KR101016613B1 - 마이코박테리아―유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항―마이코박테리아제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 현재까지 알려지지 않은 마이코박테리아의 CutI 단백질에 의해 일산화탄소 탈수소효소의 발현이 조절되고, 일산화탄소 탈수소효소의 활성에 영향을 미친다는 것을 확인하여 항-마이코박테리아제의 가능성을 제시하였다. 또한, 본 발명은 마이코박테리아에 존재하고 인체에는 존재하지 않는 일산화탄소 탈수소효소의 발현 조절을 대상으로 한 것이므로 인체에 부작용이 없는 항-마이코박테리아제의 개발에 유리하며, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 개발되는 항-마이코박테리아제는 종래의 항-마이코박테리아제와의 시너지 효과로 보다 효과적인 마이코박테리아 관련 질병의 치료에 이용될 수 있다.

마이코박테리아, 일산화탄소 탈수소효소, 일산화질소 탈수소효소, CutI

Description

마이코박테리아―유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항―마이코박테리아제의 스크리닝 방법{Polypeptide and Polynucleotide Derived from Mycobacteria and Screening Method for Anti―Mycobacterial Agent}

본 발명은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

결핵은 전 세계적으로 널리 퍼져 있을 뿐만 아니라, 현재 사용되고 있는 BCG 백신의 낮은 예방효율과 에이즈 환자들의 기회감염 증가 및 기존 약제로 치료가 불가능한 다제내성 결핵(MDR-TB) 감염의 증가로 인하여 장차 심각한 보건상의 문제로 대두되고 있다^{1 ,2}. 이와 같은 문제를 해결하는 하기 위해 새로운 결핵 백신 및 새로운 결핵치료제들이 개발되고 있으나, 현재 개발되고 있는 치료제들은 모두 결핵균의 마이콜릭 액시드(mycolic acid)의 생합성이나 RNA 전사과정, FASI 저해, 아라비노갈락탄 합성 또는 단백질 합성 등과 관련된 기존에 잘 알려진 목표들을 대상으로 하고 있어 결핵 치료에 큰 효과를 거두지 못할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명자들에 의해 확인된 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, CO-DH)는 현재 개발 중인 결핵치료제에 대한 전혀 새로운 목표이며³, CO-DH의 발현 및 활성에 관여하는 다른 단백질들도 결핵치료에 대한 새로운 목표가 될 것으로 기대한다. 현재 CO-DH를 신약 개발을 위한 하나의 목표로 설정한 후 CO-DH에 대한 저해제를 탐색하고 있으나, 컴퓨터를 이용한 분석을 통해 가상적인 CO-DH의 활성 부분을 분석한 결과, CO-DH의 활성 부분은 기체인 CO가 들어갈 수 있는 좁은 통로이기 때문에 CO-DH의 활성 부분에 직접적으로 결합할 수 있는 저해제는 발견이 어렵고, CO-DH의 다른 부분에 결합하여 CO-DH의 활성을 저해하는 물질을 탐색 중이나 아직까지 그 효과가 뛰어난 저해제를 발굴하지 못한 상황이다. 따라서 CO-DH의 활성을 저해할 수 있는 다른 방법으로 CO-DH의 전사나 발현에 관련되는 다른 단백질의 저해를 CO-DH의 활성저해의 또 다른 목표로 계획하고 있다.

현재까지 거의 150종 이상의 마이코박테리아가 알려져 있으며 (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html), 그 중에서 게놈 프로젝트가 완료된 것은 17종이다. 이 17종의 마이코박테리아 중에 CO-DH를 가지고 있는 종은 14종으로 많은 종의 마이코박테리아가 CO-DH를 가지고 있다. 또한 게놈 프로젝트에 의한 경우가 아니라도 마이코박테리아에서 CO-DH는 다른 속의 세균과는 달리 많은 종이 CO-DH를 가지고 있음이 확인되었고^{4 ,5,6}, 이는 다른 세균과는 달리 마이코박테리아 CO-DH 만의 특이한 NO 비독성화 능력에 의해 기인된다고 추정된다³. 결핵균의 CO-DH 주변에는 7개의 잘 보전된 유전자가 존재하고 있으며, 이들은 모두 CO-DH의 발현이나 활성에 영향을 줄 것이라 생각된다⁷. 본 발명자는 이러한 7개의 유전자의 기능을 확인하여, CO-DH의 발현이나 활성에 크게 영향을 미치는 단백질을 찾고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 현재 사용 또는 개발 중에 있는 결핵치료제나 결핵치료제 후보물질들의 목표와는 전혀 다른 목표를 발굴하기 위하여, 결핵균에 공통적으로 존재하며 NO를 비독성화할 수 있는 NO-DH의 활성을 가지고 있는 CO-DH의 활성을 저해하기 위해³, CO-DH의 발현 및 활성에 영향을 주는 유전자들의 산물을 새로운 결핵치료의 목표로 발굴하고자 하였다. 이와 같은 연구는 현재까지 시도되지 않고 있는 새로운 목표를 대상으로 하는 연구로, 전 세계적으로 본 발명자에 의해서만 진행되고 있는 유일한 연구이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 현재까지 개발된 항-마이코박테리아제가 결핵을 비롯하여 마이코박테리아와 관련된 여러 질병들을 효과적으로 예방 또는 치료하는 데에 미흡하다는 점에 착안하여 연구를 통해 일산화탄소 탈수소효소가 새로운 항-마이코박테리아제의 타겟이 될 수 있음을 확인하였고, 일산화탄소 탈수소효소 유전자와 관련된 다른 유전자 및 단백질들을 지속적으로 연구한 결과, 일산화탄소 탈수소효소를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 단백질을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 분자에 특이적으로 혼성화되는 프라이머 또는 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 현재까지 개발된 항-마이코박테리아제가 결핵을 비롯하여 마이코박테리아와 관련된 여러 질병들을 효과적으로 예방 또는 치료하는 데에 미흡하다는 점에 착안하여 연구를 통해 마이코박테리아에서 일산화탄소 탈수소효소가 새로운 항-마이코박테리아제의 타겟이 될 수 있음을 확인하였고, 일산화탄소 탈수소효소 유전자와 관련된 다른 유전자 및 단백질들을 지속적으로 연구한 결과, 일산화탄소 탈수소효소를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 단백질을 동정하였다.

대식세포는 인체에 침입한 병원체를 제거하는 기능을 하는 면역세포의 일종으로, 자신이 삼킨 병원체를 소화시키고 파괴하기 위하여 여러 가지 화합물을 만들어 내는데, 그 중의 하나가 일산화질소(nitric oxide, NO)이다. 그러나, 대식세포 내에서 생존할 수 있는 병원성 박테리아들은 대식세포가 만들어내는 천연 NO 저해제를 이용하여 NO의 작용을 저해, 회피하거나 박테리아 스스로 NO를 해독시키는 효소를 만들어 냄으로써 대식세포 내에서 살아남아 증식할 수 있다. 병원성 마이 코박테리아는 대식세포 내의 일산화질소를 산화하는 NO 디옥시게나아제(NO dioxigenase) 또는 퍼옥시나이트리타아제(peroxynitritase)와 같은 효소를 갖고 있으며(Couture, M., S. R. Yeh, B. A. Wittenberg, J. B. Wittenberg, Y. Ouellet, D. L. Rousseau, and M. Guertin., Proc . Natl . Acad . Sci. 96:11223-11228(1999) 및 Wengenack, N. L., Jensen, M. P., Rusnak, F., and Stern, M. K. Biochem. Biophys . Res . Commun . 256:485487(1999)), 본 발명의 일산화탄소 탈수소효소도 일산화질소를 산화시키는 기능을 가지고 있음이 알려져 있다(Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim YM., Biochem . Biophys . Res . Commun . 362(2):449-53(2007)).

본 명세서에서 사용되는 용어, “마이코박테리아”는 왁시(waxy)한 소수성의 풍부한 마이콜릭 액시드(mycolic acid)가 포함된 두꺼운 세포벽을 갖는 호기성의 항산성 그람 양성 박테리아로 분류되는 박테리아 집단을 의미한다. 마이코박테리아는 배양시 빠르게 생장하는 비병원성 마이코박테리아(non-pathogenic mycobacteria) 및 배양시 느리게 생장하는 병원성 마이코박테리아(pathogenic mycobacteria)로 분류될 수 있다. 비병원성 마이코박테리아로는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1 등이 있으며, 병원성 마이 코박테리아로는 Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum 등이 있다. 이들 마이코박테리아 집단의 상당수는 일산화탄소를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있다고 보고되어 있으며(Park SW, Hwang EH, Park H, Kim JA, Heo J, Lee KH, Song T, Kim E, Ro YT, Kim SW, Kim YM., J. Bacteriol . 185(1):142-7(2003)), 병원성 마이코박테리아를 연구하는 그룹들은 배양의 편의성 및 안전성을 위해 병원성 마이코박테리아와 유전적 특성이 유사한 비병원성 마이코박테리아를 모델로 하여 병원성 마이코박테리아의 특성을 밝히고 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “카복시도박테리아”는 일산화탄소를 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용하여 생장하는 박테리아 집단을 의미한다(Kim, Y. M., and G. D. Hegeman., Int . Rev . Cytol . 81:1-32(1983)).

본 명세서에서 사용되는 용어, “일산화탄소 탈수소효소(CO-DH)”는 카복시도박테리아에서 일산화탄소를 이산화탄소로 산화시키는 주효소를 의미하며, 다음과 같은 반응을 통해 일산화탄소를 산화시킨다: CO + H₂O → CO₂ + 2H₊ + 2e^-. 또한, 마이코박테리아 내에서 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화질소를 산화하여 유독한 일산화질소를 무해한 이산화질소로 해독시키는 기능을 하며, 이는 병원성 마이코박테리아가 대식세포 내에서 생존할 수 있는 기작으로 작용할 수 있다(Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim YM., Biochem. Biophys. Res. Commun. 362(2):449-53(2007)). 따라서 본 명세서에서 상기 일산화탄소 탈수소효소는 용어 “일산화질소 탈수소효소(NO-DH)”와 혼용된다. 또한, 본 명세서에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소의 구조유전자는 “cutBCA”로 표시된다. 하기 실시예에서 사용된 박테리아인 “Mycobacterium sp. strain JC1”은 상기 마이코박테리아 집단에 속하는 박테리아의 한 종류로 카복시도박테리아에 포함되는 박테리아인데, Mycobacterium sp. strain JC1의 16S rRNA 유전자는 다른 마이코박테리아 집단의 16S rRNA 유전자와 최소 96% 이상의 유사성을 나타내며 일부 마이코박테리아 집단(예컨대, M. peregrinum , M. wolinsky 등)의 16S rRNA 유전자와 최대 99%의 유사성을 나타낸다 (Kusunoki and Ezaki, Intl . J. System . Bacteriol . 42:240-245(1992); Brown et al., Intl . J. System . Bacteriol . 49:1493-1511(1999)). 또한, 튜버큘로스테아린산(tuberculostearic acid)라고 불리는 10-메틸 C_{18 :0}를 가지고 있음은 물론, 지방산의 분포도 다른 마이코박테리아의 지방산 분포와 유사한 박테리아이다(Song et al., J. Microbiol . 40:237-240(2002)).

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는다.

첨부한 서열목록 제2서열을 포함하는 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소의 유전자의 전사 또는 일산화탄소 탈수소효소의 발현을 활성화하는 단백질에 해당한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “아미노산 서열”은 아미노산의 중합체(예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 등)를 의미하며, 용어 “폴리펩타이드”는 “단백질” 및 “펩타이드”와 혼용된다.

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York(1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer . chem . Soc .. 85:2149-2156(1963)) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, (1989)).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 본 발명의 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열 (perfectly complementary sequence)뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열 (substantially complementary sequence)도 포함한다. 용어 “실질적으로 상보적인 서열”은 당업계에 공지된 엄격 조건 (stringent conditions) 하에서 예컨대 서열목록 제1서열 의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 용어 “엄격 조건"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있으며, 엄격 조건은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 엄격 조건은 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어져 있다.

한편, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부 서열, 즉, 단편 (fragment)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이코박테리아-유래 뉴클레오타 이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 주형인 상기 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오타이드의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵 산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 제공되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열일 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 상술한 바와 같다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:581-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, (1999); Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida(1984); 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY(1991)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 제조합 벡터에서 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결(operatively linked)된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 연결된”은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서 열은 상기 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 박테리아 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018- 1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 마이코박테리아-유래 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 형질전환 세포를 제조하기 위하여, 게놈 DNA 서열 및 그의 전사체(transcripts)가 이용될 수 있다. 전사체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 실시할 수 있으며, 재조합 벡터를 이용하여 전사체를 제조하는 경우에는 우선, 벡터를 선형화 하여 전사체를 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 형질전환을 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

형질전환 과정에 있어서 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (ⅰ) 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 (ⅱ) 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩 타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 항-마이코박테리아제로 판정하는 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 스크리닝 대상의 물질을 접촉시킨다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용되는 세포는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 세포(예컨대, 형질전환된 E. coli 또는 야생형 마이코박테리아)를 포함한다. 본 발명의 스크리닝에 사용될 수 있는 형질전환 미생물 또는 야생형 마이코박테리아의 구체적인 예는 상술한 바와 같다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 마이코박테리아는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum, Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum 또는 Mycobacterium porcinum 이고, 보다 바람직하게는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium 또는 Mycobacterium ulcerans이며, 보다 더 바람직하게는 Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium avium 이고, 가장 바람직하게는 Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1 또는 Mycobacterium tuberculosis이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험 물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.

시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 90:6909(1993); Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91:11422(1994); Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37:2678(1994); Cho et al., Science 261:1303(1993); Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2059(1994); Carell et al., Angew. Chem . Int . Ed . Engl . 33:2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37:1233(1994) 등에 개시되어 있다.

이어, 세포 내 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정한다. 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 물질은 항-마이코박테리아제로 판 정된다.

상기 폴리펩타이드의 양을 측정하는 방법은 다양한 분석 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 다양한 면역분석 포맷으로 상기 폴리펩타이드의 양을 측정할 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida(1980); Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ(1984); 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 상기 폴리펩타이드를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단 계; (ⅱ) 일차항체로서 상기 폴리펩타이드-특이적 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m- PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 상기 폴리펩타이드에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 상기 폴리펩타이드의 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이 블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

시료에서 상기 폴리펩타이드에 대한 시그널이 비처리 대조군 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 항-마이코박테리아제로 판정된다.

상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC press, 102-108(2004)), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머(예컨대, 진핵세포) 또는 확인하고자 하는 유전자(예컨대, 원핵세포)에 대한 특이적 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 상기 폴리뉴클레오타이드-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 cutI 유전자의 발현양 변화를 측정한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 이 감소-조절(down-regulation)하는 것으로 분석된 물질은 항-마이코박테리아제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양(Buruli ulcer), 임파선염(lymphadenitis) 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질이다.

대표적인 결핵균인 M. tuberculosis H37Rv를 포함한 여러 병원성 마이코박테리아들이 CO-DH를 가지고 있으며(예컨대, M. tuberculosis C, M. tuberculosis CDC1551, M. tuberculosis F11, M. bovis, M. tuberculosis sp. Haarlem, M. marinum, M. ulcerans 등), 이들 중에는 결핵 외에 부룰리 궤양 및 임파선염 등 다른 질병을 유발하는 세균도 있다(예컨대, M. marinum, M. ulcerans 등). 이들은 모두 마크로파지 내에서 NO의 독성을 제거하여 생존함으로써 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Subbian et al., BMC Microbiol. 7:4(2007); Ouellet et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:59025907(2002)). 바람직하게는 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질이며, 가장 바람직하게는 결핵의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 스크리닝되는 항-마이코박테리아제가 사용될 수 있는 결핵의 종류로는 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두결핵, 중이결핵, 장결핵 및 폐결핵이 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따라 개발되는 항-마이코박테리아제는 종래의 항-마이코박테리아제와의 시너지 효과로 상술한 마이코박테리아 관련 질병의 치료에 보다 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명은 현재까지 알려지지 않은 마이코박테리아의 CutI 단백질에 의해 일산화탄소 탈수소효소의 발현이 조절되고, 일산화탄소 탈수소효소의 활성에 영향을 미친다는 것을 확인하여 항-마이코박테리아제의 가능성을 제시하였다.

(ⅲ) 본 발명은 마이코박테리아에 존재하고 인체에는 존재하지 않는 일산화탄소 탈수소효소의 발현 조절을 대상으로 한 것이므로 인체에 부작용이 없는 항-마이코박테리아제의 개발에 유리하다.

이하, 도면을 참고한 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 실험 방법

사용 균주 및 세균 배양

본 발명에서 사용한 균주는 Mycobacterium sp. strain JC1이며^{8 ,9}, 세균의 배양은 종래의 카복시도박테리아(carboxydobacteria)의 배양에 사용하였던 기본염류배지(Standard Mineral Base, SMB)¹⁰를 사용하였으며, 일산화탄소(30%, v/v) 또는 포도당(0.2%, w/v)을 공급하면서 37℃에서 배양하였다. 유전자 조작을 위해 대장균을 루리아-버타니(LB)배지에서 배양하였다.

염색체 DNA 의 분리

염색체 DNA의 분리는 Murray 및 Thomson¹¹의 방법을 변형하여 수행하였다. SMB에 포도당을 첨가한 배지에서 지수성장기까지 진탕배양 (37℃, 200 rpm)한 5 ㎖의 Mycobacterium sp. strain JC1 배양액을 원심분리 (18,000 × g, 15분, 4℃)하여 얻은 침전물에 567 ㎕의 TE 버퍼 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0])를 넣어 현탁하였다. 여기에 20 ㎎/㎖ 농도로 TE 버퍼에 녹인 10 ㎕의 라이소자임 용액 및 30 ㎕의 10% (w/v) SDS 용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이 혼합액에 100 ㎕의 5 M 소듐 클로라이드를 넣어 혼합한 후, 80 ㎕의 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)/소듐 클로라이드 용액 (4.1 g의 소듐 클로라이드를 80 ㎖의 증류수에 녹인 다음, 10 g의 CTAB을 가열하면서 천천히 첨가하고, 전체 부피를 100 ㎖이 되게 증류수를 더한다)을 넣어 65℃에서 10분 동안 방 치하였다. 동량의 페놀-클로로포름-아이소아밀 알코올(25:24:1, v/v/v)용액을 첨가하고 원심분리(18,000 × g, 15분, 4℃)하여 상층액을 취하여 같은 과정을 2회 반복하였다. 이렇게 하여 얻은 용액에 3 M 소듐 아세테이트 (pH 5.2)를 최종 농도가 0.3 M이 되게 첨가하여 혼합한 후, 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 30분간 방치한 다음, 원심분리(18,000 × g, 15분, 4℃)하여 얻은 침전물을 70% (v/v) 에탄올로 세척하여 건조한 후, RNase (10 ㎍/㎖)-TE 버퍼 20 ㎕에 용해하여 사용하였다.

플라스미드 DNA 분리

DNA-스핀^TM 플라스미드 DNA 정제 키트(Intron)의 설명서를 참고하였다. 플라스미드를 추출하기 위해서 LB 배지에 대장균을 밤새도록 배양한 세포배양액 3 ㎖을 튜브에 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 얻은 균체를 250 ㎕의 버퍼 1(Intron)에 현탁하였다. 250 ㎕의 버퍼 2(Intron)를 넣어준 후 천천히 섞고 실온에서 2분 동안 방치하였다. 그 다음 350 ㎕의 버퍼 3(Intron)을 넣고 천천히 섞고 즉시 얼음에 2분 동안 방치하였다. 원심분리(18,000 × g, 10분, 4℃)하여 상층액을 조심스럽게 취한 후, 실리카 비드 멤브레인으로 채워진 컬럼(Intron)에 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시켰다. 통과액을 버리고 컬럼에 다시 700 ㎕의 워싱 버퍼를 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)를 하였다. 워싱 버퍼를 완전히 제거한 컬럼을 상온에서 2분 동안 방치하여 건조시킨 후 50 ㎕의 증류수를 넣고 상온에서 1분 동안 방치하였다. 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 플라스미드를 포함하는 용액을 얻었다.

아가로즈 젤로부터 DNA 절편의 분리

아가로즈 젤로부터 DNA 절편의 분리는 메가-스핀 키트(Intron)를 사용하였다. 제한효소로 처리한 DNA 시료를 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후, 원하는 DNA 절편 위치를 UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 확인하였다. 원하는 부분의 아가로즈 젤을 잘라내서 튜브에 옮긴 후, 여기에 500 ㎕의 gel extraction 버퍼(Intron)를 넣고 오븐에 5분 동안 방치하였다. 젤이 녹으면, 상온에서 잘 섞어준 후, 일루션 컬럼에 시료를 주입하여 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시켰다. 통과한 시료를 버리고 컬럼에 700 ㎕의 워싱 버퍼를 주입한 후, 원심 분리 (18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시키고, 통과한 시료를 버리고 상온에서 1분 동안 건조하였다. 컬럼을 완전히 건조시킨 후, 30 ㎕의 증류수를 컬럼의 가운데 부위에 떨어뜨려 실온에서 2분 동안 방치하였다. 사용한 컬렉팅 튜브를 제거하고 멸균된 새로운 튜브로 교체한 후, 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 분리된 DNA 절편을 얻었다.

형질전환

형질전환은 대장균의 경우 CaCl₂ 방법을 사용하였고¹², Mycobacterium sp. strain JC1의 경우 Parish 및 Stocker의 방법을 변형한 전기 천공법을 사용하였다¹³. 전기 천공법은 Bio-Rad사의 Gene Pulser^TM와 Pulse Controller를 사용하였다. CaCl₂ 방법 용 컴피턴트 세균을 만들기 위하여 대장균을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 100 ㎖의 새 LB 액체배지에 접종하여 약 3시간 진탕 배양하여 OD₆₀₀ 값이 0.7 정도 될 때 멸균된 원심분리 튜브에 옮기고 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 모아 10 ㎖의 차가운 0.1 M CaCl₂ 용액으로 재현탁하고 얼음에 30분 동안 방치하였다. 다시 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 모은 후 상층액은 버리고 여기에 15% (v/v) 글리세롤이 포함된 차가운 0.1 M CaCl₂ 용액 2 ㎖을 넣고 균체를 풀고 50 ㎕씩 멸균된 튜브에 분주하여 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. DNA 적당량을 컴피턴트 세균과 섞고 얼음에서 20분 동안 방치한 후 42℃에서 90초 동안 열 충격을 준 다음, 얼음에서 1분간 식히고 여기에 200 ㎕의 LB 액체배지를 넣어주고 37℃에서 1시간 배양한 다음 적절한 항생제가 포함되어 있는 LB 고체배지에 평판도말하고 37℃에서 배양하였다. 칼라 셀렉션을 위해서는 플레이트에 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드 (X-gal, 20 ㎎/㎖) 40 ㎕ 및 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG, 1 M) 4 ㎕를 첨가하였다.

Mycobacterium sp. strain JC1의 경우는 전기 천공용 컴피턴트 세균을 준비하기 위하여 SMB에 포도당을 첨가한 배지에서 지수성장기(OD₆₀₀에서 0.5)까지 진탕 배양한 후 얼음에서 2시간 방치하고 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 얻었다. 이를 배양액과 같은 양의 멸균된 차가운 10% (v/v) 글리세롤 용액으로 씻어준 후, 부피를 1/3씩 줄여나가며 2번 더 씻어주었다. 최종적으로 10% (v/v) 글리세롤 용액에 풀어 -70℃에서 보관하였다가 컴피턴트 세균으로 사용하였다. 0.2 cm의 형질전환용 큐벳(Bio-Rad)에 100 ㎕의 컴피턴트 세균과 300 ng의 DNA를 넣고 2.5 ㎸/㎝, 25 ㎌ 및 600 Ω의 조건으로 12 msec 동안 전기 천공을 하였다. 형질전환을 수행하기 전 얼음에 10분 동안 방치하였고, 형질전환 수행 후 얼음에 10분 동안 방치한 뒤 큐벳당 0.5 ㎖의 0.2% (w/v) 포도당이 포함된 SMB 배지를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 다음 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖) 및 0.2% (w/v) 포도당이 첨가된 고체 SMB 배지에 형질전환 시킨 균주를 도말하였다.

효소 및 시약

제한 효소는 KOSCO (Seoul, Korea)에서, T4 DNA 리가아제는 Invitrogen (Carlsbad, California)에서 구입하였다. 제한 효소의 사용, DNA 연결 반응 및 기타 DNA 재조합 방법은 시료 제공자의 지시에 따라 수행하였다. 암피실린은 Gemini Bio-Product 제품 (Gemini Bio-Product Co., Calabasas, CA)을 사용하였고, 하이그로마이신은 Roche(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 시약들은 Sigma 제품 (Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였다.

Mycobacterium sp . strain JC1 cutI ^- 돌연변이체 제작

cutI 유전자를 포함하고 있는 pJK53을 KpnI으로 절단하여 얻은 4,020-bp와 2,739-bp 및 589-bp의 조각 중 4,020-bp와 2,739-bp 조각을 연결하여 결실된 cutI 유전자가 포함된 pSW58 벡터를 제작하였다. pSW58의 결실된 cutI 유전자부분을 pKO에 삽입하기 위하여, pSW58을 PstI으로 잘라서 얻은 DNA 절편 중에서 2,167-bp 절편을 PstI으로 자른 pKO에 삽입하여 pSW60이라 명명하였다(표 1 및 도 1). 제조된 pSW60를 전기 천공법으로 Mycobacterium sp. strain JC1에 도입한 후, 하이그로마이신(75 ㎍/㎖)을 포함하고 있는 SMB-포도당 고체배지를 이용하여 싱글 크로스오버 돌연변이체를 얻었다. 이 싱글 크로스오버 돌연변이체를 하이그로마이신이 없는 SMB-포도당 배지에서 일주일 동안 충분히 배양하여 두 번째 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하였다. 이 컬쳐를 30 ㎕ 씩 10%(w/v) 수크로오즈를 포함하는 SMB 고체배지에 도말함으로써 수크로오즈가 있는 환경에서 성장이 가능한 더블 크로스오버 돌연변이체를 탐색하였다. 획득한 더블 크로스오버 돌연변이체로부터 염색체 DNA를 분리하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 이 돌연변이체가 cutI ^- 돌연변이체임을 확인하였다.

중합효소 연쇄 반응( PCR )

PCR은 Master gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 수행하였다. 50 ㎕ PCR 반응용액 중에는 2.5 mM MgCl₂, dNTP, 10x 버퍼, 각각 20 pmol의 양방향 프라이머, Ex Taq DNA 중합효소 (Takara, Shiga, Japan)와 100 ng의 DNA 주형을 포함하였다. PCR 조건은 전-변성은 94℃에서 10 분, 변성은 94℃에서 1 분, 어닐링은 65℃에서 1분, 그리고 신장은 72℃에서 2분 조건에서 30회 반복 수행한 후, 마지막으로 후-신장을 72℃에서 10분 동안 수행하였다.

성장곡선 측정

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 표현형을 확인하기 위해 SMB-포도당 배지 또는 SMB-CO 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 성장곡선을 분광광도계(U-2000, Hitachi)를 이용하여 측정하였다.

보상실험( complementation test )

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상실험을 위해 Mycobacterium sp. strain JC1의 cutI을 포함하는 1,539 bp의 PCR 산물을 cutI-CT-F( 5'-AAGCTTAGTCCAGTCCGAACCCGAAC-3'; 밑줄, HindIII 인식 부위) 및 cutI-CT-R( 5'-GGATCCCGAATAGGAAGCCAGCTTTC-3'; 밑줄, BamHI 인식 부위) 프라이머를 이용하여 염색체 DNA로부터 증폭한 후, HindIII와 BamHI으로 동시에 자른 pNBVI에 연결하여 pSW98 벡터를 제작하였다 (표 1). 제작된 pSW98은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에 보상실험을 위해 전기 천공을 하였다.

단백질 추출

CO-DH 활성 염색과 웨스턴 블롯에 사용할 효소추출액을 얻기 위해, SMB-포도당 배지에서 배양한 세균을 18,000 × g로 4℃에서 10분간 원심분리 (Eppendorf centrifuge-5403, Hamburg, Germany)하여 모은 다음, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액으로 두 번 씻고, 3 ㎖의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액에 재현탁하였다. 현탁된 세균을 0℃에서 초음파 분쇄기 (Sonics & Materials Inc., Danbury, CT)로 20% 진폭에서 3초간 초음파를 가하고 10초간 쉬는 것을 20회 반복하여 세균을 파쇄하였다. 파쇄된 배양액을 18,000 × g로 4℃에서 30분간 원심분리(Eppendorf centrifuge-5403)하여 모은 다음 상등액을 효소추출액으로 사용하였다.

단백질 정량

BSA를 표준단백질로 사용하여 Bradford의 방법에 따라 단백질을 정량하였다 ¹⁴.

전기영동

전기영동은 Mighty Small SE245 vertical slab gel 장치 (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)를 이용하여 Laemmli 방법을 변형하여 실시하였다¹⁵. 네이티브 효소의 분석을 위해서는 SDS (Sigma, St. Louis, MO)를 포함하지 않고 전기영동을 실시하였다. 아크릴아미드 농도는 30% (w/v) 아크릴아미드 (Sigma)와 0.8% (w/v)의 N,N'-비스-메틸렌 아크릴아미드(Sigma)를 포함하는 저장 용액으로부터 7.5% (w/v) 젤을 만들어 사용하였다. 단백질 시료는 시료 버퍼와 섞어서 로딩하였으며 전기영동은 얼음물 순환 장치를 이용하여 냉각시키면서 실시하였다. 전기영동시 전압은 전원 공급장치 (EPS-310, Amersham Pharmacia Biotech.)를 통하여 일정하게 유지시켜 주었는데, 스태킹 젤에는 80 V로 전압을 유지시켰고, 시료 버퍼가 세퍼레이트 젤로 들어가면 전압을 120 V로 증가시켜 전기영동하였다.

CBB 염색

CBB R-250을 사용하여 단백질을 염색하기 위해¹⁶, 45% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 아세트 산 및 0.25% (w/v) CBB R-250이 함유된 용액에서 30분 동안 염색하였다. 염색이 완료된 젤은 탈염색 용액 (30% [v/v] 메탄올 및 10% [v/v] 아세트 산)으로 여러번 반복하여 세척하였다.

CO - DH 활성 염색

CO-DH 활성염색은 Kim과 Hegeman의 방법을 이용하여 실시하였다¹⁰. 효소추출액을 SDS가 포함되지 않은 아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 젤을 50 mM Tris- HCl (pH 7.5) 완충용액이 든 유리관에 넣어 5분 동안 CO로 포화시킨 다음 이 반응액에 0.05% (w/v) 페나진 메토설페이트(PMS, Sigma) 및 0.25% (w/v) 니트로블루 테트라졸리움(NBT, Sigma)을 혼합한 용액 1 ㎖을 첨가한 후 선명한 활성염색 밴드가 나타날 때까지 방치하였다. 이 때 모든 과정을 빛을 차단한 상태에서 수행하였다.

웨스턴 블롯

효소추출액을 SDS가 포함되지 않은 아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 젤의 단백질을 멤브레인에 Western blotter (Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 밤새도록 전기로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼한 멤브레인을 1× PBS (13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 0.43 mM Na₂HPO₄·7H₂O 및 0.14 mM KH₂PO₄)에 1분 동안 담그고 10% 블로킹 솔루션(1× PBS에 10% [w/v]의 탈지분유를 녹인다)으로 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. 여기에 Mycobacterium sp. strain JC1의 CO-DH를 순화(Kim et al., J. Bacteriol . 171:958-964(1989))하여 토끼에서 얻은 항체를 1:5,000으로 희석되게 넣고 다시 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. 1× PBS로 15분씩 2회 씻어주고 Zymax^TM Goat anti-Rabbit IgG(H+L) (Zymed, S. Sanfrancisco, California) 1:5,000으로 희석되게 넣은 10% 블로킹 솔루션으로 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. PBS로 15분씩 3회 씻어주고 WEST-ZOL^TM (Intron, Sungnam, Korea)의 A용액과 B용액을 1:1 비율로 섞어 멤브레인에 골 고루 뿌려준 후 X-ray 필름 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokyo, Japan)으로 감광하였다.

β- 갈락토시다아제 활성 측정

CO-DH 프로모터 활성에 대한 cutI 유전자 산물의 영향을 조사하기 위해, cutB의 시작코도(ATG)의 ‘A'로부터 cutB의 전사 반대방향으로 12 bp 위치에서 cutR 유전자 시작코돈(GTG)의 처음 ‘G'로부터 cutR의 전사 방향으로 411 bp 위치까지 720-bp의 잠정적인 카피 I CO-DH 유전자의 프로모터가 포함되어 있는 pCS6¹⁷, cutB의 시작코돈(ATG)의 ‘A'로부터 cutB의 전사 반대방향으로 12 bp 위치에서 orf1 유전자 시작코돈(ATG)의 ‘A'로부터 orf1의 전사 방향으로 496 bp 위치까지 760-bp의 잠정적인 카피 II CO-DH 유전자의 프로모터가 포함되어 있는 pCS7¹⁷, 그리고 프로모터가 없는 대조군인 pCS8¹⁷을 Mycobacterium sp. strain JC1에 전기 천공법을 통해 형질전환시켰다. 0.2% (w/v) 포도당과 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 SMB 배지에 pCS6, pCS7 및 pCS8로 각각 형질전환된 Mycobacterium sp. strain JC1를 37℃, 200 rpm에서 밤새 진탕 배양한 후, 0.2% (w/v) 포도당과 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖)이 포함된 500 ㎖의 SMB 배지에 5㎖ 접종하였다. 접종된 것을 37℃, 200 rpm에서 적당한 시기까지 배양한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 3 ㎖에 재현탁하였다. 균체를 초음파 분쇄기 (Sonic & Materials, VCX600, Danbury, CT)를 이용하여 진폭 20% 조건으로 3.0초간 파쇄하고, 9.9초간 쉬는 과정을 5분간 반복하여 균체를 파쇄한 다음 원심분리(18,000 x g, 4℃, 30분)하여 얻어진 상층액을 효소추출액으로 사용하여 Miller¹⁸의 방법에 따라 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 효소추출액 200 ㎕에 500 ㎕의 Z 버퍼 (0.1 M 소듐 포스페이트 [pH 7.0], 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 50 mM β-머캅토에탄올)를 첨가한 후 기질로서 o-니트로페닐-β-D-갈락토사이드 (ONPG [4 ㎎/㎖])를 200 ㎕ 첨가하였다. 이 혼합액의 색 변화를 420 nm의 흡광도에서 시간당 측정하였다. β-갈락토시다아제 1 유닛은 ONPG로부터 분당 1 nmole의 o-니트로페놀을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였고, 효소 활성(specific activity)는 단백질 ㎎당 분당 β-갈락토시다아제 유닛으로 표시하였다.

생존률 측정

각 세균에서 SNP에 대한 생존률을 측정하기 위해 Hernandez-Urzua 등의 방법을 변형하여 실행하였다^{1 9}. SMB-포도당 배지에서 지수성장기 중반까지 성장시킨 각 세균을 100 ㎕씩 튜브에 넣었다. 측정 시간은 0, 30, 60 및 90분으로 정하고 5 mM의 SNP를 넣은 실험군과 넣지 않은 대조군을 각각 3개씩 준비하였다. 이렇게 준비한 것을 시간별로 배양한 후, 적절히 희석한 후 SMB-포도당 고체배지에 도말하여 얻어진 콜로나 숫자를 바탕으로 CFU(colony forming units)를 계산하여 생존곡선을 얻었다. 시간별로 배양시에는 무균상태에서 빛이 있는 아래에서 실험했는데 SNP는 빛에 의해 분해되어 NO를 발생시키기 때문이다²⁰.

플라스미드	설 명	출 처
pBluescriptⅡ SK(+)	pUC19로부터 유래한 2,961-bp의 플라스미드, Ampr	Stratagene
pNBVI	p16R1으로부터 유래한 5.8-kb 플라스미드, Hygr	참고문헌 21
pKO	Mycobacterium sp. strain JC1에서 자살 벡터로 사용되는 8,366-bp 플라스미드, Kmr, Hygr, sacB.	참고문헌 22
pJK53	람다 클론 #2으로부터의 4.4-kb SacI 절편을 포함하는 pBluescriptⅡ SK(+)	본 발명
pSW58	4,020-bp 및 2,739-bp의 KpnI 절편이 자가 연결된 pJK53	본 발명
pSW60	pSW58으로부터의 2,167-bp PstI 절편을 포함하는 pKO	본 발명
pSW98	cutI 유전자를 포함하는 1,539-bp PCR 생산물을 지닌 pNBVI.	본 발명
pCS6	잠정적인 카피 I CO-DH 프로모터-lacZ 융합체를 포함하는 pNBV1; 9,341 bp	참고문헌 17
pCS7	잠정적인 카피 II CO-DH 프로모터-lacZ 융합체를 포함하는 pNBV1; 9,381 bp	참고문헌 17
pCS8	프로모터가 없는 lacZ를 포함하는 pNBV1; 8,621 bp	참고문헌 17

2. 실험 결과

Mycobacterium sp . strain JC1 의 cutBCA 및 cutI 와 병원성 마이코박테리아에 존재하는 cutBCA 및 cutI 유사유전자와의 동일성 비교

본 실시예에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소의 구조유전자인 cutBCA와 병원성 마이코박테리아의 cutBCA 유사유전자와의 동일성 여부를 조사하기 위해 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석을 수행하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 Mycobacterium sp. strain JC1의 cutBCA는 M. tuberculosis를 포함한 병원성 마이코박테리아의 cutBCA 유사유전자와 뉴클레오티드 서열에 있어서 상당히 높은 동일성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 cutI에 대해서도 위와 동일한 방법으로 여러 병원성 마이코박테리아의 유사유전자에 대한 동일성을 조사하였다(표 3). 이러한 결과는 본 실시예에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소 및 일산화탄소 탈수소효소 발현 관련 유전자들이 병원성 마이코박테리아의 그것들과 큰 차이가 없음을 보여준다.

박테리아	유전자	Mycobacterium sp. strain JC1 cutB, cutC 및 cutA와의 동일성 (%)a
		cutB와 동일성	cutC와 동일성	cutA와 동일성
M. tuberculosis	rv0375c	71	-	-
	rv0374c	-	73	-
	rv0373c	-	-	81
M. bovis	mb0382c	71	-	-
	mb0381c	-	73	-
	mb0380c	-	-	81
M. marinum	mmar _0655	72	-	-
	mmar _0656	-	71	-
	mmar _0657	-	-	82
M. ulcerans	mul _0117	71	-	-
	mul _0116	-	71	-
	mul _0115	-	-	82

Mycobacterium sp . strain JC1 cutI ^- 돌연변이체 획득

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^-의 돌연변이는 상동 재조합에 의해 유도되었으며, 돌연변이체의 스크리닝은 마이코박테리아의 돌연변이체를 만들 때 가장 많이 이용되는 방법 중 하나인 sacB 유전자 산물인 레반수크라아제를 이용하여 제작되었다²³. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 각각 배양시켜 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 성장기질로 포도당을 이용한 성장에는 문제가 없으나(도 3), CO를 성장 기질로 하여 성장하지 못하는 것으로 확인되었다(도 4).

Mycobacterium sp . strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상 실험

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체가 cutI의 돌연변이 때문에 CO를 성장기질로 성장하지 못하는 것인지 아니면 다른 원인이 있는지 확인하기 위해 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상실험을 실험방법에 설명된 것과 같이 실시하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상실험 결과 cutI의 돌연변이로 인해 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 CO를 성장기질로 하여 성장하지 못함을 확인하였다(도 5).

Mycobacterium sp . strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서의 CO - DH 발현 확인

CO를 성장기질로 성장하지 못하는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체가 CO-DH 단백질이 발현되지 않아 CO를 이용하지 못하는 것인지, CO-DH 단백질은 발현이 되었으나 보조인자(cofactor) 등이 제대로 갖추어지지 않아 활성이 없는 상태로 발현이 되어 CO를 이용하지 못하는 것인지 확인하기 위해, CO-DH 효소 활성 염색 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. CO-DH 효소 활성 염색 및 웨스턴 블롯을 수행 결과, CO-DH 단백질 자체가 발현되지 않아 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체가 CO를 성장기질로 이용하지 못하는 것으로 확인되었다(도 6).

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 CO-DH의 전사를 확인하기 위해, 노던 블롯과 프로모터 어세이를 수행하였다. 노던 블롯 결과Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 CO-DH의 전사가 전혀 이루어지지 않았고(도 7), 이러한 결과는 프로모터 어세이에 의해 재검증되었다(도 8a 내지 도 8d). Mycobacterium sp. strain JC1의 CO-DH는 포도당을 기질로 하여 성장할 때도 발현되는 것으로 알려져 있으며²⁴, 지수성장기 후반에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있다²⁴. 프로모터 어세이 결과에서도, 지수성장기 후반에 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형의 카피 II cutBCA의 프로모터 활성이 증가하는 것으로 확인되었으나 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 프로모터 활성은 증가되지 않았다. 따라서 CutI는 CO-DH의 전사에 중요한 역할을 하는 단백질임이 재확인되었다.

NO 에 대한 생존율 실험

실제적으로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체가 NO에 대해 저항성이 있는지 확인하기 위해 NO를 발생시키는 SNP를 사용하여 NO에 대한Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 저항성을 확인하였다. SNP 실험 결과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형보다 NO에 대한 생존율이 80% 정도 감소하였다(도 9).

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 획득하기 위한 방법이다. 유전자의 중간 부분이 결실되어 돌연변이된 cutI 유전자를 가지고 있으며, 돌연변이체 선별을 위한 sacB 유전자 및 hygR 유전자를 가지고 있는 pSW60을 이용하여 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 선별하였다.

도 2는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 확인하기 위한 PCR 결과이다. 분석을 위한 프라이머로는 cutI-F(5'-CCGAGACCATCGACTGGGTG-3') 및 cutI-R(5-GCGCATTACCGTGCGACGTG-3')를 사용하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 야생형의 경우 1,772-bp, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 경우1,183-bp의 PCR 산물이 나타나게 된다. 레인 1은 PCR 산물의 크기를 확인하기 위한 사이즈 마커이며, 레인 2-7은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체 후보군을 대상으로 PCR한 결과이다. PCR 결과, 레인 2, 4 및 6번의 후보가 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체임이 확인되었다.

도 3은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 포도당을 이용한 성장을 확인한 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 표현형을 확인하기 위해, SMB-포도당 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 배양하여 성장곡선을 그렸다. 포도당을 성장 기질로 이용시 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 야생형과 비교했을 때, 전혀 성장에 차이가 없었다.

도 4는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 CO를 이용한 성장을 확인한 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 표현형을 확인하기위해, SMB-CO 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형 및 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체를 배양하여 성장곡선을 그렸다. CO를 성장 기질로 이용시 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 거의 성장하지 못하는 것으로 확인되었다.

도 5는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상실험 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 보상실험 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 cutI의 돌연변이로 인해 CO를 성장기질로 이용하지 못함이 확인되었다.

도 6은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 CO-DH 단백질이 발현되지 않음을 보여준다. 도면 6A에서 CBB 스테이닝 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 야생형(도면 6A, B 및 C의 l번 레인)과 비교하여 보았을 때 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체(도면 6A, B 및 C의 2번 레인)의 다른 단백질 등은 동일한 수준으로 발현이 되었으나 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 CO-DH는 발현되지 않음이 확인되었다. 도면 6B에서 CO-DH 활성염색 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체는 CO-DH 활성이 없었고, 이는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 CO-DH가 발현되지 않아서 나타난 결과였음이 Mycobacterium sp. strain JC1 CO-DH 항체를 이용한 웨스턴 블롯 결과 확인되었다(도면 6C).

도 7은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서의 cutBCA의 전사를 확인한 결과이다. 노던 블롯으로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 cutBCA의 전사를 cutB를 프로브로 조사한 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서는 cutBCA의 전사가 일어나지 않음을 확인하였다. A, 추출한 전체 RNA. B, cutB를 프로브로 이용한 노던 블롯 결과. 레인 1, Mycobacterium sp. strain JC1에서 추출한 전체 RNA. 레인 2, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 추출한 전체 RNA. 세균은 모두 SMB-포도당 배지에서 지수성장기까지 배양시킨 후 RNA를 추출하였다.

도 8a-8d는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터 활성을 확인한 결과이다. 성장시기별로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터의 활성을 확인한 결과, 카피 I cutBCA과 카피 II cutBCA의 활성이 거의 없음을 확인하였다. Mycobacterium sp. strain JC1에서 CO-DH는 정지기(stationary phase)에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있으므로, 성장시기를 구분하여(도 8a의 #1, #2 및 #3), 지수정장 중반기(도 8b), 이른 정지기(도 8c), 정지 중반기(도 8d)에서 각각 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터의 활성을 확인하였다.

도 9는 NO에 의한 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 성장 저해를 확인한 결과이다. NO를 발생시키는 SNP를 이용하여, Mycobacterium sp. strain JC1 야생형과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체의 NO에 대한 저항율을 측정한 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI ^- 돌연변이체(-○-)는Mycobacterium sp. strain JC1 야생형(-●-)보다 80% 이상 생존률이 감소함을 확인하였다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Yonsei University <120> Polypeptide and Polynucleotide Derived from Mycobacteria and Screening Method for Anti-Mycobacterial Agent <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213> Mycobacterium sp. <400> 1 gtggcttcgc cgtttctgct gcgcggcgtc gatctcgcag ccttcgccgc cgccctggta 60 gcacgcttgc gtggtgccgg gttgctggtg tccgccagca gtgcagcagg actcgtcgag 120 gcactgcgcc ggttctggcc gactgaccgg gaacagctgt actggaccgc ccggctgaca 180 cttgttagcc gggcggagga cctgattggc ttcgacgccg cgttcgacgc tctgttcgcc 240 gacgccgtcc tgggtttgga cccgcccggc ctcaaacaaa gtctcggcac cacgacggta 300 cccgagcccg gcgtgcgggg ccgacagcac gcacaggctg agggcggttt gccgtgggcg 360 acccggccag cgtcgatcac agcagcgagc gaggacaacg acagcgacat cggtattccc 420 gagatgctgc ccagtcggct cgtcgcgcgc gccgaggagc cgttcgaacg ttttgacgcg 480 gccgatctac gcctgatcgg cgcctggctg gaacaggcgg tggctcgctg gccgcgtcgt 540 cggagtctgc gccgcgaacc gcatccgcat ggaaagcgca tcgacttgcg gcgcaccatg 600 aaagcgtcgc gggccaccgg ctgggagccg gtcgtactcg cgcggacccg gccgcgccag 660 cactcccggc gcatggtgct gatgtgcgac gtcagcgggt cgatgcaggc ctatgcatcc 720 gtctatctgc acttgatgcg tgcggcggcg ttgcagcaga aggggatgcg gccggaggtt 780 ttcgccttct cgacatcgct gacccgactg actccggtgc tgtcacatcg gtccgcggag 840 gtggcgctgg cgcgcgccaa cgccaaggtc gccgaccgct acggcggtac ccacctcggg 900 cggagtgtca ccgaattgct ggccacgtcg cacggtaatg cgctgcgcgg cgcggtggtg 960 atcatcgctt ccgacggttg ggacagcgat ccgccggagc tgctggcgcg agcggtcgcc 1020 cgggttcgcc ggcgtgcgca tcagctggtg tggctcaacc cgcgggccgc gcgcccggga 1080 tttcagccgc tggccggggc gatggcggcc gcgttgccgt actgcgacgc cgtgctgccg 1140 gcgcattcgc tttctgggtt gcaggagctg ttcgcggtgc tggccgaggg atcgggctac 1200 cgagcatga 1209 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Mycobacterium sp. <400> 2 Met Ala Ser Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Gly Leu Leu Val Ser Ala 20 25 30 Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Glu Ala Leu Arg Arg Phe Trp Pro Thr 35 40 45 Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Thr Ala Arg Leu Thr Leu Val Ser Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Leu Ile Gly Phe Asp Ala Ala Phe Asp Ala Leu Phe Ala 65 70 75 80 Asp Ala Val Leu Gly Leu Asp Pro Pro Gly Leu Lys Gln Ser Leu Gly 85 90 95 Thr Thr Thr Val Pro Glu Pro Gly Val Arg Gly Arg Gln His Ala Gln 100 105 110 Ala Glu Gly Gly Leu Pro Trp Ala Thr Arg Pro Ala Ser Ile Thr Ala 115 120 125 Ala Ser Glu Asp Asn Asp Ser Asp Ile Gly Ile Pro Glu Met Leu Pro 130 135 140 Ser Arg Leu Val Ala Arg Ala Glu Glu Pro Phe Glu Arg Phe Asp Ala 145 150 155 160 Ala Asp Leu Arg Leu Ile Gly Ala Trp Leu Glu Gln Ala Val Ala Arg 165 170 175 Trp Pro Arg Arg Arg Ser Leu Arg Arg Glu Pro His Pro His Gly Lys 180 185 190 Arg Ile Asp Leu Arg Arg Thr Met Lys Ala Ser Arg Ala Thr Gly Trp 195 200 205 Glu Pro Val Val Leu Ala Arg Thr Arg Pro Arg Gln His Ser Arg Arg 210 215 220 Met Val Leu Met Cys Asp Val Ser Gly Ser Met Gln Ala Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Val Tyr Leu His Leu Met Arg Ala Ala Ala Leu Gln Gln Lys Gly Met 245 250 255 Arg Pro Glu Val Phe Ala Phe Ser Thr Ser Leu Thr Arg Leu Thr Pro 260 265 270 Val Leu Ser His Arg Ser Ala Glu Val Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ala 275 280 285 Lys Val Ala Asp Arg Tyr Gly Gly Thr His Leu Gly Arg Ser Val Thr 290 295 300 Glu Leu Leu Ala Thr Ser His Gly Asn Ala Leu Arg Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Ile Ile Ala Ser Asp Gly Trp Asp Ser Asp Pro Pro Glu Leu Leu Ala 325 330 335 Arg Ala Val Ala Arg Val Arg Arg Arg Ala His Gln Leu Val Trp Leu 340 345 350 Asn Pro Arg Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gln Pro Leu Ala Gly Ala Met 355 360 365 Ala Ala Ala Leu Pro Tyr Cys Asp Ala Val Leu Pro Ala His Ser Leu 370 375 380 Ser Gly Leu Gln Glu Leu Phe Ala Val Leu Ala Glu Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Arg Ala

Claims (11)

1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소 유전자의 전사를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소의 발현을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.
4. (a) 상기 제 1 항의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오 타이드.
6. 상기 제 4 항의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 되는 프라이머 또는 프로브.
7. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
8. (ⅰ) 상기 제 4 항의 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
9. 상기 제 8 항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포.
10. 다음의 단계를 포함하는 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법:

    (a) (ⅰ) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 (ⅱ) 상기 제 4 항 또는 제 5 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료는 항-마이코박테리아제로 판정된다.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양(Buruli ulcer), 임파선염(lymphadenitis) 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질인 것을 특징으로 하는 방법.

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