺伝子の不活化、
iv)opaDの代わりの第2のporA遺伝子の挿入、
v) H因子結合タンパク質バリアント2発現の増加、および
vi)PorAタンパク質およびOpcタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含むB16B6由来の髄膜炎菌亜型Bの遺伝子改変された菌株。 - 前記遺伝子改変菌株がET−37野生型菌株B16B6に由来する、請求項20に記載の遺伝子改変菌株。
- 前記菌株を鉄欠損培地で生育させる、請求項17から21のいずれか1項に記載の遺伝子改変菌株。
- synX遺伝子、lpxL1遺伝子、またはlgtA遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、請求項17から22のいずれか1項に記載の遺伝子改変菌株。
- 請求項17から23のいずれか1項に記載の1つまたは複数の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含む組成物。
- 前記組成物が2つ以上の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記組成物が3つ以上の遺伝子改変菌株由来のNOMVを含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記NOMVを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく細胞ペーストまたは液体培養物から調製する、請求項1から3または8から16または24から26のいずれか1項に記載の組成物、あるいは、請求項4から7のいずれか1項に記載の組み合わせ物。
- 前記組成物または組み合わせ物を賦形剤としての5%グルコースに懸濁する、請求項1から3または8から16または24から26のいずれか1項に記載の組成物、あるいは、請求項4から7のいずれか1項に記載の組み合わせ物。
- 前記NOMVを1つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項1から3または8から16または24から26のいずれか1項に記載の組成物、あるいは、請求項4から7のいずれか1項に記載の組み合わせ物。
- 前記遺伝子改変した菌株を鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる、請求項1から3または8から16または24から26のいずれか1項に記載の組成物、あるいは、請求項4から7のいずれか1項に記載の組み合わせ物。
- 動物またはヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための、請求項1から3または8から16または24から26のいずれか1項に記載の組成物、あるいは、請求項4から7のいずれか1項に記載の組み合わせ物。
- 前記組成物をB群髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するために使用する、請求項31に記載の組成物。
- 髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するために用いる髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を調製する方法であって、
a)遺伝子改変することができる髄膜炎菌B型菌株を選択する工程、
b)synX遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程,
c)lpxL1遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、
d)lgtA遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、および
e)1つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって前記菌株を遺伝子改変する工程
f)opa遺伝子の読み取り枠へ少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子を挿入する工程
を含む、方法。 - 少なくとも1つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−C配列をGヌクレオチドおよびCヌクレオチドを含む配列で置換することによって前記菌株を遺伝子改変して少なくとも1つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための組成物を調製する方法であって、
a)以下:
i.synX遺伝子の不活化,
ii.lpxL1遺伝子の不活化、
iii.IgtA遺伝子の不活化、
iv.opa遺伝子の代わりの少なくとも1つの第2の抗原性が異なるporA遺伝子の挿入、
v.少なくとも1つの微量保存外膜タンパク質の増加した発現または安定した発現、および
vi.少なくとも1つの外膜タンパク質の安定化させた発現
からなる群から選択される1つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、
b)前記a)の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、
c)前記発酵培養物を不活化する工程、
d)連続フロー型遠心分離によって髄膜炎菌培養細胞を採取し、そして細胞ペーストを回収する工程、
e)前記細胞ペーストからNOMVを単離する工程、および
f)ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにNOMVを再懸濁する工程
を含む、方法。
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