CN102105166A - 脑膜炎球菌多价原始外膜囊泡疫苗、其制备方法和应用 - Google Patents

脑膜炎球菌多价原始外膜囊泡疫苗、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含来自至少一种经遗传修饰的奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗组合物，其提供针对脑膜炎球菌疾病、更优选B亚型脑膜炎球菌疾病的保护性免疫力。本发明还提供了针对脑膜炎球菌疾病对动物或人进行免疫的方法，包括施用本发明的疫苗组合物。

Description

脑膜炎球菌多价原始外膜囊泡疫苗、其制备方法和应用
相关申请的交叉引用
本发明要求申请日为2008年5月30日，名称为“脑膜炎球菌多价原始外膜囊泡疫苗”的美国临时申请号61/057,462的优先权。该申请的全部公开和内容通过引用全文并入本文。
联邦政府支持的研究或开发
美国政府享有本申请中的权利。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是世界范围内的脑膜炎和败血病的主要诱因。脑膜炎球菌性脑膜炎是脑膜、沿着脑和脊髓的膜的炎症。在脑膜炎球菌性败血病和脑膜炎球菌性脑膜炎中，损伤是由失控的局部或全身性宿主炎性应答引起的。目前B群脑膜炎球菌疾病占很多国家包括北美和南美洲以及欧洲的所有脑膜炎球菌疾病的至少一半。在70年代末期在挪威出现了一种新的B群脑膜炎奈瑟球菌的毒性克隆体，称为ET5，从那时起ET5在挪威、古巴、巴西和智利引起了长时期的流行病。这些流行病已经产生了严重的公共健康问题并且在数个受影响的国家引起了开发有效B群疫苗的深入研究。在美国缺乏批准的B群疫苗，并且A和C荚膜多糖疫苗在18个月以下的儿童中效力很差，这已经阻止了针对脑膜炎球菌疾病的常规儿童疫苗接种的认真考虑。
脑膜炎奈瑟球菌分为13个血清群，其中9个群引起侵袭性疾病(A、B、C(C1，C1-)、X、Y、W-135、Z和L)。5个血清群是开发疫苗的靶标，因为它们能够引起流行病，其中包括血清群A、B、C、Y和W135，它们是很多疫苗研究的靶标。
针对引起几乎所有的侵袭性脑膜炎球菌疾病的脑膜炎奈瑟球菌的血清群A、C、Y和W135的疫苗是可获得的，并且常规使用，效果甚佳。由于多种原因，开发针对脑膜炎奈瑟球菌的B群菌株的合适疫苗却困难得多。例如，确定血清群的荚膜多糖在用于疫苗时是无效的且具有潜在的不安全性，这是因为它具有与某些人类细胞尤其是血细胞中存在的多聚唾液酸相同的结构。
造成缺乏合适疫苗的另一个原因是以下事实：表面暴露的荚膜下(subcapsular)抗原，例如外膜蛋白和脂寡糖(内毒素)在抗原性上是可变的和/或在B群菌株中的表达是不恒定的。尚未鉴别出单独具有对有效疫苗而言必不可少的所有特征的单一抗原。
发明内容
在一个方面，本技术提供了包含原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗，所述原始外膜囊泡获自经过遗传修饰以提供广泛保护的至少两种脑膜炎球菌菌株。所述原始外膜囊泡包括基于PorA、LOS和保守性外膜蛋白的三组不同抗原；并且所述经遗传修饰的菌株被修饰为，基于lpxLl，synX和lgtA基因的灭活提供增强的安全性。两种脑膜炎球菌菌株均可表达具达具有不同LOS核心结构并具有由葡萄糖和半乳糖组成的α链的LOS。每种菌株可以表达基于B群病例分离体中最常见的PorA亚型选择的至少两种不同的PorA亚型蛋白或亚型表位。此外，所述疫苗还包括不同的具有诱导杀菌抗体能力的保守性表面蛋白，其在每种菌株中过表达并且选自FHBP(GNA1870)变体1、FHBP变体2和FHBP变体3；NadA；App；NspA；TbpA和TbpB。
在另一方面，本技术提供了来自三种经遗传修饰的、抗原性上不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株的NOMV的组合。至少一种所述菌株选自(1)H44/76HOPS-DL，其具有下列遗传修饰或特征：基因synX、lpxLl和lgtA的灭活；在opaD的位置***第二porA基因(亚型P1.7-1，1)；NadA增强的表达；和Opc和PorA的稳定高表达；(2)8570HOPS-GAL，其具有下列遗传修饰或特征：基因synX、lpxLl和lgtA的灭活；在opaD的位置***第二porA基因；因子H结合蛋白变体1的增强的表达；和PorA和Opc的稳定高表达；和/或(3)B16B6HPS-G2A，其具有下列遗传修饰或特征：基因synX、lpxL 1和lgtA的灭活；在opaD的位置***第二porA基因；因子H结合蛋白变体2的增强的表达；和PorA和Opc的稳定高表达。从压缩的细胞(packed cells)或从耗尽的培养基中制备NOMV，不暴露于去污剂或变性溶剂。所述疫苗可以与一种或多种佐剂混合并且可以肌内和/或鼻内给药。
在另一个方面，本技术提供了针对脑膜炎球菌疾病、更优选为B群脑膜炎球菌疾病的疫苗组合物，其包括来自一种或多种经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)。所述一种或多种经遗传修饰的菌株经过下列修饰：每种菌株中synX基因的灭活、lpxL1基因的灭活、lgtA基因的灭活，其导致表达短的或截短的缺少四糖“乳糖-N-新四糖”的脂寡糖(LOS)，和/或在opa基因的位置***至少一个抗原性上不同的第二porA基因。在另一个方面，经遗传修饰的菌株还包含至少一种次要的保守性外膜蛋白的增加的或稳定的表达，和/或至少一种外膜蛋白的稳定的表达。所述至少一个抗原性上不同的第二porA基因可以表达至少一种PorA亚型蛋白或亚型表位，其选自脑膜炎B群分离体的最常见的PorA亚型。
在另一个方面，本技术提供了脑膜炎奈瑟球菌亚型B菌株的经遗传修饰的疫苗菌株。所述经遗传修饰的疫苗菌株可以包括H44/76HOPS-D菌株(B1)、8570 HOS-G1菌株(B2)和/或B16B6 HPS-G2A菌株(B3)。
在另一个方面，本技术提供了脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的H44/76菌株：i)synX基因的灭活，ii)lpxL1基因的灭活，iii)lgtA基因的灭活，iv)在opaD基因的位置***第二porA基因，v)相对于原始菌株，NadA的增强的表达，和vi)Opc和PorA蛋白的稳定的增强的表达。在一些方面，所述经遗传修饰的菌株衍生自ET-5野生型菌株H44/76(B：15：P1.7，16：L，3，7：P5.5，C)。
在另一个方面，本技术提供了脑膜炎奈瑟球菌亚型B菌株的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的8570：i)synX基因的灭活，ii)lpxL1基因的灭活，iii)lgtA基因的灭活，iv)在opaD的位置***第二porA基因，v)因子H结合蛋白变体1的增强的表达，和vi)PorA和Opc蛋白的稳定的增强的表达。在一些方面，所述经遗传修饰的菌株衍生自ET-5野生型菌株8570(B：4：P 1.19，15：L3，7v：P5.5，11，C)。
在另一个方面，本技术提供了脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的B16B6：i)synX基因的灭活，ii)lpxL1基因的灭活，iii)lgtA基因的灭活，iv)在opaD的位置***第二porA基因(亚型P1.22-1，4)，v)因子H结合蛋白变体2的增强的表达，和vi)PorA和Opc蛋白的稳定的增强的表达。在一些方面，所述经遗传修饰的菌株衍生自ET-5野生型菌株B16B6(B：2a：P1.5，2：L2：P5.1，2，5)。
在一些方面，本技术提供了在铁缺陷型的培养基中生长的经遗传修饰的菌株。
在其它方面，本技术提供了经遗传修饰的菌株，其中通过在灭活基因的序列内***药物抗性基因使synX基因、lpxLl基因或lgtA基因灭活。
另一个方面提供了包括源生自本技术的经遗传修饰的菌株的NOMV的疫苗。所述NOMV从压缩的细胞或从耗尽的培养基中制备，不暴露于去污剂或变性溶剂。所述疫苗还可以包含一种或多种佐剂。在其它方面，遗传上改变的菌株改变为表达铁摄入蛋白。
在另一个方面，本技术提供了针对脑膜炎球菌疾病的疫苗，其包含多种原始外膜囊泡(NOMV)，其中至少一些所述NOMV基本没有表达或脂寡糖(LOS)的唾液酸化；包含含有脂A的LOS，所述脂A具有五酰基结构；并包含至少一种次要的保守性外膜蛋白的增加的表达，其中所述次要的保守性外膜蛋白选自诱导杀菌抗体的蛋白。所述次要的保守性外膜蛋白可以选自NadA、因子H结合蛋白(FHBP)变体1和FHBP变体2。在其它方面，至少一些NOMV包含短的或截短的基本上不含四糖“乳糖-N-新四糖(LNnT)”的LOS，和/或至少一些NOMV包含两个或更多个不同的PorA蛋白。
在另一个方面，本技术提供了在动物或人中引发针对脑膜炎球菌疾病的免疫应答的方法，其包括向动物或人施用包含来自至少一种经遗传改变的脑膜炎奈瑟球菌菌株的NOMV的组合物，以进行针对脑膜炎球菌疾病的免疫。疫苗用于针对B群脑膜炎球菌疾病的免疫。
在另一个方面，本技术提供了制备用于针对脑膜炎球菌疾病的疫苗的经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的方法，包括以下步骤：a)选择能够进行遗传修饰的脑膜炎球菌B型菌株；b)通过灭活synX基因对该菌株进行遗传修饰；c)通过灭活lpxL1基因对该菌株进行遗传修饰；d)通过灭活lgtA基因对该菌株进行遗传修饰；和e)通过增加一种或多种次要的保守性外膜蛋白的表达对该菌株进行遗传修饰。在另一个方面，所述方法还包括通过将至少一个抗原性上不同的第二porA基因***到opa基因的开放读码框中而对该菌株进行遗传修饰。在其它方面，所述方法还包括以下步骤：通过将至少一种外膜蛋白的启动子内或开放读码框内的多聚C序列替换为包含G和C核苷酸的序列而对该菌株进行遗传修饰，以稳定表达或过表达所述至少一种外膜蛋白。
在另一方面，本技术提供了制备针对脑膜炎球菌疾病的疫苗的方法，包括以下步骤：a)培养包含一种或多种选自下列的修饰的脑膜炎奈瑟球菌的经遗传修饰的菌株：synX基因的灭活、lpxL1基因的灭活、lgtA基因的灭活、在opa基因的位置***至少一个抗原性上不同的第二porA基因、至少一种次要的保守性外膜蛋白的增强的或稳定的表达、和/或至少一种外膜蛋白的稳定的表达；b)使用a)的培养的菌株接种发酵器中的培养基，通过发酵扩增培养物；c)灭活发酵的培养物；d)通过持续流动离心法收集培养的脑膜炎奈瑟球菌细胞并收集细胞糊；e)从细胞糊中分离NOMV；和f)将NOMV重悬于适合于疫苗施用的缓冲液或载体。
附图说明
图1的流程图描述了用于生产疫苗的经遗传修饰的奈瑟球菌菌株的主细胞库(master cell bank)的制备。
图2的流程图描述了用于生产疫苗的经遗传修饰的奈瑟球菌菌株的细胞库制备物的生产。
图3的流程图描述了奈瑟球菌的发酵，其用于制备用于生产疫苗的经遗传修饰的奈瑟球菌菌株。
图4的流程图描述了来自用于生产疫苗的经遗传修饰的奈瑟球菌菌株的NOMV的纯化。
图5是图4的流程图的继续。
图6是考马斯蓝染色的凝胶图，其显示了标准物(泳道1)、对照8570 HOPS-G NOMV制备物(泳道2)、过滤的原液疫苗(bulk vaccine)(泳道3)和成品疫苗(泳道4)的蛋白含量。
图7是银染凝胶，其显示了疫苗的脂寡糖含量。泳道1是对照ML5LPS，泳道2是过滤的原液疫苗，泳道3是成品疫苗产品。将15μl的1∶2稀释的100μg/ml疫苗跑胶(20μl的100μl/ml 1∶2稀释的对照)。
图8是抗体染色的western印迹图，其显示了8570 HOPS-GNOMV疫苗中存在的蛋白的性质和组成。
图9的图显示了从经过不同浓度的疫苗温育之后的人血液释放的TNF-α。
图10的图显示了从经过不同浓度的经遗传修饰的NOMV疫苗温育之后的人血液释放的IL-6。
图11的图显示了“从经过不同浓度的经遗传修饰的疫苗温育之后的人血液释放的TNF-α”与“从经过来自菌株44/76的DOC提取的OMV温育之后的人血液释放的TNF-α”进行比较。
图12的柱形图显示了以含有或不含佐剂的不同浓度的8570HOPS-G疫苗接种的小鼠的杀菌效价。
图13的柱形图显示了以8570 HOPS-G疫苗接种的小鼠针对不同测试菌株的杀菌效价。
图14的图显示了LOS、GNA1870、NOMV和Opc抗原的杀菌抗体消除测定的结果。
图15显示了以含有或不含佐剂的8570 HOPS-G NOMV疫苗接种的兔子的抗体应答。
图16的图显示了8570 HOPS-G1 NOMV疫苗对测试菌株的杀菌抗体消除测定的结果。
图17的图显示了8570 HOPS-G1 PorA敲除菌株的LOS和FHBP抗原的杀菌抗体消除测试的结果。
图18是本技术的三种经遗传修饰的奈瑟球菌菌株(A＝B1，B＝B2，C＝B3)的表型的图示。
图19是用于构建经遗传修饰的奈瑟球菌菌株的质粒的图示：a)构建为敲除lgtA的质粒，b)表达第二PorA的质粒，c)通过直系同源启动子(如果是大肠杆菌的话，则用Ptac)的驱动过表达fHbp的质粒，d)通过同源启动子(脑膜炎奈瑟球菌的PorA启动子)的驱动过表达NadA的质粒，和e)通过同源重组替换NspA基因，以fHbp(变体1和2)和NadA过表达质粒转化脑膜炎奈瑟球菌的示意图。
图20a是通过敲除三种经遗传修饰的菌株中的lgtA基因而使NOMV疫苗菌株的截短的LOS免疫型稳定化的图示。图20b是经遗传改变的菌株B2和亲代菌株(B16B6)表达的LOSα链的免疫印迹图，使用针对L3，7，9(左)和L8(右)的单克隆抗体。
图21的示意图显示了经遗传修饰的菌株B3中fHbp变体2的表达。图21a)显示了通过免疫印迹方法选择含有庆大霉素抗性的重组子、含有fHbp过表达的菌株；图21b)是Western印迹图，显示了fHBp的表达的增加，其中使用针对fHbp的JAR4单克隆抗体。
具体实施方式
本技术提供了用于针对脑膜炎球菌疾病、更优选针对脑膜炎奈瑟球菌B型亚组进行免疫的广泛保护的疫苗组合物。本技术的一个实施方式提供了包含来自至少一种、优选至少两种、更优选至少三种经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗组合物。原始外膜囊泡，也称为泡(bleb)，是从革兰氏阴性细菌的外膜的片段形成或衍生的囊泡，在生长过程中自然脱落，其可以从培养基获得或通过不使用去污剂或变性溶剂的温和方法从细胞获得。这些NOMV通常包含外膜蛋白(OMP)、脂类、磷脂、周质物质和脂多糖(LPS)，包括脂寡糖。革兰氏阴性细菌，尤其是病原体，例如脑膜炎奈瑟球菌，在毒性感染中，通常会在称作起泡(blebbing)的过程中脱落NOMV。在本技术中，NOMV是从细菌的外膜产生的囊泡，其中不使用化学变性过程，并且是从经遗传修饰的菌株产生的，所述菌株在抗原性上是不同的并且每种菌株都经过遗传修饰以改进安全性、抗原性的稳定性和保护性免疫应答的广度。
本发明的一个实施方式提供了包含衍生自至少两种或更多种经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株、优选至少三种不同的经遗传修饰的菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗组合物。
本技术的在一些实施方式中提供了脑膜炎奈瑟球菌、优选B亚型脑膜炎奈瑟球菌的抗原性上不同的菌株，其包括细菌基因组内的至少3个遗传修饰，更优选至少5个遗传修饰，更适宜地至少6个遗传修饰。所述遗传修饰可以包括以下一种或多种：1)synX基因的灭活，该基因对于唾液酸的生物合成是必需的，其灭活导致没有荚膜表达或脂寡糖(LOS)的唾液酸化；2)lpxL1基因的灭活，这会产生毒性显著较低的LOS，其具有五酰基结构的脂A；3)在一个opa基因(OpaC或OpaD)的位置***抗原性上不同的第二porA基因；4)至少一种次要的保守性外膜蛋白的增加的表达，所述次要的保守性外膜蛋白显示出诱导杀菌抗体的能力(例如，但不限于，NadA、因子H结合蛋白(FHBP)变体1和FHBP变体2)；5)每种菌株中lgtA基因的灭活，这导致短的或截短的LOS的表达，其缺少四糖“乳糖-N-新四糖(LNnT)”，和/或6)某些外膜蛋白的稳定的表达，例如Opc和PorA，这些蛋白在野生型菌株中易于发生相变异(phase variation)。
本技术提供了经遗传修饰的菌株，所述菌株提供了使用的安全性的增加以及针对脑膜炎球菌疾病的保护性抗体应答的广度的增加。在一个实施方式中，通过向细菌基因组中引入至少一个下列突变，经遗传修饰的菌株提供了增加的安全性：删除synX基因，这会阻断衣壳的唾液酸合成，并导致形成荚膜阴性的表型的NOMV；删除lpxL1基因，这会通过产生五酰基脂A结构而降低内毒素活性；和/或删除lgtA基因，这会阻断脂寡糖(LOS)上乳糖-N-新四糖的生物合成，从而使截短的LOS结构稳定；更优选地，经遗传修饰的菌株提供这些突变中的两项，最优选地，经遗传修饰的菌株提供所有这三项突变。在本技术的另一个实施方式中，通过靶向NOMV中包含的三组可能的保护性抗原中的至少一个，经遗传修饰的菌株具有保护性抗体应答的增加的广度。所述靶向的三种可能的抗原包括以下至少一种：PorA蛋白、至少一种次要的保守性蛋白、和/或LOS核心结构，并且包括其任意组合。在更优选的实施方式中，经遗传修饰的菌株靶向至少两种可能的保护性抗原，最优选靶向所有这三种可能的保护性抗原。
在本技术的一些实施方式中，通过美国专利6,558,677中描述的方法将synX-突变(synX基因的灭活)***经遗传修饰的菌株，该专利通过引用全文并入本文。简而言之，使用基于pUC19的质粒转化经遗传修饰的菌株，所述质粒包含synX基因，其中200bp序列替换为卡那霉素抗性基因。选择Kan抗性转化子并通过PCR测试其中是否存在被破坏的synX基因并测试其荚膜阴性表型。这种synX-突变体是基于Swartley和Stephens(Swartley and Stephens(1994)J.Bacteriol.176：1530-1534)报道的结果和序列信息构建的，他们的研究显示：向synX基因中***转座子会导致荚膜阴性表型。可以向任何可转化的脑膜炎奈瑟球菌菌株中导入相同或等同的突变。使用以下程序构建了用于转化脑膜炎球菌的合适质粒。使用通过重叠延伸(SOE)聚合酶链式反应(PCR)的剪接(Horton等人(1989)Gene 77：61-65)将3个DNA序列拼接在一起。所述3个DNA序列包括：从5′末端开始，synXB碱基67-681；来自pUC4K(Pharmacia LKB Biotech Co.)的卡那霉素抗性基因671-1623；和synxB碱基886-1589。此外，通过在用于扩增synXB 67-691碱基序列的PCR引物末端加入假定的摄取序列(uptake sequence)ACCGTCTGAA，在5′末端添加该摄取序列。通过PCR扩增完整的构建体、纯化并平末端连接进入pUC19。pUC19用于转化大肠杆菌DH5α并在LB琼脂上以50μg卡那霉素进行选择。选取卡那霉素抗性菌落，提取DNA、纯化并以XbaI切割。将假定的摄取序列的另一个拷贝连接进入此多克隆位点区，使用得到的质粒转化大肠杆菌DH5α并通过PCR就另外的摄取序列的存在来筛选卡那霉素抗性菌落。从所选择的菌落中分离质粒DNA并用作PCR的模板，所述PCR使用仅扩增质粒的***部分(不包括氨比西林抗性基因，其不应被导入脑膜炎奈瑟球菌)的引物。然后纯化经扩增的DNA并用于转化经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株。通过卡那霉素抗性选择脑膜炎奈瑟球菌的synX(-)突变体并通过PCR扩增修饰区域加以确认。
在本发明的一些实施方式中，在经遗传修饰的菌株中将lpxL1基因灭活以产生疫苗组合物中的NOMV上表达的内毒素毒性降低的LOS。脑膜炎奈瑟球菌LOS的脂A通常是六酰基结构，其负责LOS的内毒素毒性特性。脂A中存在的两个酰基-氧-酰基连接的次级脂肪酸对于内毒素毒性活性具有重要意义。经遗传修饰的菌株包括如van der Ley及其同事(van der Ley，P.，Steeghs，L.，Hamstra，H.J.，van Hove，J.，Zomer，B.，and van Alphen，L.Modification of lipid Abiosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants：influence on lipopolysaccharide structure，toxicity，and adjuvant activity.Infection and Immunity 69(10)，5981-5990，2001.)描述的lpxL1突变体。lpxL1基因的删除导致五-酰基LOS的正常水平的表达，其具有大大降低的内毒素毒性，如通过兔子热源测试法和使用来自全血的人单核细胞进行的细胞因子释放测定法所测。在本技术的其它实施方式中考虑到了用于破坏lpxL1基因以用于开发经遗传修饰的菌株的其它方法。
在一些实施方式中，经遗传修饰的菌株中包含***到opa基因中的一个(OpaC或OpaD)的位置中的抗原性上不同的第二porA基因。脑膜炎奈瑟球菌的主要外膜蛋白PorinA或PorA是porA基因的产物。PorA具有广泛的抗原性变异，并且易于发生相变异以逃避免疫选择性压力；因此，它对其它亚型并不总是具有交叉保护性。为了增加疫苗组合物对不同亚型的PorA的反应活性，将至少一个另外的porA基因***到经遗传改变的菌株的opaC或opaD基因中。所选的用于***的PorA血清型是根据B亚型脑膜炎球菌疾病病例中发现的最主要的PorA形式来选择的。合适的PorA血清型包括但不限于，P1.7-1(来自菌株M1080)；P1.22，14(来自菌株M4410)；P1.22，1，4；或本领域技术人员理解的或目前文献中描述的其它适宜的PorA血清型，例如Sacchi等人，Diversity and prevalence of PorA types in Neisseria meningitidis serogroup B in the United States，1992-1998，J Infect Dis.2000Oct；182(4)：1169-76中所描述的。所述第二PorA基因可以置于提供PorA蛋白表达的任何合适的有力的启动子的控制之下，例如来自适宜的菌株例如H44/76菌株的PorA启动子。将porA基因克隆进入经遗传改变的菌株的合适方法是本领域技术人员已知的，可以包括但不限于同源重组。例如，可以通过PCR从细菌染色体DNA扩增porA基因，将其克隆进入克隆载体，并使用通过修改的重叠延伸PCR技术的基因剪接将其再克隆进入适当地构建的质粒，例如pUC19。可以通过同源重组将该构建体质粒导入细菌的基因组以替换opa基因。可以通过使用针对Porin的单克隆抗体通过菌落印迹法来选择转化子。这些方法对本领域技术人员是已知的。
在本技术的进一步的实施方式中，修饰的菌株具有至少一种次要外膜蛋白的稳定的和/或增加的表达。合适的次要外膜蛋白显示出诱导杀菌抗体的能力(例如，但不限于，NadA、因子H结合蛋白(FHBP)变体1和FHBP变体2)。不被任何理论所束缚，高度保守的表面暴露的次要外膜蛋白(通过基因组分析鉴别为具有诱导保护性抗体的潜力)的稳定的和/或增加的表达可以引起交叉保护性免疫应答的增加。适宜的保守性次要蛋白包括但不限于NadA、FHBP变体1和2和Opc。使次要外膜蛋白(OMP)稳定和/或过表达的方法包括使用表达质粒和同源重组，或本领域技术人员已知的其它合适的方法。次要OMP可以置于有力的启动子的控制之下，例如但不限于，脑膜炎奈瑟球菌PorA启动子或IPTG可诱导的大肠杆菌ptac启动子。
如下文实施例中所描述，使用构建体质粒在经遗传修饰的菌株中建立fHbp1和fHbp2的增加的表达，其中过表达的蛋白被正确地加工、脂化并转移至外膜表面。例如，v.1在IPTG可诱导的大肠杆菌Ptac启动子的控制下在菌株8570 HOPS-G (B2)中的表达比在亲代菌株8570中的表达高大约4倍；v.2在菌株B16B2 HPS-G2A(B3)中的表达比在亲代菌株B16B6中的表达高32-64倍(见图20)。或者，利用PorA启动子的表达***可用于使次要的保守性蛋白稳定/过表达。
在本技术的进一步的实施方式中，经遗传修饰的菌株包括lgtA基因的灭活，这导致短的或截短的缺少四糖“乳糖-N-新四糖(LNnT)”的LOS的表达。
脑膜炎球菌的LOS的一个重要特征是相变异，这是由于lgtA和其它奈瑟球菌基因中的核苷酸残基的均聚束(homopolymeric tract)的高频率突变造成的。这些突变开启或关闭LgtA转移酶的表达，该酶介导LOSα-链的组装(改变庚糖二上的取代基的构象)。lgtA基因的这种相变异激活可能引起LOSα-链的不想要的延长，从而导致产生与人类血液细胞抗原具有结构类似性的乳糖-N-新四糖。在本技术的经遗传修饰的菌株中，通过使用抗生素标志物或其它合适的标志物(用于筛选基因中的变异)，例如，但不限于zeomycin抗性基因，破坏原始基因，将lgtA基因敲除。敲除lgtA基因的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于，构建质粒和同源重组或转化。在所观察的至少22个传代的过程中，在所有的经修饰的菌株中，突变的ΔlgtA基因是无活性的，并且这是稳定的截短形式的LOS核心结构。lgtA基因的删除稳定了截短的α-核心LOS结构，例如，提供了如图19所示的截短的核心结构，其中显示了3个示例性的修饰的菌株，例如B3菌株，其含有具有L3核心结构的L8α链。本技术的经遗传修饰的菌株含有对应于免疫型L3、L5和L2的特异性LOS核心结构，提供了稳定的核心结构，其中可以增强免疫应答，在下文的实施例中证明截短的L8样LOS(L8-3、L8-5和L8-2)能够杀死表达全长LOS的野生型菌株。ΔlgtA菌株能够激发识别截短的和全长形式的LOS结构的抗体，与人类血细胞中存在的乳糖-N-新四糖寡糖没有交叉反应。
在本技术的其它实施方式中，经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株稳定表达在野生型菌株中通常易于发生相变异的外膜蛋白，所述蛋白是例如但不限于Opc和PorA。可以通过本领域已知的方法稳定这些蛋白的表达，所述方法包括以最佳长度形式的最大表达的非重复序列替换待稳定的基因的启动子或读码框中的多聚重复序列。例如，这些基因的启动子中的多聚-C或多聚-G序列的一部分可以替换为相同长度的含有C和G核苷酸二者的序列，例如opcA的启动子(见SEQ IDNO：1)的12bp的多聚-G序列替换为新的相同长度的含有C和G核苷酸二者以及Not I位点的序列(见SEQ ID NO：2，Not I位点以下划线标出)。在其它适宜的实施方式中，PorA启动子(例如，见SEQID NO：3)中的多聚-G序列可以替换为新的含有C和G核苷酸的序列。
本技术的其它实施方式提供了在含有低水平铁的液体培养基中生长以便诱导参与铁摄取的蛋白(例如，转移结合蛋白A和B)表达的疫苗菌株。在一些实施方式中，所用的培养基不含有特异性添加的铁螯合剂，例如得斯芬(desferol)。一种适宜的培养基是从BW Catlin(Catlin BW.(1973)J.Infec.Dis.128：178-194)发表的培养基改进而来：将几种单独的氨基酸替换为1％的酪蛋白氨基酸(经鉴定的，Difco Laboratories)。每升所述培养基含有下列物质：0.4g NH4Cl、0.168gKCl、5.85g NaCl、1.065g Na2HPO4、0.17g KH2PO4、0.647g柠檬酸钠、6.25g乳酸钠(60％的糖浆)、0.037g CaCl2.2H2O、0.0013gMnSO4.H2O、5g甘油、0.02g半胱氨酸、10g酪蛋白氨基酸、0.616gMgSO4，加蒸馏水至1升。将相同的铁缺陷型培养基用于起始培养瓶和最终培养瓶或发酵器。
包括来自至少3种不同的经遗传修饰的B亚型菌株的NOMV的本技术的疫苗组合物可以提供3种潜在水平的保护或3种抗原，每种潜在地诱导保护性抗体应答。所述3种抗原是PorA蛋白(疫苗中存在6种不同的PorA亚型，3种疫苗菌株的每一种有2种PorA蛋白)；脂寡糖(疫苗中存在3种不同的LOS核心结构，每种菌株有1种)；和保守的次要蛋白NadA、FHBP变体1和2，以及Opc，它们在疫苗菌株中过表达。虽然PorA具有相对高水平的抗原变异，其中已经鉴别了几百种不同的序列变异，但是某些PorA血清亚型比其它的更经常遇到，适度数目的不同的血清亚型可以潜在地提供针对一半以上的B群疾病的保护。在疫苗中具备一种以上的能够诱导杀菌抗体的抗原具有重要意义，这是因为已经表明了当抗原的表面密度较低时，针对该抗原的抗体可能不能启动补体介导的裂解事件。但是，如果存在针对两种或更多种此类抗原的抗体，则抗体联合在一起能够启动补体介导的裂解。本发明的经遗传修饰的菌株包括但不限于图18中所示的3种菌株，包括B1(44/76 HOPS-D)、B2(8570 HOPS-G1)和B3(B16B6HPS-G2)菌株。
本技术提供了这样的疫苗，其提供针对脑膜炎球菌疾病、尤其是脑膜炎奈瑟球菌B亚型引起的脑膜炎球菌疾病的广谱保护。本发明的疫苗组合物可以与现有的四价的A、C、Y和W-135疫苗组合以提供针对多数致病性脑膜炎奈瑟球菌血清群的保护。不被任何特定理论所束缚，本技术的疫苗还可以提供针对其它致病性血清群以及脑膜炎球菌的次要血清群的后备保护(back up protection)，因为该疫苗所基于的荚膜下抗原为脑膜炎球菌的所有血清群所共有。
在本技术的优选实施方式中，通过同源重组和/或位点特异性重组的方式将目标基因或目标DNA输送并整合进入细菌染色体。用于输送此类基因和/或操纵子的整合性载体可以是条件化的可复制的或***质粒、噬菌体、转位子，或通过本领域技术人员已知的限制性水解或PCR扩增获得的线性DNA片段。在一些实施方式中，整合靶向那些对于体外生长可有可无的染色体区域。在其它实施方式中，可以通过游离型载体(episomal vector)，例如环形/线性可复制质粒、粘粒、质粒、溶原性噬菌体或细菌人工染色体的方式将目标基因或目标DNA输送至细菌。可以通过可选择的遗传标志物例如赋予对抗生素(例如卡那霉素、zeomycin、红霉素、氯霉素、庆大霉素等)抗性的基因、赋予对重金属和/或毒性化合物抗性的基因、或补偿营养缺陷型突变的基因来选择重组事件。或者，可以通过PCR扩增、测序、限制性消化或本领域技术人员已知的其它方法进行重组的筛选。
本文所称的“疫苗”定义为药物组合物或治疗性组合物，其用于接种动物以使该动物产生抵抗生物体、优选为致病性生物体感染的免疫力。疫苗通常包含一种或多种衍生自一种或多种生物体的抗原，向动物施用之后将刺激主动免疫力并保护该动物抵抗这些生物体或相关的致病性生物体的感染。
通过本领域技术已知的方法制备用于向哺乳动物、适宜地向人类、小鼠、大鼠或兔子施用的纯化的NOMV，所述方法可以包括过滤以将溶液灭菌、稀释该溶液、添加佐剂和稳定该溶液。
本发明的疫苗可以通过多种途径向人类或动物施用，包括但不限于，例如非肠道(例如肌内或透皮)、鼻内、口、局部或本领域技术人员已知的其它途径。下文使用的术语非肠道包括静脉内、皮下、真皮内、肌内、动脉内注射，或输注技术。疫苗可以是单剂制备物的形式或多剂瓶装形式，其可用于大规模免疫项目。制备和使用疫苗的适宜方法可以参见Remington′s Pharmaceutical Scien ces，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，Osol(ed.)(1980)和New Trends in Developments in Vaccines，Voller等人(编)，University Park Press，Baltimore，Md.(1978)，通过引用并入。
本技术的疫苗组合物通常以非肠道方式、以包含标准的熟知的非毒性的生理上可接受的载体、佐剂和/或介质的剂量单元制剂的形式施用。
本技术的疫苗组合物还可以包含一种或多种佐剂。“佐剂”是指这样的物质：当与特异性疫苗抗原一起使用时，其增强、加速或延长抗原的抗原特异性免疫应答，但是当单独使用时，其不会刺激产生免疫应答。合适的佐剂包括无机或有机佐剂。合适的无机佐剂包括但不限于，例如，铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝(优选是氢氧化铝)，但也可以是钙盐(特别是碳酸钙)、铁或锌，或者可以是酰基化的酪氨酸的不溶性悬浮液，或酰基化的糖，阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷嗪。其它合适的佐剂是本领域技术人员已知的。还可以使用合适的Th1佐剂***，并且包括但不限于，例如，单磷酰脂A，LPS的其它非毒性衍生物，以及，单磷酰脂A(例如3-邻位-脱酰基的单磷酰脂A(#D-MPL)与铝盐的组合。
其它的适宜的佐剂的实例包括但不限于，MF59、MPLA、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)、细菌脂多糖、氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类似物，可以从Corixa(Hamilton，Mont.)获得，且描述于美国专利号6,113,918；例如，2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基、2-脱氧-4-O-膦酰-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷、MPLTM(3-O-脱酰基的单磷酰脂A)(可以从Corixa获得)，描述于美国专利号4,912,094，合成的多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)，COG-ODN(CpG寡脱氧核苷酸)，多肽，皂甙，例如Quil A或STIMULONTMQS-21(Antigenics，Framingham，Mass.)，描述于美国专利号5,057,540，百日咳毒素(PT)，或大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)，尤其是LT-K63，LT-R72，CT-S109，PT-K9/G129；参见，例如国际专利公开号WO93/13302和WO 92/19265，霍乱毒素(野生型或突变形式)。或者，各种油制剂，例如硬脂酰酪氨酸(ST，参见美国专利号4,258,029)，被称为MDP的二肽，皂甙，霍乱毒素B亚基(CTB)，来自大肠杆菌的热不稳定的肠毒素(LT)(已经开发了遗传上类毒素的突变体LT)，和Emulsome(Pharmos，LTD.，Rehovot，Israel)。各种细胞因子和淋巴因子适合用作佐剂。一种这样的佐剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其核苷酸序列描述于美国专利号5,078,996。细胞因子白细胞介素-12(IL-12)是另一种佐剂，其描述于美国专利号5,723,127。已经表明其它的细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，包括但不限于白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-α、β和γ、粒细胞集落刺激因子，和肿瘤坏死因子α和β，它们适合用作佐剂。
可以将疫苗组合物冻干以产生针对脑膜炎奈瑟球菌的干燥形式的疫苗，以便易于运输和储存。此外，可以以混合疫苗的形式来制备疫苗，所述混合疫苗含有包含来自上文描述的经遗传改变的菌株的蛋白的NOMV，以及至少一种其它的抗原，只要该添加的抗原不干扰疫苗的有效性并且不以加和或协同方式增加副作用和不利反应。疫苗可以与化学部分联合，所述化学部分可以改善疫苗的溶解性、吸收、生物半衰期等。所述部分还可以降低疫苗的毒性、消除或减弱疫苗的任何不想要的副作用等。能够介导此类效应的部分公开于Pharmaceutical Sciences(1980)。将此类部分偶联至分子的程序是本领域熟知的。
疫苗可以储存于密封的瓶、安瓿等容器中。本发明的疫苗一般可以通过喷雾的形式施用，用于鼻内给药；或者通过鼻滴液、吸入剂、扁桃体上的拭子、或作为胶囊、液体、悬浮液或西也剂用于口服给药。在疫苗是干燥形式的情况下，在施用前将疫苗溶解于或悬浮于灭菌的蒸馏水。优选使用任何惰性载体，例如盐水、磷酸盐缓冲液、或者NOMV疫苗在其中具有适宜的溶解性的任何此类载体。
本技术的疫苗组合物可以包括载体。如果处于溶液或液体气雾剂悬浮液中，合适的载体可以包括但不限于，盐溶液、蔗糖溶液，或其它药学上可接受的缓冲液。气雾剂溶液还可以包含表面活性剂。
可以使用的可接受的介质和溶剂包括水、林格氏溶液、和等渗氯化钠溶液，包括磷酸盐、乳酸盐缓冲的盐溶液、Tris等。另外，无菌的、不易挥发的油常规地用作溶剂或悬浮介质，包括但不限于，例如，合成的单-或双-甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射制剂。
可注射制剂，例如无菌的可注射水性或油性悬浮液，是使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知技术配制的。无菌的可注射制剂也是处于非毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇中的溶液。
通过参考以下实施例可以更好地理解本文描述的技术及其优点。提供这些实施例是为了描述本技术的具体实施方式。通过提供这些具体实施例，本申请人不因此限制本技术的范围和精神。本领域技术人员将理解，本文描述的技术的完整范围包括本说明书随附的权利要求所定义的主题以及这些权利要求的任何变体、修饰或等同物。
实施例
实施例1.经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌疫苗菌株的衍生和包含经遗传修饰的疫苗菌株的外膜蛋白的NOMV的生产
对亲代菌株8570进行5种遗传修饰，获得经遗传修饰的菌株8570HOPS-G1，所述亲代菌株经过该菌株的来源实验室的多位点酶电泳分析并且确定属于ET-5克隆复合物(Caugant等人)。在进行遗传修饰之前，对PorA可变区进行测序分类，并确认LOS的免疫型。菌株8570是ET-5克隆4：P1.19，15：L7v，ProB3(ST4)Tbp2II型。按照以下描述，对该菌株依次进行5个遗传修饰：
1)在opaD基因座***不同的第二porA基因，敲除opaD基因。基于pUC 19的质粒pA 18.4在***子中没有抗生素抗性标志物，将该质粒用于把第二porA基因***到opaD基因座的染色体中，通过以***子替换基因中部的100bp序列而使opaD失能。***子含有新的来自菌株M4410(B：15：PI.22，14)的porA基因，并将其置于来自菌株H44/76的porA启动子之后。得到的porA型是P1.19，15：P1.22，14，其含有两个porin A基因。
2)从1中获得的表达第二PorA的菌株开始，通过将opcA的启动子中的12bp的多聚-C序列替换为含有C和G核苷酸二者的相同长度的新序列来使外膜蛋白opcA的表达稳定化。最初的启动子序列(SEQ ID NO：1)(多聚-G序列为斜体和粗体)5′..CATAGTTAAAACCTCTAAAATTTGGATTGTAGTCGGATATGGTAACATAACGTAAATAATCGTTACGCTTACAATTATATTCTTAAGCTTTC
Figure BDA0000042725460000191
ATTT..3′替换为含有G和C核苷酸二者的具有NotI位点(下划线)的修改的启动子序列(SEQ ID NO：2)5′..CATAGTTAAAACCTCTAAAATTTGGATTGTAGTCGGATATGGTAACATAACGTAAATAATCGTTACGCTTACAATTATATTCTTAAGCTTTCATTTT.3′。选择的替换序列包含NotI的限制性位点以能够验证替换序列的存在。用于转化的质粒是pOpc79(SEQ ID NO：4)。质粒***子不含抗生素标志物。基于使用针对OpcA的单克隆抗体进行的菌落印迹来选择转化子。待转化的菌株选择为OpcA阴性相变体，通过菌落印迹鉴定强烈的OpcA阳性克隆。通过PCR和限制性酶(NotI)分析将真实转化子和OpcA阳性相变体区分开。
3)从2中得到的菌株开始，通过将lpxL1基因中部的260bp的序列替换为含有tetM抗生素抗性基因的***子而使基因lpxL1失能，所述基因lpxL1是负责把两个酰基-氧-酰基连接的脂肪酸之一连接至LOS的脂A的酰基转移酶。所述tetM基因获自质粒pJS1934，该质粒衍生自转座子Tn916(Swartley，等人1993.Mol.Microbiol.10：299-310)。用于使lpxL1基因失能的质粒是pMn5(Seq.ID No.5)。使用lpxL1基因的起始端和末端的引物通过PCR确认lpxL1基因中***子的存在，该PCR产生3.3kbp的扩增子。
4)从步骤3得到的菌株开始，通过在nspA基因座中***GNA 1870变体1基因的第二个拷贝(敲除NspA的表达)来增加保守性外膜蛋白GNA 1870(变体1)(FHBP v.1)的表达。新***的基因是***子的一部分，所述***子含有庆大霉素抗生素抗性基因、具有IPTG-可诱导的Ptac启动子的大肠杆菌lac操纵子、GNA1870变体1基因和rrnB终止子，所用的质粒显示于图19c和Seq.ID No.6。基于PUC19的质粒pBE/GNA1870/101用于转化和同源重组，以把GNA 1870变体1基因***到修饰的菌株中。按照表1中描述的特征构建pBE/GNA1870/101质粒plasmid(7687b.p.)(序列见Seq.ID No.6)。
表1
Figure BDA0000042725460000201
＊)从pUC 19的nt.1开始。修饰该质粒以除去Nde I位点，以方便进行以下克隆：使用Nde I-EcoR I将其消化，除去213b.p.的片段。补平粘末端并连接以恢复该质粒。结果是，Nde I(183)和EcoRI(395)位点被破坏。为了克隆用于表达靶蛋白的构建体，我们使用了pUC 19的Sac I和Hind III克隆位点。
5)使用基于pUC19的质粒转化从步骤4得到的菌株，所述质粒包含synX基因，其中200bp的序列替换为卡那霉素抗性基因。选择卡那霉素抗性的转化子并通过PCR测试是否存在破坏的synX基因和荚膜阴性表型。结果验证了synX基因的敲除。
6)使用质粒pBE-501转化从步骤4得到的菌株，所述质粒包含zeomycin基因，敲除lgtA基因(Seq.ID No.9)。质粒pBE-501包含表2所示的特征。lgtA基因的敲除产生了短的或截短的不含四糖“乳糖-N-新四糖(LNnT)”的LOS的表达(见图20)。
表2
Figure BDA0000042725460000211
＊)使用BssH II消化LgtA cDNA。重新补平产生的3′和5′粘末端，将Zeocin基因***此平末端化的cDNA。在切除被破坏的Zeocin基因的情况下(可能在修复细菌DNA的过程中发生)，LgtA片段的降级的5′和3′将具有不可修复的序列。
对这种经遗传修饰的菌株进行测试以确保其保留所有5个突变并且表达所有预期的抗原。
实施例2：疫苗数量的经遗传修饰的菌株的生产
然后将经遗传修饰的菌株用于生产主细胞库和生产细胞库，以用于图1-5中的流程图详细描述的疫苗生产，以便产生NOMV的组合物。测试NOMV培养物中外膜蛋白和LOS的表达。
实施例3：疫苗的表征
将实施例2中获得的最终产品进行质量控制测试，并在小鼠和兔子中进行临床前安全性及免疫原性测试。
最终疫苗产品的组成是：
蛋白质2001ag/ml
脂寡糖36tg/ml
核酸2.5μg/ml
氯化钠0.9％
Tris-HCl缓冲液0.01M pH 7.6
进一步通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和western印迹分析疫苗成分。图6显示了考马斯蓝染色的凝胶，其显示了相对于对照(泳道2)和过滤的原液(泳道3)，疫苗中的蛋白含量(泳道4)。图7显示了银染的凝胶，其显示了相对于对照(ML5LPS，泳道1)和过滤的原液疫苗(泳道2)，疫苗中的脂糖成分(泳道3)。图8显示了根据表3所列的抗体就NOMV疫苗的主要成分对疫苗进行的鉴定测试的结果。
表3
  泳道   抗体特异性   单克隆抗体   预期的反应   测试结果
  1   预染的标准物   不适用
  2   L8 LOS   2-1 L8   痕量   痕量
  3   L8v LOS   25-1-LC1   阳性   阳性
  4   L3，7LOS   9-2-L379   痕量   痕量
  5   Lip (H8)   2-1-CA2   阳性   阳性
  6   Opa P5.10   23-1-P5.10   阴性   阴性
  7   Opa P5.11   MF7-1-P5.11   阴性   阴性
  8   Opc(P5.C)   B306-P5C   阳性   阳性
  9   FHBP I (GNA1870)   JAR 4   阳性   阳性
  10   Rmp   9F5   阳性   阳性
  11   PorB P4   15-1-P4   阳性   阳性
  12   PorA P1.14   MN21G3.17   阳性   阳性
  13   PorA P1.15   MN3C5C   阳性   阳性
  14   PorA P1.19   2-1-P1.19   阳性   阳性
  15   TBP2   476C2G2   阳性   阳性
  16   Gp B多糖   2-2-B   阴性   阴性
  17   氨基黑染色   不适用
图6、7和8中的结果显示了来自经遗传修饰的菌株8570 HOPS-GNOMV的疫苗的NOMV中的蛋白含有所描述的蛋白和LOS。
实施例4：疫苗的一般性安全测试
按照21 CFR 610.11中规定的一般性安全测试对疫苗进行测试。疫苗的测试结果显示于表4。
表4
Figure BDA0000042725460000231
实施例5：兔子热源测试＊
表3中给出了单独的经遗传修饰的疫苗8570 HOPS-G NOMV和吸附至氢氧化铝佐剂的疫苗的兔子热源测试(测试内毒素活性)的结果。给出的数值是在兔子中不诱导发烧(体温升高＞0.5℃)的所测的最大量，其结果显示于表5。
表5
Figure BDA0000042725460000241
＊这些测试由BioReliance，Inc.在GLP下按照CFR中指明的程序进行。
＊＊对于所有制剂(剂量)，用于人类研究的氢氧化铝的量/kg。
总之，单独的疫苗在0.4pg/kg通过审查，氢氧化铝佐剂在15pg/kg通过审查(待用于临床研究的最大量/kg)，吸附至氢氧化铝的疫苗在0.5μg/kg通过审查，但是在1.0pg/kg未通过审查。这些在pg/kg的基础上的结果的外推提示吸附的疫苗在人类中在25-50μg的剂量范围内不会引起发热。
实施例6：从人全血释放的细胞因子
通过测定疫苗从人的新鲜全血中诱导促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的能力来检测其内毒素含量。结果显示于图9和10。数据是3次(大肠杆菌LPS标准物和含有lpxL2 LOS的NOMV疫苗批号1119)或5次(含有野生型LOS的NOMV疫苗批号0832，和含有lgxL1 LOS的NOMV疫苗批号1289)测试的平均值。误差条是平均值的标准误差。NOMV的浓度是基于蛋白的，但大肠杆菌LPS标准物的浓度是基于LPS的重量。不被任何特定理论所束缚，这些结果提示本疫苗可能在人类志愿者中具有类似于含有lpxL2 LOS的疫苗(脑膜炎球菌44/76 MOS 5D NOMV疫苗，批号1119，BB-IND 12687)的安全性特征谱。
将8570 HOPS-G NOMV疫苗批号1289的活性与脱氧胆酸盐提取的外膜蛋白囊泡(OMV)进行比较。使用Fredriksen JH，等人NIPHAnnals，14：67-80，1991描述的基本方法制备囊泡，不同之处在于，在全部程序中使用0.5％的脱氧胆酸盐(DOC)来重悬超离心的沉淀，而不是使用1.2％的DOC。该比较的结果显示于图11。
实施例7：小鼠中的免疫原性和杀菌抗体应答
以4周的间隔向小鼠施用3剂经遗传修饰的疫苗菌株8570HOPS-G(吸附至或不吸附至氢氧化铝佐剂(Rehydragel LV))。在第0、4和8周使用0.1、0.3、1.0或3.0μg的NOMV通过腹膜内方式接种小鼠(一组10只)，表6中列出了疫苗小组。在第0、7和10周采取血清。测试血清针对4种不同菌株、疫苗亲本菌株和几种相关菌株的杀菌抗体，使用正常人类血清作为补体来源。免疫前的血清均没有杀菌活性。
表6
  疫苗小组   注射的疫苗量
  1   0.1μg
  2   0.3μg
  3   1.0μg
  4   3.0μg
  5   0.1μg+Rehydragel LV
  6   0.3μg+Rehydragel LV
  7   1.0μg+Rehydragel LV
  8   3.0μg+Rehydragel LV
  9   1.0μg+Rehydragel HPA
图12中显示了在第10周(3剂疫苗)获得的结果，其显示了经遗传修饰的菌株的不同疫苗小组的杀菌效价。两种测试菌株与疫苗菌株的亲代是同基因的。它们是通过将porA基因替换为具有不同血清亚型特异性的替代性porA从亲代菌株衍生而来。这些测试菌株中表达的两种PorA蛋白(P1.19，15和P1.22，14)存在于疫苗中，但第三种(P1.22-1，4)不存在。与疫苗菌株相比，第4种菌株44/76具有不同的PorA、不同的PorB和不同的LOS核心结构。令人惊奇的是，与发表的研究结果不同(其中脱氧胆酸盐提取的囊泡疫苗显示PorA抗原为通常的显性抗原)，本技术的疫苗的结果证明，杀菌活性的主要部分不依赖于靶菌株的血清亚型，因此不针对PorA。
8570 HOPS-G NOMV疫苗在小鼠中诱导的杀菌抗体不显示血清亚型特异性，而是主要不依赖于血清亚型和血清型(图13)。发现杀死菌株44/76的抗体主要是针对LOS。误差条是平均值的标准误差。施用吸附至或不吸附至Rehydragel LV氢氧化铝佐剂的疫苗。
通过使用不同的分离的抗原消除杀菌活性来分析针对异质菌株44/76的杀菌抗体应答的特异性。将接种后的小鼠血清稀释至杀菌终点(-50％杀死)，并在包被了不同浓度的几种抗原的96孔平板的孔中温育。温育4个小时后，测试血清的杀菌活性并确定杀菌抗体的消除的百分率。从靶菌株制备的纯化的LOS(免疫型L3，7)能够消除几乎所有抗体。从疫苗菌株制备的纯化的LOS(免疫型L8v)能够消除大约70％的抗体。保守性蛋白GNA1870(纯化的、重组的蛋白)消除了大约20％的杀菌活性，不被任何特定理论所束缚，这表示涉及抗-LOS抗体和抗-GNA1870抗体二者的一些合作杀灭效应，如图14所示。
实施例8：兔子中的免疫原性
还测试了疫苗在兔子中的免疫原性。使用不同剂量的疫苗(吸附至或不吸附至氢氧化铝佐剂)通过肌肉内方式接种每组4只兔子。以6周的间隔给予3剂疫苗，在最后一次注射之后2周采取血样。测定兔子对4种测试菌株的杀菌抗体应答。测试菌株包括表达不同的PorA蛋白和L3，7v LOS的8570的3种同基因变体，以及含有异源PorA和具有不同核心结构的LOS的菌株44/76。PorA蛋白P1.19，15和P1.22，14存在于疫苗中，但是P1.22-1，4不存在。杀菌测试的结果显示于图15。按照与小鼠血清相同的方式分析针对菌株44/76的交叉反应杀菌活性，结果基本上是相同的。多数交叉反应性杀菌抗体可以通过与测试菌株同源的纯化的LOS消除。
实施例9：完整多价NOMV疫苗的实验室批次的制备和动物测试
除了以上实施例中描述的菌株8570 HOPS-G1之外，还选择并遗传修饰了另外两种疫苗菌株。第一种是菌株B16B6(B：2a：P 1.5，2：L2)。该菌株属于遗传组ET-37并且具有2类PorB蛋白和I型转铁蛋白结合蛋白B。第二种是菌株44/76(B：15：P1.7，16：L3，7)，其属于遗传组ET-5并且代表造成20世纪70和80年代在挪威流行的B型脑膜炎球菌疾病的流行性菌株。其表达3类PorB蛋白和II型转铁蛋白结合蛋白B。
按照大体上与菌株8570 HOPS-G1相同的方式进行菌株B16B6的遗传修饰。使两个基因synX和lpxL1失能，以阻止荚膜的合成和LOS的唾液酸化并降低LOS的毒性。在opaD基因的位置***第二porA基因(亚型P1.22-4)。使用质粒pBE-201(Seq.ID.No 7)将具有IPTG可诱导的大肠杆菌Ptac启动子的GNA 1870(FHBP)的变体2***到nspA基因的位置，作为第二个拷贝。按照表7所示的特征构建质粒pBE-201(7687b.p.，用于fHBP(变体2)的额外表达)。
表7
Figure BDA0000042725460000281
＊)从pUC 19的nt.1开始。修饰该质粒以除去Nde I位点，以方便进行以下克隆：使用Nde I-EcoR I将其消化，除去213b.p.的片段。补平粘末端并连接以恢复该质粒。结果是，Nde I(183)和EcoRI(395)位点被破坏。为了克隆用于表达靶蛋白的构建体，我们使用了pUC 19的Sac I和Hind III克隆位点。
得到的菌株的相变体表达由葡萄糖和半乳糖组成的截短的α链。通过菌落印迹选择L2 LOS。得到的经遗传修饰的菌株命名为B16B6HPS-G2，见图18。
也按照与菌株8570 HOPS-G1相同的方式进行菌株44/76的遗传修饰。通过***突变使两个基因synX和lpxL1失能，在opaD基因的位置***第二porA基因(亚型P1.7-1，1)及其启动子，并且在nspA基因的位置在porA启动子之后***第二个拷贝的nadA。质粒pBE-311用于同源重组以***NadA基因，按照表8所示的特征构建质粒3-11，其序列见Seq.ID No.8。
表8
Figure BDA0000042725460000301
＊)从pUC 19的nt.1开始。修饰该质粒以除去Nde I位点，以方便进行以下克隆：使用Nde I-EcoR I将其消化，除去213b.p.的片段。补平粘末端并连接以恢复该质粒。结果是，Nde I(183)和EcoRI(395)位点被破坏。为了克隆用于表达靶蛋白的构建体，我们使用了pUC 19的Sac I和Hind III克隆位点。
＊＊)44-76启动子的14个G的多聚G束被修饰：替换为最佳的以表达11个G。
另外，通过补救与其基因相关的相变异使OpcA的表达稳定化。按照实施例1中对于菌株8570 HOPS-G1所描述的方式进行：破坏其启动子中的多聚-G串。按照实施例1中的描述破坏lgtA基因以产生截短的LOS。使用L8特异性单克隆抗体，通过菌落印迹选择表达L8免疫型的得到的菌株的相变体。这种经遗传修饰的菌株命名为44/76HOPS-D，如图18所示。对这两种另外的菌株进行表征以确定所有的遗传修饰的稳定性并将每种的贮液冷冻。
实施例10：
从菌株B16B6 HPS-G2和44/76HOPS-D制备NOMV疫苗
使用三种经遗传修饰的菌株制备NOMV疫苗组合物的实验批次。菌株以1升的培养物生长于摇床上的Fernbach瓶中的Catlin氏改进培养基中。通过离心收集细胞，称重并将细胞沉淀物冷冻。将细胞沉淀物解冻并按照基本上与实施例2中描述的从菌株8570 HOPS-G1制备疫苗的临床批次相同的程序制备NOMV。按比例缩减制备过程，在2-8℃在225,000xg超离心60分钟以除掉核酸和所有可溶性的非囊泡物质。
实施例11：使用完整多价疫苗免疫小鼠
使用来自每种经遗传修饰的疫苗菌株的2pg的NOMV疫苗(来自3种菌株的NOMV的组合疫苗总共为6pg)通过腹膜内方式接种每组10只CD-1小鼠。在第0、4和8周给予3剂疫苗。在接种前和最后一次接种后2周(第10周时)采取血样。
测试来自各个小鼠的血清的针对同源菌株的杀菌抗体，测试来自每组10只小鼠的合并血清的针对“14种异源B群菌株+1种C群菌株”的集合(它们表达宽范围的不同荚膜下抗原)。
组合的多价疫苗诱导了针对三种疫苗菌株中的每一种的几何平均值1∶256的效价，针对15种异源菌株中的13种产生了4倍或更高的杀菌抗体的增加。有两种测试菌株没有被杀灭，尽管它们与疫苗菌株之一具有相同的抗原。观察到的针对菌株集合的杀菌效价显示于表9。
表9
Figure BDA0000042725460000321
疫苗代码：
B1＝44/76 HOPS-D NOMV
B2＝8570 HOS-G1 NOMV
B3＝B16B6 HPS-G2 NOMV
这些结果证明了组合疫苗诱导针对宽范围的B群菌株以及针对潜在的其它血清群的菌株的杀菌(保护性)抗体的能力。
使用杀菌活性消除测试对杀菌抗体进行的分析证明了针对所有三组抗原的抗体均参与杀灭至少一些测试菌株。在一些情况下，针对一种以上的抗原的抗体参与并且联合在一起产生针对给定菌株的杀菌活性。
使用从菌株8570 HOPS-G1的同基因突变体制备的NOMV疫苗接种另外的小鼠组。突变菌株的不同之处在于它们所表达的PorA。两种突变体表达单一的PorA(两种的一种或另一种存在于多价疫苗菌株中)，第三种突变体是PorA敲除突变体，其不表达PorA蛋白。四种菌株中的每一种所诱导的针对几种不同测试菌株的杀菌效价显示于表10。
表10
Figure BDA0000042725460000322
对于表10中的前5种测试菌株，PorA的表达对于疫苗诱导的杀菌抗体的效价没有影响。对于最后2种都表达P1.14的菌株，P1.14表位在疫苗中的存在与各血清杀灭菌株的能力相关。这证明了针对PorA的抗体参与所观察到的对某些菌株的杀灭。对于其它菌株，例如同源菌株和菌株44/76，其它抗原负责多数杀菌活性。这通过杀菌活性消除测试得到证明。图16给出了一种这样的测试的结果。图17中显示的结果证明针对LOS和FHBP(GNA1870)的抗体通过针对敲除PorA的8570 HOPS-G1的突变体的抗血清参与杀灭菌株8570。
Figure IDA0000042725530000031
Figure IDA0000042725530000041
Figure IDA0000042725530000051
Figure IDA0000042725530000071
Figure IDA0000042725530000081
Figure IDA0000042725530000091
Figure IDA0000042725530000101
Figure IDA0000042725530000121
Figure IDA0000042725530000131
Figure IDA0000042725530000141
Figure IDA0000042725530000151
Figure IDA0000042725530000161
Figure IDA0000042725530000171
Figure IDA0000042725530000181
Figure IDA0000042725530000191
Figure IDA0000042725530000201
Figure IDA0000042725530000211

Claims (47)

1.包含原始外膜囊泡的疫苗，所述原始外膜囊泡获自经过遗传修饰以提供广泛保护的至少两种脑膜炎球菌菌株，其中所述原始外膜囊泡包括基于PorA、LOS和保守性外膜蛋白的三组不同抗原；并且其中所述经遗传修饰的菌株被修饰为提供基于lpxLl、synX和lgtA基因灭活的增强的安全性。
2.权利要求1的疫苗，其中每种菌株表达的LOS具有不同的LOS核心结构并具有由葡萄糖和半乳糖组成的α链。
3.权利要求1的疫苗，其中每种菌株表达基于B群病例分离体中最常见的PorA亚型选择的至少两种不同的PorA亚型蛋白或亚型表位。
4.权利要求1的疫苗，其中具有诱导杀菌抗体能力的不同的保守性表面蛋白在每种菌株中过表达并且所述蛋白选自FHBP(GNA1870)变体1、FHBP变体2和FHBP变体3；NadA；App；NspA；TbpA和TbpB。
5.来自三种经遗传修饰的、抗原性上不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株的NOMV的组合，其中至少一种所述菌株选自：
(1)H44/76HOPS-DL，其具有下列遗传修饰或特征：
基因synX、lpxLl和lgtA的灭活；
在opaD的位置***第二porA基因(亚型P1.7-1，1)；
NadA增强的表达；和
Opc和PorA的稳定高表达；
(2)8570 HOPS-GAL，其具有下列遗传修饰或特征：
基因synX、lpxLl和lgtA的灭活；
在opaD的位置***第二porA基因；
因子H结合蛋白变体1的增强的表达；和
PorA和Opc的稳定高表达；和
(3)B16B6 HPS-G2A，其具有下列遗传修饰或特征：
基因synX、lpxL 1和lgtA的灭活；
在opaD的位置***第二porA基因；
因子H结合蛋白变体2的增强的表达；和
PorA和Opc的稳定高表达。
6.权利要求5的疫苗菌株的组合，其中所述菌株H44/76HOPS-DL衍生自ET-5野生型菌株H44/76(B：15：P1.7，16：L，3，7：P5.5，C)。
7.权利要求5的疫苗菌株的组合，其中所述菌株8570HOPS-GIL衍生自ET-5野生型菌株8570(B：4：P 1.19，15：L3，7v：P5.5，11，C)。
8.权利要求5的疫苗菌株的组合，其中所述菌株B16B6 HPS-G2L衍生自ET-5野生型菌株B16B6(B：2a：P 1.5，2：L2：P5.1，2，5)。
9.权利要求1的疫苗，其中从压缩的细胞或从耗尽的培养基中制备NOMV，不暴露于去污剂或变性溶剂。
10.权利要求1的疫苗，其中所述疫苗悬浮于作为赋形剂的5％葡萄糖中。
11.权利要求1的疫苗，其中所述NOMV与一种或多种佐剂混合，所述佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝、MF 59、CPG-ODN或MPLA。
12.使用肌内和/或鼻内施用的权利要求1的疫苗以进行针对脑膜炎球菌疾病的免疫的方法。
13.使用肌内和/或鼻内施用的权利要求1的疫苗以进行针对B群脑膜炎球菌疾病的免疫的方法。
14.针对脑膜炎球菌疾病的疫苗组合物，其包含来自一种或多种经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)，其中所述一种或多种经遗传修饰的菌株经过下列修饰：
i.synX基因的灭活，
ii.lpxL1基因的灭活，
iii.每种菌株中lgtA基因的灭活，从而导致表达短的或截短的缺少四糖“乳糖-N-新四糖”的脂寡糖(LOS)，和
iv.在opa基因的位置***至少一个抗原性上不同的第二porA基因。
15.权利要求14的疫苗组合物，其中所述经遗传修饰的菌株还包含至少一种次要的保守性外膜蛋白的增加的或稳定的表达。
16.权利要求14-15任一项的疫苗组合物，其中所述经遗传修饰的菌株还包含至少一种外膜蛋白的稳定的表达，其中所述外膜蛋白选自Opc和PorA。
17.权利要求14-16任一项的疫苗组合物，其中所述至少一个抗原性上不同的第二porA基因表达至少一种PorA亚型蛋白或亚型表位，其选自脑膜炎B群分离体的最常见的PorA亚型。
18.权利要求15-17任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种次要的保守性外膜蛋白选自FHBP(GNA1870)变体1、FHBP变体2、FHBP变体3；NadA；App；NspA；TbpA和B。
19.脑膜炎奈瑟球菌亚型B菌株的经遗传修饰的疫苗菌株，其包含H44/76HOPS-D菌株。
20.脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的H44/76菌株：
i)synX基因的灭活，
ii)lpxL1基因的灭活，
iii)lgtA基因的灭活，
iv)在opaD基因的位置***第二porA基因，
v)相对于原始菌株，NadA的增强的表达，和
vi)Opc和PorA蛋白的稳定的增强的表达。
21.权利要求19或20的经遗传修饰的菌株，其中所述菌株H44/76HOPS-DL衍生自ET-5野生型菌株H44/76(B：15：P1.7，16：L，3，7：P5.5，C)。
22.脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其包含菌株8570HOS-G1。
23.脑膜炎奈瑟球菌亚型B菌株的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的8570：
i)synX基因的灭活，
ii)lpxL1基因的灭活，
iii)lgtA基因的灭活，
iv)在opaD基因的位置***第二porA基因，
v)因子H结合蛋白变体1的增强的表达，和
vi)PorA和Opc蛋白的稳定的增强的表达。
24.权利要求22或23的经遗传修饰的菌株，其中所述经遗传修饰的菌株衍生自ET-5野生型菌株8570(B：4：P 1.19，15：L3，7v：P5.5，11，C)。
25.脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其包含B16B6 HPS-G2A菌株。
26.脑膜炎奈瑟球菌亚型B的经遗传修饰的疫苗菌株，其衍生自包含以下遗传修饰的B16B6：
i)synX基因的灭活，
ii)lpxL1基因的灭活，
iii)lgtA基因的灭活，
iv)在opaD基因的位置***第二porA基因(亚型P1.22-1，4)，
v)因子H结合蛋白变体2的增强的表达，和
vi)PorA和Opc蛋白的稳定的增强的表达。
27.权利要求25或26的经遗传修饰的菌株，其中所述经遗传修饰的菌株衍生自ET-37野生型菌株B16B6(B：2a：P 1.5，2：L2：P5.1，2，5)。
28.权利要求19-27任一项的经遗传修饰的菌株，其中所述菌株在铁缺陷型培养基中生长。
29.权利要求19-28任一项的经遗传修饰的菌株，其中通过在灭活基因的序列内***药物抗性基因使synX基因、lpxLl基因或lgtA基因灭活。
30.包含来自一种或多种权利要求20-29任一项的经遗传修饰的菌株的NOMV的疫苗组合物。
31.权利要求30的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含来自两种或更多种经遗传修饰的菌株的NOMV。
33.权利要求30的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含来自三种或更多种经遗传修饰的菌株的NOMV。
34.权利要求1-18和30-33任一项的疫苗组合物，其中所述NOMV从压缩的细胞或从耗尽的培养基中制备，不暴露于去污剂或变性溶剂。
35.权利要求1-18和30-33任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物悬浮于作为赋形剂的5％的葡萄糖中。
36.权利要求1-18和30-33任一项的疫苗组合物，其中所述NOMV与一种或多种佐剂混合。
37.权利要求1-18和30-33任一项的疫苗组合物，其中所述经遗传修饰的菌株改变为表达铁摄入蛋白。
38.针对脑膜炎球菌疾病的疫苗，其包含多种原始外膜囊泡(NOMV)，其中至少一些所述NOMV基本上没有表达或脂寡糖(LOS)的唾液酸化；包含含有脂A的LOS，所述脂A具有五酰基结构；并包含至少一种次要的保守性外膜蛋白的增加的表达，其中所述次要的保守性外膜蛋白选自诱导杀菌抗体的蛋白。
39.权利要求38的疫苗，其中所述次要的保守性外膜蛋白选自NadA、因子H结合蛋白(FHBP)变体1和FHBP变体2。
40.权利要求38的疫苗，其中至少一些NOMV包含短的或截短的基本上不含四糖“乳糖-N-新四糖(LNnT)”的LOS。
41.权利要求38的疫苗，其中至少一些NOMV包含两种或更多种不同的PorA蛋白。
42.权利要求43的疫苗，其中所述至少两种或更多种不同的PorA蛋白选自脑膜炎奈瑟球菌B亚型菌株的最常见菌株。
43.在动物或人中引发针对脑膜炎球菌疾病的免疫应答的方法，其包括向动物或人施用权利要求1-18和30-33任一项的组合物，以进行针对脑膜炎球菌疾病的免疫。
44.权利要求43的方法，其中所述疫苗用于针对B群脑膜炎球菌疾病的免疫。
45.制备用于针对脑膜炎球菌疾病的疫苗的经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的方法，包括以下步骤：
a)选择能够被遗传修饰的脑膜炎球菌B型菌株；
b)通过灭活synX基因对该菌株进行遗传修饰；
c)通过灭活lpxL1基因对该菌株进行遗传修饰；
d)通过灭活lgtA基因对该菌株进行遗传修饰；和
e)通过增加一种或多种次要的保守性外膜蛋白对该菌株进行遗传修饰。
46.权利要求46的方法，还包括以下步骤：通过将至少一个抗原性上不同的第二porA基因***到opa基因的开放读码框中而对该菌株进行遗传修饰。
47.权利要求45或46的方法，还包括以下步骤：
通过将至少一种外膜蛋白的启动子内或开放读码框内的多聚C序列替换为包含G和C核苷酸的序列而对该菌株进行遗传修饰，以稳定表达或过表达所述至少一种外膜蛋白。
48.制备针对脑膜炎球菌疾病的疫苗的方法，包括以下步骤：
a)培养包含一种或多种选自下列的修饰的脑膜炎奈瑟球菌的经遗传修饰的菌株：
i.synX基因的灭活，
ii.lpxL1基因的灭活，
iii.lgtA基因的灭活，
iv.在opa基因的位置***至少一个抗原性上不同的第二porA基因，
v.至少一种次要的保守性外膜蛋白的增强的或稳定的表达，和
vi.至少一种外膜蛋白的稳定的表达；
b)使用a)的培养的菌株接种发酵器中的培养基，通过发酵扩增培养物；
c)灭活发酵的培养物；
d)通过持续流动离心法收集培养的脑膜炎奈瑟球菌细胞并收集细胞糊；
e)从细胞糊中分离NOMV；和
f)将NOMV重悬于适合于疫苗施用的缓冲液或载体。
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