ES2342482T3 - Variante genetica relacionada con fosfatasa de proteina humana con manos ef-1 (ppef-1) asociada con linfoma linfoblastico de celulas t. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende una variante de eliminación de terminal N de la proteína PPEF-1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4, en donde en el terminal N de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 adicionalmente no está presente la secuencia de proteína.
Description
Variante genética relacionada con fosfatasa de
proteína humana con manos EF-1
(PPEF-1) asociada con linfoma linfoblástico de
células T.
La invención se relaciona con las secuencias de
polipéptido y de ácido nucleído de una variante genética relacionada
con fosfatasa de proteína humana novedosa con manos EF -1
(PPEF-1), procesos para su preparación, y usos de
la misma en el diagnóstico del Linfoma de células T, en particular,
Linfoma linfoblástico de célula T.
El cáncer es una de las causas principales de
muerte en el mundo. De acuerdo con el informe de la WHO Fact
Sheet-Cancer (2003), el cáncer cuenta con 7.1
millones de muertes (12.6% del total global) anualmente y se espera
que los casos de cáncer se implementen de 10 millones de personas en
el 2000 a 15 millones de personas en el 2020. Los Linfomas son
cánceres originados en el sistema linfático. Los linfomas se dividen
en linfomas Hodgkin y en linfomas no-Hodgkin. En
los Estados Unidos, el linfoma no-Hodgkin con un
incremento de 2.7% de incidencia es el quinto y sexto cáncer más
común entre hombres y mujeres, respectivamente (The Leukemia &
Lymphoma Society). En años recientes, se han hecho progresos hacia
el entendimiento de la biología molecular y celular de los linfomas
no -Hodgkin. Se han hecho muchas contribuciones importantes mediante
la identificación de varios factores genéticos claves asociados con
los linfomas no-Hodgkin. Sin embargo, los
tratamientos de linfomas no-Hodgkin dependerán
principalmente de quimioterapia y radioterapia debido a que los
mecanismos moleculares que subyacen a la patogenia de los linfomas
no-Hodgkin permanecen sin clarificar.
Se ha establecido que el daño o la mutación del
ADN en un linfocito puede resultar en crecimiento excesivo y no
controlado del linfocito (The Leukemia & Lymphoma Society). Por
lo tanto, las estrategias futuras para la prevención y tratamiento
de cánceres se enfocarán en la elucidación de genes dañados/mutados,
en particular, los genes ubicados en el cromosoma Xp22 debido a que
se ha mostrado que este segmento se asocia con el desarrollo de
linfoma. Adicionalmente, se ha reportado una correlación entre
Linfomas de células T e hipomagnesemia & hipocal-
cemia.
cemia.
Se sugiere que la Hipomagnesemia con
hipocalcemia segundaria se origina por la interrupción de un gen de
hipocalcemia dependiente de magnesio en el cromosoma Xp22. Por lo
tanto, las estrategias futuras para la prevención y tratamiento de
linfoma de Célula T se enfocarán en la elucidación de los sustratos
genéticos anormales ubicados en el cromosoma Xp22. Es interesante
notar que una fosfatasa de proteína humana con el gen de manos EF- 1
(PPEF-1) mapeado en esta región (Brunner et
al. (1999) Genome Res. 9:437-48) contiene
motivos de manos EF- en su terminal carboxi (Sherman et al.,
(1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94:11639-44). Se ha
mostrado que las manos EF- están involucradas en la unión del
calcio (Ramulu and Nathans (2001) J Biol Chem.
276:25127-35) lo que sugiere fuertemente que el
PPEF-1 puede tener una función en el desarrollo de
Linfoma de células T. Así, el descubrimiento de variantes genéticas
de PPEF-1 puede ser una meta importante para el
desarrollo de marcadores diagnósticos de linfoma de células T.
La presente invención proporciona una variante
de gen relacionada con el PPEF-1- ubicada en el
linfoma de células T humanas. La secuencia de nucleótido de la
variante génica y la secuencia de polipéptido codificada por lo
tanto se puede utilizar para el diagnóstico de cualquier enfermedad
asociada con esta variante génica o linfoma de células T, en
particular, Linfoma linfoblástico de célula T.
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión y una célula anfitriona para expresar la
variante.
La invención también proporciona un método para
la producción de variantes.
La invención proporciona adicionalmente un
anticuerpo que se une específicamente a la variante. Por ejemplo,
al seleccionar una única secuencia para una de las variantes. Por
ejemplo, un fragmento de péptido que expande las uniones de
eliminación. Se puede generar un anticuerpo que une a una de las
variantes y no al PPEF-1. Preferiblemente, tales
antígenos de péptido son de por lo menos 17 aminoácidos de largos.
Pero en algunos casos péptidos más pequeños tales como de 10 mer,
12 mer, o 15 mer pueden ser suficientes. Péptidos mayores, tal como
20 mer, 50 mer, cientos de-mer (y los que están
entre ellos) y aún también se pueden utilizar hasta proteínas de
longitud completa.
La invención también proporciona métodos para
detectar la presencia de una variante en un mamífero.
Fig. 1 muestra la secuencia de ácido nucleído
(SEQ ID NO:1), secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:2) y ácido
nucleído con la secuencia de aminoácido correspondiente (SEQ ID
NO:1&2) de PPEF-1.
Fig. 2 muestra la secuencia de ácido nucleído
(SEQ ID NO:3), secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:4) y ácido
nucleído con la secuencia de aminoácido correspondiente (SEQ ID
NO:3&4) de PPEF-1V.
Fig. 3 muestra la alineación de secuencia de
nucleótido entre el gen PPEF-1 humano y su variante
génica relacionada (PPEF-1V).
Fig. 4 muestra la alineación de la secuencia de
de aminoácido entre la proteína PPEF-1 humano y su
variante génica relacionada (PPEF-1V).
Fig. 5 muestra el patrón de expresión de
PPEF-1V en estirpes de célula humana.
Todos los términos técnicos y científicos
utilizados aquí, a menos que se defina otra cosa, tienen el mismo
significado como lo entienden comúnmente las personas expertas en la
técnica.
El término "anticuerpo" como se utiliza
aquí denota moléculas intactas (un polipéptido o grupo de
polipéptidos) así como también fragmentos de los mismos, tal como
fragmentos Fab, R-(ab')_{2}, y Fv, que son capaces unir los
epítopos. Los anticuerpos se producen por células B especializadas
después de estimulación por un antígeno. Estructuralmente, el
anticuerpo consiste de cuatro subunidades que incluyen dos cadenas
pesadas y dos cadenas livianas. La distribución de carga y forma de
superficie interna del dominio de un anticuerpo es complementaria a
las características de un antígeno. Así, el anticuerpo puede actuar
específicamente contra el antígeno en una respuesta inmune.
El término "par base (bp)" utilizado aquí
denota nucleótidos compuestos de una purina en un hebra de ADN que
puede ser hidrógeno unido a una pirimidina en la otra hebra. Los
residuos timina (o uracilo) y adenina se ligan por dos enlaces de
hidrógeno. Los residuos citosina y guanina se ligan por tres enlaces
de hidrógeno.
El término "herramienta de búsqueda de
alineación local básica (BLAST; Altschul et al., (1997)
Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)" utilizado
aquí denota programa para evaluación de homologías entre una
secuencia de consulta (aminoácido o ácido nucleico) y una secuencia
de prueba. Los programas BLAST específicos se describen como
sigue:
(1) BLASTN compara una secuencia de consulta de
nucleótido contra una base de datos de secuencia de nucleótido;
(2) BLASTP compara una secuencia de consulta de
aminoácido contra una base de datos de secuencia de proteínas;
(3) BLASTX compara los productos de traducción
conceptual de seis cuadros de una secuencia de nucleótido de
consulta contra una base de datos de secuencia de proteína;
(4) TBLASTN compara una secuencia de proteína de
consulta contra una base de datos de secuencia de nucleótido
traducida en todos los seis cuadros de lectura; y
(5) TBLASTX compara las traducciones de seis
cuadros de una secuencia de consulta de nucleótidos contra la
traducción de seis cuadros de una base de datos de secuencia de
nucleótidos.
El término "cADN" utilizado aquí denota
ácidos nucleicos que se sintetizan a partir de una plantilla de mARN
utilizando trancriptasa inversa.
El término "colección de cADN" utilizado
aquí denota una colección compuesta de ADN complementario que se
transcribe en forma inversa a partir de mARN.
El término "complemento" utilizado aquí
denota una secuencia de polinucleótido capaz de formar pares base
con otras secuencia de nucleótido. Por ejemplo, la secuencia
5'-ATGGACTTACT-3' se une a la
secuencia de complementariedad
5'-AGTAAGTCCAT-3'.
El término "eliminación" utilizado aquí
denota una remoción de una porción de uno o más residuos de
aminoácidos/nucleótidos de un gen.
El término "etiquetas de secuencia expresada
(EST)" utilizado aquí denota secuencias de nucleótidos cortas
(200 a 500 pares bases) que se derivan del extremo 5' o 3' de un
cADN.
El término "vector de expresión" utilizado
aquí denota una construcción de ácido nucleico que contiene un
sitio de clonación para introducir el ADN en el vector, uno o más
marcadores selecciónales para seleccionar vectores que contienen el
ADN, un origen de replicación para replicar el vector siempre que la
célula anfitriona divida, una secuencia terminadora, una señal de
poliadenilación, y una secuencia de control adecuada que puede
expresar efectivamente el ADN en un anfitrión adecuado. La secuencia
de control adecuada puede incluir un promotor, mejorador y otras
secuencias reguladoras necesarias para dirigir polimerasas para
transcribir el ADN.
El término "célula anfitriona" utilizado
aquí denota una célula que se utiliza para recibir, mantener, y
permitir la reproducción de un vector de expresión que comprende
ADN. Las células anfitrionas se transforman o se transfectan con
vectores adecuados construidos utilizando métodos de ADN
recombinante. El ADN recombinante introducido con el vector se
replica siempre que se divida la célula.
El término "inserción" o "adición"
utilizado aquí denota la adición de una porción de uno o más
residuos aminoácidos/nucleótidos a un gen.
El término "in silico" utilizado aquí
denota un proceso de utilización de métodos computacionales (por
ejemplo, BLAST) para analizar secuencias de ADN.
El término "reacción de cadena de polimerasa
(PCR)" utilizado aquí denota un método que incrementa el número
de copia de una secuencia de ácido nucleico utilizando una
polimerasa de ADN y un conjunto de cebadores (aproximadamente 20 bp
de oligonucleótidos complementarios a cada hebra de ADN) bajo
condiciones adecuadas (rondas sucesivas de hibridación de cebador,
alargamiento de hebra, y disociación).
El término "polinucleótido" o "secuencia
de ácido nucleico" utilizado aquí denota una secuencia de
nucleótidos (guanina, citosina, timina o adenina) en un orden
específico que puede ser un fragmento de ADN o ARN natural o
sintetizado. Puede ser monocatenario o bicatenario.
El término "proteína" o "polipéptido"
utilizado aquí denota una secuencia de aminoácidos en un orden
específico que se puede codificar por un gen por un gen o por un
ADN recombinante. Este también se puede sintetizar químicamente.
El término "interferencia de ARN (iARN)"
utilizado aquí denota una introducción de ARN bicatenario homólogo
(dsARN) en un célula para inhibir específicamente la expresión de un
gen.
El término "reacción de cadena de polimerasa
de transcriptasa inversa (RT-PCR)" utilizado aquí
denota un proceso que transcribe mARN con hebra de ADN
complementarios utilizando transcriptasa inversa seguida por
reacción de cadena de polimerasa para amplificar el fragmento
específico de las secuencias de ADN.
El término "transformación" utilizado aquí
denota un proceso que describe la captación, incorporación,
expresión del ADN exógeno por células anfitrionas procariótica.
El término "Transfección" utilizado aquí
denota un proceso que describe la captación, incorporación,
expresión del ADN exógeno por células anfitrionas eucariotas.
El término "variante" utilizado aquí denota
un fragmento de secuencia (nucleótido o aminoácido) insertada o
eliminada por uno o más nucleótidos/aminoácidos.
De acuerdo con la presente invención, se
proporcionan los polipéptidos de una variante de gen relacionada
con PPEF-1 humana novedosa y las secuencia de ácido
nucleico que codifican la misma.
De acuerdo con la presente invención, se utiliza
secuencia de cADN PPEF-1 humana para consultar las
bases de datos EST utilizando el programa BLAST para buscar
variantes de genes relacionadas con PPEF-1. Una
secuencia parcial de CADN humana (es decir., EST) similar a
PPEF-1 se identifica del EST depositado en una base
de datos de cADN construida utilizando una estirpe de células
SUP-T1 (linfoma linfoblástico de células T). El clon
de cADN, denominado PPEF-1V (variante
PPEF-1), se aísla luego de la colección de cADN
SUP-T1 y se secuencia. La figura 2 muestra por lo
tanto las secuencias de ácido nucleico (SEQ ID Nº:3) del
PPEF-1V y sus secuencias de aminoácidos
correspondientes (SEQ ID Nº: 4) codificadas.
La longitud completa del CADN del
PPEF-1V es un clon 2130 bp que contiene un cuadro de
lectura abierto (ORF) 1503bp que se extiende a partir de los
nucleótidos 188 a 1690, que corresponde a una proteína codificada de
501 residuos de aminoácidos con una masa molecular predicha de 57.8
kDa. La secuencia ATG de iniciación de PPEF-1V se
ubica en los nucleótidos 188-190bp. Para determinar
la variación de la secuencia del clon de cADN
PPEF-1V, se desarrolla una alineación de secuencia
de nucleótido PPEF-1/aminoácido, con
PPEF-1V (figuras Nº. 3 y 4). Los resultados indican
que se encuentra una eliminación genética principal en las
secuencias del nucleótidos alineadas, que indican que el
PPEF-1V tiene una eliminación de 350 bp en la
secuencia de PPEF-1 de los nucleótidos
128-477. Así, la proteína PPEF-1V
contiene una eliminación de terminal N de 152 aminoácidos que se
comparan con la proteína PPEF-1. La exploración del
PPEF-1 y la secuencia de aminoácidos
PPEF-1V contra las entradas de perfil en PROSITE
(ScanProsite) indica que la proteína PPEF-1 contiene
un sitio de motivo IQ (18-43aa), y tres sitios de
dominio de unión de calcio de mano EF (483-518aa,
566-601aa, y 606-641 aa). La
proteína PPEF-1V contiene, sin embargo, solo tres
sitios de dominio de unión de calcio de mano EF
(331-366aa, 414-449aa, y
454-489aa). Se ha reportado que el motivo IQ del
PPEF-1 es un sitio de unión de calmodulina (Kutuzov
et al. (2002) Biochem Biophys Res Commun.
293:1047-52). La falta de motivo IQ en
PPEF-1V sugiere que la función del
PPEF-1V puede ser independiente de la unión de
calmodulina.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
En la presente invención, se desarrolla una
búsqueda de EST depositada en dbEST en NCBI para determinar la
presencia de PPEF-1V in silico. El resultado del
análisis in silico muestra que un EST (número de acceso GenBank
BE546038) se encuentra que confirma la ausencia de la región de 350
bp en la secuencia de nucleótidos PPEF-1V. Por lo
tanto, cualquier fragmento de nucleótido que comprende las
secuencias inmediatas en la dirección 5' y 3' de la región
eliminada de 350 bp (128-477 bp) de
PPEF-1V son los "objetivos génicos" y se pueden
utilizar como sondas para determinar la presencia de
PPEF-1V bajo condiciones de alta rigurosidad. Un
método alterno es que cualquier conjunto de cebadores para
amplificar el fragmento que contiene las secuencias inmediatas 5' y
3' de la región eliminada de 350 bp (128-477 bp) del
PPEF-1V son los "objetivos génicos" y se
pueden utilizar para determinar la presencia de la variante.
De acuerdo con la presente invención, los
polipéptidos del PPEF-1V humano y sus fragmentos se
pueden producir a través de técnicas de ingeniería genética. En
este caso, ellos se producen mediante células anfitrionas
apropiadas que se han transformado por ADN que codifican los
polipéptidos o fragmentos de los mismos. La secuencia de nucleótido
de codifica el polipéptido del PPEF-1V humano o sus
fragmentos se inserta en un vector de expresión apropiado, es
decir, un vector que contiene los elementos necesarios para las
transcripción y traducción de la secuencia de codificación
insertada en un anfitrión adecuado. Las secuencias de ácido nucleico
se insertan en el vector en donde la secuencia se expresará bajo
condiciones apropiadas (por ejemplo, en orientación apropiada y el
cuadro de lectura correcto y con secuencias de expresión apropiada
que incluyen secuencia de unión de polimerasa de ARN y secuencias
de unión ribosómica).
Cualquier método que sea conocido por aquellos
expertos en la técnica se pueden utilizar para construir vectores
de expresión que contienen las secuencias que codifican los
polipéptidos de PPEF-1V humano y los elementos de
control transcripcional/traduccional apropiados. Estos métodos
pueden incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y
técnicas sintéticas, y recombinantes genéticos in vivo.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de
vector de expresión/anfitrión para expresar la secuencia de
codificación de polipéptido. Estas incluyen, pero no se limitan a,
microorganismos tales como bacterias transformadas con
bacteriófagos recombinantes, plásmidos o vectores de expresión de
ADN cósmidos; la levadura transformada con vector de expresión de
levadura; sistemas de células de insectos infectadas con virus (por
ejemplo baculovirus); sistema de células de plantas transformadas
con vectores de expresión vírico (por ejemplo virus mosaico de
coliflor, CaMV, o virus mosaico del tabaco, TMV); o sistema de
células de animales infectada con virus (por ejemplo virus vaccina,
adenovirus, etc). Preferiblemente la célula anfitriona es una
bacteria, más preferiblemente la bacteria de E. coli.
Alternativamente, los polipéptidos de
PPEF-1V humano o fragmentos del mismo se pueden
sintetizar utilizando métodos químicos. Por ejemplo, se puede
desarrollar síntesis de péptidos utilizando varias técnicas de fases
sólidas. La síntesis automatizada se puede lograr utilizando el
sintetizador de péptidos ABI 431A
(Perkin-Elmer).
De acuerdo con la presenten invención, los
fragmentos de los polipéptidos y las secuencias de ácidos nucleicos
del PPEF-1V humano se utilizan como inmunógenos,
cebadores o sondas. Preferiblemente, los fragmentos purificados del
PPEF-1V humano son los utilizados. Los fragmentos se
pueden producir mediante digestión de enzima, división química de
polipéptidos purificados o aislados o secuencias de ácido nucleico,
o síntesis química. El fragmento se puede aislar después o
purificar. Tales fragmentos purificados o aislados de los
polipéptidos y las secuencias de ácidos nucleicos se pueden
utilizar como inmunógenos, cebadores o sondas.
La presente invención suministra adicionalmente
los anticuerpos que unen específicamente uno o más epítopos de
superficie externa de los polipéptidos del PPEF-1V
humano.
De acuerdo con la presente invención, la
inmunización de mamíferos tal como humanos, conejos, ratas, ratones,
ovejas, cabras, vacas, o caballos con inmunógenos descritos aquí se
desarrollan utilizando procedimientos bien conocidos por aquellos
expertos en la técnica, para el propósito de obtener antisuero que
contiene anticuerpos policlonales o estirpes de hibridoma que
secretan anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos se pueden preparar mediante
técnicas estándar, dadas las enseñanzas contenidas aquí. Tales
técnicas se describen, por ejemplo, en la patente Estadounidense
número 4,271,145 y la patente Estadounidense número 4,196,265. En
resumen, se inmuniza un animal con el inmunógeno. Se preparan
hibridoma al fusionar células de bazo del animal inmunizado con
células de mieloma. Se seleccionan productos fusionados para
aquellos anticuerpos productores que se unen específicamente al
inmunógeno. Se aíslan los clones hibridoma positivos, y los
anticuerpos monoclonales se recuperan a partir aquellos clones.
Los regímenes de inmunización para la producción
de anticuerpos policlonales y monoclonales se conocen bien en la
técnica. Se puede inyectar el inmunógeno mediante una ruta, que
incluye la ruta subcutánea, intravenosa, intraperitoneal,
intradérmica, intramuscular, por mucosa o una combinaciones de las
mismas. El inmunógeno se puede inyectar en forma soluble, en forma
agregada, adherida a un portador física o mezclada con un adyuvante.
El antisuero y los anticuerpos se pueden purificar utilizando
métodos de cromatografía de columna.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
generar fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión
específica para los polipéptidos o fragmentos de los mismos también.
Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a
fragmentos F(ab')_{2} hechos por digestión de pepsina de la
molécula de anticuerpo o fragmento Fab generado al reducir los
puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}
\global\parskip1.000000\baselineskip
La invención objeto también proporciona métodos
para diagnosticar las enfermedades asociadas con linfoma de células
T o PPEF-1V más preferiblemente, linfoma
linfoblástico de células T, al utilizar la secuencia de ácido
nucleico, el polipéptido del PPEF-1V humano, o
fragmentos del mismo, y los anticuerpos contra los polipéptidos.
Se pueden encontrar muchas variantes génicas
para asociar con enfermedades (Stallings-Mann et
al., (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93:
12394-9; Liu et al., (1997) Nat Genet
16:328-9; Siffert et al., (1998) Nat Genet
18: 45 to 8; Lukas et al., (2001) Cancer Res 61: 3212 to 9).
En razón a que el clon PPEF-1V se aísla de la
estirpe celular del linfoma linfoblástico de células T
(SUP-T1), es aconsejable que el
PPEF-1V sirva como un marcador para el diagnóstico
del linfoma linfoblástico de células T humanas. Así, el nivel de
expresión del PPEF-1V con relación al
PPEF-1 puede ser un indicador útil para detectar
pacientes sospechosos de tener linfoma de células T o más
específicamente el linfoma linfoblástico de células T. Esto sugiere
que el índice de nivel de expresión relativa (mARN o proteína)
puede conferir una susceptibilidad incrementada al linfoma de
células T, más preferiblemente, linfoma linfoblástico de células T.
Los fragmentos de los trascriptos PPEF-1V (mARN) se
pueden detectar mediante método RT-PCR. Los
polipéptidos del PPEF-1V se pueden determinar
mediante la unión de los anticuerpos a estos polipéptidos. De otra
parte, se puede utilizar un método (ARNi; interferencia de ARN) que
se conoce por los expertos en la técnica para interferir y degradar
el ARN objetivo utilizando moléculas de ácido nucleico cortas
bicatenarias sintetizadas químicamente (aproximadamente 23
nucleótidos de dsARN) (Montgomery et al. (1998) Proc Natl
Acad Sci U S A. 95:15502-7). De acuerdo con la
presente invención, las moléculas de ácido nucleico cortas
bicatenarias que contienen las secuencias inmediatas 5' y 3' de la
región eliminada de 350 bp (128-477 bp) del
PPEF-1V se pueden utilizar para interferir y
degradar el mARN del PPEF-1V. Después se conduce al
método de ARNi, se pueden utilizar los polipéptidos o transcriptos
reducidos para determinar la precedencia de maARN
PPEF-1V.
De acuerdo con la presente invención se puede
determinar la expresión de estas variantes de gen de mARN mediante,
pero no limitado a, RT-PCR. Utilizando los reactivos
TRIZOL (Life Technology), se puede aislar ARN total de las muestras
de pacientes. La muestra de tejido (por ejemplo muestras de biopsia)
se convierten en polvo bajo nitrógeno líquido antes de
homogenización. La pureza del ARN y la integridad se evalúan
mediante absorbancia a 260/280 nm y mediante electroforesis de
agarosa. Se puede designar uno de los cebadores para amplificar el
tamaño esperado de los fragmentos PCR PPEF-1V. Por
ejemplo, uno de los cebadores es un fragmento de las secuencias
(fragmento A) o un fragmento complementario a las secuencias
(fragmento B) que contienen los genes objetivos: nucleótidos
127-128 de PPEF-1V; el otro es un
fragmento de las secuencias PPEF-1V designado en
cualquier ubicación en la dirección 5' del "fragmento B" o un
fragmento complementario a las secuencias PPEF-1V
designado en cualquier ubicación en la dirección 3' del "fragmento
A". Alternativamente, se designa un cebador en cualquier
ubicación en la dirección 5' del nucleótido 127 del
PPEF-1V y otro se designa en cualquier ubicación
complementaria a una porción en la dirección 3' del nucleótido 128
de PPEF-1V. La longitud del fragmento PCR del
PPEF-1V será de 350 bp más cortas que aquella del
PPEF-1. Los fragmentos PCR se analizan en un gel de
1% de agarosa utilizando 5 microlitros (10%) de productos
amplificados. La intensidad de las señales se puede determinar al
utilizar el programa Molecular Analyst (Versión 1.4.1;
Bio-Rad). Así, el índice de los niveles de
expresión relativos para cada producto PCR coamplificado se puede
calcular basado en las intensidades de señal.
Se puede desarrollar el experimento
RT-PCR de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Boehringer Mannheim). Una mezcla de reacción de 50
\mul que contiene un total de 2 \mul de ARN (0.1 \mug
/\mul), 1 \mul de cada cebador (20 pM), 1 \mul de cada dNTP
(10 mM), 2.5 \mul de solución DTT (100 mM), 10 \mul de
amortiguador 5X RT-PCR, 1 \mul de mezcla de
enzima, y 28.5 \mul de agua destilada estéril se pueden someter a
las condiciones tal como transcripción inversa a 60ºC durante 30
minutos seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 2
minutos, hibridación a 60ºC durante 2 minutos, y extensión a 68ºC
durante 2 minutos. Se puede repetir el análisis
RT-PCR dos veces para asegurar la reproductibilidad,
para un total de tres experimentos independientes.
También se puede analizar la expresión de
variantes génicas utilizando el método de hibridación Northern Blot.
El fragmento específico del PPEF-1V se puede
amplificar mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR)
utilizando un conjunto de cebadores diseñado para
RT-PCR. El fragmento amplificado PCR se puede marcar
y puede servir como una sonda para hibridar las membranas que
contienen el ARN total extraído de las muestra bajo condiciones de
55ºC en una solución de hibridación adecuada durante 3 horas. Los
blot se pueden lavar dos veces en 2 x SSC, 0.1% SDS a temperatura
ambiente durante 15 minutos cada uno, seguido por dos lavadas en 0.1
x SSC y 0.1% SDS a 65ºC durante 20 minutos cada uno. Después de
estas lavadas, el blot se puede enjuagar brevemente en amortiguador
de lavado y se puede incubar en solución de bloqueado durante 30
minutos. Luego el blot se puede incubar en solución de anticuerpo
adecuada durante 30 minutos. Los blot se pueden lavar en
amortiguador de lavado durante 30 minutos y equilibrar en
amortiguador de detección adecuado antes de detectar las señales.
Alternativamente, se puede detectar la presencia de variantes
génicas (cADN o PCR) utilizando el método de micro ensayo. Los
productos de PCR o cADN que corresponden a las secuencias de
nucleótidos de la presente invención se pueden inmovilizar en un
sustrato adecuado tal como un porta objetos. La hibridación se puede
desarrollar utilizando mARN etiquetado extraído de las muestras.
Después de hibridación, se remueve el mARN no hibridado. La
abundancia relativa de cada transcrito etiquetado, que hibrida a un
producto cADN/PCR inmovilizado en el micro ensayo se puede
determinar al analizar las imágenes exploradas.
De acuerdo con la presente invención, se puede
determinar la presencia del polipéptido del PPEF-1V
mediante, pero no limitado a, el inmunizado que utiliza el
anticuerpo que une específicamente al polipéptido. Los polipéptidos
de las variantes génicas se pueden expresar en celular procariótica
al utilizar vectores de expresión procariótico adecuados. Los
fragmentos de cADN de PPEF-1V se pueden amplificar
por PCR utilizando el conjunto de cebador A con sitios de digestión
de restricción incorporados en los extremos 5' y 3',
respectivamente. Los productos PCR se pueden digerir mediante
enzimas, purificar, e insertar en los sitios correspondientes del
vector de expresión procariótico en cuadro para generar los
plásmidos recombinantes. La fidelidad de la secuencia de este ADN
recombinante se puede verificar mediante secuenciación. Los
plásmidos recombinantes procarióticos se pueden transformar en
células anfitrionas (por ejemplo, E. coli BL21 (DE3)). La
síntesis de proteína recombinante se puede estimular mediante la
adición de 0.4 mM de isopropiltigaloctosida (IPTG) durante 3 horas.
Se pueden purificar proteínas expresadas bacterialmente.
El polipéptido de la variante génica se puede
expresar en células animales al utilizar vectores de expresión
eucarióticos. Las células se pueden mantener en medio Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bobino
fetal (FBS; Gibco BRL) a 37ºC en una atmosfera de 5% de CO_{2}
humidificado. Antes de la transfección, la secuencia de nucleótido
de cada variante génica se puede amplificar con cebadores PCR que
contienen ciclos de digestión de enzima de de restricción y se ligan
en los sitios correspondientes del vector de expresión eucariótica
en cuadro. La fidelidad de la secuencia de este ADN recombinante se
puede verificar mediante secuenciación. Las células se pueden
colocar en platos de 12 pozos un día antes de transfección a una
densidad de 5 x 10^{4} células por pozo. La transfección se puede
llevar a cabo utilizando reactivo de transfección Lipofectaminutese
Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gibco BRL).
Tres horas luego de transfección, el medio que contiene los
complejos se puede reemplazar con medio fresco. Después de 48 de
incubación, las células se puede raspar en amortiguador de lisis
(0.1 M Tris HCl, pH 8.0, 0.1% Triton
X-100)para purificación de las proteínas
expresadas. Después que se purifiquen estas proteínas, los
anticuerpos monoclonales contra estas proteínas purificadas
(PPEF-1V) se pueden generar utilizando técnicas de
hibridoma de acuerdo con los métodos convencionales (de StGroth and
Scheidegger, (1980) J Immunol Methods 35:1-21; Cote
et al. (1983) Proc Natl Acad Sci U S A
80:2026-30; and Kozbor et al. (1985) J
Immunol Methods 81:31-42).
De acuerdo con la presente invención, la
presencia de los polipéptidos del PPEF-1V en las
muestra del linfoma linfoblástico de células T se puede determinar
mediante, pero no limitado a, análisis Western blot. Las proteínas
extraídas de las muestras se pueden separar mediante
SDS-PAGE y transferir a membranas adecuadas tal como
difloruro polivinilideno (PVDF) en amortiguador de transferencia
(25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 192 mM glicina, 20%
metanol) con un aparato Tans-Blot durante 1 hora a
100V (por ejemplo, Bio-Rad). Las proteínas se pueden
inmunotransferir con anticuerpos específicos. Por ejemplo, la
transferencia de membranas con proteínas extraías se pueden
bloquear con amortiguadores adecuados tal como 3% de solución de BSA
o 3% de solución de leche en polvo baja en grasa en amortiguador
TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1%
Tween 20) y se incuba con anticuerpo monoclonal dirigido contra los
polipéptidos de las variantes génicas. El anticuerpo no unido se
remueve al lavar con TBST durante 5 X 1 minutos. El anticuerpo unido
se puede detectar utilizando reactivos de detección de
inmunotransferencia Western ECL.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
ilustración, pero no para limitar la invención.
Etiquetas de secuencia expresadas (EST)
generadas de secuenciamiento de base PCR a gran escala del extremo
5' de los clones de cADN de linfoma linfoblástico de células T
humanas se compilan y sirven como bases de datos EST. Las
comparaciones de secuencia contra las bases de datos de proteínas y
nucleótidos no redundantes se desarrollan utilizando programas
BLASTN y BLASTX, en el Centro Nacional para Información de
Biotecnología (NCBI) con un corte de significancia de
p<10^{-10}. El EST representa el gen PPEF-1V
putativo que se identifica durante el curso de la generación
EST
Se aísla un clon cADN que exhibe la secuencia
EST similar al gen PPEF-1 de la colección de cADN de
linfoma linfoblástico de células T y se denomina
PPEF-1V.los insertos de estos clones se cortan
posteriormente in vivo del vector de expresión \lambdaZAP
utilizando el sistema fago auxiliar ExAssist/XLOLR (Stratagene). Se
cortan las partículas de fagémido mediante coinfección de células
XL1-BLUE MRF' con el fago auxiliar ExAssist. Los
fagémidos pBluescript cortados se utilizan para infectar células
E. coli XLOLR, que les falta el supresor ámbar necesario
para la replicación de fago ExAssist. Se seleccionan células XLOLR
infectadas utilizando resistencia a la canamicina. Las colonias
resultantes contienen el vector fagémido bicatenario con el inserto
de cADN clonado. Se hace crecer una colonia sencilla durante la
noche en LB-canamicina, y se purifica el ADN
utilizando el equipo de purificación de plásmido
Qiagen.
Qiagen.
Se secuencia el ADN fagémido utilizando el
equipo de secuenciamiento de ciclo terminador de Taq
dye-dedoxi para el sistema de secuenciamiento
Applied Biosystems 377 (PerkinElmer Life Sciences). Utilizando el
método de cebador-"walking", se determina la secuencia de
longitud completa. Se desarrollan búsquedas de nucleótidos y
proteínas utilizando BLAST contra la base de datos no redúndate de
NCBI.
La secuencia codificación para cada clon de cADN
se busca contra la base de datos de secuencia dbEST utilizando el
algoritmo BLAST en el sitio de red NCBI. El EST derivado de cada
tejido se utiliza como una fuente de información para análisis de
expresión de regido transcrito. La distribución de tejido para clon
de cADN aislado se determina mediante coincidencias de EST con
aquella variante de secuencia partículas (inserciones o
eliminaciones) con un corte de significación p<10^{-10}.
Se conduce el patrón de expresión del
PPEF-1V en estirpe celulares humanas utilizando
RT-PCR. las estirpes celulares humanas son WI38
(pulmón, feto); A549 (adenocarcinoma de pulmón); H661 (carcinoma
macrocítico, pulmón); H520 (carcinoma de célula escamosa, pulmón);
H209 (carcinoma microcítico, pulmón); JHH-4
(Hepatoma); SUP-T1 (linfoma linfoblástico de
células T); Daudi (linfoma de Burkitt); Ramos (linfoma de Burkitt);
RAJI (linfoma de Burkitt); ZR75-1 (carcinoma de
mama); MDAMB-231 (adenocarcinoma de mama); Hs 578T
(carcinoma de mama); G5T/VGH (Glioblastoma multiforme); TSGH9201
(carcinoma Gástrico); Ca Ski (carcinoma epidermoide de cuello
uterino); Hela S3 (carcinoma epiteloide cervical); COLO 320 HSR
(adenocarcinoma de colon); SW620 (Adenocarcinoma); TSGH8301
(carcinoma de vejiga urinaria); ES-2 (carcinoma de
ovario); DU145 (carcinoma de próstata y cerebro); MIA
paca-2 (carcinoma pancreático); CE48T/VGH (carcinoma
epidermoide de esófago); CE81T/VGH (carcinoma de esófago bien
diferenciado escamoso); HL-CZ (leucemia
promonocítica); Hs 181.tes (testículo normal). La pureza e
integridad del ARN total extraído de cada una de las estirpes
celulares se evalúa mediante absorbancia a 260/280 nm y mediante
electroforesis de gel de agarosa. Los cebadores directos e inversos
para PPEF-1V fueron:
5'-CTGACACATATACTTCATGCCC-3' y
5'-CACACAGGATCATTAGGATCTC-3'. Los
tamaños esperados de los fragmentos PPEF-1V PCR
fueron de 265bp.
Se utiliza deshidrogenasa de
gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH);
número de acceso. M33197) para control interno. Los cebadores
directos e inversos para GAPDH fueron:
5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3' y
5'-GTGTCGCTG
TTGAAGTCAGA-3'. El tamaño esperado de los fragmentos GAPDH PCR fue 472 bp. en resumen, una mezcla de reacción de 50 \mul que contiene 2 \mul total de ARN (0.1 \mug/\mul), 1 \mul de cada cebador (20 pM), 1 Pl de cada dNTP (10 mM), 2.5 \mul de solución de DTT (100 mM), 10 \mul de 5X de amortiguador RT-PCR, 1 \mul de mezcla de enzima y 28.5 \mul de agua redestilada estéril se someten a transcripción inversa a 60ºC durante 30 minutos seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, se realiza hibridación a 60ºC durante 2 minutos, y extensión a 68ºC durante 2 minutos. Cinco microlitros (10%) de los productos amplificados mezclados con 1 \mul de amortiguador de carga se separan en un 1% de gel de agarosa horizontal con bromuro de etidio en amortiguador 0.5X TAE. Se realiza electroforesis al gel en 100 V durante 45 minutos. La Figura 5 muestra que el mARN PPEF-1V solo se expresa altamente en la estirpe celular de linfoma linfoblástico de célula T lo que sugiere que el PPEF-1V se puede utilizar para diagnosticar el linfoma de célula T, en particular, el linfoma linfoblástico de célula T. Mostrado a la izquierda aparecen los marcadores de escalera de ADN de 100 bp.
TTGAAGTCAGA-3'. El tamaño esperado de los fragmentos GAPDH PCR fue 472 bp. en resumen, una mezcla de reacción de 50 \mul que contiene 2 \mul total de ARN (0.1 \mug/\mul), 1 \mul de cada cebador (20 pM), 1 Pl de cada dNTP (10 mM), 2.5 \mul de solución de DTT (100 mM), 10 \mul de 5X de amortiguador RT-PCR, 1 \mul de mezcla de enzima y 28.5 \mul de agua redestilada estéril se someten a transcripción inversa a 60ºC durante 30 minutos seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, se realiza hibridación a 60ºC durante 2 minutos, y extensión a 68ºC durante 2 minutos. Cinco microlitros (10%) de los productos amplificados mezclados con 1 \mul de amortiguador de carga se separan en un 1% de gel de agarosa horizontal con bromuro de etidio en amortiguador 0.5X TAE. Se realiza electroforesis al gel en 100 V durante 45 minutos. La Figura 5 muestra que el mARN PPEF-1V solo se expresa altamente en la estirpe celular de linfoma linfoblástico de célula T lo que sugiere que el PPEF-1V se puede utilizar para diagnosticar el linfoma de célula T, en particular, el linfoma linfoblástico de célula T. Mostrado a la izquierda aparecen los marcadores de escalera de ADN de 100 bp.
Todas las referencias se enumeran para la
conveniencia del lector.
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and comparative analysis of nine Fugu genes: conservation of synteny
with human chromosome Xp22.2-p22.1. Genome
Res. 9: 437-48, (1999).
Ramulu and Nathans, Cellular and
subcellular localization, N-terminal acylation, and
calcium binding of Caenorhabditis elegans protein phosphatase with
EF-hands. J Biol Chem. 276:
25127-35, (2001).
Sherman et al. Identification and
characterization of a conserved family of protein serine/threonine
phosphatases homologous to Drosophila retinal degeneration C.
Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 11639-44,
(1997).
<110> visgeneer Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VARIANTE GENÉTICA RELACIONADA CON
FOSFATASA DE PROTEÍNA HUMANA CON MANOS EF
-1(PPEF-1) ASOCIADA CON LINFOMA
LINFOBLÁSTICO DE CÉLULAS T
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ninguno
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (17)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
variante de eliminación de terminal N de la proteína
PPEF-1 que comprende la secuencia de aminoácido de
la SEQ ID NO: 4, en donde en el terminal N de la secuencia de
aminoácido de la SEQ ID NO: 4 adicionalmente no está presente la
secuencia de proteína.
2. Un ácido nucleico aislado que codifica dicho
polipéptido de la Reivindicación 1.
3. El ácido nucleico aislado de la
Reivindicación 2, que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ
ID NO: 3.
4. Un ácido nucleico aislado que comprende por
lo menos 30 nucleótidos consecutivos seleccionados de la SEQ ID NO:
3 y que incluye un di-nucleótido de los nucleótidos
127 a 128 de la SEQ ID NO: 3.
5. Un vector de expresión que comprende el ácido
nucleico de una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4.
6. Una célula anfitriona que comprende dicho
vector de expresión de la Reivindicación 5.
7. Un método para producir el polipéptido de la
Reivindicación 1, que comprende las etapas de:
- (1)
- cultivar la célula anfitriona de la Reivindicación 6 bajo una condición adecuada para la expresión de un polipéptido de variante PPEF; y
- (2)
- recuperar dicho polipéptido de variante PPEF a partir del cultivo de la célula anfitriona.
8. Un anticuerpo que une específicamente a dicho
polipéptido de la Reivindicación 1.
9. El anticuerpo de la Reivindicación 8, que es
un anticuerpo policlonal o monoclonal.
10. Un método para detectar la presencia de un
ácido nucleico PPEF en un mamífero, que comprende las etapas
de:
- (1)
- extraer el ARN total de una muestra obtenida de dicho mamífero;
- (2)
- amplificar dicho ARN mediante reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) para obtener una muestra de cADN;
- (3)
- hibridar dicha muestra de cADN con el ácido nucleico de una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4; y
- (4)
- detectar dicha hibridación.
11. El método de la Reivindicación 10, en donde
dicho proceso de hibridación se conduce mediante Northern blot o
microensayo para diagnosticar una pluralidad de cánceres.
12. El método de la Reivindicación 11, en donde
dicha pluralidad de cánceres incluye el linfoma de célula T.
13. El método de la Reivindicación 12, en donde
dicho linfoma de célula T es linfoma linfoblástico de célula T.
14. Un método para detectar la presencia de un
polipéptido PPEF o fragmento del mismo en un mamífero que comprende
las etapas de:
- (a)
- poner en contacto las proteínas obtenidas de una muestra de un mamífero con un anticuerpo que une específicamente a un polipéptido PPEF o un fragmento del mismo de la SEQ ID NO: 4 pero no de la SEQ ID NO: 2; y
- (b)
- detectar dicha unión de antígeno PPEF a anticuerpo.
15. El método de la Reivindicación 14, en donde
dichas muestras de unión de antígeno PPEF a anticuerpo se detectan
mediante el método Western blot para ayudar a diagnosticar una
pluralidad de cánceres.
16. El método de la Reivindicación 15, en donde
dicha pluralidad de cánceres incluyen linfoma de célula T.
17. El método de la Reivindicación 16, en donde
dicho linfoma de célula T es linfoma linfoblástico de célula T.
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| EP06019930A EP1903109B8 (en) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | Human protein phosphatase with EF-hands-1(PPEF-1)-related gene variant associated with T-cell lymphoblastic lymphoma |
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| ES06019930T Active ES2342482T3 (es) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | Variante genetica relacionada con fosfatasa de proteina humana con manos ef-1 (ppef-1) asociada con linfoma linfoblastico de celulas t. |
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| EP1903109B8 (en) | 2010-12-15 |
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