JP5722765B2 - 藍藻類サキシトキシン遺伝子クラスタおよびシアノトキシンを有する生物の検出 - Google Patents

藍藻類サキシトキシン遺伝子クラスタおよびシアノトキシンを有する生物の検出 Download PDF

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Description

本発明は、藍藻類、渦鞭毛藻類の検出のための方法、および特に、シアノトキシンを有する(cyanotoxic)生物の検出のための方法に関する。藍藻類、渦鞭毛藻類、およびシアノトキシンを有する生物の検出のためのキットが提供される。本発明はさらに、サキシトキシンおよびシリンドロスペルモプシン生合成経路のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニングの方法に関する。
背景
藍藻としても公知の藍藻類は、海および淡水環境に広く存在する光合成細菌である。水質ならびにヒトおよび動物の健康に特に重要なのは、毒性化合物を産生するそれらの藍藻類である。藍藻類は富栄養条件の下で、高い毒素濃度を激烈に促進する大きなブルームを形成する傾向がある。藍藻類ブルームは、沿岸水域、河川、湖、ならびに飲料水および娯楽用貯水池において繁茂し、かつ広がる可能性がある。それらが産生する毒素は、ヒトおよび動物に重大な健康上のリスクを引き起こし得、最も毒性の強い藍藻類は世界的な分布を有するため、本問題は国際的に関連性がある。
多様な範囲の藍藻類の属が、水面上での毒性を有する藍藻ブルームを形成することについて周知である。サキシトキシン（SXT）およびその類似体は麻痺性貝中毒（PSP）症候群を引き起こし、世界中でヒトの健康を苛み、かつ沿岸の甲殻類に関する経済活動に影響を与える。PSP毒素は、原核生物および真核生物の両方により産生される独特のアルカロイドである。PSP毒素は、最も強力でかつ蔓延している藻類毒素の1つであり、世界中でヒト、動物、および生態系に影響を及ぼす可能性がある、重大な中毒学的健康リスクと考えられている。これらの毒素は電位開口型ナトリウムおよびカルシウムチャンネルを遮断し、ならびにカリウムチャンネルのゲート開閉を延長してニューロンシグナルの伝達を阻止する。世界的に毎年2000件を超えるPSPのヒトの症例が発生していると推定されている。さらに、産生微生物の沿岸のブルームは、海産物のPSP毒素汚染および高価な生体毒素監視プログラムが連続的に必要であるために数百万ドルもの経済的損害をもたらす。PCRおよびELISAに基づくスクリーニングなどの、麻痺性貝毒素（PST）産生藻類ブルームを予測する早期警戒システムは、PST産生の遺伝学的基礎についてのデータが欠如しているためにまだ利用できない。
SXTは、種々の位置で置換され得、30種類を超える天然のSXT類似体をもたらす三環系ペルヒドロプリンアルカロイドである。SXTの生合成は複雑でかつ独特のように見えるが、ある特定の種の海洋渦鞭毛藻類および淡水藍藻類を含む2つの界由来の生物は、明らかに同一の生合成経路によりこれらの毒素を産生することができる。かなりの努力にもかかわらず、SXTの生合成および修飾に関与する酵素または遺伝子のいずれも以前には同定されていない。
藍藻類のシリンドロスペルモプシス（Cylindrospermopsis）属の発生は全ての大陸上で実証されており、そのため世界的な規模で重大な公衆衛生上脅威をもたらす。シリンドロスペルモプシス属により産生される主要な毒素がシリンドロスペルモプシン（CYR）である。シリンドロスペルモプシンは、ヒトの健康へ脅威をもたらす上に、シリンドロスペルモプシンに汚染された飲料水で家畜の中毒がおこるために農場主にも重大な経済的損失を引き起こす。シリンドロスペルモプシンは肝毒性、一般毒性、および神経毒性の効果を有し、ならびに潜在的な発癌物質である。その毒性はグルタチオンおよびタンパク質合成の阻害、ならびにチトクロムP450を阻害するためである。次の6種類の藍藻類の種が、これまでにシリンドロスペルモプシンを産生すると同定されている：シリンドロスペルモプシス ラシボルスキー（Cylindrospermopsis raciborskii）、アファニゾメノン オバリスポラム（Aphanizomenon ovalisporum）、アファニゾメノン フロスアクア（Aphanizomenon flos-aquae）、ウメザキア ナタンス（Umezakia natans）、ラフィディオプシス クルバータ（Rhaphdiopsis curvata）、およびアナベナ ベルギー（Anabaena bergii）。シリンドロスペルモプシンでのヒトの中毒の事件は今まで亜熱帯オーストラリアで報告されているのみであるが、C. ラシボルスキーおよびA. フロスアクアは最近、より温和な気候の地域において検出されている。C. ラシボルスキーが密集したブルームを形成する傾向、および産生生物の侵襲性は、飲料水の品質への世界的な関心を引き起こし、かつシリンドロスペルモプシン産生生物の存在について飲料水の蓄えの監視を余儀なくさせる。
藍藻類、ならびに特にサキシトキシンおよびシリンドロスペルモプシンなどのシアノトキシンを産生することができるそれらの株を検出する急速かつ正確な方法が必要である。シアノトキシンを有する生物を検出するための急速かつ正確な方法は、藍藻類ブルームの潜在的な健康上の危険を評価するため、および毒性ブルームの大発生の効果を最小化するような有効な水の管理戦略の実行のために必要とされる。
概要
第1の局面において、SEQ ID NO: 1記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
第1の局面の1つの態様において、断片は、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む。
第2の局面において、第1の局面に記載の配列によりコードされる単離されたリボ核酸または単離された相補的DNAが提供される。
第3の局面において、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
1つの態様において、1つまたは複数の：第1の局面に記載のポリヌクレオチド、第2の局面に記載のリボ核酸もしくは相補的DNA、または第3の局面に記載のポリペプチドと特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。
別の態様において、第1の局面に記載のポリヌクレオチド、または第2の局面に記載のリボ核酸もしくは相補的DNAを含むベクターが提供される。ベクターは発現ベクターであってもよい。
別の態様において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
別の態様において、第3の局面に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体が提供される。
第4の局面において、藍藻類の検出のための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは複数の：
（i）第1の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第2の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第3の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料における藍藻類を示す方法が提供される。
第5の局面において、シアノトキシンを有する生物を検出するための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示す方法が提供される。
第5の局面の1つの態様において、シアノトキシンを有する生物は藍藻類または渦鞭毛藻類である。
第4および第5の局面の1つの態様において、試料を解析する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む。ポリメラーゼ連鎖反応は、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用し得る。
第4および第5の局面の別の態様において、方法は、1つまたは複数の：
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階をさらに含む。
試料のさらなる解析は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅を含み得る。ポリメラーゼ連鎖反応は、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用し得る。
第6の局面において、渦鞭毛藻類の検出のための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは複数の：
（i）第1の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第2の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第3の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料における渦鞭毛藻類を示す方法が提供される。
第6の局面の1つの態様において、試料を解析する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む。
第4、第5、および第6の局面の1つの態様において、検出は、ゲル電気泳動および核酸配列決定の1つまたは両方を含む。試料は、1つまたは複数の、単離されたまたは培養された生物を含み得る。試料は環境試料であってもよい。環境試料は、塩水、淡水、または藍藻ブルーム由来であってもよい。
第7の局面において、藍藻類の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）第1の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第2の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第3の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料における藍藻類を示すキットが提供される。
第8の局面において、シアノトキシンを有する生物の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示すキットが提供される。
第7および第8の局面の1つの態様において、少なくとも1つの剤は、プライマー、抗体、またはプローブである。プライマーまたはプローブは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
第7および第8の局面の別の態様において、キットは、1つまたは複数の：
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの追加的な剤をさらに含む。
少なくとも1つの追加的な剤は、プライマー、抗体、またはプローブであってもよい。プライマーまたはプローブは、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
第9の局面において、渦鞭毛藻類の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）第1の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第2の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第3の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料における渦鞭毛藻類を示すキットが提供される。
第10の局面において、第3の局面に記載の1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する化合物のスクリーニングの方法であって、候補化合物およびポリペプチドの相互作用を可能にするのに適した条件の下でポリペプチドを候補化合物と接触させる段階、およびポリペプチドの活性を検定する段階を含む方法が提供される。
第10の局面の1つの態様において、1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する段階は、該ポリペプチドの発現または活性を阻害する段階を含む。
第10の局面の別の態様において、1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する段階は、該ポリペプチドの発現または活性を増強する段階を含む。
第11の局面において、SEQ ID NO: 80記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
第11の局面の1つの態様において、断片は、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む。
第12の局面において、第11の局面に記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNAが提供される。
第13の局面において、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
1つの態様において、1つまたは複数の：第11の局面に記載のポリヌクレオチド、第12の局面に記載のリボ核酸もしくは相補的DNA、または第13の局面に記載のポリペプチドと特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。
別の態様において、第11の局面に記載のポリヌクレオチド、または第12の局面に記載のリボ核酸もしくは相補的DNAを含むベクターが提供される。ベクターは発現ベクターであってもよい。1つの態様において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
別の態様において、第13の局面に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体が提供される。
第14の局面において、藍藻類の検出のための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは複数の：
（i）第11の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第12の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第13の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料における藍藻類を示す方法が提供される。
第15の局面において、シアノトキシンを有する生物を検出するための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは両方の：
（i）SEQ ID NO: 95記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 96記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示す方法が提供される。
第15の局面の1つの態様において、シアノトキシンを有する生物は藍藻類である。
第14および第15の局面の1つの態様において、試料を解析する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む。ポリメラーゼ連鎖反応は、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用し得る。
第14および第15の局面の別の態様において、方法は、1つまたは複数の：
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含む。
試料のさらなる解析は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅を含み得る。ポリメラーゼ連鎖反応は、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用し得る。
第16の局面において、シリンドロスペルモプシン産生生物を検出するための方法であって、この方法における使用のために試料を取得する段階、および1つまたは両方の：
（i）SEQ ID NO: 95記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 96記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料におけるシリンドロスペルモプシン産生生物を示す方法が提供される。
第16の局面の1つの態様において、シアノトキシンを有する生物は藍藻類である。第16の局面の別の態様において、試料を解析する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む。ポリメラーゼ連鎖反応は、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用し得る。
第14、第15、および第16の局面の1つの態様において、検出は、ゲル電気泳動および核酸配列決定の1つまたは両方を含む。試料は、1つまたは複数の、単離されたまたは培養された生物を含み得る。試料は環境試料であってもよい。環境試料は、塩水、淡水、または藍藻ブルーム由来であってもよい。
第17の局面において、藍藻類の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）第11の局面に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）第12の局面に記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）第13の局面に記載の配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料における藍藻類を示すキットが提供される。
第18の局面において、シアノトキシンを有する生物の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 95記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 96記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示すキットが提供される。
第17および第18の局面の1つの態様において、少なくとも1つの剤は、プライマー、抗体、またはプローブである。プライマーまたはプローブは、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
第17および第18の局面の別の態様において、キットは、
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列の存在を検出するための少なくとも1つの追加的な剤をさらに含み得る。
少なくとも1つの追加的な剤は、プライマー、抗体、またはプローブであってもよい。プライマーまたはプローブは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
第19の局面において、シリンドロスペルモプシン産生生物の検出のためのキットであって、1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 95記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 96記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料におけるシリンドロスペルモプシン産生生物を示すキットが提供される。
第20の局面において、第13の局面に記載の1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する化合物のスクリーニングの方法であって、候補化合物およびポリペプチドの相互作用を可能にするのに適した条件の下でポリペプチドを候補化合物と接触させる段階、およびポリペプチドの活性を検定する段階を含む方法が提供される。
第20の局面の1つの態様において、1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する段階は、該ポリペプチドの発現または活性を阻害する段階を含む。
第20の局面の別の態様において、1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する段階は、該ポリペプチドの発現または活性を増強する段階を含む。
定義
本出願において使用される際、単数形の「ある（a）」、「1つの（an）」、および「その」は、文脈が別の方法で明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「幹細胞」という用語は、多数の幹細胞も含む。
本明細書において使用される際、「含む（comprising）」という用語は「包含する（including）」を意味する。「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などの「含む（comprising）」という単語の変化は、対応して様々な意味を有する。従って、例えば、タンパク質をコードする配列を「含む」ポリヌクレオチドは、排他的にその配列からなってもよいし、または1つもしくは複数の追加的な配列を含んでもよい。
本明細書において使用される際、「抗体（antibody）」および「複数の抗体（antibodies）」という用語は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、IgA（IgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、またはIgM、およびIgY、一本鎖全長抗体を含む全長抗体、ならびにそれらの抗原結合断片を含む。抗原結合抗体断片は、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fvs（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）、ならびにVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片を含むが、それらに限定されない。抗体は、任意の動物起源由来であってもよい。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領域を単独で、または以下の：ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインの全体または部分との組み合わせで含み得る。また、可変領域およびヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインの任意の組み合わせも含まれる。抗体は、生体分子に特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、多特異的、ヒト化、ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であってもよい。
本明細書において使用される際、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ならびに同一の意味を有すると解釈される。
本明細書において使用される際、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は互換的に使用され、ならびに同一の意味を有すると解釈される。
本明細書において使用される際、「キット」という用語は材料を送達するための任意の送達システムをさす。本明細書で説明される検出アッセイの文脈において、そのような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器における、標識、参照試料、支持材料など）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面の指示書など）の1つの場所から別の場所への貯蔵、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連性のある反応試薬および／または支持材料を含有する箱のような、1つまたは複数の囲いを含む。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、記事などの任意の考察は、単に本発明について文脈を提供する目的のためである。これらの事項の任意または全てが先行技術基盤の一部を形成し、または本出願の優先日以前の本発明と関連性のある分野における共通の一般知識であったとの承認として解釈されるべきではない。
説明の目的のために本明細書において言及された全ての文書は、別の方法で述べられない限り参照により組み入れられる。
[請求項1001]
SEQ ID NO: 1記載の配列、またはその変異体もしくは断片を含む単離されたポリヌクレオチド。
[請求項1002]
断片が、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む、請求項1001記載のポリヌクレオチド。
[請求項1003]
請求項1001または請求項1002記載の配列によりコードされる、単離されたリボ核酸または単離された相補的DNA。
[請求項1004]
以下、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
[請求項1005]
以下の1つまたは複数の：
（i）請求項1001または1002記載のポリヌクレオチド、
（ii）請求項1003記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）請求項1004記載のポリペプチド、
と特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマー。
[請求項1006]
請求項1001もしくは請求項1002記載のポリヌクレオチド、または請求項1003記載のリボ核酸もしくは相補的DNAを含むベクター。
[請求項1007]
請求項1006記載のベクターを含む宿主細胞。
[請求項1008]
藍藻類の検出のための方法であって、該方法における使用のために試料を取得する段階、および以下の1つまたは複数の：
（i）請求項1001または1002記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）請求項1003記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）請求項1004記載の配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料における藍藻類を示す、方法。
[請求項1009]
シアノトキシンを有する生物を検出するための方法であって、該方法における使用のために試料を取得する段階、および以下の1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示す、方法。
[請求項1010]
シアノトキシンを有する生物が藍藻類または渦鞭毛藻類である、請求項1009記載の方法。
[請求項1011]
解析する段階が、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む、請求項1008〜1010のいずれか一項記載の方法。
[請求項1012]
ポリメラーゼ連鎖反応が、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用する、請求項1011記載の方法。
[請求項1013]
以下の1つまたは複数の：
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階をさらに含む、請求項1008〜1012のいずれか一項記載の方法。
[請求項1014]
解析する段階が、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅を含む、請求項1013記載の方法。
[請求項1015]
ポリメラーゼ連鎖反応が、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用する、請求項1013記載の方法。
[請求項1016]
渦鞭毛藻類の検出のための方法であって、該方法における使用のために試料を取得する段階、および以下の1つまたは複数の：
（i）請求項1001または1002記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）請求項1003記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）請求項1004記載の配列を含むポリペプチド、
の存在について試料を解析する段階を含み、該存在が試料における渦鞭毛藻類を示す、方法。
[請求項1017]
解析する段階が、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅、および増幅された配列を検出する工程を含む、請求項1016記載の方法。
[請求項1018]
試料が、1つまたは複数の、単離されたまたは培養された生物を含む、請求項1008〜1017のいずれか一項記載の方法。
[請求項1019]
試料が環境試料である、請求項1008〜1018のいずれか一項記載の方法。
[請求項1020]
環境試料が、塩水、淡水、または藍藻ブルーム由来である、請求項1019記載の方法。
[請求項1021]
請求項1004記載のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体。
[請求項1022]
藍藻類の検出のためのキットであって、以下の1つまたは複数の：
（i）請求項1001または1002記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）請求項1003記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）請求項1004記載の配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料における藍藻類を示す、キット。
[請求項1023]
シアノトキシンを有する生物の検出のためのキットであって、以下の1つまたは複数の：
（i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）(i)記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示す、キット。
[請求項1024]
少なくとも1つの剤が、プライマー、抗体、またはプローブである、請求項1022または請求項1023記載のキット。
[請求項1025]
プライマーまたはプローブが、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む、請求項1024記載のキット。
[請求項1026]
以下の1つまたは複数の：
（i）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）(i)記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
（iii）
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの追加的な剤をさらに含む、請求項1022〜1025のいずれか一項記載のキット。
[請求項1027]
少なくとも1つの追加的な剤が、プライマー、抗体、またはプローブである、請求項1026記載のキット。
[請求項1028]
プライマーまたはプローブが、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含む、請求項1027記載のキット。
[請求項1029]
渦鞭毛藻類の検出のためのキットであって、以下の1つまたは複数の：
（i）請求項1001または1002記載の配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）請求項1003記載のリボ核酸または相補的DNA、
（iii）請求項1004記載の配列を含むポリペプチド、
の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該存在が試料における渦鞭毛藻類を示す、キット。
[請求項1030]
請求項1004記載の1つまたは複数のポリペプチドの発現または活性を調節する化合物のスクリーニングの方法であって、
候補化合物およびポリペプチドの相互作用を可能にするのに適した条件の下でポリペプチドを候補化合物と接触させる段階；および
ポリペプチドの活性を検定する段階
を含む、方法。
[請求項1031]
調節が、ポリペプチドの発現または活性を阻害する段階を含む、請求項1030記載の方法。
[請求項1032]
調節が、ポリペプチドの発現または活性を増強する段階を含む、請求項1030記載の方法。
本発明の好ましい態様が、添付の図面に関連して単に実施例として、次に説明される。
毒性および非毒性藍藻類におけるsxt遺伝子の分布を示す表である。PSP、サキシトキシン；CYLN、シリンドロスペルモプシン；＋、遺伝子断片が増幅された；−、遺伝子が検出されなかった。 種々のSXT遺伝子を増幅するために使用したプライマー配列を示す表である。 種々のSXT遺伝子を増幅するために使用したプライマー配列を示す表である。 種々のSXT遺伝子を増幅するために使用したプライマー配列を示す表である。 C. ラシボルスキーT3のサキシトキシン遺伝子クラスタ由来のsxt遺伝子、それらの推定の長さ、他の生物由来の同様のタンパク質配列とそれらのBLAST類似性マッチ、およびそれらの予測される機能を示す表である。 C. ラシボルスキーT3のサキシトキシン遺伝子クラスタ由来のsxt遺伝子、それらの推定の長さ、他の生物由来の同様のタンパク質配列とそれらのBLAST類似性マッチ、およびそれらの予測される機能を示す表である。 C. ラシボルスキーT3由来のsxt遺伝子クラスタの構造的構成を示す図である。使用されている略語は以下である：IS4、挿入配列4；at、アミノトランスフェラーゼ；dmt、薬物代謝産物トランスポーター；ompR、ompRファミリーの転写制御因子；penP、ペニシリン結合；smf、DNA取り込みに関与すると予測される遺伝子。目盛りは塩基対における遺伝子クラスタの長さを示す。 SXT生合成の経路およびsxt遺伝子の推定の機能を示す流れ図である。 シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3の細胞抽出物から選択されたイオンのMS/MSスペクトルを示す。イオンの予測される断片化および対応するm/z値が示されている。図5A、アルギニン（m/z 175）。 シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3の細胞抽出物から選択されたイオンのMS/MSスペクトルを示す。イオンの予測される断片化および対応するm/z値が示されている。図5B、サキシトキシン（m/z 300）。 シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3の細胞抽出物から選択されたイオンのMS/MSスペクトルを示す。イオンの予測される断片化および対応するm/z値が示されている。図5C、中間体A'（m/z 187）。 シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3の細胞抽出物から選択されたイオンのMS/MSスペクトルを示す。イオンの予測される断片化および対応するm/z値が示されている。図5D、中間体C'（m/z 211）。 シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3の細胞抽出物から選択されたイオンのMS/MSスペクトルを示す。イオンの予測される断片化および対応するm/z値が示されている。図5E、中間体E'（m/z 225）。 C. ラシボルスキーAWT205のシリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタ由来のcyr遺伝子、それらの推定の長さ、他の生物由来の同様のタンパク質配列とそれらのBLAST類似性マッチ、およびそれらの予測される機能を示す表である。 毒性および非毒性藍藻類におけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子（cyrJ）の分布を示す表である。16S rRNA遺伝子の増幅が陽性対照として示されている。CYLN、シリンドロスペルモプシン；SXT、サキシトキシン；N.D.、検出されなかった；＋、遺伝子断片が増幅された；−、遺伝子が検出されなかった；NA、入手不能；AWQC、Australian Water Quality Center。 シリンドロスペルモプシン生合成の生合成経路を示す流れ図である。 C. ラシボルスキーAWT205由来のシリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタの構造的構成を示す図である。目盛りは塩基対における遺伝子クラスタの長さを示す。
説明
本発明者らは、サキシトキシン生合成を担う遺伝子クラスタ（SXT遺伝子クラスタ）、およびシリンドロスペルモプシン生合成を担う遺伝子クラスタ（CYR遺伝子クラスタ）を同定した。各遺伝子クラスタの完全配列を決定し、その中の同定された遺伝子の各々に機能的活性を割り当てた。この情報に基づき、本発明者らは、完全なサキシトキシンおよびシリンドロスペルモプシンの生合成経路を解明した。
従って、本発明は、SXT遺伝子クラスタおよびCYR遺伝子クラスタの各々に由来するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、特に、各経路内の特定の遺伝子に関する配列を提供する。本発明の配列のうちの１つまたは複数の試料中の存在（または欠如）に基づく、試料中の藍藻類株の検出のための方法およびキットが、提供される。本発明者らは、サキシトキシン産生微生物のSXT遺伝子クラスタに存在するある種のオープンリーディングフレームが、サキシトキシンを産生しない微生物のSXT遺伝子クラスタには欠如していることを決定した。同様に、シリンドロスペルモプシン産生微生物のCYR遺伝子クラスタに存在する１つのオープンリーディングフレームが、非シリンドロスペルモプシン産生微生物には欠如していることが発見された。従って、本発明は、毒素産生微生物の検出のための方法およびキットを提供する。
また、サキシトキシンおよび／またはシリンドロスペルモプシンの生合成経路におけるタンパク質の発現または活性を調整することができる化合物の同定のためのスクリーニング法も、本発明により提供される。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明者らは、サキシトキシン（SXT）遺伝子クラスタおよびシリンドロスペルモプシン（CYR）遺伝子クラスタの完全なポリヌクレオチド配列を決定した。
本発明の局面および態様によると、SXT遺伝子クラスタは、SEQ ID NO:1に示されるようなポリヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号DQ787200）を有していてもよいし、またはSEQ ID NO:1の配列にハイブリダイズするために十分なSEQ ID NO:1との配列同一性を示してもよいが、これらに限定はされない。
SXT遺伝子クラスタは、31個の遺伝子および30個の遺伝子間領域を含む。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子1は、SEQ ID NO:4に示された759塩基対（bp）のヌクレオチド配列である。SXT遺伝子1のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の1625位のヌクレオチドから2383位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子1によりコードされたポリペプチド配列（SXTD）は、SEQ ID NO:5に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子2は、SEQ ID NO:6に示された396bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子2のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の2621位のヌクレオチドから3016位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子2によりコードされたポリペプチド配列（ORF3）は、SEQ ID NO:7に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子3は、SEQ ID NO:8に示された360bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子3のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の2955位のヌクレオチドから3314位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子3によりコードされたポリペプチド配列（ORF4）は、SEQ ID NO:9に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子4は、SEQ ID NO:10に示された354bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子4のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の3647位のヌクレオチドから4000位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子4によりコードされたポリペプチド配列（SXTC）は、SEQ ID NO:11に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子5は、SEQ ID NO:12に示された957bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子5のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の4030位のヌクレオチドから4986位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子5によりコードされたポリペプチド配列（SXTB）は、SEQ ID NO:13に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子6は、SEQ ID NO:14に示された3738bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子6のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の5047位のヌクレオチドから8784位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子6によりコードされたポリペプチド配列（SXTA）は、SEQ ID NO:15に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子7は、SEQ ID NO:16に示された387bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子7のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の9140位のヌクレオチドから9526位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子7によりコードされたポリペプチド配列（SXTE）は、SEQ ID NO:17に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子8は、SEQ ID NO:18に示された1416bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子8のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の9686位のヌクレオチドから11101位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子8によりコードされたポリペプチド配列（SXTF）は、SEQ ID NO:19に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子9は、SEQ ID NO:20に示された1134bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子9のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の11112位のヌクレオチドから12245位のヌクレオチドまでにわたる。SXT遺伝子9によりコードされたポリペプチド配列（SXTG）は、SEQ ID NO:21に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子10は、SEQ ID NO:22に示された1005bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子10のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の12314位のヌクレオチドから13318位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子10によりコードされたポリペプチド配列（SXTH）は、SEQ ID NO:23に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子11は、SEQ ID NO:24に示された1839bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子11のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の13476位のヌクレオチドから15314位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子11によりコードされたポリペプチド配列（SXTI）は、SEQ ID NO:25に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子12は、SEQ ID NO:26に示された444bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子12のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の15318位のヌクレオチドから15761位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子12によりコードされたポリペプチド配列（SXTJ）は、SEQ ID NO:27に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子13は、SEQ ID NO:28に示された165bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子13のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の15761位のヌクレオチドから15925位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子13によりコードされたポリペプチド配列（SXTK）は、SEQ ID NO:29に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子14は、SEQ ID NO:30に示された1299bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子14のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の15937位のヌクレオチドから17235位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子14によりコードされたポリペプチド配列（SXTL）は、SEQ ID NO:31に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子15は、SEQ ID NO:32に示された1449bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子15のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の17323位のヌクレオチドから18771位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子16によりコードされたポリペプチド配列（SXTM）は、SEQ ID NO:33に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子16は、SEQ ID NO:34に示された831bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子16のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の19119位のヌクレオチドから19949位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子16によりコードされたポリペプチド配列（SXTN）は、SEQ ID NO:35に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子17は、SEQ ID NO:36に示された774bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子17のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の20238位のヌクレオチドから21011位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子17によりコードされたポリペプチド配列（SXTX）は、SEQ ID NO:37に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子18は、SEQ ID NO:38に示された327bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子18のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の21175位のヌクレオチドから21501位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子18によりコードされたポリペプチド配列（SXTW）は、SEQ ID NO:39に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子19は、SEQ ID NO:40に示された1653bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子219のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の21542位のヌクレオチドから23194位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子19によりコードされたポリペプチド配列（SXTV）は、SEQ ID NO:41に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子20は、SEQ ID NO:42に示された750bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子20のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の23199位のヌクレオチドから23948位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子20によりコードされたポリペプチド配列（SXTU）は、SEQ ID NO:43に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子21は、SEQ ID NO:44に示された1005bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子21のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の24091位のヌクレオチドから25095位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子21によりコードされたポリペプチド配列（SXTT）は、SEQ ID NO:45に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子22は、SEQ ID NO:46に示された726bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子22のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の25173位のヌクレオチドから25898位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子22によりコードされたポリペプチド配列（SXTS）は、SEQ ID NO:47に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子23は、SEQ ID NO:48に示された576bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子23のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の25974位のヌクレオチドから26549位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子23によりコードされたポリペプチド配列（ORF24）は、SEQ ID NO:49に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子24は、SEQ ID NO:50に示された777bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子24のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の26605位のヌクレオチドから27381位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子24によりコードされたポリペプチド配列（SXTR）は、SEQ ID NO:51に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子25は、SEQ ID NO:52に示された777bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子25のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の27392位のヌクレオチドから28168位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子25によりコードされたポリペプチド配列（SXTQ）は、SEQ ID NO:53に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子26は、SEQ ID NO:54に示された1227bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子26のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の28281位のヌクレオチドから29507位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子26によりコードされたポリペプチド配列（SXTP）は、SEQ ID NO:55に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子27は、SEQ ID NO:56に示された603bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子27のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の29667位のヌクレオチドから30269位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子27によりコードされたポリペプチド配列（SXTO）は、SEQ ID NO:57に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子28は、SEQ ID NO:58に示された1350bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子28のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の30612位のヌクレオチドから31961位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子28によりコードされたポリペプチド配列（ORF29）は、SEQ ID NO:59に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子29は、SEQ ID NO:60に示された666bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子29のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の32612位のヌクレオチドから33277位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子29によりコードされたポリペプチド配列（SXTY）は、SEQ ID NO:61に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子30は、SEQ ID NO:62に示された1353bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子30のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の33325位のヌクレオチドから34677位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子30によりコードされたポリペプチド配列（SXTZ）は、SEQ ID NO:63に示される。
SXT遺伝子クラスタの遺伝子31は、SEQ ID NO:64に示された819bpのヌクレオチド配列である。SXT遺伝子31のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の35029位のヌクレオチドから35847位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子31によりコードされたポリペプチド配列（OMPR）は、SEQ ID NO:65に示される。
SXT遺伝子クラスタの5'境界領域は、1320bpの遺伝子（orf1）を含み、その配列はSEQ ID NO:2に示される。orf1のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の1位のヌクレオチドから1320位のヌクレオチドまでにわたる。orf1によりコードされたポリペプチド配列は、SEQ ID NO:3に示される。
SXT遺伝子クラスタの3'境界領域は、774bpの遺伝子（hisA）を含み、その配列はSEQ ID NO:66に示される。hisAのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の35972位のヌクレオチドから36745位のヌクレオチドまでにわたる。hisAによりコードされたポリペプチド配列は、SEQ ID NO:67に示される。
SXT遺伝子クラスタの3'境界領域は、396bpの遺伝子（orfA）も含み、その配列は、SEQ ID NO:68に示される。orfAのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の37060位のヌクレオチドから37455位のヌクレオチドまでにわたる。orfAによりコードされたポリペプチド配列は、SEQ ID NO:69に示される。
本発明のその他の局面および態様によると、CYR遺伝子クラスタは、SEQ ID NO:80（GenBankアクセッション番号EU140798）に示されるようなヌクレオチド配列を有していてもよいし、またはSEQ ID NO:80の配列にハイブリダイズするために十分なSEQ ID NO:80との配列同一性を示してもよいが、これらに限定はされない。
CYR遺伝子クラスタは、15個の遺伝子および14個の遺伝子間領域を含む。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子1は、SEQ ID NO:81に示された5631bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子1のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の444位のヌクレオチドから6074位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子1によりコードされたポリペプチド配列（CYRD）は、SEQ ID NO:82に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子2は、SEQ ID NO:83に示された4074bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子2のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の6130位のヌクレオチドから10203位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子2によりコードされたポリペプチド配列（CYRF）は、SEQ ID NO:84に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子3は、SEQ ID NO:85に示された1437bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子3のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の10251位のヌクレオチドから11687位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子3によりコードされたポリペプチド配列（CYRG）は、SEQ ID NO:86に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子4は、SEQ ID NO:87に示された831bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子4のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の11741位のヌクレオチドから12571位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子4によりコードされたポリペプチド配列（CYRI）は、SEQ ID NO:88に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子5は、SEQ ID NO:89に示された1398bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子5のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の12568位のヌクレオチドから13965位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子5によりコードされたポリペプチド配列（CYRK）は、SEQ ID NO:90に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子6は、SEQ ID NO:91に示された750bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子6のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の14037位のヌクレオチドから14786位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子6によりコードされたポリペプチド配列（CYRL）は、SEQ ID NO:92に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子7は、SEQ ID NO:93に示された1431bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子7のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の14886位のヌクレオチドから16316位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子7によりコードされたポリペプチド配列（CYRH）は、SEQ ID NO:94に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子8は、SEQ ID NO:95に示された780bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子8のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の16893位のヌクレオチドから17672位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子8によりコードされたポリペプチド配列（CYRJ）は、SEQ ID NO:96に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子9は、SEQ ID NO:97に示された1176bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子9のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の18113位のヌクレオチドから19288位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子9によりコードされたポリペプチド配列（CYRA）は、SEQ ID NO:98に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子10は、SEQ ID NO:99に示された8754bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子10のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の19303位のヌクレオチドから28056位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子10によりコードされたポリペプチド配列（CYRB）は、SEQ ID NO:100に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子11は、SEQ ID NO:101に示された5667bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子11のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の28061位のヌクレオチドから33727位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子11によりコードされたポリペプチド配列（CYRE）は、SEQ ID NO:102に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子12は、SEQ ID NO:103に示された5004bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子12のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の34299位のヌクレオチドから39302位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子12によりコードされたポリペプチド配列（CYRC）は、SEQ ID NO:104に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子13は、SEQ ID NO:105に示された318bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子13のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の39366位のヌクレオチドから39683位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子13によりコードされたポリペプチド配列（CYRM）は、SEQ ID NO:106に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子14は、SEQ ID NO:107に示された600bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子14のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の39793位のヌクレオチドから40392位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子14によりコードされたポリペプチド配列（CYRN）は、SEQ ID NO:108に示される。
CYR遺伝子クラスタの遺伝子15は、SEQ ID NO:109に示された1548bpのヌクレオチド配列である。CYR遺伝子15のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:80の40501位のヌクレオチドから42048位のヌクレオチドまでにわたる。遺伝子15によりコードされたポリペプチド配列（CYRO）は、SEQ ID NO:110に示される。
一般に、本発明の核酸およびポリペプチドは、単離または精製された形態のものである。
本明細書に示されたSXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列に加えて、それらの変異体および断片も、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書に開示されたSXTポリヌクレオチドおよびCYRポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、または相補的デオキシリボ核酸（cDNA）であり得る。
RNAは、DNA配列のRNAポリメラーゼにより触媒される転写に由来してもよい。RNAは、対応するDNA配列の転写に由来する一次転写物であってもよい。RNAは、転写後プロセシングを受けていてもよい。例えば、一次RNA転写物は、成熟RNAを形成するため、転写後プロセシングを受けることがある。メッセンジャーRNA（mRNA）とは、細胞によりタンパク質へと翻訳され得る対応するオープンリーディングフレームに由来するRNAをさす。cDNAとは、mRNAに相補的であり、それに由来する二本鎖DNAをさす。センスRNAとは、mRNAを含んでおり、従って、細胞によりタンパク質へと翻訳され得るRNA転写物をさす。アンチセンスRNAとは、標的一次転写物またはmRNAの全部または一部に相補的であって、標的遺伝子の発現を阻止するために使用され得るRNA転写物をさす。
熟練者は、本明細書に開示されたSXTおよびCYRのDNA配列によりコードされるRNA配列およびcDNA配列が、遺伝暗号を使用して導出され得ることを認識するであろう。RNA配列は、特定のDNA配列に相補的な配列を生成することにより、所定のDNA配列から導出され得る。相補的な配列は、DNA配列の各シトシン（「C」）塩基をグアニン（「G」）塩基に、DNA配列の各グアニン（「G」）塩基をシトシン（「C」）塩基に、DNA配列の各チミジン（「T」）塩基をアデニン（「A」）塩基に、DNA配列の各アデニン（「A」）塩基をウラシル（「U」）塩基に変換することにより、生成され得る。
相補的DNA（cDNA）配列は、上記のようなDNA配列からRNA配列を導出し、次いで、そのRNA配列をcDNA配列に変換することにより、DNA配列から導出され得る。RNA配列は、RNA配列の各シトシン（「C」）塩基をグアニン（「G」）塩基に、RNA配列の各グアニン（「G」）塩基をシトシン（「C」）塩基に、RNA配列の各ウラシル（「U」）塩基をアデニン（「A」）塩基に、RNA配列の各アデニン（「A」）塩基をチミジン（「T」）塩基に変換することにより、cDNA配列に変換され得る。
「変異体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に類似している配列をさす。一般に、二つの配列が、特定の領域で、または特定化されていない場合には配列全体で、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合（「配列同一性」の割合）を有する場合、それら二つの配列は「実質的に類似している」。従って、本明細書に開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の「変異体」は、少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、または99％の参照配列との配列同一性を共有し得る。
一般に、ポリペプチド配列変異体は、共通の質的生物学的活性を保有している。ポリヌクレオチド配列変異体は、一般に、共通の質的生物学的活性を一般に保有しているポリペプチドをコードする。「変異体」という用語の意味には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのホモログも含まれる。ポリヌクレオチドホモログは、典型的には、異なる細菌種に由来するが、本明細書に開示された対応するポリヌクレオチドと実質的に同一の生物学的な機能または活性を共有している。ポリペプチドホモログは、典型的には、異なる細菌種に由来するが、本明細書に開示された対応するポリペプチドと実質的に同一の生物学的な機能または活性を共有している。例えば、本明細書に開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドのホモログには、藍藻類の異なる種に由来するものが含まれるが、これらに限定はされない。
さらに、「変異体」という用語には、本発明のポリペプチドのアナログも含まれる。ポリペプチド「アナログ」とは、実質的に同一の機能を保持するような、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換を含む、本発明のポリペプチドの誘導体であるポリペプチドである。「保存的なアミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）内の、あるアミノ酸の、類似の特性を有するもう一つのアミノ酸との置換または交換をさす。例えば、電荷を有するアミノ酸グルタミン酸（Glu）の、類似の電荷を有するアミノ酸アスパラギン酸（Asp）との置換は、保存的なアミノ酸置換であろう。
一般に、二つの配列の間の配列同一性の割合は、比較ウインドウにおいて二つの最適に整列化された配列を比較することにより決定され得る。比較ウインドウ内の配列の部分は、例えば、二つの配列を最適に整列化するため、欠失または付加を含まない参照配列（例えば、本明細書に開示されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）と比較して、欠失または付加（即ち、ギャップ）を含んでいてもよい。次いで、マッチする位置の数を与えるため、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定し、マッチする位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数によって割り、配列同一性の割合を与えるため、その結果に100を掛けることにより、配列同一性の割合を計算することができる。
二つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、配列同一性の割合とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定されるような、比較ウインドウまたは指定された領域において比較され一致が最大となるよう整列化された場合の、特定の領域（または、特定化されていない場合には、配列全体）における、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合をさす。
配列比較のためには、典型的には、ある配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、サブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用してもよいし、または別のパラメーターを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づき、参照配列と比べた試験配列についての配列同一率を計算する。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適のアラインメントは、慣習的に、以下のものを含むが、これらに限定はされない、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る：PC/Geneプログラム内のCLUSTAL（Intelligenetics,Mountain View,Californiaから入手可能）；GCG Wisconsin Genetics Software Package,Version 10（Accelrys Inc.,9685 Scranton Road,San Diego,California,USAから入手可能）内のALIGNプログラム（バージョン2.0）、ならびにGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA。
BESTFITプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package,for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53711）は、二つの配列の間の最適な相同セグメントを見出すため、SmithおよびWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム（Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)）を使用する。配列間の相同性の程度を決定するため、BESTFITまたはその他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメーターは、参照ヌクレオチド配列の全長で同一性の割合が計算され、参照配列内のヌクレオチドの総数の最大5％の相同性のギャップが許容されるよう設定され得る。
GAPは、マッチの数が最大になり、ギャップの数が最小になる、二つの完全配列のアラインメントを見出すため、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453に記載されたアルゴリズムを使用する。GAPは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、マッチする塩基が最も多く、ギャップが最も少ないアラインメントを作出する。それは、マッチする塩基のユニットにおいてギャップクリエーションペナルティおよびギャップエクステンションペナルティの提供を可能にする。GAPは、最適なアラインメントのファミリーの１つのメンバーを提示する。
グローバルシーケンスアラインメントとも呼ばれる、クエリー配列と対象配列との間の最適な全体マッチを決定するためのもう一つの方法は、Brutlagら（Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいて、クエリー配列および対象配列は両方ともDNA配列である。RNA配列はUをTに変換することにより比較され得る。該グローバルシーケンスアラインメントの結果は、同一率である。
BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムも、配列同一率および配列類似率を決定するために使用され得る。これらは、Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402およびAltschul et al(1990)J.Mol.Biol.215:403-410にそれぞれ記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通して公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同一の長さのワードと整列化された場合に、マッチするか、または正の値である閾値スコアTを満たす、クエリー配列内の長さWの短いワードを同定することにより、ハイスコアリングシーケンスペア（high scoring sequence pairs）（HSP）を同定することを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）とも呼ばれる（Altschul et al（前記））。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含有している、より長いHSPを見出すための検索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合には、パラメーターM（1対のマッチ残基のためのリワードスコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に＜0）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが最大達成値からXの量だけ低下した時；１つもしくは複数の負のスコアを有する残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0以下になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時、停止される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。（ヌクレオチド配列のための）BLASTNプログラムは、11のワード長（W）、10の期待値（E）、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列のためのBLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）をデフォルトとして使用し、BLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl,Acad.Sci USA 89:10915を参照のこと）は、50のアラインメント（B）、10の期待値（E）、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。［0028］BLASTアルゴリズムは、二つの配列の間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787を参照のこと）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こるであろう確率の指標を提供する最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）である。例えば、試験核酸の参照核酸との比較において、最小合計確率が、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、その核酸は、参照配列に類似していると見なされる。
本発明は、本明細書に開示されたポリペプチドの断片も企図する。ポリペプチド「断片」とは、本発明のポリペプチドまたはその変異体の構成成分をコードするか、または構成成分であるポリペプチド分子である。典型的には、断片は、それを構成成分とするポリペプチドと共通の質的生物学的活性を保有している。ペプチド断片は、約5〜約3000アミノ酸長、約5〜約2750アミノ酸長、約5〜約2500アミノ酸長、約5〜約2250アミノ酸長、約5〜約2000アミノ酸長、約5〜約1750アミノ酸長、約5〜約1500アミノ酸長、約5〜約1250アミノ酸長、約5〜約1000アミノ酸長、約5〜約900アミノ酸長、約5〜約800アミノ酸長、約5〜約700アミノ酸長、約5〜約600アミノ酸長、約5〜約500アミノ酸長、約5〜約450アミノ酸長、約5〜約400アミノ酸長、約5〜約350アミノ酸長、約5〜約300アミノ酸長、約5〜約250アミノ酸長、約5〜約200アミノ酸長、約5〜約175アミノ酸長、約5〜約150アミノ酸長、約5〜約125アミノ酸長、約5〜約100アミノ酸長、約5〜約75アミノ酸長、約5〜約50アミノ酸長、約5〜約40アミノ酸長、約5〜約30アミノ酸長、約5〜約20アミノ酸長、および約5〜約15アミノ酸長であり得る。または、ペプチド断片は約5〜約10アミノ酸長であってもよい。
本明細書に開示されたポリヌクレオチドの断片も企図される。ポリヌクレオチド「断片」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはその変異体の構成成分をコードするか、または構成成分であるポリヌクレオチド分子である。ポリヌクレオチドの断片は、必ずしも、生物学的活性を保持しているポリペプチドをコードする必要はない。断片は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして有用であり得る。断片は、本発明のポリヌクレオチドに由来してもよいし、または別法としてその他の何らかの手段により、例えば、化学合成により合成されてもよい。
本発明のある種の態様は、SEQ ID NO:1の断片に関する。SEQ ID NO:1の断片には、例えば、5'遺伝子境界領域遺伝子orf1が欠如しているSEQ ID NO:1の構成成分が含まれ得る。または、SEQ ID NO:1の断片には、例えば、3'遺伝子境界領域遺伝子hisAが欠如しているSEQ ID NO:1の構成成分が含まれ得る。または、SEQ ID NO:1の断片には、例えば、3'遺伝子境界領域遺伝子orfAが欠如しているSEQ ID NO:1の構成成分が含まれ得る。または、SEQ ID NO:1の断片には、例えば、5'遺伝子境界領域遺伝子orf1が欠如しており、かつ3'境界領域遺伝子orfAが欠如しているSEQ ID NO:1の構成成分が含まれ得る。または、SEQ ID NO:1の断片には、例えば、5'遺伝子境界領域遺伝子orf1が欠如しており、かつ3'境界領域遺伝子hisAおよびorfAが欠如しているSEQ ID NO:1の構成成分が含まれ得る。
その他の態様において、SEQ ID NO:1の断片は、１つまたは複数のSXTオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。SXTオープンリーディングフレームは、
Figure 0005722765
、およびそれらの変異体からなる群より選択され得る。
本発明の付加的な態様は、SEQ ID NO:80の断片に関する。SEQ ID NO:80の断片は、１つまたは複数のCYRオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。CYRオープンリーディングフレームは、
Figure 0005722765
、およびそれらの変異体からなる群より選択され得る。
特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ベクターへクローニングされてもよい。ベクターは、例えば、DNA、RNA、または相補的DNA（cDNA）の配列を含むことができる。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入、細胞へのそれらの導入、および導入された配列の発現のために適合したその他の任意の適当な媒体であり得る。典型的には、ベクターは発現ベクターであり、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列のような発現制御配列およびプロセシング配列を含み得る。本発明は、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞も企図する。例えば、本発明のポリヌクレオチドをベクターへクローニングし、そのベクターを細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli）へ形質転換することができる。ベクターの構築および宿主細胞へのそれらの形質転換のための方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New YorkおよびAusubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Incに記載されている。
ヌクレオチドプローブ、プライマー、および抗体
本発明は、相同配列の同定のためのプライマーおよびプローブとして使用するための、本明細書に開示されたポリヌクレオチドの配列に基づくヌクレオチドおよび断片を企図する。
ヌクレオチドおよび断片は、オリゴヌクレオチドの形態をとり得る。オリゴヌクレオチドとは、典型的には少なくとも約5ヌクレオチド〜約80ヌクレオチド長、より典型的には約10ヌクレオチド長〜約50ヌクレオチド長、さらに典型的には約15ヌクレオチド長〜約30ヌクレオチド長である、PCRのような核酸増幅反応において使用するのに適しているヌクレオチド残基の短いストレッチである。
プローブは、相同配列の検出、典型的には、ハイブリダイゼーションによる相同配列の検出において使用するための、可変の長さ、例えば、約10ヌクレオチド〜数千ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNA断片、cDNA断片、RNA断片、またはその他のオリゴヌクレオチドであり得る。
ヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーの設計および／または作製のための方法は、当技術分野において一般に公知であり、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York；Itakura K.et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Innis et al.,(Eds)(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；およびInnis and Gelfand,(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)に記載されている。ヌクレオチドプライマーおよびプローブは、例えば、化学合成技術、例えば、ホスホジエステル法およびホスホトリエステル法（例えば、Narang S.A.et al.(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown,E.L.(1979)et al.Meth.Enzymol.68:109；および米国特許第4356270号を参照のこと）、ジエチルホスホラミダイト法（Beaucage S.L et al.(1981)Tetrahedron Letters,22:1859-1862を参照のこと）により調製され得る。修飾された固体支持体においてオリゴヌクレオチドを合成する方法は、米国特許第4458066号に記載されている。
上記のプローブおよびプライマーを含む本発明の核酸は、検出を容易にするため、マーカーの取り込みによって標識されてもよい。核酸を標識し検出するための技術は、例えば、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Incに記載されている。適当なマーカーの例には、蛍光分子（例えば、アセチルアミノフルオレン、5-ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン）、および放射性同位元素（例えば、32P、35S、3H、33P）が含まれる。マーカーの検出は、例えば、化学、光化学、免疫化学、生化学、または分光学の技術により達成され得る。
本発明のプローブおよびプライマーは、例えば、関心対象の試料の中の藍藻類および／または渦鞭毛藻類を検出または単離するために使用され得る。さらに、または別法として、本発明のプローブおよびプライマーは、関心対象の試料の中のシアノトキシンを有する生物および／またはシリンドロスペルモプシン産生生物を検出または単離するために使用されてもよい。さらに、または別法として、本発明のプローブまたはプライマーは、例えば、他の細菌種を含む他の生物の対応する配列を単離するために使用されてもよい。本明細書に示された配列との配列相同性に基づき、そのような配列を同定するためには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ハイブリダイゼーション等のような方法を使用することができる。本明細書に示された配列全体またはそれらの断片との配列同一性に基づき選択される配列は、態様に包含される。そのような配列には、開示された配列のオルソログである配列が含まれる。「オルソログ」という用語は、共通の祖先遺伝子に由来し、種分化の結果として異なる種に見出される遺伝子をさす。異なる種に見出される遺伝子は、ヌクレオチド配列および／またはコードされたタンパク質配列が、本明細書中の他の箇所で定義されるような実質的同一性を共有している場合に、オルソログと見なされる。オルソログの機能は、しばしば、種の間で高度に保存されている。
ハイブリダイゼーション技術においては、所定の試料の中に存在する他の対応する核酸配列に選択的にハイブリダイズするプローブを生成するために、既知のヌクレオチド配列の全部または一部が使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNA断片、cDNA断片、RNA断片、またはその他のオリゴヌクレオチドであり得、検出可能マーカーにより標識されてもよい。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作成され得る。
プローブと標的配列との間の相同性（配列同一性）のレベルは、概して、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって決定されるであろう。特に、プローブとして使用されるヌクレオチド配列は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのホモログまたはその他の変異体にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調節するために利用され得る多数の条件および因子が、当業者に周知である。例えば、特定の核酸にハイブリダイズさせる核酸の長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）；ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール等の存在または欠如のような、塩およびその他の成分の濃度；ならびにハイブリダイゼーション工程および／または洗浄工程の温度の調節。
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、塩濃度が約1.5M未満のNaイオン、典型的には、約0.01〜1.0MのNaイオン濃度（またはその他の塩）であり、pHが7.0〜8.3、温度が、短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）の場合には少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50ヌクレオチド長）の場合には少なくとも約60℃であるものであろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件には、37℃における30％〜35％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液によるハイブリダイゼーション、および50℃〜55℃における1×〜2×SSC（20×SSC＝3.0M NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム）における洗浄が含まれる。例示的な中ストリンジェンシー条件には、37℃における40％〜45％ホルムアミド、1.0M NaCl、1％SDSにおけるハイブリダイゼーション、および55℃〜60℃における0.5×〜1×SSCにおける洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、37℃における50％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSにおけるハイブリダイゼーション、および少なくとも約20分間の60℃〜65℃における0.1×SSCにおける最終洗浄が含まれる。任意で、洗浄緩衝液は、約0.1％〜約1％SDSを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般に、約24時間未満であり、通常、約4〜約12時間である。
PCRアプローチの下では、関心対象の生物から抽出されたcDNAまたはゲノムDNAから、対応するDNA配列を増幅するため、PCR反応において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーが設計され得る。PCRプライマーの設計およびPCRクローニングの方法は、当技術分野において一般に公知であり、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)；Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc；Maniatis et al.Molecular Cloning(1982),280-281；Innis et al.(Eds)(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；およびInnis and Gelfand,(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)に開示されている。PCRの公知の方法には、ペアプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマー等を使用する方法が含まれるが、これらに限定はされない。
熟練者は、PCRまたはRT-PCRにおいて使用するための本明細書に記載されたプライマーが、SXT配列またはCYR配列の検出のためのプローブとしても使用され得ることを認識するであろう。
また、本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体も、本発明により企図される。抗体は、所定の試料の中の１つまたは複数のSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチドを定性的または定量的に検出し分析するために使用され得る。「特異的に結合する」とは、抗体が、無関係なタンパク質に結合するより高い親和性で標的ポリペプチドまたはその断片に結合し得ることと理解されるであろう。例えば、抗体は、少なくとも約10-4M〜約10-10Mの範囲の結合定数でポリペプチドまたはその断片に結合することができる。好ましくは、結合定数は、少なくとも約10-5M、または少なくとも約10-6Mであり、より好ましくは、SXTポリペプチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの断片に対する抗体の結合定数は、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、または少なくとも約10-9M、またはそれ以上である。
本発明の抗体は、多様な形態で存在することができ、例えば、完全抗体として、または相補性決定領域のような、抗体断片もしくはその他の免疫学的活性を有する断片として、存在することができる。同様に、抗体は、機能的な抗原結合ドメイン、即ち、重鎖および軽鎖の可変ドメインを有する抗体断片として存在することもできる。また、抗体断片は、Fv、Fab、F(ab)2、scFv（単鎖Fv）、dAb（単一ドメイン抗体）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabody）、およびトリアボディ（triabody）からなる群より選択される形態で存在することもできるが、これらに限定はされない。
抗体「断片」は、完全抗体の修飾により、または所望の抗体断片の合成により作製され得る。抗体断片を含む抗体を生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、組換えDNA技術による合成を含む。熟練者は、例えば、米国特許第5296348号およびAusubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Incに記載されたもののような、抗体合成法を承知しているであろう。
好ましくは、抗体は、関心対象のSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチドの別個の領域または断片から調製される。関心対象のポリペプチドの抗原性部分は、約5〜約15アミノ酸のような任意の適切な長さを有し得る。好ましくは、抗原性部分は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個のアミノ酸残基を含有している。
本明細書の情況において、本発明のSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチドに特異的な抗体との言及には、関心対象のポリペプチドの断片に特異的な抗体が含まれる。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、当技術分野において公知の任意の適当な方法を使用して、精製されたSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの核酸配列を使用して、調製され得る。例えば、典型的にはFab部分を含有しているモノクローナル抗体は、Harlow and Lane(Eds)Antibodies-A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(1986)2nd ed；およびKohler & Milstein,(1975)Nature 256:495-497に記載されたハイブリドーマ技術を使用して調製され得る。そのような技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製が含まれ、ウサギまたはマウスを免疫感作することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製（例えば、Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281；Ward et al.(1989)Nature 341:544-546を参照のこと）も含まれるが、これらに限定はされない。
本発明の抗体には、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体が含まれることも理解されるであろう。本発明の抗体は、複数の抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する二重特異性抗体であってもよい。例えば、抗体は、１つまたは複数のSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの断片に対する特異性を有し、さらに、別の抗原に対する結合特異性を有していてもよい。ヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体の調製のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、2006年2月7日にGarabedianらに発行された「Antibodies that recognize and bind phosphorylated human glucocorticoid receptor and methods of using same」という名称の米国特許第6995243号に記載されたようなものを含む。
一般に、SXTポリペプチドまたはCYRポリペプチドを含む可能性がある試料は、SXTポリペプチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの断片に特異的に結合する抗体と接触させられ得る。任意で、複合体の洗浄およびその後の単離を容易にするため、抗体を試料と接触させる前に、抗体を固体支持体に固定させてもよい。固体支持体の例には、例えば、マイクロタイタープレート、ビーズ、ティック（tick）、またはミクロビーズが含まれる。ProteinChipアレイまたは上記のようなプローブ基質に、抗体を付着させてもよい。
本発明のSXTポリペプチドまたはCYRポリペプチドに結合した抗体の同定のための検出可能標識には、蛍光色素、蛍光染料、放射標識、当技術分野において一般的に使用されている西洋ワサビ過酸化物、アルカリホスファターゼ、およびその他のような酵素、ならびにコロイド金または色ガラスまたはプラスチックビーズを含む比色定量標識が含まれるが、これらに限定はされない。または、試料中のマーカーは、例えば、結合したマーカー特異抗体を検出するため、標識された二次抗体を使用する、間接アッセイを使用して検出されてもよい。
抗体-マーカー複合体の存在を検出するか、またはその量を測定するための方法には、例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、グレーティングカプラウェーブガイド（grating coupler wave guide）法、またはインターフェロメトリーのような、蛍光、化学発光、発光、吸光度、複屈折、透過率、反射率、または屈折率の検出が含まれる。高周波法には、多極共鳴分光法が含まれる。電気化学的な方法には、電流測定法およびボルタメトリー法が含まれる。光学的な方法には、画像法および非画像法および顕微鏡検が含まれる。
抗体-マーカー複合体の存在を検出するか、またはその量を測定するための有用なアッセイには、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、またはウエスタンブロットアッセイが含まれる。そのような方法は、例えば、Clinical Immunology(Stites & Terr,eds.,7th ed.1991)；Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology,volume 37(Asai,ed.1993)；およびHarlow & Lane（前記）に記載されている。
検出のための方法およびキット
本発明は、SXTの核酸およびポリペプチドの検出および／または単離のための方法およびキットを提供する。CYRの核酸およびポリペプチドの検出および／または単離のための方法およびキットも、提供される。
一つの局面において、本発明は、藍藻類の検出のための方法を提供する。熟練者は、「藍藻類」の検出には、１つまたは複数の藍藻類の検出が包含されることを理解するであろう。方法は、方法において使用するための試料を入手すること、および１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出することを含む。SXTのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在は、試料中の藍藻類の指標となる。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によってコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
本発明者らは、SXT遺伝子クラスタのいくつかの遺伝子が、サキシトキシン産生生物には存在し、サキシトキシンを産生しないSXT遺伝子クラスタを有する生物には欠如していることを決定した。具体的には、本発明者らは、SXT遺伝子クラスタの遺伝子6（sxtA）（SEQ ID NO:14）、遺伝子9（sxtG）（SEQ ID NO:20）、遺伝子10（sxtH）（SEQ ID NO:22）、遺伝子11（sxtI）（SEQ ID NO:24）、および遺伝子17（sxtX）（SEQ ID NO:36）が、サキシトキシンを産生する生物にのみ存在することを同定した。
従って、別の局面において、本発明は、シアノトキシンを有する生物を検出する方法を提供する。方法は、方法において使用するための試料を入手すること、およびSEQ ID NO:14（sxtA、遺伝子6）、SEQ ID NO:20（sxtG、遺伝子9）、SEQ ID NO:22（sxtH、遺伝子10）、SEQ ID NO:24（sxtI、遺伝子11）、SEQ ID NO:36（sxtX、遺伝子17）に示された配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む１つまたは複数のSXTポリヌクレオチドの検出に基づき、シアノトキシンを有する生物を検出することを含む。さらに、または別法として、SEQ ID NO:14（sxtA、遺伝子6）、SEQ ID NO:20（sxtG、遺伝子9）、SEQ ID NO:22（sxtH、遺伝子10）、SEQ ID NO:24（sxtI、遺伝子11）、SEQ ID NO:36（sxtX、遺伝子17）によりコードされた配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含むRNAまたはcDNAの検出に基づき、シアノトキシンを有する生物を検出することもできる。さらに、または別法として、１つまたは複数のシアノトキシンを有する生物を含むと推測される試料において、SEQ ID NO:15（SXTA）、SEQ ID NO:21（SXTG）、SEQ ID NO:23（SXTH）、SEQ ID NO:25（SXTI）、SEQ ID NO:37（SXTX）に示された配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む１つまたは複数のポリペプチドの検出に基づき、シアノトキシンを有する生物を検出することもできる。シアノトキシンを有する生物とは、サキシトキシンを産生することができる任意の生物であり得る。本発明の好ましい態様において、シアノトキシンを有する生物は、藍藻類または渦鞭毛藻類である。
本発明のある種の態様において、藍藻類を検出するための方法またはシアノトキシンを有する生物を検出するための方法は、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなCYRポリヌクレオチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の検出をさらに含んでいてもよい。CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、およびそれらの変異体または断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、およびそれらの変異体または断片からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされたRNAまたはcDNAであってもよい。
CYRポリペプチドは、
Figure 0005722765
、およびそれらの変異体または断片からなる群より選択される配列を含み得る。
本発明者らは、CYR遺伝子クラスタの遺伝子8（cyrJ）（SEQ ID NO:95）が、シリンドロスペルモプシン産生生物には存在するが、シリンドロスペルモプシンを産生しないCYR遺伝子クラスタを有する生物には欠如していることを決定した。従って、藍藻類を検出するための方法またはシアノトキシンを有する生物を検出するための方法は、SEQ ID NO:95に示された配列またはその変異体もしくは断片を含むCYRポリヌクレオチドの検出に基づく、シリンドロスペルモプシン産生生物の検出をさらに含んでいてもよい。さらに、または別法として、藍藻類を検出するための方法またはシアノトキシンを有する生物を検出するための方法は、SEQ ID NO:95によりコードされた配列またはその変異体もしくは断片を含むRNAまたはcDNAの検出に基づく、シリンドロスペルモプシン産生生物の検出をさらに含んでいてもよい。さらに、または別法として、藍藻類を検出するための方法またはシアノトキシンを有する生物を検出するための方法は、SEQ ID NO:96に示された配列またはその変異体もしくは断片を含むCYRポリペプチドの検出に基づく、シリンドロスペルモプシン産生生物の検出をさらに含んでいてもよい。
別の局面において、本発明は、藍藻類の検出のための方法を提供する。熟練者は、「藍藻類」の検出には、１つまたは複数の藍藻類の検出が包含されることを理解するであろう。方法は、方法において使用するための試料を入手すること、および１つまたは複数の本明細書に開示されるようなCYRのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出することを含む。CYRのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在は、試料中の藍藻類の指標となる。
CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
CYRポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
本発明の別の局面において、CYR遺伝子8（cyrJ）の検出に基づき、シリンドロスペルモプシン産生生物を検出する方法が提供される。方法は、方法において使用するための試料を入手すること、およびSEQ ID NO:95に示された配列またはその変異体もしくは断片を含むCYRポリヌクレオチドの存在を検出することを含む。さらに、または別法として、CYR遺伝子8（cyrJ）の検出に基づき、シリンドロスペルモプシン産生生物を検出するための方法は、SEQ ID NO:95によりコードされた配列またはその変異体もしくは断片を含むRNAまたはcDNAの検出を含んでいてもよい。さらに、または別法として、CYR遺伝子8（cyrJ）の検出に基づき、シリンドロスペルモプシン産生生物を検出するための方法は、SEQ ID NO:96に示された配列またはその変異体もしくは断片を含むCYRポリペプチドの検出を含んでいてもよい。
本発明のある種の態様において、CYR配列またはそれらの変異体もしくは断片の検出を含む藍藻類を検出するための方法は、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTポリヌクレオチドまたはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の検出をさらに含む。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
別の局面において、本発明は、渦鞭毛藻類の検出のための方法を提供する。熟練者は、「渦鞭毛藻類」の検出には、１つまたは複数の渦鞭毛藻類の検出が包含されることを理解するであろう。方法は、方法において使用するための試料を入手すること、および１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTポリヌクレオチドまたはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出することを含む。SXTポリヌクレオチド、SXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在は、試料中の渦鞭毛藻類の指標となる。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載された方法に従って使用するための試料は、１つまたは複数のシアノトキシンを有する生物を含むと推測されるものであり得る。シアノトキシンを有する生物は、１つもしくは複数の藍藻類および／または１つもしくは複数の渦鞭毛藻類であり得る。さらに、または別法として、本明細書に記載された方法に従って使用するための試料は、１つもしくは複数の藍藻類および／または１つもしくは複数の渦鞭毛藻類を含むと推測されるものであってもよい。本明細書に記載された方法に従って使用するための試料は、比較試料または対照試料、例えば、既知の濃度もしくは密度の藍藻類および／もしくは渦鞭毛藻類を含む試料、または藍藻類および／もしくは渦鞭毛藻類の１つもしくは複数の既知の種もしくは株を含む試料であってもよい。
本明細書に記載された方法に従って使用するための試料は、任意の起源に由来し得る。例えば、試料は、環境試料であってもよい。環境試料は、例えば、塩水、淡水、または藍藻ブルームに由来し得る。または、試料は、培養物のような実験的起源または商業的起源に由来してもよい。
本明細書に開示された方法およびキットは、SXTおよび／またはCYRの遺伝子クラスタが存在する任意の生物の検出のために一般に適していることが、当業者には認識されるであろう。本発明の方法が適用可能である適当な藍藻類は、ユレモ（Oscillatoriales）目、クロオコックス（Chroococcales）目、ネンジュモ（Nostocales）目、およびスティゴネマ（Stigonematales）目より選択され得る。例えば、藍藻類は、アナベナ（Anabaena）属、ノストック（Nostoc）属、ミクロシスチス（Microcystis）属、プランクトスリックス（Planktothrix）属、オシラトリア（Oscillatoria）属、ホルミジウム（Phormidium）属、およびノデュラリア（Nodularia）属より選択され得る。例えば、藍藻類は、シリンドロスペルモプシス ラシボルスキー（Cylindrospermopsis raciborskii）T3種、シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーAWT205種、アファニゾメノン オバリスポラム（Aphanizomenon ovalisporum）種、アファニゾメノン フロスアクア（flos-aquae）種、アファニゾメノンsp.種、ウメザキア ナタンス（Umezakia natans）種、ラフィジオプシス クルバタ（Raphidiopsis curvata）種、アナベナ ベルギー（bergii）種、リングビア ウォレイ（Lyngbya wollei）種、およびアナベナ キルキナリス（circinalis）種より選択され得る。本発明の方法ならびにキットが適用可能である適当な渦鞭毛藻類の例は、アレクサンドリウム（Alexandrium）属、ピロジニウム（Pyrodinium）属、およびギムノジニウム（Gymnodinium）属より選択され得る。本発明の方法およびキットは、カルチャーコレクションの中の、または環境試料からの、新規の肝臓毒性の種または属の発見のためにも利用され得る。本発明の方法ならびにキットは、他の動物、例えば、魚および甲殻類に蓄積するシアノトキシンを検出するためにも利用され得る。
本明細書に開示されたSXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出は、任意の適当な方法を使用して実施され得る。例えば、本明細書に開示されたSXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出のための方法は、１つまたは複数のSXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよびポリペプチドに特異的なプライマー、プローブ、または抗体の使用を含み得る。熟練者が１つまたは複数のSXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよびポリペプチドに特異的なプライマー、プローブ、または抗体を利用し得る適当な技術およびアッセイには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（およびこの技術の関連した変法）、ELISAおよびフローサイトメトリーのような抗体に基づくアッセイ、ならびに蛍光顕微鏡検が含まれる。本明細書に開示されたSXTおよびCYRのポリペプチドが同定され得る方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Coligan J.E.et al.(Eds)Current Protocols in Protein Science(2007),John Wiley and Sons,Inc；Walker,J.M.,(Ed)(1988)New Protein Techniques:Methods in Molecular Biology,Humana Press,Clifton,NJ；およびScopes,R.K.(1987)Protein Purification:Principles and Practice,3rd.Ed.,Springer-Verlag,New York,N.Yに記載されている。例えば、本明細書に開示されたSXTポリペプチドおよびCYRポリペプチドは、ウエスタンブロットまたは分光測光分析により検出され得る。SXTポリペプチドおよびCYRポリペプチドの検出に適している方法のその他の例は、例えば、米国特許第4683195号、米国特許第6228578号、米国特許第7282355号、米国特許第7348147号、およびPCT公開WO/2007/056723に記載されている。
本発明の好ましい態様において、SXTおよびCYRのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出は、SXTおよび／またはCYRの配列またはそれらの変異体もしくは断片に特異的にハイブリダイズするプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により、関心対象の試料からDNAを増幅し、増幅された配列を検出することにより達成される。
本明細書に開示された方法およびキットを使用した分析のための核酸およびポリペプチドは、混合培養物中の生物から抽出されてもよいし、または個々の種もしくは属の単離物としての生物から抽出されてもよい。従って、核酸および／もしくはポリペプチドの単離前に生物を培養してもよいし、または別法として、水試料もしくは藍藻ブルームのような環境試料から直接、核酸および／もしくはポリペプチドを抽出してもよい。
本発明の方法およびキットを使用した分析のための核酸の抽出および精製に適している方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc；Neilan(1995)Appl.Environ.Microbiol.61:2286-2291；およびNeilan et al.(2002)Astrobiol.2:271-280に記載されている。熟練者は、それらに記載された核酸単離のための特定の方法に本発明が限定されず、その他の適当な方法も本発明に包含されることを容易に認識するであろう。本発明は、核酸の分析前に核酸を単離することなく実施されてもよい。
本発明のためのポリペプチドの抽出および精製に適している方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Coligan J.E.et al.(Eds)Current Protocols in Protein Science(2007),John Wiley and Sons,Inc；Walker,J.M.,(Ed)(1988)New Protein Techniques:Methods in Molecular Biology,Humana Press,Clifton,NJ；およびScopes,R.K.(1987)Protein Purification:Principles and Practice,3rd.Ed.,Springer-Verlag,New York,N.Y.に記載されている。タンパク質抽出に適している技術の例には、透析、限外ろ過、および沈殿が含まれるが、これらに限定はされない。使用するために適しているタンパク質精製技術には、逆相クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、遠心分離、ゲルろ過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換が含まれるが、これらに限定はされない。
本発明の方法およびキットに従い、SXTポリヌクレオチドおよびCYRポリヌクレオチドまたはそれらの変異体もしくは断片は、当技術分野において公知の任意の適当な手段によって検出され得る。本発明の好ましい態様において、SXTポリヌクレオチドおよびCYRポリヌクレオチドは、PCR増幅により検出される。PCRアプローチの下では、本発明のSXTポリヌクレオチドおよびCYRポリヌクレオチドを増幅するためのPCR反応において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーが設計され得る。SXT配列およびCYR配列の逆転写に由来するメッセンジャーRNA（mRNA）から増幅された相補的DNA（cDNA）のPCR増幅（RT-PCR）も、本発明に包含される。PCRの公知の方法には、ペアプライマー、ネスティッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマー等を使用する方法が含まれるが、これらに限定はされない。PCRプライマーおよびRT-PCRプライマーを設計するための方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc；Maniatis et al.Molecular Cloning(1982),280-281；Innis et al.(Eds)(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)；およびSambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New Yorkに開示されている。
熟練者は、所望の産物を獲得する能力に影響を与えることなく、PCR法およびRT-PCR法の様々なパラメーターが調節され得ることを容易に認識するであろう。例えば、塩濃度を変動させることもできるし、または変性工程、アニーリング工程、および伸長工程のうちの１つもしくは複数の時間および／もしくは温度を変動させることもできる。同様に、利用可能な核酸の量、または効率的な増幅のために必要とされる鋳型の最適量に依って、DNA、cDNA、またはRNAの鋳型の量を変動させることもできる。本発明の方法およびキットにおいて使用するためのプライマーは、典型的には、オリゴヌクレオチドであり、典型的には、少なくとも約5ヌクレオチド〜約80ヌクレオチド長、より典型的には、約10ヌクレオチド長〜約50ヌクレオチド長、さらに典型的には、約15ヌクレオチド長〜約30ヌクレオチド長である。熟練者は、本明細書に記載されたプライマーが、PCR、RT-PCR、およびSXT配列またはCYR配列の検出のためのプローブの使用を含むが、これらに限定はされない、多数の異なる適用のために有用であり得ることを認識するであろう。
そのようなプライマーは、例えば、直接化学合成、または適切な配列のクローニングおよび制限を含む、任意の適当な方法によって調製され得る。プライマー内の全ての塩基が、プライマーがハイブリダイズするであろう鋳型分子の配列を反映している必要はなく、プライマーは、プライマーが鋳型にハイブリダイズすることを可能にする程度に十分な相補塩基を含有していればよい。プライマーは、鋳型内の塩基に相補的でなく、塩基の伸長または増幅の際にDNAに変化を組み入れるために設計されているミスマッチ塩基を、１つまたは複数の位置に含んでいてもよい。プライマーは、増幅されたDNAのクローニングを容易にするため、5'末端に、付加的な塩基を、例えば、制限酵素認識配列の形態で含んでいてもよい。
本発明は、SXT遺伝子6（sxtA）、SXT遺伝子9（sxtG）、SXT遺伝子10（sxtH）、SXT遺伝子11（sxtI）、およびSXT遺伝子17（sxtX）（それぞれ、SEQ ID NO:14、20、22、24、および36）、またはそれらの断片もしく変異体のうちの１つまたは複数の検出に基づき、シアノトキシンを有する生物を検出する方法を提供する。さらに、または別法として、シアノトキシンを有する生物は、以下のSXTポリペプチドのうちの１つまたは複数の検出に基づき検出されてもよい：SXTA（SEQ ID NO:15）、SXTG（SEQ ID NO:21）、SXTH（SEQ ID NO:23）、SXTI（SEQ ID NO:25）、SXTX（SEQ ID NO:37）、またはそれらの断片もしくは変異体。
熟練者は、明示されたSXT配列および／またはCYR配列、またはそれらの変異体もしくは断片を増幅することができる任意のプライマーが、本発明の方法において使用するために適していることを認識するであろう。例えば、SXT遺伝子6（sxtA）のPCR増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対には、SEQ ID NO:70の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:71の配列を含む第2のプライマー、SEQ ID NO:72の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:73の配列を含む第2のプライマー、SEQ ID NO:74の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:75の配列を含む第2のプライマー、SEQ ID NO:76の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:77の配列を含む第2のプライマー、SEQ ID NO:78の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:79の配列を含む第2のプライマー、SEQ ID NO:113の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:114の配列を含む第2のプライマー、またはSEQ ID NO:115もしくはSEQ ID NO：116の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:117の配列を含む第2のプライマーが含まれる。
SXT遺伝子9（sxtG）の増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対には、SEQ ID NO:118の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:119の配列を含む第2のプライマー、またはSEQ ID NO:120の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:121の配列を含む第2のプライマーが含まれる。
SXT遺伝子10（sxtH）の増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対には、SEQ ID NO:122の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:123の配列を含む第2のプライマーが含まれる。
SXT遺伝子11（sxtI）の増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対には、SEQ ID NO:124もしくはSEQ ID NO:125の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:126の配列を含む第2のプライマー、またはSEQ ID NO:127の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:128の配列を含む第2のプライマーが含まれる。
SXT遺伝子17（sxtX）の増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対には、SEQ ID NO:129の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:130の配列を含む第2のプライマー、またはSEQ ID NO:131の配列を含む第1のプライマーおよびSEQ ID NO:132の配列を含む第2のプライマーが含まれる。
熟練者は、上記のプライマー対の断片および変異体も、SXT遺伝子6（sxtA）、SXT遺伝子9（sxtG）、SXT遺伝子10（sxtH）、SXT遺伝子11（sxtI）、またはSXT遺伝子17（sxtX）の配列を効率的に増幅する可能性があることを認識するであろう。
本発明のある種の態様において、CYR遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列は、CYR遺伝子8（cyrJ）（SEQ ID NO:95）の検出に基づき検出される。CYR遺伝子8（cyrJ）のPCR増幅のために適しているオリゴヌクレオチドプライマー対は、SEQ ID NO:111の配列またはその断片もしくは変異体を有する第1のプライマー、およびSEQ ID NO:112の配列またはその断片を有する第2のプライマーを含み得る。
また、例示されたオリゴヌクレオチドプライマーの変異体および断片も、本発明の範囲内に含まれる。熟練者は、本発明が例示された特定のプライマーの使用に限定されず、SXT配列および／またはCYR配列の増幅を可能にするよう適切に設計されている限り、別のプライマー配列も使用され得ることを認識するであろう。適当なプライマー配列は、過度の実験なしにルーチンの手法を使用して当業者によって決定され得る。SXT配列および／またはCYR配列の増幅のために適しているプライマーの位置は、G＋C含量、および望ましくない二次構造を形成する配列の能力のような因子によって決定され得る。
増幅された核酸の分析の適当な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)；Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc；およびManiatis et al.Molecular Cloning(1982),280-281に記載されている。増幅された核酸の分析の適当な方法には、例えば、事前に制限酵素消化が行われてもよいし、もしくは行われなくてもよいゲル電気泳動、および／または核酸配列決定が含まれる。ゲル電気泳動には、サイズに基づくDNA断片の分離のため、当業者によって一般的に使用されている技術である、アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動が含まれ得る。概して、ゲル中のアガロースまたはポリアクリルアミドの濃度が、ゲルの分解能を決定し、従って、アガロースまたはポリアクリルアミドの適切な濃度は、識別すべきDNA断片のサイズに依るであろう。
本発明の他の態様において、SXTポリヌクレオチドおよびCYRポリヌクレオチド、およびそれらの変異体または断片は、適当なプローブの使用により検出されてもよい。本発明のプローブは、本明細書に開示されたSXTポリヌクレオチドおよび／またはCYRポリヌクレオチドの配列に基づく。プローブは、相同配列の検出、典型的には、ハイブリダイゼーションによる相同配列の検出において使用するための、可変の長さ、例えば、約10ヌクレオチド〜数千ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNA断片、cDNA断片、RNA断片、またはその他のオリゴヌクレオチドであり得る。
ヌクレオチドプローブの設計および／または作製のための方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Robinson P.J..et al.(Eds)Current Protocols in Cytometry(2007),John Wiley and Sons,Inc；Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc；Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plain view,New York；およびManiatis et al.Molecular Cloning(1982),280-281に記載されている。ヌクレオチドプローブは、例えば、化学合成技術、例えば、ホスホジエステル法およびホスホトリエステル法（例えば、Narang S.A.et al.(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown,E.L.(1979)et al.Meth.Enzymol.68:109；および米国特許第4356270号を参照のこと）、ジエチルホスホラミダイト法（Beaucage S.L et al.(1981)Tetrahedron Letters,22:1859-1862を参照のこと）によって調製され得る。修飾された固体支持体においてオリゴヌクレオチドを合成する方法は、米国特許第4458066号に記載されている。
本発明のプローブは、検出を容易にするため、マーカーの組み込みにより標識されてもよい。核酸を標識し検出するための技術は、例えば、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Incに記載されている。適当なマーカーの例には、蛍光分子（例えば、アセチルアミノフルオレン、5-ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン）および放射性同位元素（例えば、32P、35S、3H、33P）が含まれる。マーカーの検出は、例えば、化学、光化学、免疫化学、生化学、または分光学の技術により達成され得る。
本発明の方法およびキットには、本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体の使用も包含される。抗体は、所定の試料の中の１つまたは複数のSXTまたはCYRのポリペプチドを定性的または定量的に検出し分析するために使用され得る。抗体の作成および使用のための方法は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、Harlow and Lane(Eds)Antibodies-A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y：Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(1986)2nd ed；およびKohler & Milstein,(1975)Nature 256:495-497に記載されている。抗体は、例えば、フローサイトメトリー、免役組織化学、または当技術分野において公知のその他の手段による検出を可能にする蛍光色素にコンジュゲートされてもよい。または、抗体は、比色定量または化学発光による検出を可能にする基質に結合させられてもよい。本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる１つまたは複数の抗体に結合することができる二次抗体の使用も企図する。
本発明は、シアノトキシンを有する生物および／または藍藻類および／または渦鞭毛藻類の検出のためのキットも提供する。一般に、本発明のキットは、１つまたは複数の本明細書に開示されたSXTおよび／またはCYRのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出するための少なくとも一つの剤を含む。本発明のSXT配列および／またはCYR配列を検出することができる任意の適当な剤が、キットに含まれ得る。非限定的な例には、プライマー、プローブ、および抗体が含まれる。
一つの局面において、本発明は、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTポリヌクレオチドまたはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出するための少なくとも一つの剤を含む、藍藻類の検出のためのキットを提供する。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
また、シアノトキシンを有する生物の検出のためのキットも提供される。キットは、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTポリヌクレオチドまたはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出するための少なくとも一つの剤を含む。
SXTポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
少なくとも一つの剤は、本明細書に開示されたSXTのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出のための任意の適当な試薬であり得る。例えば、剤は、プライマー、抗体、またはプローブであり得る。例示に過ぎないが、プライマーまたはプローブは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
本発明のある種の態様において、藍藻類またはシアノトキシンを有する生物の検出のためのキットは、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなCYRポリヌクレオチドおよび／またはCYRポリペプチドの配列、またはそれらの変異体もしくは断片を検出することができる少なくとも一つの付加的な剤をさらに含んでいてもよい。
CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。
または、CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNAを含んでいてもよい。
CYRポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含み得る。
少なくとも一つの付加的な剤は、例えば、プライマー、抗体、およびプローブからなる群より選択され得る。適当なプライマーまたはプローブは、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
別の局面において、本発明は、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなCYRポリヌクレオチドまたはCYRポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出するための少なくとも一つの剤を含む、藍藻類の検出のためのキットを提供する。
CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、CYRポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
CYRポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
本発明のある種の態様において、CYR配列またはそれらの変異体もしくは断片の検出のための１つまたは複数の剤を含む、藍藻類を検出するためのキットは、本明細書に開示されたSXTポリヌクレオチドおよび／またはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片のうちの１つまたは複数を検出することができる少なくとも一つの付加的な剤をさらに含んでいてもよい。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
少なくとも一つの剤は、本明細書に開示されたCYRポリヌクレオチドおよび／またはCYRポリペプチドの検出のための任意の適当な試薬であり得る。例えば、剤は、プライマー、抗体、またはプローブであり得る。例示に過ぎないが、プライマーまたはプローブは、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
また、１つまたは複数の本明細書に開示されるようなSXTポリヌクレオチドまたはSXTポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片の存在を検出するための少なくとも一つの剤を含む、渦鞭毛藻類の検出のためのキットも、提供される。
SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択される配列を含み得る。
または、SXTポリヌクレオチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片、ならびに／または本明細書に開示されたようなポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片からなる群より選択される配列によりコードされるRNAまたはcDNAであってもよい。
SXTポリペプチドは、
Figure 0005722765
、ならびにそれらの変異体および断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
一般に、本発明のキットは、任意の数の付加的な成分を含み得る。非限定的な例として、付加的な成分には、細胞培養のための試薬、参照試料、緩衝液、標識、および検出アッセイを実施するための説明書が含まれ得る。
スクリーニングの方法
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらの断片およびアナログは、これらの分子と相互作用する化合物および剤のスクリーニングおよび同定のために有用である。特に、望ましい化合物は、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの活性を調整するものである。そのような化合物は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現または活性を活性化するか、刺激するか、増加させるか、阻害するか、または防止することにより、調整効果を発揮し得る。適当な化合物は、直接相互作用（例えば、結合）または間接相互作用のいずれかによって効果を発揮し得る。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに結合するか、またはその他の方式で相互作用する化合物、特に、それらの活性を調整する化合物は、多様な適当な方法によって同定され得る。非限定的な方法には、ツーハイブリッド法、共免疫沈降、アフィニティ精製、質量分析、タンデムアフィニティ精製、ファージディスプレイ、標識転移、DNAマイクロアレイ／遺伝子共発現、およびタンパク質マイクロアレイが含まれる。
例えば、ツーハイブリッドアッセイは、１つの候補剤または複数の候補剤が、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片と相互作用または結合するか否かを決定するために使用され得る。酵母ツーハイブリッドアッセイ系は、タンパク質間相互作用を検出するために典型的に使用されている、酵母に基づく遺伝学的アッセイである（Fields and Song.,Nature 340:245-246(1989)）。アッセイは、転写活性化因子のマルチドメイン性を利用する。例えば、既知の転写活性化因子のDNA結合ドメインを、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片と融合させ、転写活性化因子の活性化ドメインを候補剤と融合させる。候補剤と、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片との間の相互作用は、転写活性化因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインとを接近させるであろう。転写活性化因子によって活性化された特定のレポーター遺伝子のその後の転写が、相互作用の検出を可能にする。
上記の技術を修飾して、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を検出可能なタグ、例えば、アルカリホスファターゼと融合させ、FlanaganおよびLeder（Flanagan and Leder,Cell 63:185-194(1990)）によって記載されたような修飾された型の免疫沈降を使用することにより、融合タンパク質を構築してもよい。
または、１つの候補剤または複数の候補剤が、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片と相互作用または結合するか否かを決定するため、共免役沈降を使用することもできる。この技術を使用して、シアノトキシンを有する生物、藍藻類、および／または渦鞭毛藻類を、タンパク質間相互作用の保存に適した非変性条件下で溶解させることができる。次いで、得られた溶液を、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に特異的な抗体と共にインキュベートし、バルク溶液から、例えば、固体支持体に付着した抗体結合タンパク質によるキャプチャーによって、免疫沈降させることができる。この方法による本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片の免疫沈降は、そのタンパク質に会合した剤の共免疫沈降を容易にする。会合した剤の同定は、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、および質量分析を含むが、これらに限定はされない、当技術分野において公知の多数の方法を使用して確立され得る。
または、１つの候補剤または複数の候補剤が本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片と相互作用または結合するか否かを決定するため、ファージディスプレイ法を使用してもよい。ファージディスプレイとは、遺伝子バンクからの複数の遺伝子をファージへ組み込むことにより、タンパク質相互作用についてスクリーニングする試験である。この方法の下では、各遺伝子のペプチドまたはタンパク質産物がウイルス粒子の表面上にディスプレイされるよう、多数の遺伝子をバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現させるため、組換えDNA技術が使用される。このようにして、ファージディスプレイされた関心対象のペプチドまたはタンパク質産物の完全なライブラリーが作製され得る。次いで、得られたファージディスプレイされたペプチドまたはタンパク質産物のライブラリーを、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に結合する能力についてスクリーニングすることができる。相互作用ファージから抽出されたDNAは、相互作用タンパク質の配列を含有している。
または、１つの候補剤または複数の候補剤が本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片と相互作用または結合するか否かを決定するため、アフィニティクロマトグラフィを使用してもよい。例えば、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を（セファロースのような）支持体上に固定化し、細胞溶解物をカラムに通すことができる。次いで、固定化された本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に結合するタンパク質を、カラムから溶出させ、例えば、N末端アミノ酸配列決定によって同定することができる。
本発明のポリペプチドの活性の可能性のある調整剤を、当業者に公知の多数の技術によって、上記の方法によるスクリーニングのため生成することができる。例えば、コンピューターに基づくモデリングを使用して、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片の構造をモデル化し、それにより、可能性のある調整剤の設計を容易にするため、X線結晶学および核磁気共鳴分光法のような方法を使用することができる。様々な型のコンビナトリアルケミストリーも、推定調整剤を生成するために使用され得る。
本発明のポリペプチドおよびそれらの適切な変異体もしくは断片は、それらと結合するかまたはその他の方式で相互作用する能力について候補化合物をアッセイするため、ハイスループットスクリーニングにおいて使用され得る。これらの候補化合物は、ポリペプチド活性に対する化合物の効果を決定するため、機能的なポリペプチドに対してさらにスクリーニングされ得る。
本発明は、ポリペプチドの発現を調節することにより、本発明のポリペプチドに対する調整効果を発揮する化合物も企図する。この場合、そのような化合物は、候補化合物の存在下でのポリペプチドの発現のレベルを、候補化合物の非存在下での発現のレベルと比較することにより同定され得る。
上記の方法は、本発明のポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片と相互作用するかまたはそれらの活性を調整することができる剤を同定するために利用され得る方法の型の例に過ぎないことが認識されるであろう。その他の適当な方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内にある。
上記の方法を使用して、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片のアゴニストである剤を同定することができる。アゴニストである剤は、ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つまたは複数を増強する。または、上記の方法は、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片のアンタゴニストである剤を同定することもできる。アンタゴニストである剤は、ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つまたは複数を遅らせる。
抗体は、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。好ましくは、適当な抗体は、本発明のポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは断片の別々の領域または断片から調製される。関心対象のポリヌクレオチドの抗原性部分は、約5〜約15アミノ酸のような任意の適切な長さであり得る。好ましくは、抗原性部分は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個のアミノ酸残基を含有している。
適当な抗体の生成のための方法は、当業者によって容易に認識されるであろう。例えば、本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体、または、典型的には、Fab部分を含有しているその変異体もしくは断片は、Antibodies-A Laboratory Manual,Harlow and Lane,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1988)に記載されたハイブリドーマ技術を使用して調製され得る。
本質的には、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に対するモノクローナル抗体の調製においては、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され得る。これらには、Kohler et al.,Nature,256:495-497(1975)によって最初に開発されたハイブリドーマ技術が含まれ、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al.,Immunology Today,4:72(1983)）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp.77-96,Alan R.Liss,Inc.,(1985)）も含まれる。発癌性DNAによるBリンパ球の直接形質転換またはエプスタインバーウイルスによるトランスフェクションのような、融合以外の技術によっても、不死の抗体産生細胞系を作出することができる。例えば、M.Schreier et al,"Hybridoma Techniques" Cold Spring Harbor Laboratory,(1980)；Hammerling et al,"Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" Elsevier/North-Holland Biochemical Press,Amsterdam(1981)；およびKennett et al,"Monoclonal Antibodies",Plenum Press(1980)を参照のこと。
簡単に説明すると、モノクローナル抗体が産生されるハイブリドーマを作製する手段、骨髄腫またはその他の自己永続性の細胞系を、それらの認識因子結合部分または認識因子またはそれらの起源特異的なDNA結合部分により過免疫感作された哺乳動物の脾臓から入手されたリンパ球と融合させる。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、当認識因子と免疫反応する能力、および標的細胞における特定の転写活性を阻害する能力によって同定される。
本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有している栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養物を開始させることにより作製され得る。培養物を、ハイブリドーマが培地中へ抗体分子を分泌するために十分な条件および期間で、維持する。次いで、抗体を含有している培地を収集する。次いで、周知の技術により、抗体分子をさらに単離してもよい。
同様に、ポリクローナル抗体の作製のために使用され得る様々な手法が当技術分野において公知である。本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に対するポリクローナル抗体の作製のためには、本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片の注射により、ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含むが、これらに限定はされない、様々な宿主動物を免疫感作することができる。さらに、ポリペプチド、その変異体または断片は、免疫原性担体（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH））にコンジュゲートされてもよい。また、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム パルバム（Corynebacterium parvum）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントを含むが、これらに限定はされない、様々なアジュバントを、免疫学的応答を増加させるために使用してもよい。
所望の抗体についてのスクリーニングも、当技術分野において公知の多様な技術によって達成され得る。抗体の免疫特異的結合についてのアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等（例えば、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1994)を参照のこと）が含まれるが、これらに限定はされない。抗体結合は、一次抗体上の検出可能標識によって検出され得る。または、抗体は、適切に標識された二次抗体または試薬との結合によって検出されてもよい。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多様な方法が、当技術分野において公知であり、本発明の範囲に含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に対して産生された抗体（またはその断片）は、そのタンパク質に対する結合親和性を有する。好ましくは、抗体（またはその断片）は、約105M-1より大きな、より好ましくは約106M-1より大きな、より好ましくはさらに約107M-1より大きな、最も好ましくは約108M-1より大きな結合親和性またはアビディティを有する。
本発明に従って適当な量の抗体を入手することに関して、無血清培地を用いたバッチ発酵を使用して、抗体を製造することができる。発酵後は、抗体を、クロマトグラフィ工程およびウイルス不活化／除去工程が組み入れられた多工程手法を介して精製することができる。例えば、プロテインAアフィニティクロマトグラフィによってまず抗体を分離し、次いで、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するため、溶媒／界面活性剤により処理することができる。残余のタンパク質、溶媒／界面活性剤、および核酸を除去するため、さらなる精製、典型的には、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィを使用してもよい。精製された抗体を、ゲルろ過カラムを使用して、さらに精製し、0.9％生理食塩水で製剤化することができる。次いで、製剤化されたバルク調製物を、滅菌し、ウイルスろ過し、分配することができる。
本発明の態様は、コードされたポリペプチドの翻訳を阻止することにより、本発明の核酸またはその断片もしくは変異体の発現を阻害するため、アンチセンス技術を利用してもよい。アンチセンス技術は、核酸が相補配列と対合するという事実を利用する。適当なアンチセンス分子は、化学合成によって、または、アンチセンスRNAの場合には、当業者に公知の方法によってプロモーターに連結されてインビトロもしくはインビボでの転写によって製造され得る。
例えば、関心対象のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列のある領域に対して、その長さ全体で少なくとも実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、典型的には18〜30ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成することができる。相補的な細胞ヌクレオチド配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および／またはmRNA安定性に干渉することができる。適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法によって調製され得、ヌクレオチド配列の調節領域、またはコーディング配列（遺伝子）もしくは非コーディング配列（遺伝子間領域）を標的とし結合するよう設計され得る。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、自動合成装置で合成されるであろう。適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞への送達、細胞内での安定性、および／または適切な標的への結合を改善するために設計された修飾を含んでいてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数のホスホロチオエート結合を追加するか、または１つもしくは複数のモルホリン環を骨格に含めること（いわゆる、「モルホリノ」オリゴヌクレオチド）によって修飾されてもよい。
RNA干渉（RNAi）として公知の別のアンチセンス技術が、ポリヌクレオチドの発現を阻害するため、当技術分野において公知の方法（例えば、WO 99/49029およびWO 01/70949を参照のこと）に従って使用されてもよい。RNAiとは、低分子干渉RNA分子（siRNA）による特異的なmRNAの破壊による選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段をさす。siRNAは、二本鎖RNAの切断によって生成され、一方の鎖は、不活化されるメッセージと同一である。一方の鎖がp53 mRNA転写物の特異的な領域と同一である二本鎖RNA分子を合成し、直接導入してもよい。または、細胞内で提示された後、dsRNAに変換される、対応するdsDNAを利用してもよい。RNAiにおいて使用するための適当な分子の合成、および転写後遺伝子サイレンシングの達成のための方法は、当業者に公知である。
発現を阻害するためのさらなる手段は、mRNA転写物を切断し、それにより野生型タンパク質の産生を防止することができる、リボザイムのような触媒性アンチセンス核酸構築物の導入によって達成され得る。リボザイムを、リボザイム触媒部位に隣接する標的との配列相補性を有する二つの領域により、特定の配列にターゲティングし、アニールさせる。結合後、リボザイムは部位特異的に標的を切断する。関心対象の配列を特異的に認識し切断するリボザイムの設計および試験は、当業者に周知の技術によって達成され得る（例えば、Lieber and Strauss,1995,Molecular and Cellular Biology,15:540-551を参照のこと）。
以下、本発明を具体的な例を参照しながら説明するが、これらの例は、決して、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
以下、本発明を具体的な例を参照しながら説明するが、これらの例は、決して、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例1：藍藻類培養物およびSXT遺伝子クラスタの特徴決定
本研究において使用された藍藻類株（図1）を、連続照明（10μmol m-2s-1）下で26℃で静置回分培養でJaworski培地において増殖させた。Neilan,B.A.1995..Appl Environ Microbiol 61:2286-2291に記載されたように、フェノール-クロロホルム抽出の後、リゾチーム／SDS／プロテイナーゼK溶解によって、全ゲノムDNAを藍藻類細胞から抽出した。上清中のDNAを2倍容量の-20℃エタノールにより沈殿させ、70％エタノールにより洗浄し、TE緩衝液（10：1）に溶解させ、-20℃で保存した。sxt ORFの増幅のために使用されたPCRプライマー配列を、図1Bに示す。
PCRアンプリコンを、TAE緩衝液（40mMトリス酢酸、1mM EDTA、pH 7.8）でのアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色（0.5μg/ml）後、UVアミノ交換反応によって可視化した。DNAの未知の領域の配列決定を、Moffitt et al.(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:6353-6362に記載されるようなアダプター媒介PCRによって実施した。自動DNA配列決定は、PRISM Big Dyeサイクルシーケンシングシステムおよびモデル373シーケンサー（Applied Biosystems）を使用して実施した。配列データをABI Prism-Autoassemblerソフトウェアを使用して分析し、他の翻訳された配列との類似率および同一率は、National Center for Biotechnology Information（NIH）によるBLASTを使用して決定し、配列-構造比較を介して遠縁ホモログを同定するためには、Fugue blast（http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/）を使用した。sxt遺伝子クラスタを、ソフトウェアPhred、Phrap、およびConsed（http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html）を使用して構築し、オープンリーディングフレームを手作業で同定した。C.ラシボルスキーT3由来のsxt遺伝子クラスタについてのGenBankアクセッション番号は、DQ787200である。
実施例2：SXT中間体の質量分析
細菌抽出物およびSXT標準物を、エレクトロスプレーソースが取り付けられたイオントラップ型質量分析計（Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus）に接続されたHPLC（Thermo Finnigan Surveyor HPLCおよびオートサンプラー）によって分析した。アナライトは、100mL/分で、2.1mm×150mm Phenomenex Luna 3ミクロンC18カラムで分離された。分析は、10mMヘプタフルオロ酪酸（HFBA）中5％アセトニトリルで出発する勾配を使用して実施した。これを10分間維持し、次いで、30分かけて100％アセトニトリルにまで上昇させた。カラムを洗浄するため、条件を10分間100％アセトニトリルに保持し、次いで、次の試料のためにカラムを平衡化するため、10mM HFBA中5％アセトニトリルに戻し、再び10分間保持した。このため、各試料のランタイムは60分であった。10〜100mLの試料容量を各分析のために注入した。HPLC溶出液は、以下のようにプログラムされたエレクトロスプレーソースに直接送られた：エレクトロスプレー電位5kV、シースガス流速30任意単位、補助ガス流速5任意単位。キャピラリー温度は200℃であり、47Vの電位を有していた。イオン光学は、試料分析の前に、標準毒素溶液による装置のオートチューン機能を使用して、感度が最大となるよう最適化した。質量スペクトルは、m/z範囲145〜650でセントロイドモードで取得した。質量範囲設定は、「ノーマル」であり、最大イオン注入時間は200ms、自動ゲインコントロール（automatic gain control）（AGC）はオンであった。タンデム質量スペクトルは、プリカーサーイオンに関連するm/z範囲で入手した。衝突エネルギーは、典型的には、20〜30 ThermoFinnigan任意単位であり、入手可能な場合には、標準物を使用して情報が最大となるよう最適化した。
実施例3：シリンドロスペルモプシス ラシボルスキーT3のSXT遺伝子クラスタの同定および配列決定
C.ラシボルスキーT3において、まず、縮重PCRを介して、O-カルバモイルトランスフェラーゼが検出された。その後、それをsxtIと命名した。さらなる調査により、sxtIのホモログが四つの藍藻類属のSXT毒素産生株に排他的に存在し（表1）、従って、SXT毒素生合成における優れた候補遺伝子であることが示された。次いで、C.ラシボルスキーT3のsxtIの上下流へのゲノムウォーキングアップによって、完全推定SXT生合成遺伝子クラスタ（sxt）の配列を入手した（図3）。C.ラシボルスキーT3において、このsxt遺伝子クラスタは、およそ35000bpに及び、31個のオープンリーディングフレームをコードしている（図2）。クラスタは、O-カルバモイルトランスフェラーゼ（sxtI）に加えて、メチルトランスフェラーゼ（sxtA1）、クラスIIアミノトランスフェラーゼ（sxtA4）、アミジノトランスフェラーゼ（sxtG）、ジオキシゲナーゼ（sxtH）を含む、SXT生合成酵素をコードするその他の遺伝子も含んでいた。毒性藍藻類株および非毒性藍藻類株における選択されたsxtオープンリーディングフレームのPCRスクリーニングによって、それらが、SXT毒素産生単離物に排他的に存在することが示され（図1A）、従って、これらの遺伝子の毒性表現型との関連が示された。以下の節には、適用可能な場合には、生物情報学的分析、生合成中間体に関するLCMS/MSデータ、およびインビトロ生合成に基づき、推定sxt遺伝子クラスタ内のオープンリーディングフレーム、およびそれらの予測される機能を記載する。
実施例4：親分子SXT生合成遺伝子の機能的予測
sxt遺伝子クラスタの生物情報学的分析によって、それが、sxtAと命名された、ポリケチドシンターゼ（PKS）様構造の以前に記載されていない例を含有していることが明らかになった。SxtAは、4個の触媒ドメインSxtA1〜SxtA4を保有している。反復PSI-blast検索によって、SxtA1のS-アデノシルメチオニン（SAM）依存性メチルトランスフェラーゼとの低い配列相同性が明らかになった。さらなる分析によって、SAM依存性メチルトランスフェラーゼに特異的な3個の保存配列モチーフ（278-ITDMGCGDG-286、359-DPENILHI-366、および424-VVNKHGLMIL-433）がSxtA1に存在することが明らかになった。SxtA2は、GCN5関連N-アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）に関連している。GNATは、アセチル-CoAから様々なヘテロ原子への酢酸の転移を触媒し、アシルキャリアータンパク質（ACP）に酢酸を負荷するPedIのような他の一般的でないPKSに関連して報告されている。SxtA3はACPに関連しており、ホスホパンテテイニル付着部位を提供する。SxtA4は、クラスIIアミノトランスフェラーゼに相同であり、8-アミノ-7-オキソノナノエートシンターゼ（AONS）に最も類似していた。クラスIIアミノトランスフェラーゼは、ピリドキサルリン酸（PLP）依存性酵素の単系統性の群であり、アミノ酸のクライゼン縮合を実施することが公知の唯一の酵素である。従って、本発明者らは、sxtAが、クライゼン縮合を含む、SXT生合成における第一工程を実施すると推論した。
一次構造に基づく、SxtAの予測される反応順序は、アセチル-CoAからACP（SxtA3）への酢酸の負荷、それに続く、SxtA1により触媒されるアセチル-ACPのメチル化によるプロピオニル-ACPへの変換である。次いで、クラスIIアミノトランスフェラーゼドメインSxtA4が、プロピオニル-ACPとアルギニンとの間のクライゼン縮合を実施するであろう（図4）。このように、SxtAの推定生成物は、4-アミノ-3-オキソグアニジノヘプタンであり、それを本明細書においては化合物A'と呼ぶ（図4）。比較遺伝子配列分析に基づきSXT生合成のためのこの経路を確証するため、C.ラシボルスキーT3の細胞抽出物を、化合物A'（図5）ならびに対照としてのアルギニンおよびSXTの存在について、LC-MS/MSによってスクリーニングした。アルギニンおよびSXTは容易に検出され（図5）、予想されたフラグメントイオンを生じた。他方、m/z 187から入手されたLC-MS/MSデータは、C.ラシボルスキーT3からの構造Aの存在と一致した（図5）。MS/MSスペクトルは、A'からのアンモニアおよびグアニジンの喪失の後に予想されるフラグメントイオン（m/z 170、m/z 128）を示した。LC-MS/MSデータは、SxtAの予測される機能を強く支持し、従って、SXT生合成経路における修正された開始反応を支持した。
sxtGは、L-アルギニン:リジンアミジノトランスフェラーゼとの最も高いアミノ酸配列類似性を有していた推定アミジノトランスフェラーゼをコードする。SxtAの産物が、アミジノトランスフェラーゼSxtGの基質であって、SxtGが、アルギニンからa-アミノ基A'（図4）へとアミジノ基を転移させ、従って、化合物B'（図3）と呼ばれる4,7-ジグアニジノ-3-オキソヘプタンを生じることが提唱される。この仮説の反応順序も、LC-MS/MSによるC'の検出によって支持された（図4）。しかしながら、C.ラシボルスキーT3由来の細胞抽出物は、測定可能なレベルのB'（4,7-ジグアニジノ-3-オキソヘプタン）を含有していなかった。中間体B'が検出され得なかったことについての可能性の高い説明は、SxtBの作用を介した迅速な環化によるC'の形成である。
sxt遺伝子クラスタは、g-プロテオバクテリア由来のシチジンデアミナーゼ様酵素に類似している酵素sxtBをコードする。シチジンデアミナーゼの触媒機序は、シチジンからのアンモニアのレトロアルドール切断であり、それは、B'からC'への変換における第1の複素環の形成と同一の逆方向の反応機序である（図4）。従って、SxtBが、このレトロアルドール様縮合を触媒することが示唆される（工程4、図4）。
SXTへのメチオニンメチルの取り込みおよびそのヒドロキシル化を研究した。ただ一つのメチオニンメチルに由来する水素は、SXTに保持され、SXTの酢酸由来のC-5とC-6との間に1,2-Hシフトが観察された。SXT前駆体のメチル側鎖のヒドロキシル化は、SAM由来メチル基と酢酸由来C-6との間の二重結合のエポキシ化を介して進む。この取り込みパターンは、先の環化の間に形成されたであろうC-5とC-6との間の二重結合に対するメチオニンメチルの求電子攻撃に起因するのかもしれない。その後、新たなメチレン側鎖がエポキシ化され、続いて、アルデヒドへと開環され、その後、ヒドロキシルへと還元されるであろう。ただ一つのメチオニンメチル由来水素の保持、C-5とC-6との間の1,2-Hシフト、およびC-1とC-5との間の1,2-Hシフトの欠如は、メチオニンメチルの導入が3個の複素環の形成に先行する、この研究の結果と完全に一致している。
sxtDは、ステロールデサチュラーゼとの配列類似性を有する酵素をコードし、sxt遺伝子クラスタに存在する唯一の候補デサチュラーゼである。SxtDは、C'のC-1とC-5との間に二重結合を導入し、C-5とC-6との間の1,2H-シフトを引き起こすと予測される（化合物D'、図3）。sxtSの遺伝子産物は、非ヘム鉄2-オキソグルタレート依存性（2OG）ジオキシゲナーゼとの配列相同性を有する。これらは、ヒドロキシル化反応、エポキシ化反応、不飽和化反応、環化反応、および拡大反応を実施することができる多機能酵素である。2OGジオキシゲナーゼは、複素環の酸化的形成を触媒することが報告されている。従って、SxtSは、新たな二重結合の連続エポキシ化、および同時二環化によるエポキシドのアルデヒドへの開環を実施することができる。これは、ただ一つのメチオニンメチル由来水素の保持、およびSXTのC-1とC-5との間の1,2-Hシフトの欠如（工程5〜7、図4）を説明する。SxtUは、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼとの配列類似性を有する。既知の機能を有する最も類似している酵素は、クラブラン酸-9-アルデヒドの末端アルデヒドをアルコールへと還元するクラバルデヒド（clavaldehyde）デヒドロゲナーゼ（AAF86624）である。従って、SxtUは、工程8（図4）においてSXT前駆体の末端アルデヒド基を還元し、化合物E'を形成すると予測される。
従って、SxtD、SxtS、およびSxtUの協調作用は、化合物C'のE'へのヒドロキシル化および二環化である（図4）。このSXT生合成の提唱された経路を支持して、m/z 211およびm/z 225から入手されたLC-MS/MSは、C.ラシボルスキーT3からの化合物C'およびE'の検出を可能にした（図5）。他方、中間体B（m/z 216）およびC（m/z 198）についての証拠は、LC-MS/MSによって見出され得なかった。MS/MSスペクトルは、C'からのアンモニアおよびグアニジンの喪失、E'の場合には水の喪失の後に予想されるフラグメントイオンを示した。
E'の検出は、完全なSXT分子をもたらす最終反応が、その遊離ヒドロキシル基のO-カルバモイル化およびC-12の酸化であることを示した。しかしながら、これらの最終反応の実際の順序は、未だ確実ではない。sxtIの遺伝子産物は、トリコデスミウム エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）由来の予測O-カルバモイルトランスフェラーゼ（アクセッションABG50968）および藍藻類由来のその他の予測O-カルバモイルトランスフェラーゼに最も類似している。O-カルバモイルトランスフェラーゼは、常に、カルバモイルリン酸からのカルバモイル基を遊離ヒドロキシル基へ転移させる。本発明者らのデータは、カルバモイルリン酸からのカルバモイル基の、E'の遊離ヒドロキシ基への転移を、SxtIが触媒するかもしれないことを示す。既知の機能を有するsxtJおよびsxtKのホモログは、データベースに見出されなかったが、sxtJおよびsxtKのホモログは、しばしば、O-カルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子に隣接してコードされていることが注目された。
sxt遺伝子クラスタは、細菌のフェニル-プロピオン酸ジオキシゲナーゼおよび関連した環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼの末端オキシゲナーゼサブユニットを各々コードする二つの遺伝子、sxtHおよびsxtTを含有している。予測された機能を有する最も近縁のホモログは、カプレオマイシジン（capreomycidine）の環炭素（C-6）をヒドロキシル化するストレプトミセス ビナセウス（Streptomyces vinaceus）由来のカプレオマイシジンヒドロキシラーゼであった。従って、SxtHおよびSxtTは、SXT生合成において類似の機能、即ち、F'をSXTへと変換するC-12の酸化またはヒドロキシル化および酸化を実施するのかもしれない。
細菌のフェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼおよび関連した環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼに属するメンバーは、各触媒サイクルの後に再生のためオキシゲナーゼレダクターゼを必要とするため、多成分酵素である。sxt遺伝子クラスタは、この機能を果たすであろう推定電子伝達系を提供する。sxtVは、ノストック パンクチフォルメ（punctiforme）由来のフェレドキシンとの高い配列相同性を有する4Fe-4Sフェレドキシンをコードする。sxtWは、A.バリアビリス（variabilis）およびノストック パンクチフォルメに由来するフマル酸レダクターゼ／コハク酸デヒドロゲナーゼ様酵素に最も類似しており、次に、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来のAsfAに類似している。AsfAおよびAsfBは、アリールスルホン酸の異化に起因する電子の伝達に関与している酵素である。SxtVは、コハク酸から電子対を抽出して、フマル酸に変換し、次いで、フェレドキシン（SxtW）を介してSxtHおよびSxtTに電子を転移させると推定される。
実施例5：SXTテーラリング遺伝子の比較配列分析および機能的割り当て
親分子SXTの合成後、修飾酵素が様々な官能基を導入する。SXTに加えて、C.ラシボルスキーT3は、N-1ヒドロキシル化毒素（neoSXT）、脱カルバモイル化毒素（dcSXT）、およびN-スルフリル化毒素（GTX-5）を産生し、A.キルキナリスAWQC131Cは、脱カルバモイル化毒素（dcSXT）、O-スルフリル化毒素（GTX-3/2、dcGTX-3/2）、ならびにO-スルフリル化毒素およびN-スルフリル化毒素（C-1/2）の両方を産生するが、N-1ヒドロキシル化毒素は産生しない。
sxtXは、セファロスポリンヒドロキシラーゼとの相同性を有する酵素をコードする。sxtXは、neoSXTのようなSXTのN-1ヒドロキシル化アナログを産生するC.ラシボルスキーT3、A.フロスアクアNH-5、およびリングビア ウォレイにのみ検出された。この遺伝子クラスタの成分は、A.キルキナリスの株には存在せず、従って、おそらく、この種がN-1ヒドロキシル化PSP毒素を産生しない理由である（図1A）。従って、SxtXの予測される機能は、SXTのN-1ヒドロキシル化である。
A.キルキナリスAWQC131CおよびC.ラシボルスキーT3は、SXTのN-硫酸化アナログおよびO-硫酸化アナログ（GTX-5、C-2/3、(dc)GTX-3/4）も産生する。それぞれ、SXTおよびGTX-3/2のN-21および11-ヒドロキシSXTのO-22に特異的であった、二つの3'-リン酸5'-ホスホスルフェート（PAPS）依存性スルホトランスフェラーゼの活性が、SXT毒素産生渦鞭毛藻類ギムノジニウム カテナツム（Gymnodinium catenatum）から記載されている。C.ラシボルスキーT3由来のsxt遺伝子クラスタは、推定スルホトランスフェラーゼSxtNをコードする。SxtNによるPSI-BLAST検索によって、閾値（0.005）より上のE値を有する未知の機能の25の仮説タンパク質のみが同定された。しかしながら、プロファイルライブラリー検索によって、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ（1AQU）（Z-スコア＝24.02）およびその他のスルホトランスフェラーゼとのSxtNの有意な構造的関連性が明らかになった。SxtNは、1AQUのアデノシン3'-リン酸5'-ホスホスルフェート（PAPS）結合領域に相当する、保存されたN末端領域を有する。しかしながら、SxtNがN-21またはO-22に硫酸基を転移させるか否かは不明である。興味深いことに、sxt遺伝子クラスタはアデニリル硫酸キナーゼ（APSK）SxtOをコードし、そのホモログはPAPSの形成に関与している（図2）。APKSは、ATPスルフリラーゼの産物、アデニリル硫酸をリン酸化し、PAPSに変換する。硫酸化された二次代謝産物をもたらすその他の生合成遺伝子クラスタも、PAPSの産生のために必要とされる遺伝子を含有している。
SXTの脱カルバモイル化アナログは、二つの仮説シナリオのいずれかを介して産生され得る。PSP毒素の生合成においてカルバモイルトランスフェラーゼSxtIの下流で作用する酵素が、広範囲の基質特異性を有し、SXTのカルバモイル化前駆体および脱カルバモイル化前駆体の両方をプロセシングすることが提唱される。または、SXTまたはその前駆体からのカルバモイル分子の加水分解が起こるのかもしれない。SxtLは、チオエステラーゼ、アリールエステラーゼ活性、プロテアーゼ活性、およびリゾホスホリパーゼ活性を有する多機能酵素であるGDSL-リパーゼに関連している。従って、SxtLの機能には、SXTアナログからのカルバモイル基の加水分解が含まれる可能性がある。
実施例6：代謝物輸送に関与しているクラスタ関連SXT遺伝子
sxtFおよびsxtMは、NorMファミリーのナトリウムにより駆動されるMATE（multidrug and toxic compound extrusion）タンパク質との高い配列類似性を有する二つのタンパク質をコードした。MATEタンパク質のNorMファミリーのメンバーは、陽イオン性物質を排出する、細菌のナトリウムにより駆動されるアンチポーターである。両性であるC-毒素を除き、全てのPSP毒素が、陽イオン性物質である。従って、SxtFおよびSxtMも、PSP毒素の排出に関与している可能性がある。V.パラヘマトリチクス（parahaematolyticus）由来のNorMの変異研究によって、基質特異性を付与する3個の保存された負の電荷を有する残基（D32、E251、およびD367）が同定されたが、基質認識の機序は未知のままである。SxtFにおいて、NorMのE251に相当する残基は保存されているが、D32およびD367に相当するものは、中性アミノ酸であるアスパラギンおよびチロシンにそれぞれ交換されている。SxtMにおいて、D32およびE251に相当する残基は保存されているが、D367はヒスチジンに交換されている。基質結合残基の変化は、これらのタンパク質によって輸送されるPSP毒素基質の違いを反映している可能性がある。
実施例7：サキシトキシンシンターゼの推定転写調節因子
窒素およびリン酸の利用可能性のような環境因子が、渦鞭毛藻類および藍藻類におけるPSP毒素の産生を調節することが報告されている。それぞれ、PhoUおよびOmpRに関連した二つの転写因子sxtYおよびsxtZ、ならびに二成分調節因子（two component regulator）ヒスチジンキナーゼが、C.ラシボルスキーT3のsxt遺伝子クラスタの3'末端の近位に同定された。PhoU関連タンパク質は、リン酸取り込みの負の調節因子であり、OmpR様タンパク質は、窒素および浸透圧バランスを含む多様な代謝の調節に関与している。従って、C.ラシボルスキーT3におけるPSP毒素産生は、リン酸の利用可能性にも、その他の環境因子にも応答して、転写レベルで調節されている可能性が高い。
実施例8：SXT遺伝子の系統学的起源
C.ラシボルスキーT3のsxt遺伝子クラスタは、真性モザイク構造を有する。C.ラシボルスキーT3のsxt遺伝子のおよそ半分は、他の藍藻類に由来するカウンターパートに最も類似していたが、残りの遺伝子は、プロテオバクテリア、放線菌、スフィンゴバクテリア、およびファーミキューテスに由来するホモログと最も近いマッチを有していた。遺伝子水平伝播（HGT）が原核生物ゲノムの進化の主要な駆動力である、という一連の証拠が増加しつつあり、しばしばトランスポサーゼおよびファージが関与しているHGTによって、藍藻類ゲノムが大きく影響を受けていることは公知である。sxt遺伝子の過半数が、他の藍藻類に由来するホモログに最も密接に関連しているという事実は、HGTを介して他の細菌から残りの遺伝子を連続的に獲得した祖先の藍藻類においてSXT生合成が進化した可能性を示唆する。調査されたsxt遺伝子クラスタの構造的な組成、およびIS4-ファミリーに関連したいくつかのトランスポサーゼの存在は、sxt遺伝子の小さなカセットが可動性であることを示唆している。
実施例9：藍藻類培養物およびCYR遺伝子クラスタの特徴決定
藍藻類株を、上記実施例1に記載されたようなJaworski培地において増殖させた。以前に記載されたようにして（Neilan,B.A.1995..Appl Environ Microbiol 61:2286-2291）、フェノール-クロロホルム抽出の後、リゾチーム／SDS／プロテイナーゼK溶解によって、全ゲノムDNAを藍藻類細胞から抽出した。上清中のDNAを、2倍容量の-20℃エタノールにより沈殿させ、70％エタノールにより洗浄し、TE緩衝液（10:1）に溶解させ、-20℃で保存した。
推定シリンドロスペルモプシン生合成遺伝子に隣接するDNAの未知の領域の特徴決定を、Moffitt et al.(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:6353-6362に記載されたようなアダプター媒介PCRを使用して実施した。PCRは、1×Taqポリメラーゼ緩衝液、2.5mM MgCl2、0.2mMデオキシヌクレオチド三リン酸、各10pmolの順方向および逆方向プライマー、10〜100ngのゲノムDNA、および0.2UのTaqポリメラーゼ（Fischer Biotech,Australia）を含有している20μl反応容量で実施された。サーマルサイクリングは、GeneAmp PCR System 2400サーマルサイクラー（Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT）において実施された。サイクリングは、94℃、3分の変性工程により開始し、続いて、94℃、10sの変性、55〜65℃、20sのプライマーアニーリング、および72℃、1〜3分のDNA鎖伸長の30サイクルであった。増幅は、72℃、7分の最終伸長工程によって完結した。増幅されたDNAを、TAE緩衝液（40mMトリス酢酸、1mM EDTA、pH 7.8）におけるアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム（0.5μg/ml）染色後、UV透過照明によって可視化した。
自動DNAシーケンシングは、PRISM Big Dyeサイクルシーケンシングシステムおよびモデル373シーケンサー（Applied Biosystems,Foster City,CA）を使用して実施した。配列データをABI Prism-Autoassemblerソフトウェアを使用して分析し、他の翻訳された配列との同一性／類似性の値は、National Center for Biotechnology Information（NIH,Bethesda,MD）によるBLASTを使用して決定した。配列-構造比較を介して遠縁のホモログを同定するためには、Fugue blast（http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/）を使用した。遺伝子クラスタは、ソフトウェアPhred、Phrap、およびConsed（http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html）を使用して構築し、オープンリーディングフレームを手作業で同定した。ポリケチドシンターゼドメインおよび非リボソームペプチドシンテターゼドメインは、結晶構造に基づく専門のデータベース（http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/sofrware/NRPSpredictor；http://www.tigr.org/jravel/nrps/、http://www.nii.res.in/nrps-pks.html）を使用して決定した。
実施例10：シリンドロスペルモプシン産生藍藻類株および非産生藍藻類株の遺伝学的スクリーニング
シリンドロスペルモプシン産生藍藻類株および非産生藍藻類株を、プライマーセットcynsulfF
Figure 0005722765
、およびcylnamR
Figure 0005722765
を使用して、スルホトランスフェラーゼ遺伝子cyrJの存在についてスクリーニングした。ゲノムDNAを、Neilan et al.(1997)Int.J.Syst.Bacteriol.47:693-697に記載されたような16S rRNA遺伝子プライマー27Fおよび809を使用して、陽性増幅について試験した。遺伝子断片の同一性を確証するため、上記実施例9に記載されたようにして、アンプリコンを配列決定した。
シリンドロスペルモプシンの生合成には、アミジノトランスフェラーゼ、NRPS、およびPKS（それぞれ、AoaA、AoaB、およびAoaC）が関与している。シリンドロスペルモプシン生合成遺伝子クラスタの配列全体を入手するため、本発明者らは、C.ラシボルスキーAWT205由来のアミジノトランスフェラーゼ遺伝子の部分配列から手法を開始させ、アダプター媒介「遺伝子歩行(gene walking)」技術を使用した。連続した外向きプライマーを設計し、43kbに及ぶ遺伝子クラスタ全体を、毒素遺伝子クラスタの両側のさらなる3.5kbと共に配列決定した。
これらの隣接領域は、ヒドロゲナーゼの成熟に関与している分子シャペロンを含む、推定アクセサリー遺伝子（hyp遺伝子）をコードする。これらの遺伝子がシリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタの両端に隣接しているという事実から、本発明者らは、毒素遺伝子クラスタは、ゲノムのこの区域に挿入され、従って、HYP遺伝子クラスタに割り込んでいるのだと仮定する。この遺伝学的転位は、シリンドロスペルモプシンクラスタ内のトランスポサーゼ様配列の存在によって機序的に支持される。
配列アラインメントを使用した遺伝子機能推論（NCBI BLAST）、予測された構造的相同性（Fugue Blast）、ならびに結晶構造に基づく専門のblastサーバーを使用したPKSドメインおよびNRPSドメインの分析に基づき、毒素遺伝子クラスタの生物情報学的分析を実施した。シリンドロスペルモプシン生合成クラスタは、15個のORFを含有しており、それらは、全て、毒素シリンドロスペルモプシンの生合成、調節、および排出のために必要とされる機能をコードする（図6）。
実施例11：CYR炭素骨格の形成
シリンドロスペルモプシンの炭素骨格の形成における第一工程は、グリシンのアミジノ基転移を介したグアニジノ酢酸の合成を含む。ヒトアルギニン:グリシンアミジノトランスフェラーゼGATMに類似しているアミジノトランスフェラーゼをコードするCyrA（AoaAホモログ）は、ドナー分子（最も可能性が高いのはアルギニン）からのグアニジノ基をアクセプター分子グリシンへと転移させ、従って、グアニジノ酢酸を形成する（図8、工程1）。
生合成の次の工程（図8、工程2）は、混合（mixed）NRPS-PKSであるCyrB（AoaBホモログ）によって実施される。CyrBは8.7kbに及び、以下のドメインをコードする；NRPSのアデニル化ドメイン（Aドメイン）およびペプチジルキャリアータンパク質（PCP）、続いて、PKS起源のβケトシンターゼドメイン（KS）、アシルトランスフェラーゼドメイン（AT）、デヒドラターゼドメイン（DH）、メチルトランスフェラーゼドメイン（MT）、ケトレダクターゼドメイン（KR）、およびアシルキャリアータンパク質（ACP）。従って、CyrBは、その後のPKS伸長のためのスターター単位を動員することができるAドメインを含有している唯一の遺伝子であるため、第二の反応を触媒するに違いない。CyrB Aドメインによって活性化される特定のアミノ酸は、その基質特異性を付与する残基が、入手可能なデータベース（http://www-ab.informatik.uni―tuebingen.de/software/NRPSpredictor；http://www.tigr.org/jravel/nrps/、http://www.nii.res.in/nrps-pks.html）において全くマッチしないため、予測不可能である。現在までのところ、基質としてグアニジノ酢酸を利用するNRPSは、他には記載されていない。Aドメインがグアニジノ酢酸を活性化し、次いで、それがペプチジルキャリアータンパク質（PCP）の可動アーム（swinging arm）を介してKSドメインへと転移すると考えられる。ATドメインはマロニル-CoAを活性化し、ACPにそれを付着させる。これに続いて、KSドメインにおいて、活性化されたグアニジノ酢酸とマロニル-CoAとの間の縮合反応が起こる。CyrBは、二つの還元モジュール、KRおよびDHを含有している。それらの協調反応が、ケト基をヒドロキシルに還元し、続いて、H2Oが排除され、C13とC14との間の二重結合がもたらされる。NRPS/PKSデータベース（上記実施例9）を介してCyrBに同定されたメチルトランスフェラーゼ（MT）ドメインは、S-アデノシルメチオニン（SAM）依存性MTと相同である。従って、MTがC13をメチル化することが示唆される。C13とC14との間で新たに形成された二重結合へのN19のアミジノ基の求核攻撃が、「Michael付加」を介して起こることが提唱される。環化は、閉環のためのBaldwin則（Baldwin et al.(1997)J.Org.Chem 42;3846-3852）に従い、シリンドロスペルモプシンの第一の環の形成をもたらす。この反応は、エネルギー的に好都合であるため、自発的であり、酵素触媒を必要としない。これが、三つの環形成のうちの最初のものである。
生合成の第三工程（図8、工程3）には、KSドメイン、ATドメイン、KRドメイン、およびACPドメインを有するPKSをコードするCyrC（AoaCホモログ）が関与している。これらのドメインの作用は、ATドメインによるマロニル-CoAの活性化、ACPへの転移、およびKSドメインにおけるCyrBの産物との縮合を介した、酢酸による成長中の鎖の伸長をもたらす。伸長された鎖は、CyrCのACPに結合し、KRドメインが、C12のケト基をヒドロキシル基へと還元する。この工程を実施するPKSモジュールは、KRドメインを含有し、DHドメインは含有しておらず、これはCyrCにのみ相当する。
酵素CyrCの触媒作用の後は、五つのモジュール；KS、AT、DH、KR、およびACPを有するPKSであるCyrD（図8、工程4）である。CyrCの産物に対するこのPKSモジュールの作用は、1個の酢酸の付加、およびC10のケト基のヒドロキシルへの還元、およびC9とC10との間の二重結合への脱水をもたらす。この二重結合は、シリンドロスペルモプシンに作成される最初の6員環である第二の環の形成をもたらす、やはり閉環のBaldwin則に従う別のMichael付加を介したアミジノ基N19による求核攻撃の部位である。
CyrDの産物は、KSドメイン、ATドメイン、DHドメイン、KRドメイン、およびACPを含有しているPKSであるCyrE（図8の工程5）の基質である。このドメインの順序は、CyrDのものと同一であるため、この段階で、どちらのPKSが先に作用するのかを確認することは不可能であるが、それらの作用は同一であると提唱されているため、それはこの時点では重要でない。CyrEは、1個の酢酸の付加、およびC7とC8との間の二重結合の形成を触媒する。この二重結合が、Michael付加を介してN18によって攻撃され、第三の環化が起こり、第二の6員環がもたらされる。
CyrFは最後のPKSモジュールであり（図8の工程6）、KS、AT、およびACPのみを含有している最小PKSである。CyrFは、CyrEの産物に作用して、酢酸によって鎖を伸長し、C4およびC6は未還元のままにする。
経路の工程7（図8）は、最終的なシリンドロスペルモプシン化合物の毒性のために必要とされる反応である、ウラシル環の形成を含む。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタは、CyrGおよびCyrHと表示される、高い配列類似性（87％）を有する二つの酵素をコードする。Psi-blast検索（NCBI）、それに続くFugueプロファイルライブラリー検索（材料および方法を参照のこと）によって、CyrGおよびCyrHが、アミドヒドロラーゼ／ウレアーゼ／ジヒドロオロターゼの酵素ファミリー（そのメンバーはN-C結合の形成および切断を触媒する）に最も類似していることが明らかになった。これらの酵素は、アルギニンまたは尿素のようなドナー分子からの第二のグアニジノ基を、シリンドロスペルモプシンのC6およびC4に転移させ、ウラシル環の形成をもたらすと提唱される。これらの酵素は、グアニジノドナーに依って二つまたは三つの反応を実施する。第一の反応は、グアニジノドナーのNとシリンドロスペルモプシンのC6との間の共有結合の形成、それに続く、C5とC6との間の二重結合を形成するH2Oの排除からなる。第二の反応は、グアニジノドナー上の第二のNとシリンドロスペルモプシンのC4との間の結合の形成を触媒し、同時に、CyrEのアシルキャリアータンパク質とシリンドロスペルモプシンとの間のチオエステル結合を破壊して、酵素複合体からの分子の放出を引き起こす。標識された酢酸を用いたフィーディング実験によって、C4の酸素が酢酸起源のものであり、生合成の間に失われず、従って、ウラシル環の新規形成を必要とすることが示された。必要である場合には、第三の反応が、尿素以外のドナー分子からのグアニジノ基の切断を触媒するであろう。シリンドロスペルモプシンのウラシル環の形成におけるCyrGおよびCyrHの作用は、ピリミジンの新規の生合成経路を記載する。
一つの理論は、環の形成にとって好都合なコンフォメーションを容易にとる直鎖状ポリケチドを示唆する。従って、環化は自発的であって、酵素の制御下にないかもしれない。これらの分析は、これが、合成途中の適切な中間体の連続的な環形成によって、段階的に起こるのかもしれないことを示す。この機序は、通常、NRPS/PKSモジュールに関連しており、酵素複合体からの最終生成物の放出および環化を触媒する、チオエステラーゼドメインまたは環化ドメインの欠如も説明する。
実施例12：CYRテーラリング反応
シリンドロスペルモプシン生合成は、C12での硫酸化およびC7でのヒドロキシル化を触媒して、生合成を完結するため、テーラリング酵素の作用を必要とする。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタの分析によって、シリンドロスペルモプシンの生合成に関与しているテーラリング反応のための三つの候補酵素、即ち、CyrI、CyrJ、およびCyrNが明らかになった。C12におけるシリンドロスペルモプシンの硫酸化は、スルホトランスフェラーゼの作用によって実施される可能性が高い。CyrJは、ヒト3'-ホスホアデニリル硫酸（PAPS）依存性スルホトランスフェラーゼに最も類似しているタンパク質をコードする。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタは、アデニル硫酸キナーゼ（ASK）、即ち、CyrNもコードする。ASKは、スルホトランスフェラーゼのための硫酸ドナーであるPAPSの形成を触媒する酵素である。CyrJが、C12でシリンドロスペルモプシンを硫酸化し、一方、CyrNが、この反応のために必要とされるPAPSのプールを作出することが提唱される。シリンドロスペルモプシン産生株および非産生株のスクリーニングによって、スルホトランスフェラーゼ遺伝子が、シリンドロスペルモプシン産生株にのみ存在することが明らかになり、シリンドロスペルモプシンの生合成へのこのクラスタ全体の関与がさらに確認された（図7）。従って、cyrJ遺伝子は、NRPS遺伝子およびPKS遺伝子より独特であり、藍藻類において一般的な、これらの遺伝子を含有している他の遺伝子クラスタとの交差反応性が、おそらく比較的少ないため、毒素プローブのための優れた候補となり得る。最終テーラリング反応は、CyrIによって実施される。Fugue検索および反復Psi-Blastによって、CyrIは、コラーゲンのヒドロキシル化を触媒する哺乳動物プロリル4-ヒドロキシラーゼアルファサブユニットを含む、2-オキソグルタレートおよびFe(II)に依存性のオキシゲナーゼスーパーファミリーに属するヒドロキシラーゼに類似していることが明らかになった。CyrIは、ウラシル環と共に、シリンドロスペルモプシンの毒性の多くを付与していると考えられる残基、C7のヒドロキシル化を触媒することが提唱される。CyrIによるC7におけるヒドロキシル化が、おそらく、シリンドロスペルモプシンの生合成の最終工程である。
実施例13：CYR毒素輸送
シリンドロスペルモプシンおよびその他の藍藻類毒素は、産生細胞から排出されるようである。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタはCyrKと表示されるORFを含有しており、その産物は、NorMファミリーのナトリウムイオンにより駆動されるMATE（multi-drug and toxic compound extrusion）タンパク質に最も類似している。この相同性およびクラスタにおける中心的な位置に基づき、CyrKは、シリンドロスペルモプシンのためのトランスポーターであると仮定される。シリンドロスペルモプシン排出におけるその推定的な役割を確証するため、タンパク質の異種発現および特徴決定が現在試みられている。
実施例14：毒素遺伝子クラスタの転写調節
シリンドロスペルモプシン産生は、固定された窒素が増殖培地から排除された場合、最も高いことが示されている（Saker et al.(1999)J.Phycol 35:599-606）。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタには、ヒドロゲナーゼの成熟に関与している「hyp」遺伝子ホモログが隣接している。藍藻類ノストックPCC73102において、それらは、窒素同化遺伝子の転写を活性化する包括的な窒素調節因子NtcAの調節下にある。シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタは、C.ラシボルスキーAWT205において完全に「hyp」遺伝子クラスタ内に位置しており、シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタには明白なプロモーター領域が同定され得ないため、シリンドロスペルモプシン遺伝子クラスタが同調節下にあると考えることは妥当である。
最後に、シリンドロスペルモプシンクラスタは、3'末端にCyrOと表示されるORFも含む。相同性によると、それは、ATP結合カセットを保有しているようであり、調節およびシグナル伝達における多様な役割を有するWDリピートタンパク質に類似している仮説タンパク質をコードする。CyrOは、転写調節およびDNA結合における役割も有する可能性がある。それは、しばしば、シャペロン様の機能を果たし、タンパク質複合体の組み立て、作動、または分解を補助するAAAファミリータンパク質との相同性も示す。CyrOの役割に関するさらなる洞察は、データベース内の他のタンパク質との配列相同性が低いことによって妨害されている。
以上は、本発明の好ましい形態を記載したものである。本発明は上に示された特定の態様に制限されるべきでないことを理解されたい。当業者に明白な修飾および変化が、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明に対して成され得る。
関連出願
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる、2008年4月24日出願の「Detection of Cyanotoxic Organisms」という名称のオーストラリア仮出願第2008902056号に基づく恩典を主張する。

Claims (14)

  1. シアノトキシンを有する生物を検出するための方法であって、該方法における使用のために試料を取得する段階、およびサキシトキシン産生生物にのみ存在するサキシトキシン(SXT)クラスタ遺伝子の存在について試料を解析する段階を含み、該解析する段階が以下を検出する段階を含み、該存在が試料におけるシアノトキシンを有する生物を示す、方法：
    （i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24およびSEQ ID NO: 36からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
    （ii）（i）記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体ポリヌクレオチド、
    （iii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
    （iv）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、およびSEQ ID NO: 37からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、または
    （v）（iv）記載のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体ポリペプチド。
  2. シアノトキシンを有する生物が藍藻類または渦鞭毛藻類である、請求項1記載の方法。
  3. 解析する段階が、
    Figure 0005722765
    、ならびに該プライマー配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用する、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅を含む、請求項1または2記載の方法。
  4. 以下の1つまたは複数の存在について試料を解析する段階をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法：
    （i）
    Figure 0005722765
    、ならびに該ポリヌクレオチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
    （ii）（i）記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
    （iii）
    Figure 0005722765
    、ならびに該ポリペプチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリペプチド。
  5. 解析する段階が、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびに該配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数のプライマーを利用する、ポリメラーゼ連鎖反応による試料からのDNAの増幅を含む、請求項4記載の方法。
  6. シアノトキシンを有する生物の検出のためのキットであって、サキシトキシン産生生物にのみ存在するSXTクラスタ遺伝子の存在を検出するための少なくとも1つの剤を含み、該剤が以下を検出し得る、キット：
    （i）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 36、ならびに該ポリヌクレオチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
    （ii）(i)記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
    （iii）SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37、ならびに該ポリペプチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリペプチド。
  7. 少なくとも1つの剤が、抗体、プライマーまたはプローブであり、プライマーまたはプローブが、
    Figure 0005722765
    、ならびに該ヌクレオチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項6記載のキット。
  8. 以下の1つまたは複数の存在を検出するための少なくとも1つの追加的な剤をさらに含む、請求項6または7記載のキット：
    （i）
    Figure 0005722765
    、ならびに該ポリヌクレオチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド、
    （ii）(i)記載の配列によりコードされるリボ核酸または相補的DNA、
    （iii）
    Figure 0005722765
    、ならびに該ポリペプチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含むポリペプチド。
  9. 少なくとも1つの追加的な剤が、抗体、プライマーまたはプローブであり、プライマーまたはプローブが、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、ならびに該配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含む、請求項8記載のキット。
  10. SEQ ID NO: 1記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたはその断片であって、断片が、
    Figure 0005722765
    からなる群より選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
  11. 請求項10記載の配列によりコードされる、単離されたリボ核酸または単離された相補的DNA。
  12. 請求項10記載の断片によってコードされ、
    Figure 0005722765
    からなる群より選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたサキシトキシン生合成経路ポリペプチド。
  13. 以下の1つまたは複数と特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマー：
    （i）請求項10記載のポリヌクレオチド、または
    （ii）請求項11記載のリボ核酸または相補的DNA、
    であって、
    Figure 0005722765
    、ならびに該ポリヌクレオチド配列のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群より選択される配列を含む、プローブまたはプライマー。
  14. 請求項12記載のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体。
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