ES2663075T3 - Detección de dinoflagelados productores de saxitoxina - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, comprendiendo el método: obtener una muestra para su uso en el método; y analizar la muestra para detectar la presencia de uno o más de un polinucleótido de dominio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido; en el que: el dominio catalítico de saxitoxina se selecciona de: dominio catalítico de saxitoxina A4 o un fragmento de un dominio catalítico de saxitoxina A4; y la presencia de dicho polinucleótido o polipéptido indica la presencia de un dinoflagelado productor de saxitoxina en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de dinoflagelados productores de saxitoxina 5 Campo técnico
La invención se refiere en general al campo de las saxitoxinas y a la identificación de microorganismos capaces de producirlas. Más específicamente, la invención se refiere a la identificación de genes que codifican saxitoxina en dinoflagelados, y a métodos para la detección específica de dinoflagelados que son productores de saxitoxinas.
10
Antecedentes
La saxitoxina (STX) es una potente neurotoxina que se produce en entornos acuáticos de todo el mundo y tiene importantes repercusiones económicas, ambientales y para la salud humana. La ingesta de especies vectores puede 15 conducir una intoxicación paralizante por mariscos, una enfermedad humana grave que puede provocar parálisis y muerte. Se estima que cada año se producen 2.000 casos de intoxicación paralizante por mariscos en seres humanos, con una tasa de mortalidad del 15%. Los costes de la monitorización y mitigación de STX han llevado a una pérdida económica anual por proliferaciones dañinas de plancton calculadas en 895 millones de dólares americanos. En entornos de agua dulce, STX se produce predominantemente por cianobacterias procariotas. Sin 20 embargo, en entornos marinos los dinoflagelados eucariotas se han asociado con la presencia de STX. A pesar de la asociación de varias especies de dinoflagelados con la producción de STX, la base genética para la producción de STX en estos microorganismos sigue sin concretarse.
Existe la necesidad de métodos para detectar la presencia (o ausencia) de dinoflagelados productores de STX en 25 muestras marinas.
Resumen de la invención
Varios estudios han intentado sin éxito identificar genes y/o enzimas de la ruta de STX en dinoflagelados por 30 caracterización enzimática, enfoques de PCR, análisis in silico de bibliotecas de etiquetas de secuencias expresadas (EST), o el uso de otras secuencias de nucleótidos disponibles públicamente. Además, varios estudios anteriores han sugerido que STX de hecho puede no ser producido por dinoflagelados, sino por bacterias cocultivadas.
Los presentes inventores han determinado que los dinoflagelados son de hecho productores de STX y han 35 identificado genes responsables de la producción de STX en estos microorganismos. La identificación de genes responsables de la producción de STX proporciona una base para numerosas pruebas moleculares para detectar dinoflagelados productores de STX tanto en agua dulce como en entornos marinos.
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en 40 una muestra, comprendiendo el método:
obtener una muestra para su uso en el método, y
analizar la muestra para detectar la presencia de uno o más de un polinucleótido de saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido,
45 en el que el dominio catalítico de saxitoxina se selecciona de: dominio catalítico de saxitoxina A4 o un
fragmento de un dominio catalítico de saxitoxina A4; y
la presencia de dicho polinucleótido o polipéptido indica la presencia de un dinoflagelado productor de saxitoxina en la muestra.
50 En una realización del primer aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos de saxitoxina A seleccionada de las expuestas en cualquiera de las SEQ ID NOS: 230-242 o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
En una realización del primer aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia de dominio catalítico de 55 saxitoxina A4, o un fragmento de la misma.
En una realización del primer aspecto, la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4 o fragmento de la misma comprende los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante
de cualquiera de las secuencias.
En una realización del primer aspecto, la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4 o fragmento de la misma consiste en los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, los 5 nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
En una realización del primer aspecto, el análisis comprende la amplificación de polinucleótidos de la muestra mediante reacción en cadena de la polimerasa.
10
En una realización del primer aspecto, la reacción en cadena de la polimerasa utiliza uno o más cebadores que comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
15 En una realización del primer aspecto, la reacción en cadena de la polimerasa utiliza uno o más cebadores que consisten en una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
En una realización del primer aspecto, la reacción en cadena de la polimerasa utiliza uno o más cebadores que 20 comprenden o consisten en una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 198-199, 228-229 y 243244, o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
En una realización del primer aspecto, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de saxitoxina A expuesta en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
25
En una realización del primer aspecto, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de saxitoxina A expuesta en la SEQ ID NO: 2 o sEq ID NO: 4, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
En una realización del primer aspecto, el dinoflagelado productor de saxitoxina es del género Alexandrium, 30 Pyrodinium o Gymnodinium.
En una realización del primer aspecto, el dinoflagelado productor de saxitoxina se selecciona del grupo que consiste en A. catenella, A. fundyense, A lusitanicum, A. minutum, A. ostenfeldii, A. tamarense, G. catenatum, y P. bahamense var compressum.
35
En una realización del primer aspecto, dicho análisis se realiza usando un par de cebadores del decimoprimer o decimosegundo aspecto.
En un tercer aspecto, la divulgación proporciona un kit para la detección de un dinoflagelado productor de saxitoxina 40 en una muestra, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de un polinucleótido de saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido.
En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona un kit para determinar la ausencia de un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de un polinucleótido 45 de saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente se une específicamente a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de saxitoxina A seleccionada de las expuestas en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 230-242 o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
50
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente se une específicamente a una secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4, o un fragmento de la misma.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4 o fragmento de la 55 misma comprende los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4 o fragmento de la
misma consiste en los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
5 En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente es un cebador, sonda o anticuerpo.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente es un cebador que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
10 En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente es un cebador que consiste en una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente es un cebador que comprende o consiste en una secuencia expuesta en una cualquiera de las SeQ ID NOs: 198-199, 228-229 y 243-244, o un fragmento o variante de una 15 cualquiera de esas secuencias.
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el agente se une específicamente a una secuencia de aminoácidos de saxitoxina A expuesta en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
20
En una realización del tercer o cuarto aspecto, el kit comprende dos agentes, en el que los dos agentes son un par de cebadores del decimoprimer o decimosegundo aspecto.
En una realización del primer, segundo, tercer o cuarto aspecto, la muestra es una muestra ambiental.
25
En una realización del primer, segundo, tercer o cuarto aspecto, la muestra es una muestra de agua salada.
En una realización del primer, segundo, tercer o cuarto aspecto, la muestra es una muestra de agua dulce.
30 En una realización del primer, segundo, tercer o cuarto aspecto, la muestra es una muestra marina.
En un quinto aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia expuesta en
la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento de la misma.
35 En una realización del quinto aspecto, el polinucleótido aislado consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento de la misma.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, o una variante o fragmento de la misma.
40
En una realización del sexto aspecto, el polinucleótido aislado consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, o una variante o fragmento de la misma.
En un séptimo aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia expuesta 45 en cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 y 247 o una variante o fragmento de una cualquiera de esas secuencias.
En una realización del séptimo aspecto, el polinucleótido aislado consiste en la secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 y 247 o una variante o fragmento de una cualquiera de 50 esas secuencias.
En un octavo aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido aislado codificado por uno cualquiera de los polinucleótidos de acuerdo con el quinto, sexto o séptimo aspecto.
55 En un noveno aspecto, la divulgación proporciona un cebador o sonda que se une específicamente a un polinucleótido de acuerdo con el quinto, sexto o séptimo aspecto.
En un décimo aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con el octavo aspecto.
En un decimoprimer aspecto, la divulgación proporciona un par de cebadores para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, en donde dicho par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 198, o un fragmento o variante de la misma, y un 5 segundo cebador que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de la misma.
En una realización del decimoprimer aspecto, el par de cebadores comprende un primer cebador que consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 198, o un fragmento o variante de la misma, y un segundo cebador 10 que consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de la misma.
En un decimosegundo aspecto, la divulgación proporciona un par de cebadores para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, en donde dicho par de cebadores comprende:
un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 198 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 199; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 200 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 201; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 202 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 203; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 204 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 205; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 206 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 207; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 208 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 209; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 210 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 211; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 220 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 221; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 222 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 223; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 228 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 229; o un primer cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 243 y un segundo cebador que comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 244.
Breve descripción de los dibujos
40 Las realizaciones preferidas de la presente invención se describirán ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 es un diagrama que muestra la estructura de sxtA en dinoflagelados y cianobacterias. A. Estructura de transcripción de las transcripciones de sxtA en A. fundyense CCMP1719. B. Estructura 45 genómica de sxtA de C. raciborskii T3. C. Estructura de STX con enlaces y moléculas introducidas por sxtA
marcadas en negrita.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el contenido de GC de transcripciones de sxtA de A. fundyense y de genes cianobacterianos de sxtA. El contenido de GC se calculó cada 10 pb con un tamaño de ventana de 1000 pb.
50 La Figura 3 muestra un árbol filogenético de SxtA1. Representación esquemática, dibujada a escala (para
ver el árbol completo, véase la Figura 5). Se muestra la topología de probabilidad máxima. Los números en los nodos representan valores bootstrap de máxima probabilidad y análisis bayesianos, respectivamente.
La Figura 4A muestra un árbol filogenético de SxtA4. Representación esquemática, dibujada a escala (para ver el árbol completo, véase la Figura 6). Se muestra la topología de probabilidad máxima. Los números en 55 los nodos representan valores bootstrap de máxima probabilidad y análisis bayesianos, respectivamente.
La Figura 4B es un gráfico que muestra el número de copias genómicas de sxtA4 en ACSH02 de A. catenella en tres puntos temporales diferentes durante el ciclo de crecimiento.
La Figura 5 muestra un árbol filogenético de SxtA1. Se muestra la topología de probabilidad máxima. Los números en los nodos representan valores bootstrap de máxima probabilidad y análisis bayesianos,
15
20
25
30
35
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
respectivamente. Las secuencias en negrita son secuencias derivadas de transcripción; ya sean generadas usando RACE o son cóntigos del ensamblaje de lectura 454.
La Figura 6 muestra un árbol filognético de SxtA4. Se muestra la topología de probabilidad máxima. Los números en los nodos representan valores bootstrap de máxima probabilidad y análisis bayesianos, respectivamente. Las secuencias en negrita son secuencias derivadas de transcripción; ya sean generadas usando RACE o son cóntigos del ensamblaje de lectura 454.
La Figura 7 es un mapa que muestra sitios de muestreo de fitoplancton y S. glomerata a los que se hace referencia en el Ejemplo 2. A. Nueva Gales del Sur, Australia, y los tres estuarios en los que se tomaron muestras de proliferaciones: B. Agua de Brisbane, C. el río Georges y D. Wagonga Inlet. La barra de escala en D representa 1 km en los mapas insertados B, C y D.
La Figura 8 es un gráfico que muestra una curva estándar del par de cebadores de sxtA4 basado en diluciones de ADN a partir de números conocidos de células de tres cepas de Alexandrium catenella que crecen exponencialmente. El ensayo se probó usando concentraciones de ADN que representan 30-2600 células en las diferentes cepas.
La Figura 9 proporciona dos gráficos que muestran la abundancia de copias génicas de sxtA4 (eje y primario) y estimaciones de células de Alexandrium catenella (eje y secundario) en base a los recuentos de identificaciones de células microscópicas y qPCR usando un par de cebadores de ADNr LSU en A. río Georges y B. sitios de muestreo de Wagonga Inlet, durante noviembre de 2010.
La Figura 10 proporciona un gráfico que muestra el número o las copias de sxtA4 l-1 y las células de Alexandrium catenella, según se determina usando un recuento manual bajo los microscopios ópticos, cada semana en el sitio de muestreo.
La Figura 11 proporciona un gráfico que muestra una ecuación de regresión entre la abundancia de células de Alexandrium catenella y las copias de sxtA4.
La Figura 12 muestra imágenes SEM de Alexandrium tamarense ATNWB01. A) Vista ventral, con membrana celular intacta, que muestra el tamaño y la forma general de la célula, barra de escala = 5 pm, B) Vista dorsal, con membrana celular intacta, que muestra la forma de la célula, barra de escala = 10 pm, C) Epicono en vista apical que muestra APC y poro en placa de 1', barra de escala = 5 pm, D) Hipocono en vista antapical, que muestra patrones de placa, barra de escala = 10 pm, E) Complejo de poros apicales, que muestra la forma de la coma, F) Placa sulcal posterior, que muestra el poro, barra de escala = 2 pm La Figura 13 muestra imágenes SEM de cepas de Alexandrium tamarense ATCJ33, ATEB01 y ATBB01 (para comparación, tomadas de Hallegraeff et al 1991). AD, ATCJ33, A) ATCJ33 que muestra una cadena de 2 células, y tamaño y forma general de la célula, barra de escala = 10 pm, B) Primera placa apical, que muestra poro ventral, C) APC, que muestra la forma de la coma, D) Primera placa apical que muestra el poro ventral, E, F, H ATEB01. E) ATEB01 que muestra el tamaño y la forma general de las células, barra de escala = 10 pm, F) ATEB01, primera placa apical que muestra el poro ventral, G) ATBB01 que muestra el poro ventral y APC, H) ATEB01 que muestra la APC.
La Figura 14 muestra la filogenia concatenada de ADNr 18S+ITS1-5.8S-ITS2+28S del complejo A. tamarense (2821 caracteres). El árbol se reconstruye con inferencia bayesiana (Phylobayes). Los números en los nodos internos representan la probabilidad posterior y los valores bootstrap (>50%) para Phylobayes y RAxML (ordenado; Phylobayes/RaxML). Los círculos de color negro indican un valor de probabilidad posterior de 1.00 y bootstrap >90%. Los clados del grupo 1-4 se han colapsado, para una versión expandida de la filogenia, véase
La Figura 15 es un perfil de toxina de ATNWB01 usando HPLC, se determinaron los picos indicados contra los estándares de toxinas de PSP.
La Figura 16 muestra la filogenia concatenada de ADNr 18S+ITS1-5.8S-ITS2+28S del complejo A. tamarense (2821 caracteres). El árbol se reconstruye con inferencia bayesiana (Phylobayes). Los números en los nodos internos representan la probabilidad posterior y los valores bootstrap (>50%) para Phylobayes y RAxML (ordenado; Phylobayes/RaxML). Los círculos de color negro indican un valor de probabilidad posterior de 1.00 y bootstrap >90%.
Definiciones
Como se usa en esta solicitud, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un dinoflagelado" también incluye una pluralidad de dinoflagelados.
Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" significa "que incluye". Las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprender" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados. Por lo tanto, por ejemplo, un polinucleótido "que comprende" una secuencia que codifica una proteína
puede consistir exclusivamente en esa secuencia o puede incluir una o más secuencias adicionales.
Como se usa en el presente documento, el término "saxitoxina" incluye saxitoxina pura y análogos de la misma, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen neosaxitoxina (neoSTX), gonyautoxinas (GTX), descarbamoilsaxitoxina 5 (dcSTX), análogos no sulfatados, análogos mono-sulfatados, análogos disulfatados, análogos descarbamoilados y análogos hidrófobos.
Cualquier descripción de los documentos de la técnica anterior en el presente documento, o declaraciones en el presente documento derivadas o basadas en estos documentos, no es una admisión de que los documentos o 10 declaraciones derivadas sean parte del conocimiento general común de la técnica relevante.
Descripción detallada
Los presentes inventores han determinado que los dinoflagelados son productores de saxitoxina (STX) y han 15 identificado genes responsables de la producción de STX en estos microorganismos. En base a este descubrimiento, los inventores han desarrollado un ensayo capaz de discernir entre especies de dinoflagelados productores de STX y especies de dinoflagelados que no producen STX.
Por consiguiente, ciertos aspectos de la invención se refieren a la provisión de secuencias polinucleotídicas y 20 polipeptídicas de STX presentes en dinoflagelados.
También se proporcionan métodos para la detección de dinoflagelados productores de STX en una muestra dada en base a la detección de la presencia (o ausencia) de una o más secuencias de la invención en la muestra.
25 También se proporcionan kits para la detección de dinoflagelados productores de STX en una muestra dada que comprende uno o más agentes para detectar la presencia (o ausencia) de una o más secuencias de la invención en la muestra.
Polinucleótidos y polipéptidos
30
Se divulgan en el presente documento secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de saxitoxina de dinoflagelado ("polinucleótidos de la invención" y "polipéptidos de la invención", respectivamente). Los polinucleótidos de la invención pueden ser ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o ácidos desoxirribonucleicos complementarios (ADNc).
35
En ciertas realizaciones, las secuencias son secuencias de polinucleótidos del gen de saxitoxina A (sxtA) o secuencias de polipéptido de saxitoxina A (STXA).
Las secuencias de polinucleótidos de sxtA pueden comprender uno o más dominios catalíticos del gen sxtA (es 40 decir, los dominios catalíticos sxtAI, sxtA2, sxtA3 o sxtA4), o uno o más fragmentos de los mismos. A modo de ejemplo no limitante únicamente, la secuencia sxtAI puede definirse por los nucleótidos 160-1821 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 1) o los nucleótidos 277-2022 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3). La secuencia sxtA2 puede definirse por los nucleótidos 1837-2415 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el 45 GenBank número de acceso jF343238 (SEQ ID NO: 1) o los nucleótidos 2038-2604 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3). La secuencia sxtA3 puede definirse por los nucleótidos 2479-2694 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 1) o los nucleótidos 2722-2949 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3). La secuencia sxtA4 puede definirse por los nucleótidos 50 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3) o los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3).
Otros ejemplos no limitantes de secuencias de polinucleótidos del gen sxtA de la invención incluyen los 55 proporcionados en el GenBank número de acceso JF343238 y JF343239 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3).
Las secuencias polipeptídicas de STXA pueden comprender uno cualquiera o más dominios catalíticos de proteína STX (es decir, los dominios catalíticos STXA1, STXA2, STXA3 o STXA4) o uno o más fragmentos de los mismos. A modo de ejemplo no limitante únicamente, la secuencia STXA1 puede definirse por los residuos de aminoácidos 1-
554 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2) o los residuos de aminoácidos 1-582 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4). La secuencia STXA2 puede definirse por los residuos de aminoácidos 560-752 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2) o los residuos de aminoácidos 5 588-776 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4). La secuencia STXA3 puede definirse por los residuos de aminoácidos 774-845 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2) o los residuos de aminoácidos 816-891 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4). La secuencia STXA4 puede definirse por los residuos de aminoácidos 947-1281 de la secuencia polipeptídica expuesta en el 10 GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4).
Otros ejemplo no limitantes de secuencias de polipéptidos STX de la invención incluyen las proporcionadas en el GenBank número de acceso JF343238 y JF343239 (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4).
15 Preferiblemente, las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas son de dinoflagelados productores de saxitoxina. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas pueden ser de dinoflagelados del orden Gonyaulacales o Gymnodiniales. Preferiblemente, los dinoflagelados son del género Alexandrium (anteriormente Gonyaulax), Pyrodinium o Gymnodinium.
20 Los ejemplos no limitantes de especies Alexandrium preferidas incluyen A. catenella (por ejemplo, las cepas ACCC01, ACSH02, ACTRA02 y CCMP1493), A. fundyense (por ejemplo, las cepas CCMP1719 y CCMP1979), A lusitanicum, A. minutum (por ejemplo, las cepas CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 y AMD16/AMAD16), A. ostenfeldii, y A. tamarense (por ejemplo, las cepas CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 y ATNWB01). Los ejemplos no limitantes de especies preferidas de Gymnodinium incluyen G. catenatum (por ejemplo, las cepas 25 GCTRA01 y CS-395). Los ejemplos no limitantes de especies preferidas de Pyrodinium incluyen P. bahamense var compressum.
Los fragmentos de ambos polinucleótidos de la invención y polipéptidos de la invención también se proporcionan en el presente documento.
30
Un "fragmento" de polinucleótido como se contempla en el presente documento es una molécula de polinucleótido que es un constituyente de un polinucleótido de la invención o variante del mismo. Los fragmentos de un polinucleótido no necesitan necesariamente codificar polipéptidos que retengan actividad biológica aunque esto no está excluido de ser el caso. En ciertas realizaciones, el fragmento puede ser útil como sonda de hibridación o 35 cebador de PCR. El fragmento puede derivarse escindiendo un polinucleótido de la invención o, como alternativa, puede sintetizarse por otros medios, por ejemplo, mediante síntesis química. Un fragmento de polinucleótido como se contempla en el presente documento puede ser de menos de aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud, menos de aproximadamente 4500 nucleótidos de longitud, o menos de aproximadamente 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25 o 15 nucleótidos de longitud. Adicionalmente, o 40 como alternativa, un fragmento de polinucleótido como se contempla en el presente documento puede tener más de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, más de aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, o más de aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 o 4000 nucleótidos de longitud. Adicionalmente o como alternativa, un fragmento de polinucleótido como se contempla en el presente documento puede tener entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, entre 45 aproximadamente 25 y aproximadamente 75 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, 100 y 250, 100 y 500, 250 y 500, 100 y 1000, 500 y 2000, 1000 y 2000 nucleótidos de longitud.
Los fragmentos de polinucleótidos de la invención comprenden fragmentos del gen sxtA. Por ejemplo, los 50 fragmentos de polinucleótidos de la invención pueden comprender uno cualquiera o más de los dominios catalíticos sxtA1, sxtA2, sxtA3 o sxtA4, o uno o más fragmentos de los mismos. Los fragmentos polipeptídicos de la invención comprenden fragmentos de la proteína STX. Por ejemplo, los fragmentos de polinucleótidos de la invención pueden comprender uno cualquiera o más de los dominios catalíticos de STXA1, STXA2, STXA3 o STXA4, o uno o más fragmentos de los mismos.
55
Los ejemplos específicos y no limitantes de los fragmentos de la secuencia de polinucleótidos del gen sxtA de la invención incluyen los proporcionados en el GenBank números de acceso JF343240 - JF343432 (SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 197), y los expuestos en las SEQ ID NOs: 224-227, 230-242 y 247.
Los ejemplos específicos y no limitativos adicionales de fragmentos de la secuencia de polinucleótidos del gen sxtA de la invención incluyen los definidos por los nucleótidos 3115-4121 y los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 3), y fragmentos y variantes de la misma.
5
Los ejemplos específicos y no limitantes de secuencias del dominio catalítico de sxtAI incluyen los expuestos en las SEQ ID NOs: 224-227 y 247.
Los ejemplos específicos y no limitantes de secuencias del dominio catalítico de sxtA4 incluyen los expuestos en las 10 SEQ ID NOs: 230-242.
Un "fragmento" polipeptídico como se contempla en el presente documento es una molécula polipeptídica que es un constituyente de un polipéptido de la invención o una variante del mismo. Típicamente, el fragmento posee actividad biológica cualitativa en común con el polipéptido del cual es un constituyente o aunque esto no sea necesariamente 15 requerido. Un fragmento de polipéptido como se contempla en el presente documento puede ser menor de aproximadamente 1500 residuos de aminoácidos de longitud, menor de aproximadamente 1400 residuos de aminoácidos de longitud, o menor de aproximadamente 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25 o 15 residuos de aminoácidos de longitud. Adicionalmente o como alternativa, un fragmento polipeptídico como se contempla en el presente documento puede ser de más de aproximadamente 15 20 residuos de aminoácidos de longitud, más de aproximadamente 25 residuos de aminoácidos de longitud, o más de aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, o 1300 residuos de aminoácidos de longitud. Adicionalmente o como alternativa, un fragmento polipeptídico como se contempla en el presente documento puede ser de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 residuos de aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de longitud, o entre 25 aproximadamente 15 y 75, 15 y 100, 15 y 150, 25 y 50, 25 y 100, 50 y 100, 50 y 150, 100 y 200, 100 y 250, 100 y 300, 100 y 500, 500 y 750, 500 y 1000, o 1000 y 1300 residuos de aminoácidos de longitud.
Los ejemplos específicos y no limitantes de fragmentos de secuencia de polipéptidos de STXA de la invención incluyen los definidos por los residuos de aminoácidos X-Y de la secuencia de polipéptidos expuesta en el GenBank 30 número de acceso JF343248 (SEQ ID NO: 3), los definidos por los residuos de aminoácidos 947-1281 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4), y fragmentos y variantes de la misma.
Las variantes de polinucleótidos de la invención y polipéptidos de la invención, y fragmentos de los mismos, también 35 se proporcionan en el presente documento.
Una "variante" como se contempla en el presente documento, se refiere a una secuencia sustancialmente similar. En general, dos secuencias son "sustancialmente similares" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (porcentaje de "identidad de secuencia"), en una región 40 específica o, cuando no se especifica, por toda la secuencia. Por consiguiente, una "variante" de una secuencia polinucleotídica y polipeptídica desvelada en el presente documento puede compartir al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia.
45 En general, las variantes de secuencias polipeptídicas poseen actividad biológica cualitativa en común. Las variantes de secuencia de polinucleótidos generalmente codifican polipéptidos que generalmente poseen actividad biológica cualitativa en común. También se incluyen dentro del significado del término "variante" los homólogos de los polinucleótidos de la invención y los polipéptidos de la invención. Un homólogo de polinucleótido es típicamente de una especie de dinoflagelado diferente pero que comparte sustancialmente la misma función o actividad biológica 50 que el polinucleótido correspondiente desvelado en el presente documento. Un homólogo de polipéptido es típicamente de una especie de dinoflagelado diferente pero que comparte sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido correspondiente desvelado en el presente documento. El término "variante" también incluye análogos de los polipéptidos de la invención. Un "análogo" polipeptídico es un polipéptido que es un derivado de un polipéptido de la invención, cuyo derivado comprende la adición, eliminación, sustitución de uno o 55 más aminoácidos, de tal forma que el polipéptido conserva sustancialmente la misma función. La expresión "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a una sustitución o reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades similares dentro de una cadena polipeptídica (secuencia primaria de una proteína). Por ejemplo, la sustitución del aminoácido cargado ácido glutámico (Glu) por el aminoácido cargado ácido aspártico (Asp) de manera similar sería una sustitución conservativa de aminoácidos.
Típicamente, los polinucleótidos y polipéptidos de la divulgación están "aislados". Se entenderá que el término "aislado" en este contexto significa que el polinucleótido o polipéptido se ha eliminado o no está asociado con algunos o ninguno de los demás componentes con los que se encontraría en su estado natural. Por ejemplo, un 5 polinucleótido "aislado" puede eliminarse de otros polinucleótidos de una secuencia de polinucleótidos mayor, o puede eliminarse de componentes naturales tales como polinucleótidos no relacionados. Asimismo, un polipéptido "aislado" se puede eliminar de otros polipéptidos de una secuencia polipeptídica más grande, o se puede eliminar de componentes naturales tales como polipéptidos no relacionados. En aras de la claridad, un polinucleótido "aislado" de polipéptido también incluye un polinucleótido o polipéptido que no se ha tomado de la naturaleza, sino que se ha 10 preparado de nuevo, tal como químicamente sintetizado y/o preparado por métodos recombinantes. Como se describe en el presente documento, un polipéptido aislado de la invención puede incluirse como una parte componente de un polipéptido o proteína de fusión más larga.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos de la divulgación se pueden clonar en un vector. El vector puede 15 comprender, por ejemplo, una secuencia de ADN, ARN o ADN complementario (ADNc). El vector puede ser un vector plasmídico, un vector viral, o cualquier otro vehículo adecuado adaptado para la inserción de secuencias extrañas, su introducción en células y la expresión de las secuencias introducidas. Típicamente, el vector es un vector de expresión y puede incluir secuencias de control y procesamiento de la expresión tales como un promotor, un potenciador, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación y secuencias de terminación de la 20 transcripción. La invención también contempla células huésped transformadas por dichos vectores. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención se pueden clonar en un vector que se transforma en una célula huésped bacteriana, por ejemplo, E. coli. Los métodos para la construcción de vectores y su transformación en células huésped se conocen generalmente en la técnica, y se describen en textos estándar tales como, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva 25 York; y Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.
Sondas, cebadores y anticuerpos
Los polinucleótidos de la divulgación incluyen derivados y fragmentos de los mismos para su uso como cebadores y 30 sondas.
Los derivados y fragmentos pueden estar en forma de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos son tramos cortos de residuos de nucleótidos adecuados para su uso en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos tales como PCR, siendo típicamente de al menos aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, 35 más típicamente de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, y aún más típicamente de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
En una realización, la sonda comprende o consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 245 o SEQ 40 ID NO: 246.
Las sondas son secuencias de nucleótidos de longitud variable, por ejemplo, entre aproximadamente 10 nucleótidos y varios miles de nucleótidos, para su uso en la detección de secuencias homólogas, típicamente por hibridación. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u 45 otros oligonucleótidos.
Los métodos para el diseño y/o la producción de sondas y/o cebadores de nucleótidos se conocen en la técnica, y se describen en textos estándar tales como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; y publicaciones tales como Itakura et al. (1984) Annu. 50 Rev. Biochem. 53: 323; Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Nueva York; Innis y Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies, Academic Press, Nueva York; y Innis y Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual, Academic Press, Nueva York.
Se pueden preparar cebadores y sondas de polinucleótidos, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química 55 tales como los métodos de fosfodiéster y fosfotriéster (véase, por ejemplo, Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109; y la Patente de Estados Unidos N.° 4356270), y el método de dietilfosforamidita (véase Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862).
Los polinucleótidos de la divulgación que incluyen las sondas y cebadores mencionados anteriormente, pueden
marcarse mediante la incorporación de un marcador para facilitar su detección. Las técnicas para marcar y detectar ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en textos estándar tales como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc. Los ejemplos no limitantes de marcadores adecuados incluyen moléculas fluorescentes (por ejemplo, acetilaminofluoreno, 5-bromodesoxiuridina, digoxigenina y fluoresceína) e 5 isótopos radiactivos (por ejemplo, 32P, 35S, 3H, 33P). La detección del marcador se puede lograr, por ejemplo, mediante técnicas químicas, fotoquímicas, inmunoquímicas, bioquímicas o espectroscópicas.
Las sondas y los cebadores se pueden usar, por ejemplo, para detectar o aislar dinoflagelados en una muestra de interés. En ciertas realizaciones, las sondas y cebadores pueden usarse para detectar dinoflagelados productores de 10 STX en una muestra de interés. Adicionalmente o como alternativa, las sondas o cebadores se pueden usar para aislar secuencias correspondientes en otros organismos incluyendo, por ejemplo, otras especies de dinoflagelados. Se pueden usar métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y similares, para identificar dichas secuencias en base a su homología de secuencia con las secuencias expuestas en el presente documento. Las secuencias que se seleccionan en base a su identidad de secuencia con las secuencias completas 15 expuestas en el presente documento o a fragmentos de las mismas se incluyen por las realizaciones. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogos de las secuencias desveladas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten una identidad sustancial como se define en otra 20 parte en el presente documento. Las funciones de los ortólogos suelen estar altamente conservadas entre las especies.
En técnicas de hibridación, la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida se usa para generar una sonda que se hibrida selectivamente a otras secuencias de ácidos nucleicos correspondientes presentes en una 25 muestra dada. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un marcador detectable. Por lo tanto, por ejemplo, las sondas para la hibridación pueden prepararse marcando oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias de la invención. El nivel de homología (identidad de secuencia) entre la sonda y la secuencia diana se determinará en gran medida por la rigurosidad de las condiciones de hibridación. En particular, la secuencia de 30 nucleótidos utilizada como sonda puede hibridarse con un homólogo u otra variante de un polinucleótido desvelado en el presente documento en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media o alta rigurosidad. Existen numerosas condiciones y factores, bien conocidos por los expertos en la técnica, que pueden emplearse para alterar la rigurosidad de la hibridación, tales como, por ejemplo, la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de base) del ácido nucleico a hibridar con un ácido nucleico especificado; concentración de sales y otros componentes, 35 tales como la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol, etc.; y alterando la temperatura de las etapas de hibridación y/o lavado.
Bajo un enfoque de PCR, los cebadores de oligonucleótidos pueden diseñarse para su uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier 40 organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR son generalmente conocidos en la técnica. Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero sin limitación, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desapareados, y similares.
45 El destinatario experto reconocerá que los cebadores descritos en el presente documento para su uso en PCR o RT- PCR también se pueden usar como sondas para la detección de secuencias de genes sxt de dinoflagelados.
También se contemplan en la divulgación anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a polipéptidos descritos en la descripción. Los anticuerpos pueden usarse para detectar y analizar cualitativa o cuantitativamente 50 uno o más polipéptidos STX en una muestra dada. Al "unirse específicamente", se entenderá que el anticuerpo es capaz de unirse al polipéptido diana o fragmento del mismo con una afinidad mayor que la que se une a una proteína no relacionada. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir al polipéptido o fragmento del mismo, con una constante de unión en el intervalo de al menos aproximadamente 10-4 M a aproximadamente 10-10 M. Preferiblemente, la constante de unión es al menos aproximadamente 10-5 M, o al menos aproximadamente 10-6 M. 55 Más preferiblemente, la constante de unión es al menos aproximadamente 10-7 M, al menos aproximadamente 10-8 M, o al menos aproximadamente 10-9 M o más. En el contexto de la presente invención, la referencia a un anticuerpo específico para un polipéptido STX de la invención incluye un anticuerpo que es específico de un fragmento del polipéptido.
Los anticuerpos de la divulgación pueden existir en una diversidad de formas incluyendo, por ejemplo, en forma de un anticuerpo completo, o como un fragmento de anticuerpo, u otro fragmento inmunológicamente activo del mismo, tal como regiones determinantes de complementariedad. De forma similar, el anticuerpo puede existir como un fragmento de anticuerpo que tiene dominios funcionales de unión a antígeno, es decir, dominios variables de cadena 5 pesada y ligera. Además, el fragmento de anticuerpo puede existir en una forma seleccionada del grupo que consiste en, pero sin limitación: Fv, Fab, F(ab)2, scFv (Fv monocatenario), dAb (anticuerpo de dominio individual), anticuerpos quiméricos, anticuerpos bi-específicos, diacuerpos y triacuerpos.
Se puede producir un "fragmento" de anticuerpo por modificación de un anticuerpo completo o por síntesis del 10 fragmento de anticuerpo deseado. Los métodos para generar anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, síntesis mediante tecnología de ADN recombinante. El destinatario experto conocerá los métodos de síntesis de anticuerpos, tales como los descritos en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5296348 y textos estándar tales como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.
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Preferiblemente, los anticuerpos se preparan a partir de regiones discretas o fragmentos del polipéptido STX de interés. Una porción antigénica de un polipéptido de interés puede ser de cualquier longitud apropiada, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos. Preferiblemente, una porción antigénica contiene al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de aminoácidos.
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Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de la divulgación se pueden preparar, por ejemplo, usando polipéptidos STX purificados de la invención, o secuencias de polinucleótidos sxt purificadas de la invención que codifican polipéptidos STX de la invención usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que contiene típicamente porciones de Fab, se puede preparar usando la 25 tecnología de hibridoma descrita en Harlow y Lane (Eds) Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y; Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1986) 2a ed; y Kohler & Milstein, (1975) Nature 256: 495-497. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación, preparación de anticuerpos por selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales inmunizando conejos o 30 ratones (véase, por ejemplo, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546).
También se entenderá que los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente humanos. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo biespecífico, que tiene especificidad de unión a más de un antígeno o epítopo. Por ejemplo, el anticuerpo puede 35 tener especificidad para uno o más polipéptidos STX o fragmentos de los mismos, y adicionalmente tener especificidad de unión por otro antígeno. Los métodos para la preparación de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos y anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos N.° 6995243.
40 Generalmente, una muestra que comprende potencialmente un polipéptido STX de la divulgación se puede poner en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido STX o fragmento del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo puede fijarse a un soporte sólido para facilitar el lavado y posterior aislamiento del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, por ejemplo, placas de microtitulación, perlas, marcas o microperlas. Los anticuerpos también se pueden unir a una matriz ProteinChip o un 45 sustrato de sonda como se ha descrito anteriormente
Las etiquetas detectables para la identificación de anticuerpos unidos a polipéptidos de la invención incluyen, pero sin limitación, fluorocromos, tintes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas tales como peróxido de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros usados comúnmente en la técnica, y etiquetas colorimétricas, incluyendo oro coloidal o 50 perlas de vidrio o plástico de colores. Como alternativa, el anticuerpo se puede detectar usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar el anticuerpo específico del polipéptido unido.
Los métodos para detectar la presencia, o medir la cantidad, de un complejo anticuerpo-marcador incluyen, por 55 ejemplo, detección de fluorescencia, quimioluminiscencia, luminiscencia, absorbancia, birrefringencia, transmitancia, reflectancia o índice de refracción, tal como resonancia de plasmón superficial, elipsometría, un método especular resonante, un método de guía de onda de acoplador de rejilla, o interferometría. Los métodos de radiofrecuencia incluyen espectroscopia de resonancia multipolar. Los métodos electroquímicos incluyen métodos de amperometría y voltametría. Los métodos ópticos incluyen métodos de imágenes y métodos sin imágenes y microscopía.
Los ensayos útiles para detectar la presencia, o medir la cantidad, de un complejo anticuerpo-marcador incluyen, incluyen, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un ensayo radioinmune (RIA), o un ensayo de transferencia Western. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Stites & Terr, (Eds) (1991) Clinical 5 Immunology, 7a ed; y Asai, (Ed) (1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37.
Métodos para detectar dinoflagelados
La divulgación proporciona métodos para la detección y/o el aislamiento de polinucleótidos de la invención y/o 10 polipéptidos de la invención ("métodos de la invención").
En una realización, la invención proporciona un método para detectar un dinoflagelado en una muestra. El método comprende obtener una muestra para su uso en el método, y detectar la presencia de un polinucleótido de la invención y/o un polipéptido de la invención, o un fragmento o variante de los mismos en la muestra. La presencia 15 del polinucleótido, polipéptido o variante o fragmento del mismo en la muestra es indicativo de dinoflagelados en la muestra.
Los presentes inventores han determinado que el gen sxtA está presente en dinoflagelados productores de saxitoxina pero ausente en dinoflagelados que no producen saxitoxina. En particular, se ha identificado que la 20 detección de los dominios catalíticos de sxtAI y/o sxtA4 del gen sxtA son indicativos de dinoflagelados productores de saxitoxina.
Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un método para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra. El método comprende obtener una muestra para su uso en el método, y detectar la 25 presencia de un polinucleótido de la invención y/o un polipéptido de la invención, o un fragmento o variante de los mismos en la muestra. La presencia del polinucleótido, polipéptido, o variante o fragmento de los mismos en la muestra es indicativo de un dinoflagelado productor de saxitoxina en la muestra.
En otra realización, la invención proporciona un método para determinar la ausencia de dinoflagelados productores 30 de saxitoxina en una muestra. El método comprende obtener una muestra para su uso en el método, y determinar la ausencia de un polinucleótido de la invención y/o un polipéptido de la invención, o un fragmento o variante de los mismos en la muestra. La ausencia del polinucleótido, polipéptido, o variante o fragmento de los mismos en la muestra es indicativo de que los dinoflagelados productores de saxitoxina no están presentes en la muestra.
35 En el contexto de los métodos de la divulgación (incluyendo aquellos a los que se hace referencia en los párrafos inmediatamente anteriores), la secuencia de polinucleótidos puede ser una secuencia del gen saxitoxina A (sxtA). La secuencia de polinucleótidos de sxtA puede comprender uno o más dominios catalíticos del gen sxtA (es decir, los dominios catalíticos sxtAI, sxtA2, sxtA3 o sxtA4), o uno o más fragmentos de los mismos. Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos sxtA comprende un dominio sxtAI y/o sxtA4, o uno o más fragmentos de la misma. 40 Más preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos sxtA comprende un dominio sxtA4, o uno o más fragmentos de la misma. La secuencia polipeptídica puede ser una secuencia del polipéptido saxitoxina A (STXA).
En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos corresponde a una secuencia proporcionada en uno cualquiera de los números de acceso al GenBank JF343238 y JF343239 (SEQ ID NO: 1 y sEq ID NO: 3), o un 45 fragmento o una variante de cualquiera de las secuencias.
En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótidos corresponde a una secuencia proporcionada en uno cualquiera de los números de acceso al GenBank JF343240 - JF343432 (SEQ ID NO: 5 - SeQ ID NO: 197), o un fragmento o una variante de una cualquiera de las secuencias.
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En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de dominio catalítico de sxtA1 proporcionada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 224-227 y 247, o un fragmento o una variante de una cualquiera de las secuencias.
55 En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de dominio catalítico de sxtA4 proporcionada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 230-242, o un fragmento o una variante de una cualquiera de las secuencias.
En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótidos puede comprender los nucleótidos 160-1821 de la secuencia
de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 1); los nucleótidos 277-2022 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3); los nucleótidos 1837-2415 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 1); los nucleótidos 2038-2604 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de 5 acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3); los nucleótidos 2479-2694 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 1); los nucleótidos 2722-2949 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3); los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3); los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 10 (SEQ ID NO: 3); o un fragmento o una variante de una cualquiera de las secuencias.
En el contexto de los métodos de la divulgación (incluyendo los referidos en los párrafos anteriores), la secuencia polipeptídica puede ser una secuencia de proteína saxitoxina A (STXA). La secuencia polipeptídica de STXA puede comprender uno cualquiera o más dominios catalíticos de proteína STXA (es decir, los dominios catalíticos STXA1, 15 STXA2, STXA3 o STXA4) o uno o más fragmentos de los mismos. Preferiblemente, la secuencia del polipéptido STXA comprende un dominio STXA1 o STXA4, o uno o más fragmentos del mismo. Más preferiblemente, la secuencia polipeptídica de STXA comprende un dominio STXA4, o uno o más fragmentos del mismo.
En algunas realizaciones, la secuencia de polipéptido corresponde a una secuencia proporcionada en el GenBank 20 números de acceso JF343238 o JF343239 (SeQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4), o un fragmento o una variante de cualquiera de las secuencias.
En otras realizaciones, la secuencia polipeptídica puede comprender los residuos de aminoácidos 1-554 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2); los residuos de 25 aminoácidos 1-582 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4); los residuos de aminoácidos 560-752 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2); los residuos de aminoácidos 588-776 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4); los residuos de aminoácidos 774-845 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343238 (SEQ ID NO: 2); los residuos de aminoácidos 30 816-891 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4); los residuos de aminoácidos 947-1281 de la secuencia polipeptídica expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 4); o un fragmento o una variante de una cualquiera de las secuencias.
Los dinoflagelados detectados en una muestra o determinados como ausentes de una muestra usando los métodos 35 de la invención pueden ser dinoflagelados productores de saxitoxina. Sin imponer ninguna limitación particular, los dinoflagelados pueden ser del orden Gonyaulacales o Gymnodiniales. Los dinoflagelados pueden ser del género Alexandrium (anteriormente Gonyaulax), Pyrodinium o Gymnodinium. Los ejemplos adecuados de especies Alexandrium incluyen A. catenella (por ejemplo, las cepas ACCC01, ACSH02, ACTRA02 y CCMP1493), A. fundyense (por ejemplo, las cepas CCMP1719 y CCMP1979), A lusitanicum, A. minutum (por ejemplo, las cepas 40 CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 y AMD16/AMAD16), A. ostenfeldii y A. tamarense (por ejemplo, las cepas CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 y ATNWB01). Los ejemplos adecuados de especies Gymnodinium incluyen G. catenatum (por ejemplo, las cepas GCTRA01 y CS-395). Los ejemplos adecuados de especies Pyrodinium incluyen P. bahamense var compressum.
45 Una muestra para su uso en los métodos de la invención se puede "obtener" por cualquier medio. Por ejemplo, la muestra puede obtenerse retirándola de un estado de origen natural (por ejemplo, una muestra de un lago, océano o río), o retirándola de un estado "no natural" (por ejemplo, un cultivo en un entorno de laboratorio, presa, depósito, tanque, etc.).
50 Puede sospecharse que una muestra para su uso en los métodos de la invención comprende uno o más dinoflagelados, o uno o más dinoflagelados productores de saxitoxina. La muestra puede ser una muestra comparativa o de control, por ejemplo, una muestra que comprende una concentración o densidad conocida de dinoflagelados o dinoflagelados productores de saxitoxina o una muestra que comprende una o más especies conocidas o cepas de dinoflagelados o dinoflagelados productores de saxitoxina. La muestra puede obtenerse a 55 partir de cualquier fuente. Por ejemplo, una muestra puede ser una muestra ambiental. La muestra ambiental puede derivarse, por ejemplo, de agua salada, agua dulce, un río, un lago, un océano o las aguas costeras. La muestra ambiental puede derivarse de una proliferación de dinoflagelados. Como alternativa, la muestra puede derivarse de una fuente de laboratorio, tal como un cultivo o una fuente comercial. Como alternativa, la muestra puede derivarse de una fuente biológica tal como, por ejemplo, tejido o fluido biológico. La muestra puede modificarse desde su
estado original, por ejemplo, mediante purificación, dilución o la adición de cualquier otro componente o componentes.
En ciertas realizaciones, una muestra analizada usando los métodos de la invención puede proporcionar información 5 con respecto a la presencia o ausencia de saxitoxina en animales que pueblan la fuente de la muestra. Por ejemplo, la muestra puede ensayarse para determinar la presencia o ausencia de saxitoxina en alimentos marinos animales tales como, por ejemplo, pescado (por ejemplo, pez globo) y en particular mariscos (por ejemplo, mejillones, almejas, ostras, vieiras y similares).
10 Los polinucleótidos y polipéptidos para su uso en los métodos de la invención se pueden aislar (es decir, extraer) de microorganismos en cultivo mixto o como especies individuales o aislados de género. Por consiguiente, los microorganismos de una muestra pueden cultivarse antes de la extracción, o la extracción puede realizarse directamente en una muestra dada. Los métodos adecuados para el aislamiento (es decir, extracción) y la purificación de polinucleótidos y polipéptidos para el análisis usando métodos de la invención son generalmente 15 conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en textos estándar tales como Ausubel (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; y Scopes, R. K. (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3a. Ed., Springer- Verlag, Nueva York, N.Y. Se describen métodos adicionales en Neilan (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 228620 2291. Las técnicas de purificación de polipéptidos adecuadas aptas para su uso en los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, cromatografía de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba, centrifugación, filtración en gel, precipitación con sulfato de amonio, e intercambio iónico.
En realizaciones alternativas, los métodos de la invención pueden realizarse sin aislar ácidos nucleicos y/o 25 polipéptidos de la muestra.
La detección de la presencia (o determinación de la ausencia) de polinucleótidos de la invención y/o polipéptidos de la invención en una muestra dada se puede realizar usando cualquier técnica adecuada. Dichas técnicas adecuadas pueden implicar típicamente el uso de un cebador, sonda o anticuerpo específico para uno cualquiera o más 30 polinucleótidos de la invención o uno cualquiera o más polipéptidos de la invención. Las técnicas adecuadas incluyen, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y variaciones relacionadas de esta técnica (por ejemplo, PCR cuantitativa), ensayos basados en anticuerpos tales como ELISA, transferencia Western, citometría de flujo, microscopía fluorescente, y similares. Estas y otras técnicas adecuadas son generalmente conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en textos estándar tales como Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein 35 Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; y Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3a. Ed., Springer- Verlag, Nueva York, N.Y.
En realizaciones preferidas, la detección de la presencia (o determinación de la ausencia) de polinucleótidos de la 40 invención en una muestra dada se logra por amplificación de ácidos nucleicos extraídos de una muestra de interés mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores que hibridan específicamente con la secuencia de polinucleótidos, y detectando la secuencia amplificada. Bajo el enfoque de PCR, los cebadores de oligonucleótidos pueden diseñarse para su uso en reacciones de PCR para amplificar polinucleótidos de la invención tales como, por ejemplo, ARN (por ejemplo, ARNm), ADN y/o polinucleótidos de ADNc. Los métodos adecuados de PCR incluyen, 45 pero sin limitación, los que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desapareados, y similares. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y RT-PCR son generalmente conocidos en la técnica y se desvelan, por ejemplo, en textos estándar tales como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281; Innis et al. 50 (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York.
55 El experto en la técnica apreciará fácilmente que diversos parámetros de los procedimientos de PCR y RT-PCR pueden alterarse sin afectar a la capacidad para obtener el producto deseado. Por ejemplo, la concentración de sal se puede variar o el tiempo y/o la temperatura de una o más de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión pueden variarse. De forma similar, la cantidad de plantilla de ADN, ADNc o ARN también se puede variar dependiendo de la cantidad de ácido nucleico disponible o la cantidad óptima de plantilla requerida para la
amplificación eficiente. Los cebadores para su uso en los métodos y kits de la presente invención son típicamente oligonucleótidos, siendo típicamente de al menos aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, más típicamente de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, y aún más típicamente de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud a aproximadamente 5 30 nucleótidos de longitud.
El experto en la técnica reconocerá que los cebadores de la divulgación pueden ser útiles para varias aplicaciones diferentes, incluyendo, pero sin limitación, PCR, RT-PCR y como sondas para la detección de polinucleótidos de la invención. Dichos cebadores se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, 10 síntesis química directa o clonación y restricción de secuencias apropiadas. No todas las bases en el cebador necesitan reflejar la secuencia de la molécula de plantilla en la que se hibridará el cebador. El cebador solo necesita contener suficientes bases complementarias para permitir que el cebador hibride con la plantilla. Un cebador también puede incluir bases de desapareamiento en una o más posiciones, que son bases que no son complementarias a las bases en la plantilla, sino que están diseñadas para incorporar cambios en el ADN tras la 15 extensión o amplificación de la base. Un cebador puede incluir bases adicionales, por ejemplo en forma de una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en el extremo 5', para facilitar la clonación del ADN amplificado.
Los métodos de la divulgación implican detectar la presencia (o determinar la ausencia) de polinucleótidos de la 20 invención y/o polipéptidos de la invención en una muestra dada. Como se ha indicado anteriormente, las secuencias pueden comprender secuencias de saxitoxina A que incluyen una cualquiera o más de las secuencias del dominio catalítico de saxitoxina A1, A2, A3 o A4 (o uno o más fragmentos de la misma). Preferiblemente, la secuencia comprende el dominio de saxitoxina A1 y/o de saxitoxina A4 (o uno o más fragmentos de la misma). Más preferiblemente, la secuencia comprende el dominio de saxitoxina A4 (o uno o más fragmentos de la misma).
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El experto en la técnica reconocerá que puede usarse cualquier cebador que sea capaz de amplificar un polinucleótido de la invención, cualquier sonda capaz de detectar un polinucleótido de la invención, o cualquier anticuerpo capaz de detectar un polipéptido de la invención, al realizar los métodos de la invención. En realizaciones preferidas, los cebadores, las sondas y los anticuerpos se unen específicamente a una cualquiera o más de las 30 secuencias de saxitoxina A a las que se hace referencia en el párrafo anterior (es decir, el párrafo directamente anterior).
Al "unirse específicamente" se entenderá que el cebador, la sonda o el anticuerpo es capaz de unirse a la secuencia diana con una afinidad mayor que la que se une a una secuencia no relacionada. Por consiguiente, cuando se 35 expone a una pluralidad de secuencias diferentes pero igualmente accesibles como posibles compañeros de unión, el cebador, sonda o anticuerpo específico para una secuencia diana se unirá selectivamente a la secuencia diana y otros compañeros de unión potenciales alternativos permanecerán sustancialmente sin unirse por el cebador, sonda o anticuerpo. En general, un cebador, sonda o anticuerpo específico para una secuencia diana se unirá preferiblemente a la secuencia diana al menos 10 veces, preferiblemente 50 veces, más preferiblemente 100 veces, 40 y mucho más preferiblemente más de 100 veces más frecuentemente que a otras secuencias potenciales que no son secuencias diana. Un cebador, sonda o anticuerpo específico para una secuencia diana puede ser capaz de unirse a secuencias no diana a un nivel débil pero detectable. Esto se conoce comúnmente como unión de fondo y se puede distinguir fácilmente de la unión específica, por ejemplo, mediante el uso de un control apropiado.
45 En realizaciones preferidas, los cebadores, sondas o anticuerpos se unen específicamente a una secuencia de polinucleotídica o polipeptídica del dominio catalítico de A4, o un fragmento de la misma. Más preferiblemente, los cebadores, sondas o anticuerpos se unen específicamente a una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos del dominio catalítico de saxitoxina A4, o un fragmento de la misma.
50 Los cebadores y las sondas adecuadas pueden unirse específicamente a cualquier fragmento de una secuencia de polinucleótidos del dominio catalítico de saxitoxina A4. A modo de ejemplo no limitante únicamente, los cebadores y las sondas adecuadas pueden unirse específicamente a un fragmento de la secuencia de polinucleótidos del dominio catalítico de saxitoxina A4 definida por los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos expuesta en el GenBank número de acceso JF343239 (SEQ ID NO: 3). Los anticuerpos adecuados pueden unirse 55 específicamente a un fragmento de una secuencia de polipéptidos del dominio catalítico de saxitoxina A4 codificada por dichas secuencias de polinucleótidos.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden implicar la detección de la presencia (o determinación de la ausencia) de polinucleótidos de la invención en una muestra que usa la amplificación por PCR. Los pares de
cebadores de oligonucleótidos adecuados para la amplificación por PCR de las secuencias de polinucleótidos de saxitoxina A pueden ser capaces de amplificar uno cualquiera o más dominios catalíticos del gen sxt, o uno o más fragmentos de los mismos. Preferiblemente, los cebadores amplifican una secuencia que comprende una secuencia de polinucleótidos del dominio catalítico de saxitoxina A4, o un fragmento de la misma. A modo de ejemplo no 5 limitante únicamente, un par de cebadores adecuado para este fin puede comprender un primer cebador que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 198, o un fragmento o variante de la misma, y/o un segundo cebador que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 199, o un fragmento o variante de la misma. Otros ejemplos no limitantes de pares de cebadores adecuados incluyen los expuestos en las SEQ ID NOs: 200-211, 220-223, 228-229 y 243-244 (incluyendo fragmentos y variantes de estas secuencias de pares de 10 cebadores).
El experto en la técnica reconocerá que los cebadores ilustrados no pretenden limitar la región del gen de saxitoxina A amplificada o los métodos de la invención en general. El experto en la técnica también reconocerá que la invención no se limita al uso de los cebadores específicos ilustrados, y también se pueden usar secuencias de 15 cebador alternativas, con la condición de que los cebadores estén diseñados apropiadamente para permitir la amplificación de secuencias de polinucleótidos de saxitoxina, preferiblemente secuencias de polinucleótidos de saxitoxina A, y más preferiblemente secuencias de polinucleótidos del dominio de saxitoxina A4.
En otras realizaciones, los métodos de la invención pueden implicar la detección de la presencia (o determinación de 20 la ausencia) de polinucleótidos de la invención en una muestra mediante el uso de sondas adecuadas. Las sondas de la invención se basan en las secuencias de polinucleótidos sxt de la invención. Las sondas son secuencias de nucleótidos de longitud variable, por ejemplo, entre aproximadamente 10 nucleótidos y varios miles de nucleótidos, para su uso en la detección de secuencias homólogas, típicamente por hibridación. Las sondas de hibridación de la invención pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros 25 oligonucleótidos. Las sondas de la invención pueden marcarse mediante la incorporación de un marcador para facilitar su detección. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen moléculas fluorescentes (por ejemplo, acetilaminofluoreno, 5-bromodesoxiuridina, digoxigenina, fluoresceína) e isótopos radiactivos (por ejemplo, 32P, 35S, 3H, 33P). La detección del marcador se puede lograr, por ejemplo, mediante técnicas químicas, fotoquímicas, inmunoquímicas, bioquímicas o espectroscópicas. Los métodos para el diseño y/o producción de sondas de 30 nucleótidos se conocen generalmente en la técnica, y se describen, por ejemplo, en textos estándar tales como Robinson et al. (Eds) Current Protocols in Cytometry (2007), John Wiley and Sons, Inc; Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; y Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, 280-281.
35
En otras realizaciones, los métodos de la divulgación pueden implicar la detección de la presencia (o determinación de la ausencia) de polipéptidos de la invención en una muestra que usa anticuerpos. Los anticuerpos pueden usarse para detectar y analizar cualitativa o cuantitativamente uno o más polipéptidos STX de la invención en una muestra dada. Los anticuerpos pueden conjugarse con un fluorocromo que permite la detección, por ejemplo, mediante 40 citometría de flujo, inmunohistoquímica u otros medios conocidos en la técnica. Como alternativa, el anticuerpo puede estar unido a un sustrato que permita la detección colorimétrica o quimioluminiscente. La divulgación también contempla el uso de anticuerpos secundarios capaces de unirse a uno o más anticuerpos capaces de unirse específicamente a un polipéptido de la invención.
45 Kits para detectar dinoflagelados
La divulgación también proporciona kits para la detección y/o el aislamiento de polinucleótidos de la invención y/o polipéptidos de la invención ("kits de la invención").
50 En ciertas realizaciones, los kits se usan para detectar un dinoflagelado en una muestra.
En otras realizaciones, los kits se usan para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra.
En otras realizaciones, los kits se usan para determinar la ausencia de dinoflagelados productores de saxitoxina en 55 una muestra.
En general, los kits de la invención comprenden al menos un agente para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos de la invención y/o uno o más polipéptidos de la invención, y/o variantes o fragmentos de los mismos (véase la descripción en la sección anterior titulada "Polinucleótidos y polipéptidos"). Cualquier agente adecuado
para este propósito se puede incluir en los kits. Los ejemplos no limitantes de agentes adecuados incluyen cebadores, sondas y anticuerpos tales como los descritos anteriormente en las secciones tituladas "Sondas, cebadores y anticuerpos" y "Métodos para detectar dinoflagelados".
5 En realizaciones preferidas, los kits son para su uso en los métodos de la invención (véase la descripción en la sección anterior titulada "Métodos para detectar dinoflagelados").
En algunas realizaciones, la invención proporciona un kit para la detección de un dinoflagelado en una muestra, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar en la muestra la presencia de uno o más polinucleótidos de 10 la invención, y/o uno o más polipéptidos de la invención, y/o una variante o fragmento de cualquiera. Preferiblemente, el dinoflagelado es un dinoflagelado productor de saxitoxina.
En otras realizaciones, la invención proporciona un kit para determinar la ausencia de un dinoflagelado en una muestra, comprendiendo el kit al menos un agente para determinar en la muestra la ausencia de uno o más 15 polinucleótidos de la invención, y/o uno o más polipéptidos de la invención, y/o una variante o fragmento de cualquiera. Preferiblemente, el dinoflagelado es un dinoflagelado productor de saxitoxina.
En general, los kits de la invención pueden comprender cualquier cantidad de componentes adicionales. A modo de ejemplo no limitante, los componentes adicionales pueden incluir componentes para recoger y/o almacenar 20 muestras, reactivos para cultivo celular, muestras de referencia, tampones, etiquetas, y/o instrucciones escritas para realizar uno o más métodos de la invención.
Los dinoflagelados detectados en una muestra o determinados como ausentes de una muestra usando los kits de la invención pueden ser dinoflagelados productores de saxitoxina. Sin imponer ninguna limitación particular, los 25 dinoflagelados pueden ser del orden Gonyaulacales o Gymnodiniales. Los dinoflagelados pueden ser del género Alexandrium (anteriormente Gonyaulax), Pyrodinium o Gymnodinium. Los ejemplos adecuados de especies Alexandrium incluyen A. catenella (por ejemplo, las cepas ACCC01, ACSH02, ACTRA02 y CCMP1493), A. fundyense (por ejemplo, las cepas CCMP1719 y CCMP1979), A lusitanicum, A. minutum (por ejemplo, las cepas CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 y AMD16/AMAD16), A. ostenfeldii y A. tamarense (por ejemplo, las cepas 30 CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 y ATNWB01). Los ejemplos adecuados de especies Gymnodinium incluyen G. catenatum (por ejemplo, las cepas GCTRA01 y CS-395). Los ejemplos adecuados de especies Pyrodinium incluyen P. bahamense var compressum.
Ejemplos
35
La invención se describirá ahora con referencia a los ejemplos específicos, que no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes.
Ejemplo 1: identificación de genes con codificación nuclear para la neurotoxina saxitoxina en dinoflagelados
40
Materiales y métodos - Mediciones de cultivo y toxinas
45 Se obtuvieron cultivos de dinoflagelados productores y no productores de saxitoxina de diversas colecciones de cultivos (Tabla 1).
Tabla 1. Lista de cepas de dinoflagelados usadas en este estudio, su producción de STX y si los fragmentos sxtA1 y
sxtA4 se amplificaron a partir de su ADN genómico.
Orden Género Especie
Cepa STX PCR sxtA1 PCR sxtA4
Gonyaulacales Alexandrium
affine
CCMP112 n. d. n. d. n. d.
affine
AABB01/01 n. d. n. d. n. d.
affine
AABB01/02 n. d. n. d. n. d.
andersonii
CCMP1597 n. d. n. d. n. d.
andersonii
CCMP2222 n. d. n. d. n. d.
catenella
ACCC01 sí sí sí
catenella
ACSH02 sí sí sí
catenella
ACTRA02 sí sí sí
catenella
CCMP1493 sí sí sí
fundyense
CCMP1719 sí sí sí
fundyense
CCMP1979 sí sí sí
minutum
CCMP1888 sí sí sí
minutum
CCMP113 sí sí sí
minutum
ALSP01 sí sí sí
minutum
ALSP02 sí sí sí
minutum
AMD16 sí sí sí
tamarense
CCMP1771 n. d. sí sí
tamarense
ATBB01 n. d. sí sí
tamarense
ATEB01 n. d. sí sí
tamarense
ATCJ33 n. d. sí sí
tamarense
ATNWB01 sí sí sí
Gambierdiscus
australes
CAWD148 * n. d. n. d
Ostreopsis
ovata
CAWD174 * n. d. n. d
siamensis
CAWD96 * n. d. n. d
Gymnodiniales Amphidinium
massarti
CS-259 * n. d. n. d
Gymnodinium
catenatum
GCTRA01 sí sí sí
catenatum
CS-395 sí sí sí
Prorocentrales Prorocentrum
lima CS-869
* n. d. n. d.
n.d. no detectado, *especie nunca reportada para sintetizar STX________
Las culturas se mantuvieron en GSe (véase el método en Doblin et al. (1999), Growth and biomass stimulation of the
toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum (Graham) by dissolved organic substances. J Exp Mar Biol Ecol 236:
33-47) o medio L1 (véase el método en Guillard y Hargraves (1993) Stichochrysis immobilis is a diatom, not a
5 chrysophyte. Phycologia 32, 234-236) a 16 - 20 °C, bajo un ciclo de luz 12/12, y una irradiancia de fotones de ~100
micromoles de fotones mr2 * * 5 * * * * 10 s-1. La toxicidad de las cepas se determinó usando HPLC o LCMS. El límite de detección
del método por HPLC varió de aproximadamente 0,07 pg STXequiv./100 g para C1 y C3 a 4,1 pg STXequiv./100 g
para GTX1. El límite de detección para el método por LCMS varió de aproximadamente 0,1 pg/célula para NEO y
STX a 0,5 pg/célula para C1 y C2.
10
- Extracción de ARN y ADN.
Para aislar el ARN total para la construcción de la biblioteca 454 (véase a continuación), se recogieron cultivos de Balech CCMP1719 de Alexandrium fundyense y Halim CCMP113 de Alexandrium minutum en fase exponencial a 15 través de centrifugación (1 min, 1000 x g, 12 °C). Las células se lavaron con PBS, se expusieron a batido de perlas en hielo seco con un batidor de perlas Fast Prep de Medinor (20 s, velocidad 4) usando perlas de 1,4 mm (Medinor) y se extrajo el ARN total con el kit de células de ARN total ChargeSwitch® (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
20 Para el análisis RACE, se aisló ARNm enriquecido con poliA usando el kit Dynabeads DIRECT (Invitrogen). Las células se recogieron por centrifugación (2 min, 4 °C, 16000 x g), se lavaron dos veces con PBS, se añadió el tampón de lisis/unión, y se homogeneizó usando el batidor de perlas (20 s, etapa 4). Después de la centrifugación (1 min, 4 °C, 16000 x g), el homogenado transparente se transfirió a la mezcla Dynabeads y el ARNm se aisló de acuerdo con el protocolo. Finalmente, el ARNm se trató con TURBO™ DNasa (Ambion) de acuerdo con el protocolo 25 suministrado.
Se aisló ADN genómico de todas las cepas de dinoflagelados enumeradas en la Tabla 1 usando el kit ChargeSwitch® de planta de ADN genómico (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, o mediante el método CTAB.
Se determinaron la calidad y la cantidad de ARN y ADN usando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific), amplificando genes de dinoflagelados de control (citocromo b, actina) y/o visualizándolos en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
5 - Construcción de la biblioteca de ADNc, secuenciación 454, ensamblaje y análisis
Las bibliotecas de ADNc enriquecidas con poliA normalizadas con adaptadores 454 unidos en cada extremo se construyeron comercialmente por Vertis Biotechnologie AG (
http://www.vertis-biotech.com/). Se secuenció media placa de cada una de las bibliotecas de CCMP 1719 de A. fundyense y CCMP113 de A. minutum usando la 10 tecnología TITAN de secuenciación Roche 454 en el Centro Noruego de Secuenciación de Alto Rendimiento (
http://www.sequencing.uio.no/). Solamente las lecturas 454 que poseían al menos un adaptador de ADNc se consideraron adicionalmente. Los adaptadores y, en caso de estar presentes, las secuencias líder con corte y empalme de dinoflagelados (SL) completas y parciales se eliminaron antes del ensamblaje utilizando una secuencia de comandos PERL interna que ahora está integrada en la herramienta bioinformática CLOTU. Las lecturas se 15 ensamblaron usando el programa de software Mira v3.0.5 con los conmutadores principales "denovo", "est", "preciso" y "454".
Para identificar secuencias putativas del gen sxt dentro de las dos bibliotecas 454, se realizaron búsquedas BLAST personalizadas en el portal de datos en línea disponible gratuitamente "Bioportal" (
www.bioportal.no). Se usaron dos 20 estrategias: los genes sxt de cianobacterias se consultaron frente a los conjuntos de datos de Alexandrium ensamblados o los conjuntos de datos de lecturas 454 sin ensamblar. Todos los aciertos con un valor de e <0,1 se extrajeron y la secuencia con el menor valor de e para cada gen se sometió a BLAST con respecto a la base de datos de proteínas no redundante en NCBI.
25 Para sxtA, todas las secuencias recuperadas se volvieron a ensamblar en el programa de software CLC Bio Main Workbench, usando un solapamiento mínimo de 10 pb y una rigurosidad de alineación baja o alta. Las secuencias de cóntigo resultantes se sometieron a BLAST con respecto a las bases de datos no redundantes y EST en NCBI usando los algoritmos blastn, blastx y tblastx. La estructura de las transcripciones sxtA se determinó alineando su secuencia traducida a sxtA de cianobacterias, así como mediante búsquedas de dominios conservados 30 (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Se determinaron previamente los residuos catalíticos y de unión a sustrato de sxtA de cianobacterias. Se realizaron búsquedas en las transcripciones para determinar la presencia de posibles péptidos señal y los correspondientes sitios de escisión usando las redes neuronales y los modelos ocultos de Markov implementados en SignalP 3.0(
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y el enfoque de 3 capas de Signal-3L (
http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/). Las hélices transmembrana se exploraron 35 utilizando TMHMM servidor 2.0 (
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) y perfiles de hidrofobicidad con gráficos de Kyte-Doolittle.
- Análisis RACE
40 Se diseñaron cebadores en regiones conservadas de los cóntigos con alta similitud con sxtA usando el software Primer3 (
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/; Tabla 2).
Tabla 2. Cebadores usados en PCR y secuenciación
Nombre
Secuencia 5' - 3' Orientación Descripción
sxt001
TGCAGCGMTGCTACTCCTACTAC (SEQ ID NO: 200) Directo se une en sxtA1, diseñado en lecturas 454
sxt002
GGTCGTGGTCYAGGAAGGAG (SEQ ID NO: 201) Inverso se une en sxtA1, diseñado en lecturas 454
sxt007
ATGCTCAACATGGGAGTCATCC (SEQ ID NO: 202) Directo se une en sxtA4, diseñado en lecturas 454
sxt008
GGGTCCAGTAGATGTTGACGATG (SEQ ID NO: 203) Inverso se une en sxtA, diseñado en lecturas 454
Cebadores adicionales usados para los análisis RACE y secuenciación
sxt013
GTAGTAGGAGTAGCKACGCTGCA (SEQ ID NO: 204) Inverso complemento inverso de sxt001
CTCCTTCCTRGACCACGACC Directo complemento inverso de sxt002
sxt014
(SEQ ID NO: 205)
sxt015
GGATGACTCCCATGTTGAGCAT (SEQ ID NO: 206) Inverso complemento inverso de sxt007
sxt016
CATCGTCAACATCTACTGGACCC (SEQ ID NO: 207) Directo complemento inverso de sxt008
sxt019
GGCAAGTATCTCCGCAGGCTTAC (SEQ ID NO: 208) Inverso se une en sxtA1, aguas arriba de sxt002
sxt020
CGTGGAGGAGCATGTTGACAGAATC (SEQ ID NO: 209) Directo se une en sxtA1, aguas abajo de sxt001
sxt026
ACTCGACAGGCCGGCAGTACAGAT (SEQ ID NO: 210) Inverso se une con sxtA4, aguas arriba de sxt008
sxt040
TGAGCAGGCACGCAGTCC (SEQ ID NO: 211) Directo se une en sxtA1 en la transcripción larga
Cebadores para amplificar clones directamente
TopoF
GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG (SEQ ID NO: 212) Directo se une en el vector pCR®2.1- TOPO®
TopoR
AGTCACGACGTTGTAAAACGACGG (SEQ ID NO: 213) Inverso se une en el vector pCR®2.1- TOPO®
El ADNc de la primera cadena se sintetizó con ~95 ng de ARNm enriquecido con poliA usando el cebador adaptador AP de acuerdo con las instrucciones del fabricante para las transcripciones con alto contenido de GC (sistema 3'RACE, Invitrogen). Después del tratamiento con RNasa H, el producto RACE se diluyó 1:10 y se usó como plantilla para PCR. Para amplificar el extremo 5' de la transcripción, se usaron tres protocolos diferentes. En primer lugar, el 5 método de Zhang (Zhang et al. (2007) Spliced leader RNA trans-splicing in dinoflagellates. Proc Natl Acad Sci USA 104: 4618-4623) se usó con ligeras modificaciones: la biblioteca 3'RACE descrita anteriormente se amplificó con los cebadores AUAP (cebador adaptador suministrado con el kit) y dinoSL enriquecer para transcripciones completas (programa de PCR: 94 °C - 60 s; 30 x (94 °C - 30 s, 68 °C - 5 min); 68 °C - 10 min; mantenimiento a 8 °C; química de PCR, véase a continuación). El producto de la PCR se diluyó 1:10 y se usó como plantilla en las PCR anidadas, que 10 se amplificaron usando el cebador dinoSL como cebadores directos y varios cebadores inversos internos diferentes (Tabla 2). Además, estos experimentos usaron los dos kits 5'RACE System (Invitrogen) y el kit GeneRacer (Invitrogen), usando los cebadores adaptador 5' proporcionados y varios cebadores inversos internos diferentes (Tabla 2). Todos los productos se clonaron y se secuenciaron como se describe a continuación.
15 - PCR y secuenciación
Todas las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de 25 pl que contenían plantilla, 1 unidad tampón de PCR 10X BD Advantage 2 (BD Biosciences), dNTP 0,2 mM, 0,5 pM de cada cebador directo e inverso (Tabla 2), DMSO (concentración final al 10%) y 0,25 unidades 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix (BD Biosciences). Si no se indica 20 otra cosa, las PCR se amplificaron como se indica a continuación: 94 °C - 2,5 min; 5 x (94 °C - 30 s; 68 °C - variable); 5 x (94 °C - 30 s; 66 °C - 30 s; 68 °C - variable); 25x (94 °C - 30 s; 64 °C - 30 s; 68 °C - variable); 68 °C - 10 min; 8 °C - mantenimiento. Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio al 1 %, se cortaron y se limpiaron con el gel Wizard® SV y el sistema PCR Clean-up (Promega) y se clonaron con el kit de clonación TOPO tA® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen; vector pCR®2.1- 25 TOPO®; células E. coli componentes químicamente resistentes a fagos One Shot® Machl™ T1). Las colonias individuales se añadieron directamente a 25 pl de reacciones de PCR que contenían 1 unidad de tampón de PCR estándar 10X (Qiagen), cebador 0,4 pM TopoF y TopoR (Tabla 2), dNTP 0,2 mM, y 1 unidad de HotStarTaq (Qiagen). Las condiciones de ciclado fueron 95 °C - 15 min, 30 x (94 °C - 30 s; 60 °C - 30 s; 72 °C - 90 s), 72 °C - 5 min, 8 °C - mantenimiento. Los productos de PCR se diluyeron y se secuenciaron por Sanger directamente desde 30 ambos lados usando los cebadores M13F y M13R suministrados con el kit de clonación.
- Amplificación genómica de SxtAI y sxtA4
Se analizaron todas las cepas de dinoflagelados (Tabla 1) para determinar la presencia de genes putativos sxtA1 y 35 sxtA4. Las PCR se realizaron usando ADNg de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. El fragmento sxtA1 se amplificó con los cebadores sxt001 y sxt002 (~550 pb) y el fragmento sxtA4 con los cebadores sxt007 y sxt008 (~750 pb) (Tabla 2).
- Análisis filogenéticos 40
Las secuencias de nucleótidos de dinoflagelados se alinearon manualmente usando MacClade v4.07 (véase Maddison y Maddison (1992) MacClade. 3 ed: Sinauer Associates) considerando la secuencia de codificación en el marco de lectura correcto antes de traducirse en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las secuencias de aminoácidos de dinoflagelados se alinearon posteriormente, usando el modelo MAFFTv6 L-INS-I para las
secuencias sxt ortólogas para cianobacterias, además de una selección de aciertos de NCBI nr Blastp estrechamente relacionados, que constituyen el exogrupo. Los alineamientos resultantes se verificaron manualmente y las posiciones mal alineadas se excluyeron usando MacClade v4.07 (véase Maddison y Maddison (1992) anterioremente).
5
ProtTest v2.4 (véase Abascal et al. (2005) ProtTest: selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics 21: 2104-2105) determinó WAG como el modelo evolutivo óptimo para todos los alineamientos inferidos. Los análisis de máxima probabilidad (ML) se realizaron con RAxML-VI-HPCv7.2.6, modelo PROTCATWAG con 25 tipos de categorías (véase Stamatakis (2006) RAxML-VI-HPC: Maximum likelihood-based phylogenetic analyses with 10 thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22: 2688-2690). La topología más probable se estableció a partir de 100 búsquedas separadas y se realizaron análisis bootstrap con 100 pseudo-réplicas. Las inferencias bayesianas se realizaron usando Phylobayes v3.2e (véase Lartillot y Philippe (2004) A Bayesian mixture model for across-site heterogeneities in the amino-acid replacement process. Mol Biol Evol 21: 1095-1109; y Lartillot y Philippe (2006) Computing Bayes factors using thermodynamic integration. Syst Biol 55: 195-207) bajo el mismo modelo de 15 sustitución con un número libre de categorías de mezcla y una discreta variación entre sitios en 4 categorías. Los árboles se dedujeron cuando la diferencia máxima más grande entre las biparticiones (cadenas) fue <0,1. Todos los análisis modelo de estimación y filogenéticos se hicieron en el "Bioportal" disponible gratuitamente (
http://www.bioportal.uio.no/).
20 - Determinación del número de copias
Se cultivaron cultivos por lotes de 200 ml por triplicado de la cepa ACSH02 de Alexandrium catenella como se ha descrito previamente, y se contó la abundancia cada tres días usando una cámara Sedgewick-Rafter y un microscopio de luz invertida (Leica Microsystems). Se tomaron muestras de 10 ml para la extracción de ADNg en la 25 fase exponencial temprana, la fase exponencial tardía y la fase estacionaria.
Los cebadores adecuados para qPCR se diseñaron basándose en regiones conservadas en un alineamiento de lecturas 454 de A. fundyense y A. minutum que cubren la región sxtA4 usando el software Primer 3 que amplifica un producto de 161 pb. Los ciclos de qPCR se realizaron en un Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science) usando SYBR 30 Green PCR Master Mix (Invitrogen). Se realizaron ensayos de qPCR en un volumen final de 25 pl de volumen que consiste en 12,5 pl de SYBR Green PCR master mix, 1 pl de aDn plantilla, 1 pl de cada par de cebadores, 1 pl de BSA y 8,5 pl de agua MilliQ. Los ensayos qPCR se realizaron por triplicado con el siguiente protocolo: 95 °C durante 10 s, y 35 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s. El análisis de la curva de fusión se realizó al final de cada programa para confirmar la especificidad de amplificación, y los productos de PCR seleccionados se 35 secuenciaron. La curva estándar se construyó a partir de una serie de dilución de 10 veces de una concentración conocida de producto de PCR reciente, que varía de 2 - 2 x 10-5 ng. Las moléculas de producto de PCR se determinaron: (A x 6,022 x 1023) x (660 x B)'1 con A: concentración del producto PCR, 6,022 x 1023: número de Avogadro, 660: peso molecular promedio por par de bases y B: longitud del producto de PCR. Se determinó el número de moléculas en las muestras desconocidas y se dividió por el número conocido de células en la plantilla 40 qPCR para obtener el número de copias por célula. El límite de detección fue de aproximadamente 5000 copias de la secuencia génica (es decir, ~20 - 30 células por ensayo, cada una con ~200 copias de la secuencia). Sin embargo, los análisis se realizaron con 10 - 100 veces este número de células, y por lo tanto, no se ejecutan en o cerca del límite de detección.
45 Resultados
- Identificación de secuencias sxt en el transcriptoma de A. minutum y A. fundyense
La secuenciación 454 dio como resultado 589.410 lecturas en bruto para A. minutum y 701.870 lecturas en bruto 50 para A. fundyense (SRA028427.1: muestras SRS151150.1 y SRS151148.1, respectivamente). Después del control de calidad, las lecturas se ensamblaron en 44.697 cóntigos y 539 singletones para A. minutum y 51.861 cóntigos y 163 singletones para A. fundyense. Las longitudes de cóntigo y contenidos de GC fueron similares para ambas bibliotecas: las longitudes de secuencia media (± DE) de 669 pb (± 360) y 678 pb (± 361) y un contenido de GC del 59% y del 58% se calcularon para A. minutum y A. fundyense, respectivamente.
55
La búsqueda de la biblioteca de ADNc 454 sin ensamblar con el gen sxtA de cianobacterias dio como resultado 94 aciertos para A. fundyense y 88 aciertos para A. minutum, respectivamente. La misma búsqueda en los conjuntos de datos ensamblados arrojó 10 cóntigos de A. fundyense y 9 de la biblioteca de A. minutum. Después de agrupar todas las secuencias y el reensamblaje, dos cóntigos mostraron una gran similitud con sxtA de cianobacterias: uno
para el dominio sxtAI (longitud de contigo = 1450 bp, GC = 60,1%, puntuación de bit = 213, valor de e = 5e'61) y el otro para sxtA4 (longitud de cóntigo = 1059 pb, GC = 65%, puntuación de bit = 195, valor de e = 1e'47). Ambos cóntigos contenían secuencias de ambas bibliotecas de Alexandrium, pero ninguno contenía un ORF completo, una secuencia líder con corte y empalme con dinoflagelados o una cola de poliA. Los dos cóntigos se usaron para 5 diseñar cebadores sxtAI y sxtA4 para amplificación genómica, análisis RACE y secuenciación.
Los resultados de la búsqueda in silico para los genes sxt centrales restantes se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3. Análisis de Blast de los genes sxt centrales de T3 de C. raciborskii frente a las bibliotecas 454 ensambladas de A. fundyense y A. minutum; dados son: el número de cóntigos con un valor de E <0,1 presente en cada biblioteca; el acierto de blastX superior, su número de acceso, taxonomía, puntuación y valor de E cuando el cóntigo superior se somete a Blast con respecto a la base de datos de proteínas no redundante de NCBI, así como el acierto más cercano a genes sxt de cianobacterias del mismo
análisis.
Biblioteca 454
Número de cóntigos Puntuación Acierto de blastX superior del Puntuación blastX Puntuación de
superior/Valor de
cóntigo superior con respecto a Acceso Taxonomía superior/valor de acierto de sxt
E
la base de datos nr de NCBI E superior/Valor de E
sxtA
A.
10 105/ 2e-51 policetico sintasa [Myxococcus YP 63211 Bacteria; 183/5e-44 182/7e-44
fundyense
xanthus DK 1622] Proteobacteria
Bacteria;
A. minutum
9 108/3e-61 SxtA [Lyngbya wollei] ACG63826 Cianobacteria 236/2e-65 236/2e-65
sxtB
A.
1 46/7e-11 citidina desaminasa [Plesiocystis ZP 01910517 Bacteria; 91/9e-27 67/1 e-11
fundyense
pacifica SIR-1] Proteobacteria
A. minutum
1 0,094 ninguno
sxtFIsxtM A. fundyense
4 51/4e-06 proteína de eflujo putativa, MATE [Polysphohdylium pallidum PN500] EFA81712 Eucariota; Amoebozoa 136/2e-30 62/5e-08
A. minutum
1 34/0,01 proteína de eflujo putativa, MATE [Arabidopsis lyrata subsp. lyrata] XP_002873960 Eucariota; Viridiplantae 78/8e-23 ninguno
sxtG
A.
9 57/2e-27 glicina amidinotransferasa YP_003768377 Bacteria; 163/3e-38 140/2e-31
fundyense
[Amycolatopsis mediterranei U32] Actinobacteria
A. minutum
7 55/2e-25 glicina amidinotransferasa YP_003768377 Bacteria; 143/2e-32 117/1 e-24
[Amycolatopsis mediterranei U32]
Actinobacteria
sxtHlsxtT
A.
7 43/2e-12 Región de Rieske (2Fe-2S) YP 321575 Bacteria; 197/6e-86 80/1 e-12
fundyense
[Anabaena variabilis ATCC 29413] Cianobacteria
A. minutum
6 41/5e-06 Región de Rieske (2Fe-2S) [Anabaena variabilis ATCC 29413] YP_321575 Bacteria; Cianobacteria 119/5e-38 60/2e-07
sxtl
A.
3 68/1 e-13 Carbamoiltransferasa [Nocardiopsis YP_003679504 Bacteria; 131/9e-29 89/9e-16
fundyense
dassonvillei DSM Actinobacteria
43111]
Biblioteca 454
Número de cóntigos Puntuación Acierto de blastX superior del Puntuación blastX Puntuación de
superior/Valor de
cóntigo superior con respecto a Acceso Taxonomía superior/valor de acierto de sxt
E
la base de datos nr de NCBI E superior/Valor de E
A. minutum
1 67/1 e-13 carbamoil transferasa ZP 05536710 Bacteria; 132/6e-29 91/1 e-16
[Streptomyces griseoflavusTu4000]
Actinobacteria
sxtR A. fundyense
3 36/0,063 atp-citrato sintasa [Ectocarpus siliculosus] CBJ30109 Eucariota; stramenopiles 349/8e-96 ninguno
A. minutum
1 38/0,015 atp-citrato sintasa [Ectocarpus CBJ30109 Eucariota; 516/1 e-144 ninguno
siliculosus] stramenopiles
sxtS
A. minutum
1 36/0,05 proteína hipotética [Perkinsus marinus ATCC 50983] XP_002767298 Eucariota; Alveolata 91/4e-34 ninguno
sxtU
A.
33 83/2e-16 proteína predicha [Chlamydomonas XP 001689640 Eucariota; 214/4e-54 107/8e-22
fundyense
reinhardtii] Viridiplantae
A. minutum
27 84/2e-16 proteína hipotética [Schizophyllum XP_003034688 Eucariota; Fungi 116/1 e-24 797/2e-13
commune H4-8]
Además de sxtA, se recuperaron cóntigos con una buena puntuación de alineamiento (puntuación de bits >55) y un valor de e altamente significativo (<e_2°) para el gen sxtG de la amidinotransferasa en ambas bibliotecas. El re- blasting de los cóntigos con los valores de e más bajos contra la base de datos de proteínas nr de NCBI mostró que el gen más similar era una glicina aminotransferasa actinobacteriana, mientras que la similitud con sxtG de 5 cianobacterias era menor pero aún muy significativa (Tabla 3). Para los genes de biosíntesis central sxtB, sxtF/M, sxtH/T, sxtl, sxtR y sxtU, se recuperaron cóntigos con un valor de e <0,1 de ambas bibliotecas de Alexandrium, mientras que sxtS solo tuvo un acierto en la biblioteca de A. minutum (Tabla 3). No se recuperaron las coincidencias para sxtC, sxtD y sxtE en ninguna de las bibliotecas. SxtC y sxtE son proteínas desconocidas y sxtD es una proteína de tipo esterol desaturasa. Es posible que las proteínas de dinoflagelados sin similitud con los genes de las 10 cianobacterias realicen su función. Como alternativa, estos genes no estaban presentes en el conjunto de datos generado. Si bien el conjunto de datos es completo, no está completo. Por ejemplo, algunas regiones de las transcripciones sxtA tampoco se recuperaron en el conjunto de datos 454, pero solo se obtuvieron mediante análisis RACE (véase anteriormente). El re-blasting contra la base de datos de proteína nr de NCBI recuperó aciertos de las proteínas para sxtB (A. fundyense solamente), sxtF/M, sxtH/T, sxtI y sxtU que son similares a las codificadas en los 15 genes cianobacterianos sxt correspondientes. La similitud de secuencia real estaba menos conservada y no se observaron aciertos significativos entre los cóntigos de Alexandrium y los genes sxt de cianobacterias.
- Estructura de transcripción de sxtA en A. fundyense
20 Los experimentos de RACE dieron como resultado dos familias de transcripciones de tipo sxtA diferentes. Ambos tenían secuencias líder con corte y empalme de dinoflagelados en el extremo 5' y colas de poliA en el extremo 3', pero diferían en secuencia, longitud, y en el número de dominios sxt que codificaban. Las transcripciones más cortas codifican los dominios sxtA1, sxtA2 y sxtA3, mientras que las transcripciones más largas codifican los cuatro dominios sxtA, que también se codifican por el gen cianobacteriano sxtA (Figura 1).
25
La secuencia de consenso de las transcripciones más cortas fue de 3136 pb excluyendo la cola de poliA. Se secuenciaron ocho clones con SL-líder, y se descubrieron tres 5'UTR diferentes. Las secuencias fueron casi idénticas; sin embargo, un clon tenía 15 pb y otro tenía una inserción de 19 pb siguiendo exactamente la secuencia SL. Las dos inserciones de secuencia fueron, aparte de la longitud, idénticas. Los nueve 3'UTR que se secuenciaron 30 fueron casi idénticos y la cola de poliA comenzó en la misma posición en cada clon. La estructura de dominio de esta transcripción de sxtA más corta fue como se indica a continuación: Los residuos de aminoácidos 1-27 codifican un péptido señal. Los residuos 28-531 corresponden a sxtA1, que contiene tres motivos conservados (I: VDTGCGDGSL (SEQ ID NO: 214), II: VDASRTLHVR (SEQ ID NO: 215), III: LEVSFGLCVL (SEQ ID NO: 216)). Los residuos 535-729 corresponden a sxtA2 con los dominios catalíticos 557-W, 648-T, 663-H, 711-R; mientras que 35 sxtA3, el dominio final de la transcripción corta, corresponde a los residuos 750-822 con el sitio de unión a fosfopanteteinilo 783-DSL-785.
La secuencia de consenso de la transcripción de sxtA más larga fue de 4613 pb (regla de la mayoría, 3'UTR más larga, sin cola de poliA, Figura 1). Se caracterizaron cinco clones con secuencias SL. Uno de ellos tenía una 40 secuencia SL ligeramente divergente con una A en la posición 15 en lugar de la G habitual. Todas las UTR 5' tenían una longitud de 97 pb (excluida la secuencia SL) y casi idénticas en secuencia. Cada uno de los cuatro clones 3' secuenciados tenía una longitud diferente (342, 407, 446 y 492 pb). La estructura de dominio de la transcripción de sxtA más larga fue como se indica a continuación: Los residuos de aminoácidos 1-25 codifican un péptido señal. Los residuos 26-530 corresponden al dominio sxtA1 con los tres motivos conservados: I: VVDTGCGDG (SEQ ID NO: 45 217), II: VDPSRSLHV (SEQ ID NO: 218) e III: LQGSFGLCML (SEQ ID NO: 219); los residuos 535-724 corresponden al dominio sxtA2, con los restos catalíticos 556-W, 661-T, 693-H, 708-R; sxtA3 corresponde a los residuos 763-539 donde 799-DSL-801 es el sitio de unión de fosfopanteteinilo; finalmente, el dominio sxtA4 corresponde a los residuos 894-1272.
50 El contenido de GC de las dos transcripciones de sxtA de Alexandriumfue consistentemente más alto que los genes de cianobacteria sxtA (Figura 2). El contenido de GC fue del 69% (transcripción larga), 62% (transcripción corta) y 43% (todos los genes de cianobacteria sxtA).
Todos los algoritmos predijeron la presencia de péptidos señal (SP) y sitios de escisión correspondientes para 55 ambas transcripciones. Sin embargo, las hélices transmembrana que pueden indicar péptidos de tránsito de clase I en dinoflagelados no se predijeron. Ninguna de las transcripciones coincidió con los criterios para los péptidos de tránsito de clase II y clase III.
Los números de acceso al Genbank son JF343238 para las transcripciones cortas y JF343239 para las
transcripciones largas de sxtA (secuencias consenso de la regla de la mayoría), y JF343357 - JF343432 para las secuencias RACE clonadas restantes de CCMP 1719 de A. fundyense.
- Filogenia de secuencias de dinoflagelados sxtAI y sxtA4 5
Los cebadores de sxtAI y sxtA4 diseñados en este estudio (Tabla 2) amplificaron bandas individuales de ~550 pb (sxtAI) y ~750 pb (sxtA4) de longitud en 18 cepas de Alexandrium que comprendían cinco especies y dos cepas de Gymnodinium catenatum, que tenían un rango de toxicidades (Tabla 1). No se amplificaron productos de PCR de sxtA1 o sxtA4 para cinco cepas de Alexandrium affine y Alexandrium andersonii no productoras de STX, ni para 10 cepas de dinoflagelados no productoras de STX de los géneros Gambierdicus, Ostreopsis, Prorocentrum, Amphidinium (Tabla 1). Estos resultados basados en PCR generalmente están de acuerdo con las mediciones de toxinas. Sin embargo, los fragmentos de sxtA1 y sxtA4 se amplificaron a partir del ADN genómico de cuatro cepas de A. tamarense (ATCJ33, ATEB01, CCMP1771, ATBB01) en las que no se detectaron STX (Tabla 1).
15 Los análisis filogenéticos de sxtA1 (Figura 3, Figura 5) muestran que todas las secuencias de sxtA1 formaron un grupo totalmente compatible, dividido en dos subgrupos. Algunos clones de la misma cepa fueron idénticos, sin embargo, se observaron clones ligeramente diferentes para la mayoría de las cepas. Estos diferentes clones se distribuyeron a lo largo de la filogenia, generalmente sin patrones relacionados con especies o cepas. Solo las secuencias de G. catenatum formaron una rama estrecha dentro de uno de los subgrupos. Los parientes más 20 cercanos al grupo de dinoflagelados fueron los genes cianobacterianos sxtA y las policétido sintasas proteobacterianas (Figura 3, Figura 5).
Todas las secuencias de sxtA4 formaron un grupo bien soportado, con clones de la misma cepa distribuidos en todas partes (Figura 4A, Figura 6). Los genes cianobacterianos sxtA y las aminotransferasas actinobacterianas 25 formaron los clados hermanos más cercanos.
Los números de acceso al Genbank para los fragmentos genómicos sxtA1 y sxtA4 son JF343240 - JF343356.
- Número de copias y polimorfismo de sxtA4 30
Se encontraron entre 100 - 240 copias genómicas de sxtA4 en A. catenella en cultivos en lotes por triplicado de ACSH02 recogidos en tres puntos de tiempo con diferentes tasas de crecimiento, en base al ensayo por qPCR (Figura 4B).
35 El análisis de un cóntigo de 987 pb, que cubría el dominio sxtA4 y se basó en lecturas 454 de A. fundyense, reveló al menos 20 polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP), 15 de los cuales eran silenciosos. Los sNp se definieron como un cambio de par de bases que se produjo en al menos dos de las lecturas. El homopolímero se estira y los indeles fueron ignorados.
40 Análisis
- Los genes Sxt están codificados en genomas de dinoflagelados
El genoma de dinoflagelado es inusualmente grande [1,5 - 200 pg de célula 1 de ADN; 52] y muy divergente. 45 Estimaciones recientes predicen que los genomas de dinoflagelados contienen entre 38.000 y casi 90.000 genes que codifican proteínas, que corresponden a 1,5 - 4,5 la cantidad de genes codificados en el genoma humano. Los resultados de la secuenciación >1,2 millones de EST en este estudio demuestran que los homólogos cercanos de los genes implicados en la biosíntesis de STX en cianobacterias también están presentes en los dinoflagelados productores de STX (Tabla 3). Para confirmar aún más sus orígenes de dinoflagelados se investigó que sxtA es el 50 único gen de partida de la ruta de biosíntesis. El transcriptoma de CCMP 1719 de A. fundyense contenía dos familias de transcripciones diferentes que tenían la misma arquitectura de dominio que sxtA en las cianobacterias. Las dos familias de transcripción variaron en longitud, secuencia y cantidad de dominios catalíticos que codifican. Las transcripciones más largas contenían los cuatro dominios presentes en los genes sxtA cianobacterianos conocidos, sin embargo, las transcripciones más cortas carecían del dominio de la aminotransferasa terminal (Figura 55 1). En contraste con las transcripciones bacterianas, ambas familias de transcripciones poseían colas de poliA eucariotas en el extremo 3' y las secuencias líder con corte y empalme de dinoflagelados en el extremo 5'. Por lo tanto, estos resultados muestran claramente que al menos sxtA, y posiblemente otros genes sxt, están codificados en el genoma nuclear de dinoflagelados y que la síntesis de STX en dinoflagelados no se origina en bacterias cocultivadas. Sin embargo, estas bacterias todavía pueden desempeñar un papel importante en la modulación de la
biosíntesis de STX en los dinoflagelados.
Los péptidos señal identificados en ambas transcripciones indican un direccionamiento específico de ambos productos de Sxt. Muchos genes en los genomas nucleares de dinoflagelados son derivados de plastos y sus 5 productos están dirigidos al plasto. Estas proteínas se traducen en el citosol y luego se transportan al plasto a través de las membranas de plastos. En los dinoflagelados que contienen peridinina como Alexandrium, este proceso requiere la presencia de motivos peptídicos de señal y de transferencia. Se predice que ambas transcripciones sxtA contienen péptidos señal, pero las estructuras del péptido de transferencia no se identificaron. Por lo tanto, parece que ambas proteínas sxtA se dirigen fuera del citosol, pero la región de la diana debe investigarse 10 experimentalmente.
Las transcripciones de sxtA de dinoflagelados no difirieron solamente de los homólogos cianobacterianos por la presencia de péptidos señal, secuencias de SL y colas de poliA, sino también en su contenido de GC. Las EST de A. fundyense tenían un contenido de GC considerablemente mayor (Figura 2). Se ha informado que los genes 15 transcritos de especies Alexandrium tienen un contenido promedio de GC >56%, mientras que las cianobacterias filamentosas, tales como los géneros productores de STX Cylindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenon y Lyngbya, tienen un contenido de GC genómico de aproximadamente el 40%. Esto indica que el contenido de GC de sxtA ha divergido significativamente del antecesor que posee el sxtA progenitor, en línea con el resto del genoma en estos microorganismos.
20
La participación de las dos transcripciones de sxtA diferentes y su papel en la síntesis de STX es actualmente poco clara, pero las diferencias en el contenido de GC (Figura 2) indican que están bajo diferentes presiones de selección.
- Las copias no idénticas de sxtA: variación a nivel de genoma y transcriptoma 25
Una característica típica de los genomas de dinoflagelados es que los genes pueden aparecer en copias múltiples, que pueden o no ser idénticas. Esto posiblemente esté relacionado con mecanismos genéticos altamente inusuales, tal como el reciclaje de ADNc procesados. Parece que sxtA también aparece en copias múltiples dentro de los genomas de dinoflagelados. Se estimó que 100 - 240 copias del dominio sxtA4 estaban presentes en el ADN 30 genómico de ACSH02 de A. catenella (ribotipo asiático templado). Las diferencias en el número de copias detectadas a lo largo del ciclo celular están probablemente relacionadas con la tasa de crecimiento del cultivo discontinuo y la proporción de células en diversas fases del ciclo celular. Todas las secuencias genómicas de sxtA4 de 15 cepas diferentes de Alexandrium y G. catenatum formaron un grupo filogenético bien soportado, con varias secuencias de clones ligeramente diferentes de la misma cepa distribuidas por todo el árbol. También se encontró 35 que SxtA1 se producía en copias múltiples no idénticas en todas las cepas analizadas (Figura 5). Además, la separación del grupo de dinoflagelados de sxtA1 en dos sub-clados indica que sxtA1 puede estar codificado por dos clases de genes separadas, al menos en algunas cepas.
La variación genómica de sxtA también está presente en los transcriptomes de Alexandrium. La adición de los datos 40 del transcriptoma al árbol de sxtA1 mostró que el clado superior corresponde a las transcripciones de sxtA más largas, mientras que el clado inferior corresponde a las transcripciones más cortas (Figura 3, Figura 5). Los análisis a nivel de nucleótidos de la región sxtA4 en el transcriptoma de A. fundyense revelaron muchos sitios de SNP, dos tercios de los cuales permanecían en silencio.
45 - Correlación entre la producción de sxtA1, sxtA4 y saxitoxina
Las secuencias genómicas sxtA1 y sxtA4 identificadas durante este estudio estuvieron presentes en todas las cepas de dinoflagelados productores de STX analizadas, incluyendo dos cepas de G. catenatum y 14 Alexandrium de las especies A. catenella, A. minutum, A. fundyense y A. tamarense. Ninguno de los dos fragmentos sxt se amplificó a 50 partir de dos cepas de A. andersoni y tres cepas de A. afines. Tampoco se detectaron homólogos en Gambierdiscus australes, Amphidinium massartii, Prorocentrum lima, Ostreopsis siamensis y Ostreopsis ovata, ninguno de los cuales se sabe que produce STX (Tabla 1).
A pesar de la muy buena correlación entre la presencia de sxtA1 y sxtA4 y el contenido de STX para la mayoría de 55 las cepas analizadas, ambos fragmentos también se amplificaron a partir de cepas de A. tamarense para las que no se detectó producción de STX (Tabla 1). Los análisis por RACE de la cepa de A. tamarense CCMP1771 revelaron que sxtA1 y sxtA4 se transcribieron en esta cepa (datos no mostrados). Se postula que la cantidad de STX producida por A. tamarense es menor que el límite de detección de los métodos de determinación de toxina por HPLC/MS utilizados, ya que se encontró que un ensayo de saxifilina muy sensible utilizado para investigar la cepa
ATBB01 de A. tamarense es tóxico. Se ha sugerido que la abundancia de la transcripción se relaciona positivamente con la cantidad de copias génicas presentes en un genoma de dinoflagelado. Por lo tanto, es posible que las cepas con niveles bajos de STX tengan menos copias de los genes sxt en comparación con aquellas con mayor producción de STX. Si esto es cierto, entonces la presencia de sxtAI y sxtA4 indicaría la toxicidad y podrían 5 desarrollarse métodos moleculares para detectar las células productoras de STX en el entorno.
- Evolución de la síntesis de STX en eucariotas y su papel en la diversificación de Alexandrium
Los genes sxt de cianobacterias están altamente conservados entre especies de cianobacterias y se cree que el 10 grupo de genes ha surgido hace al menos 2100 millones de años. Los resultados en el presente documento muestran que las transcripciones de dinoflagelados sxtA que están estrechamente relacionadas filogenéticamente con un clado de las secuencias sxtA de cianobacterias y otros genes relacionados con toxinas bacterianas putativas (Figura 3 y Figura 4) también tienen la misma estructura de dominio que los genes cianobacterianos sxtA (Figura 1). Se propone que esta sorprendente similitud es más probable debido a un evento de transferencia génica horizontal 15 (HGT) entre las bacterias productoras de STX ancestrales y los dinoflagelados. Dentro de los dinoflagelados, STX se producen por especies de los géneros Alexandrium y Pyrodinium, que pertenecen a la familia Gonyaulacaceae dentro del orden Gonyaulacales, así como por una especie del género Gymnodinium, que pertenece a la familia Gymnodiniaceae en el orden Gymnodiniales. Por lo tanto, estas toxinas se producen por dos géneros dentro de una familia y por una sola especie de un orden de dinoflagelado distante. Esta distribución de síntesis de STX dentro de 20 los dinoflagelados, así como la estrecha relación entre secuencias de sxtA de Alexandrium y Gymnodinium catenatum (Figura 3, Figura 4, Figura 5 y Figura 6), sugiere que HGT de bacteria con respecto al dinoflagelado probablemente tuvo lugar antes del origen de los géneros Alexandrium y Pyrodinium, y fue seguido de una transferencia de dinoflagelado con respecto a dinoflagelado en G. catenatum. La extensión de HGT eucariotas- eucariotas a menudo se subestima debido a las dificultades para detectar dichos eventos, sin embargo, trabajos 25 recientes resaltan la importancia y la prevalencia de dichas transferencias génicas.
La relación entre las secuencias de sxtA4 de dinoflagelados en este estudio no se resolvió en este estudio, ya que la mayoría de los nodos internos no estaban estadísticamente soportados (Figura 5 y Figura 6). Por lo tanto, no fue posible determinar con certeza si la evolución de los genes sxtA refleja la del género Alexandrium, o determinar los 30 orígenes de una HGT putativa de Alexandrium en G. catenatum. Sin embargo, las copias del gen sxtA1 y sxtA4 de múltiples cepas de G. catenatum, A. minutum y A. catenella tendieron a agruparse por especies, lo que indica que su historia refleja la evolución de estas especies. La no amplificación de sxtA1 y sxtA4 de las especies no productoras de STX A. affine y A. andersoni puede indicar que los genes sxtA se han perdido de estos linajes o han mutado tanto, que los cebadores desarrollados aquí no fueron capaces para amplificarlos.
35
Los dos conjuntos de datos de EST de Alexandrium contenían transcripciones, que codificaban homólogos para la mayoría de los genes sxt centrales identificados a partir de cianobacterias (Tabla 3). Aunque la similitud con los genes citobacterianos sxt a menudo era significativa, era mucho menor que la observada para sxtA. Los aciertos más cercanos fueron para otros genes bacterianos o eucariotas presentes en la base de datos. Esto indica que 40 diferentes genes en la ruta sxt pueden tener orígenes separados en dinoflagelados. Se requiere un trabajo adicional para dilucidar los orígenes complejos de este grupo de genes y conducirá a nuevos avances con respecto a los genomas y la biología molecular de estos microorganismos antiguos e importantes.
Ejemplo 2: Método cuantitativo para detectar y cuantificar la producción de STX en dinoflagelados
45
Materiales y métodos
- Mantenimiento de cultivos
50 Los cultivos de dinoflagelados (Tabla 4) se mantuvieron en GSe (Doblin et al., 1999, anteriormente) o en medio L1 (Guillard & Hargraves, 1993 anteriormente) a 16-20 °C. La luz se proporcionó por bombillas fluorescentes blancas (Crompton Light), con un flujo de fotones de 60-100 pmol de fotones irr2 s_1en un ciclo de oscuridad/luz de 12/12 horas. Las cepas usadas se proporcionaron por la University of Tasmania (aisladas por M. de Salas), la Australian National Culture Collection of Marine Microalgae, Provasoli-Guillard Culture Collection (CCMP) y la Cawthron 55 Institute Culture Collection.
Tabla 4. Las cepas de dinoflagelados analizadas, contenido de STX y si el par de cebadores qPCR de sxtA4 dio como resultado un producto. Todas las muestras se analizaron con un control positivo para asegurar que los
inhibidores de la PCR no estaban presentes.
Dinoflagelado____________________Número de cepa STX detectadas1 Producto de qPCR de sxtA4
Alexandrium
affine CCMP112 - -
affine CS-312/02 - -
andersonii CCMP1597 - -
andersonii CCMP2222 - -
catenella ACCC01 + +
catenella ACSH02 + +
catenella ACTRA02 + +
fundyense CCMP1719 + +
minutum CCMP113 + +
minutum CS-324 + +
tamarense ATCJ33 - +
tamarense ATNWB01 + +
Gambierdiscus
australes CAWD148 - -
Ostreopsis
ovata
CAWD174 - -
siamensis
CAWD - -
Amphidinium
massarti CS-259 - -
Gymnodinium
catenatum GCTRA01 + +
Muestra de agua ambiental que contiene: Protoceratium reticulatum Prorocentrum micans, Karenia sp
Karlodinium veneficum Polarella glacialis Symbiodinium sp n/a
- Extracción de ADN y PCR
La densidad del cultivo se determinó regularmente usando una célula Sedgewick Rafter (Proscitech) y un 5 microscopio de luz invertida (Leica Microsystems). Se recogieron números conocidos de células cultivadas durante la fase de crecimiento exponencial. El ADN se extrajo de los sedimentos celulares usando el método CTAB (see Doyle y Doyle, 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:1-5), con una precipitación adicional de ADN durante una noche a -20 °C. La calidad y cantidad de ADN se determinó usando un Nanodrop (Termocientífico), y amplificando un gen de dinoflagelado de control (ARNr de cytb o SSU), de 10 acuerdo con los protocolos de Lin et al. (2009), usando el par de cebadores 4f y 6r, que amplifican un fragmento de 440 pb, o cebadores de ADNr 18S 18SF08 (5'-TTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTG-3'(SEQ ID NO: 220)) y R0ITS (5'-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTC-3'(SEQ ID NO: 221)) que amplifican ~1780 pb.
- Desarrollo del ensayo por qPCR de sxt y determinación del número de copias 15
Se construyó un alineamiento de sxtA4 denómico y secuencias de 9 cepas de las especies Alexandrium catenella, A. tamarense, A. minutum, A. fundyense y Gymnodinium catenatum (GenBank números de acceso JF343238 - JF343239, JF343259-JF343265). Se verificó el grado de conservación de las secuencias génicas para una fracción de 440 pb del dominio sxtA4 y se encontró que era del 94-98% entre especies de Alexandrium, y del 89% entre 20 especies de Gymnodinium catenatum y Alexandrium. Los cebadores específicos para sxtA4 se diseñaron usando el software Primer3 y una secuencia consenso. La especificidad de las secuencias de cebador se confirmó entonces usando BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básica) en el NCBI (National Centre for Biotechnology Information). Las secuencias de los cebadores fueron sxtA4F 5' CTGAGCAAGGCGTTCAATTC 3' (SEQ ID NO: 198) y sxtA4R 5' TACAGATMGGCCCTGTGARC 3' (SEQ ID NO: 199), dando como resultado un 25 producto de 125 pb.
Para determinar su especificidad para cepas productoras de STX, o cepas potencialmente productoras de STX, el par de cebadores de sxtA4 se amplificó a partir de 6 especies de Alexandrium, Gymnodinium catenatum y otras 3 especies productoras de toxina de Gonyaulacales: Ostreopsis ovata, Gambierdiscus australes, Ostreopsis 30 siamensis, un dinoflagelado adicional, Amphidinium massartii, y una muestra ambiental que contenía una comunidad mixta de fitoplancton, incluyendo 6 especies de dinoflagelado identificadas (Tabla 4). La amplificación por PCR se
realizó en 20 |jl de reacciones que contenían plantilla, 0,5 jM de cada cebador, MgCl2 3 mM, 1 jl de BSA (NEB) y 10 jl de Immomix (Bioline), que contenían dNTPs, Immolase Taq polimerasa y tampón de reacción o 20 jl con plantilla, 0,2 jM de cada cebador, MgCb 3 mM, 1 jl de BSA, 2 jl de tampón de reacción MyTaq (Bioline) que contenía dNTPs, 0,2 jl de polimerasa de inicio en caliente MyTaq (Bioline) y H2O. Las PCR de inicio en caliente se 5 realizaron con una etapa de desnaturalización inicial de 95 °C durante 5-10 min, y 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 55 o 60 °C (para los cebadores cytb y sxtA4, respectivamente), 30 s a 72 °C seguido de una etapa de extensión final de 7 min a 72 °C. El fragmento 18S se amplificó en 25 jl de reacciones con plantilla, 1 unidad de tampón de PCR 10X BD Advantage 2 (BD Biosciences), dNTP 5 mM, 0,2 jM de cada cebador, DMSO (concentración final al 10%) y 0,25 unidades de 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix (BD Biosciences). Las PCR se amplificaron como se indica a 10 continuación: 94 °C - 1 min; 30 x (94 °C - 30 s; 57 °C - 30 s; 68 °C - 120 s); 68 °C - 10 min; 8 °C - mantenimiento. Los productos se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa al 3%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron.
La qPCR también se realizó usando un par de cebadores específicos para el ribotipo asiático templado de 15 Alexandrium catenella, encontrado en aguas templadas australianas, basado en una región de la región de ADN ribosomal de la subunidad grande (LSU) (Hosoi Tanabe y Sako, 2005), amplificando un fragmento de 160 pb, catF (5'-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3' (SEQ ID NO: 222)) y catR (5'-GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3'(SEQ ID NO: 223)). Los ensayos se realizaron en muestras ambientales, y las nuevas curvas estándar de este par de cebadores de ARNr LSU se construyeron sobre la base de cepas aisladas de aguas australianas por M. de Salas (UTAS): 20 ACCC01, aislada de Cowan Creek, NSW, aproximadamente a 20 km del sitio Brisbane Water y 50 km del sitio del río Georges, ACSH02, aislada del puerto de Sydney, aproximadamente a 35 km al norte del sitio del río Georges, y ACTRA02, aislada de Tasmania, Australia.
El ciclado de qPCR se realizar en un Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science) usando SSOFast Evagreen supermix 25 (Biorad). Se realizaron ensayos de qPCR en un volumen final de 20 jl que consistía en 10 jl de mezcla maestra Evagreen (que contenía colorante intercalante de ADN, tampón y Taq polimerasa), 1 jl de ADN plantilla, 0,5 jM de cada cebador y 1 jl de BSA. Los ensayos qPCR se realizaron por triplicado con los siguientes ciclos: 95°C durante 10 s, y 35 réplicas de 95°C durante 15 s y 60°C durante 30 s. El análisis de la curva de fusión se realizó al final de cada ciclo para confirmar la especificidad de amplificación, y los productos de PCR seleccionados se secuenciaron. 30
Las curvas estándar tanto para sxtA4 como ARNr LSU se construyeron de dos maneras: (1) Usando una serie de diluciones de una concentración conocida de producto de PCR fresco, que varía de 5,7-5,7 x 10'5 ng(n = 6). Se usaron curvas estándar usando producto de PCR para determinar la eficacia del ensayo (véase el método en Pfaffl, (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR Nucleic Acids Res. 2001 May 35 1;29(9):e45), así como para determinar el número de copias. Las moléculas de producto de PCR se determinaron: (A x 6,022 x 1023) x (660 x B)'1 con A: concentración del producto de PCR, 6,022 x 1023: número de Avogadro, 660: peso molecular promedio por par de bases y B: longitud del producto de PCR. Se determinó el número de moléculas en las muestras desconocidas y se dividió por el número conocido de células en la plantilla qPCR de ADN para obtener el número de copias por célula. (2) Extracción de ADN de muestras duplicadas de números conocidos de 40 células de cepas de Alexandrium catenella (ACCC01, ACSH02, ACTRA02) tomadas durante la fase de crecimiento exponencial, y dilución del ADN al 50% en 3 órdenes de magnitud (n = 6).
Para estimar la abundancia ambiental de A. catenella en las muestras basadas en el ensayo de ARNr LSU, las ecuaciones de (2) se extrapolaron y se aplicaron a los valores de CT medidos para estas muestras. Debido a que se 45 ha encontrado variabilidad en los números de copias de los genes de ARNr entre cepas de algunas especies de Alexandrium, así como una variabilidad de hasta un factor de 2 esperado debido a la variabilidad en el crecimiento y las condiciones del ciclo celular de las células, se determinó el número de copias de la región génica de ARNr LSU en muestras duplicadas de cada una de las 3 cepas. Las abundancias finales de A. catenella en las muestras ambientales se determinaron como la media y la desviación estándar de 6 estimaciones independientes.
50
- Colección de muestras de fitoplancton y ostra
La comunidad de fitoplancton se muestreó diariamente durante la marea media durante el 15-20 de noviembre de 2010, en sitios de monitorización estándar cerca de las granjas de ostras de Sydney (Saccostrea glomerata) en 55 Wagonga Inlet, Narooma, NSW, -36' 13'' E 150' 6'' S y el río Georges, NSW -34' 1" E 151' 8" S (Figura 7). Las muestras también se tomaron en Brisbane Water, NSW -33' 28" E 151' 18" S el 22 de julio de 2010 (Figura 7).
Se tomaron muestras de botellas de 4 l por triplicado cada día para el análisis molecular. Se tomó otra botella de 500 ml y se fijó inmediatamente con yoduro de Lugol para la identificación microscópica y el recuento. Las muestras se
filtraron usando filtros Millipore de 3 pm y se congelaron a -20 °C hasta la extracción del ADN. Se tomaron diez muestras individuales de S. glomerata de granjas en las inmediaciones del sitio de muestreo de fitoplancton el 17/11/10 y el 19/11/10. Las muestras de S. glomerata se agruparon para la prueba de toxinas.
5 Para determinar la especificidad del par de cebadores en muestras ambientales mixtas, se tomaron muestras de una comunidad de fitoplancton en la que no estaban presentes especies conocidas productoras de STX. Se tomaron muestras de 1 l de la comunidad de superficie en Jervis Bay el 19 de enero de 2011, y se conservaron, se concentraron, se identificaron y se contaron especies presentes de 500 ml, como anteriormente. Los dinoflagelados presentes se identificaron como Protoceratium reticulatum, Karlodinium cf veneficum, Karenia sp., Prorocentrum 10 micans, Polarella glacialis, Pfiesteria shumwayae, y Symbiodinium sp. Se filtraron 500 ml de la muestra restante y se realizó la extracción de ADN y PCR como se ha descrito anteriormente.
- Recuentos celulares de Alexandrium usando microscopía
15 Las células de fitoplancton en ~300 ml de las muestras conservadas de Lugol se concentraron por filtración de membrana asistida por gravedad sobre filtros de éster de celulosa de 5 pm (Advantec) antes del lavado en 4 ml y el recuento. Las especies de Alexandrium se identificaron y se contaron usando una célula Sedgewick Rafter y un microscopio Zeiss Axiolab equipado con óptica de contraste de fase. El número de células contadas varió entre las muestras, dependiendo de la abundancia de Alexandrium, y las tasas de error estándar se calcularon usando la 20 ecuación: Error = 2/Vn, donde n es el número de células observadas en la muestra.
- Determinación de toxinas en ostras y culturas
Las muestras de marisco y los sedimentos celulares de dinoflagelados se analizaron mediante HPLC, de acuerdo 25 con el Método oficial AOAC 2005.06 para toxinas paralizantes por mariscos en el Cawthron Institute, Nueva Zelanda. No se usó un modificador de matriz como se describe en el protocolo original, sino que se usaron recuperaciones promedio de pico para cada compuesto por separado. El análisis por HPLC se realizó en un sistema Waters Acquity UPLC (Waters) acoplado a un detector Waters Acquity FLR. La separación se logró con una columna Waters Acquity C18 BEH de 1,7 pm de 2,1 x 50 mm a 30 °C, eluida a 0,2 ml min-1. Las fases móviles eran formiato de amonio 0,1 M 30 (A) y formiato de amonio 0,1 M en acetonitrilo al 5% (B), ambos ajustados a pH 6. El gradiente consistió en el 100% de A durante 0,5 min, un gradiente lineal al 80% de B durante 3,5 min, después volviendo a las condiciones iniciales durante 0,1 min y se mantuvieron durante 1,9 min. El detector de fluorescencia tenía una excitación ajustada a 340 nm y una emisión a 395 nm. Los estándares analíticos para los análogos de STX se obtuvieron del National Research Council, Canadá. El límite de detección del HPLC de los cultivos celulares se consideró que era de 0,1 pg 35 por celula-1 para NEO y STX, 0,2 pg por célula-1 para GTX1/4, GTX6 (B2) y GTX5 (B1), 0,5 pg por célula-1 para C1,2, y <0,3 pg por célula-1 para los análogos C3,4.
Resultados
40 - Especificidad, sensibilidad y eficiencia del par de cebadores
Se encontró que los cebadores diseñados en este estudio amplifican un fragmento del tamaño correcto en todos los dinoflagelados productores de STX de la especie: Alexandrium minutum, A. catenella, A fundyense, A. tamarense y Gymnodinium catenatum (Tabla 4). Además, amplificó un fragmento del tamaño correcto de las especies A. 45 tamarense, cepa ATCJ33, ribotipo de Tasmania, que no se encontró que produjera STX a un nivel superior al límite de detección del método de HPLC utilizado. La secuenciación de los productos confirmó que se trata de un homólogo de sxtA4.
El par de cebador de sxtA4 no amplificó el ADN de las especies de Gonyaulacalean relacionadas no productoras de 50 STX Alexandrium andersonii, Alexandrium affine, Gambierdiscus australes, Ostreopsis ovata o Ostreopsis siamensis ni de la especie de dinoflagelado relacionada de forma más distante Amphidinium massartii. Además, el par de cebadores de sxtA4 no amplificó el ADN de las muestras de fitoplancton, que contenían una comunidad comunidad mixta planctónica que incluía bacterias, diatomeas, picoplancton y los dinoflagelados Protoceratium reticulatum, Karlodinium cf veneficum, Karenia sp., Prorocentrum micans, Polarella glacialis, Pfiesteria shumwayae, y 55 Symbiodinium sp. (Tabla 4). En contraste, el ADN de todas las muestras se amplificó usando el par de cebadores de control positivo para asegurar que la plantilla de reacción estaba intacta y libre de inhibidores.
La eficacia del ensayo sxtA4 basado en este par de cebadores fue del 97% según se calculó usando una serie de diluciones de producto de PCR fresco en 6 órdenes de magnitud. El ensayo tuvo una eficacia del 93-107% según se
calculó usando una serie de dilución del 50% de ADNg duplicado de las tres cepas de A. catenella (Figura 8). Para las curvas estándar basadas tanto en el producto de PCR como basadas en ADNg, los valores de r2 de las ecuaciones de regresión fueron 0,95 o mayores (Figura 8). El ensayo fue sensible a las cantidades de ADN que representan ~30 a >2000 células de las tres cepas de A. catenella. Por lo tanto, si la recolección de muestras se 5 realizó siguiendo un protocolo similar al utilizado, y se recogieron 4 l de agua de mar, se extrajeron y se eluyeron en 15 pl, de los cuales se ensayó 1 pl, el ensayo detectaría entonces concentraciones ambientales de A. catenella con un límite inferior de aproximadamente 110 células por l-1.
- Número de copias de genes sxtA4
10
El número de copias de sxtA4 en las 3 cepas cultivadas de Alexandrium catenella tenía una media de 178-280 por célula-1 (Tabla 5). La toxicidad de estas cepas fue de 3,1-6,6 pg de equivalentes de STX por célula-1 (Tabla 5). En las muestras ambientales, el número de copias de sxtA4 se estimó en 226 y 376 por célula-1 en las muestras del río Georges y Wagonga Inlet, respectivamente, y el más variable entre las estimaciones basadas en las muestras de 15 Wagonga Inlet.
Tabla 5. STX presentes en cepas de Alexandrium catenella, en pg por célula-1 y en Saccrostrea glomerata de los sitios de muestreo, en pg equivalentes de STX kg-1 de marisco, y número medio de copias de genes sxtA4 en la cepa o en todas las muestras de fitoplancton de ese sitio de muestreo. Una lectura de 0 indica que los niveles 20 estaban por debajo del límite de detección de la prueba. Las muestras de S. glomerata se tomaron el 17/11/10, el
19/11/10 y el 22/7/10 para el río Georges, Wagonga Inlet y Brisbane Water, respectivamente.
STX totales GTX- 1,4 GTX- 6 C1,2 GTX-5 (B1) NEO/STX C- 3,4 B2 sxtA4 por célula-1 +/de en la cepa o en la muestra de plancton
cultivos ACSH02
5,25 1,75 0,60 2,40 0,5 <0,1 <0,3 0 178 +/- 49 (n = 9)
ACCC01
6,60 1,15 0 2,55 0 0 1,00 1,9 240+/-97 (n = 3)
ACTRA02 S. glomerata Río Georges
3,13 1,13 0 2,00 0 0 0 0 280 +/- 85 (n = 3)
200
160 traza 30 10 0 traza 0 226 +/- 97
(n = 15)
Wagonga Inlet
48 32 0 16 0 0 0 0 376 +/- 257 (n = 12)
Brisbane Water
145 53 92 0 0 0 0 275 (n = 1)
Muestras ambientales
25 Se detectó sxtA4 en la muestra de Brisbane Water individual, así como en los conjuntos de muestras del río Georges y Wagonga Inlet (Figura 9). La secuenciación y el análisis de la curva de fusión confirmaron que se trata de sxtA4, con una identidad promedio del 99% o superior al gen correspondiente de la cepa Alexandrium catenella. Se observó una relación positiva entre el número de células, según lo estimado a partir de microscopía, el número de células según lo estimado a partir del ADNr LSU, y el número de copias de sxtA4 en ambos grupos de muestras 30 ambientales. La correlación entre el número de células según se estimó a partir de qPCR génica del ARNr LSU y el número de copias del gen sxtA4 estimado fue muy alta para las muestras del río Georges (r2 = 0.97, pendiente = 0,0059, p<0,001), e inferior para la muestra de Wagonga Inlet (r2 = 0,70, pendiente = 0,001, p<0,07) (Figura 9).
STX en muestras de S. glomerata agrupadas se detectaron de cada uno de estos tres sitios, con las mayores 35 concentraciones indicadas para el sitio del río Georges (200 pg de equivalente de STX kg-1 de marisco) con niveles inferiores registrados tanto para Wagonga Inlet como para Brisbane Water (48 y 145 pg de equivalente de STX kg-1 de marisco, respectivamente, Tabla 5).
Análisis
Se proporciona en el presente documento un nuevo método para detectar y cuantificar el potencial de producción de STX en muestras ambientales marinas. El ensayo se basa en la detección del gen sxtA que codifica una enzima única supuestamente implicada en la ruta sxt. El método descrito detectó el gen sxtA en todos los cultivos
productores de STX, y no lo detectó en los cultivos no productores de STX o la muestra ambiental que no contenía especies productoras de STX conocidas. Sin embargo, también se detectaron genes sxtA en la cepa no productora de Alexandrium tamarense, ribotipo de Tasmania, ATCJ33. Dado que se ha encontrado que una cepa estrechamente relacionada del ribotipo de Tasmania de esta especie produce STX (datos no publicados), es posible 5 que la cepa ATCJ33 tenga el potencial de producir STX bajo ciertas circunstancias. La amplificación de sxtA4 de las especies y cepas de Alexandrium y Gymnodinium catenatum en este estudio está en línea con los hallazgos en el Ejemplo uno anterior, en el que se amplificaron fragmentos de aproximadamente 550 pb y de 750 pb de sxtAI y sxtA4 de las mismas cepas ensayadas, y no se detectó la amplificación de estos fragmentos de las especies Alexandrium affine y A. andersonii.
10
- Número de copias del contenido de sxtA4 y STXs
Se encontró que la abundancia de sxtA4 era relativamente similar entre las cepas y las muestras ambientales ensayadas, con un intervalo de 178-376 copias por célula-1 (Tabla 5). Esto apoya los resultados en el Ejemplo uno 15 anterior en el que se encontraron 100-240 copias por célula-1 durante el crecimiento de la cepa ACSH02 de Alexandrium catenella usando qPCR. La toxicidad equivalente de STX total de las tres cepas de Alexandrium catenella fue de 3,1-6,6 pg equivalentes de STX por célula-1 (Tabla 5). Esto está dentro de otras especies productoras de STX, tales como cepas de A. minutum, A. catenella y A. tamarense (0,66-9,8 pg de equivalentes de STX por célula-1), dependiendo del suministro de nutrientes y el crecimiento del cultivo, pero menor que las cepas 20 más tóxicas tales como Gymnodinium catenatum (26-28 pg de equivalentes de STX por célula-1), y Alexandrium ostenfeldii (hasta 217 pg de equivalentes de STX por célula-1)
- sxtA4, A. catenella y STXs en el sudeste de Australia
25 Se tomaron muestras de Alexandrium catenella en tres ocasiones en estuarios del sureste de Australia a lo largo de este período de estudio y, en cada caso, se detectó sxtA4 (Tabla 4). Para el conjunto de muestras del río Georges, la correlación entre copias de sxtA4 por l-1 y la abundancia celular por l-1, según lo determinado por ADNr LSU, fue altamente significativa (Figura 9). En el sitio de muestreo del río Georges, se registraron abundancias medias de 3150-26450 células por l-1 a lo largo del período de muestreo de 5 días en base a la estimación del análisis de ADNr 30 LSU, y 7900-38000, basándose en los recuentos de células microscópicas de los días seleccionados. El último día de muestreo, se encontró variabilidad en los recuentos celulares entre las muestras por triplicado tomadas en el sitio, lo que refleja la fragmentación en la distribución de A. catenella. A pesar de esto, la correlación entre las copias de sxtA4 por l-1 y el número de células de Alexandrium catenella basado en qPCR de ARNr fue muy fuerte (r2 = 0,97, pendiente = 0,0059, p <0,001), y las cargas totales de STX en muestras de ostras tomadas durante esta semana 35 fueron 200 pg de equivalentes de STX por kg-1 de mariscos, por debajo del nivel regulador para la monitorización de la salud pública (800 pg de equivalentes de STX por kg-1 de marisco) pero el más alto de las tres muestras tomadas durante este estudio.
En Wagonga Inlet, se encontraron abundancias medias de 30-288 células por l-1 basadas en la estimación del 40 ensayo de qPCR de ADNr LSU y 80-540 células por l-1 basándose en los recuentos de células del microscopio a lo largo de todo el período de muestreo (Figura 9). La correlación entre las copias de sxtA4 por l-1 y el número de células, según se calculó a partir del ensayo de qPCR de ADNr LSU, fue menor que la de las muestras del río Georges (r2 = 0,70, pendiente = 0,001, p = 0,07). Esto puede reflejar el hecho de que dos de estas muestras contenían menos de 110 células por l-1 y, por lo tanto, estaban en el límite inferior de detección fiable de este 45 ensayo. Como alternativa, el menor coeficiente de correlación de este conjunto de muestreo puede atribuirse a la presencia de diferentes cepas de Alexandrium catenella que difieren en el número de copias de sxtA.
- Métodos de detección para STX y especies de Alexandrium
50 En general, la enumeración de fitoplancton formador de HAB y sus toxinas para la industria y para la investigación oceanográfica biológica se basa en el recuento basado en microscopía de especies y métodos de detección directa de toxinas. La cuantificación de las STX generalmente se realiza mediante bioensayo de ratón, HPLC instrumental, LC-MS o inmunoensayos basados en anticuerpos, tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). La HPLC es un proceso lento y costoso, que requiere un laboratorio analítico bien equipado y patrones 55 puros de STX y sus numerosos análogos. Aunque los métodos de ELISA recientemente desarrollados han superado algunos de estos inconvenientes, no están disponibles para varios derivados de STX comunes, y tienen problemas de reactividad cruzada, ya que los perfiles de las toxinas a menudo son bastante complejos.
Los métodos genético moleculares y basados en anticuerpos para la identificación y enumeración de especies
marinas de fitoplancton tienen muchas ventajas en comparación con los recuentos basados en microscopios y los métodos directos de detección de toxinas: su simplicidad, con un requisito mucho menor de preparación y experiencia en comparación con la identificación taxonómica basada en microscopía, la rentabilidad (los reactivos de qPCR generalmente tienen un coste de menos ~1 dólar por muestra), la velocidad y el potencial para la 5 automatización (hasta 30 muestras pueden procesarse por triplicado en menos de 2 horas en una máquina de qPCR estándar usando placas de 96 pocillos). El coste de las máquinas de qPCR en tiempo real ha disminuido sustancialmente en los últimos años, y es posible manipularlas con una preparación básica en técnicas de biología molecular.
10 Se puede lograr un límite de detección fiable de ~110 células por l-1 de Alexandrium catenella usando el método de qPCR indicado aquí. Los ensayos basados en qPCR para la detección de Alexandrium pueden ser más sensibles que los métodos basados en microscopía a bajas abundancias celulares y donde las especies de interés pueden ser un componente menor del fitoplancton. El método de la cámara de recuento de Sedgewick-Rafter, como se aplica en la mayor parte de los programas de monitorización de fitoplancton, se considera que tiene un límite de detección 15 fiable de 1000 células por l-1. Sin embargo, esto depende del volumen de muestra observado. En el presente estudio, los niveles de detección hasta <20 células por l-1 se lograron utilizando el método de la cámara de recuento de Sedgewick-Rafter, filtrando la muestra de tal forma que se observaron mayores volúmenes de muestra. El error estándar de los recuentos basados en microscopio depende del número de células observadas, y aumenta al disminuir el número de células. Para los métodos basados en genética molecular, el error estándar asociado con los 20 recuentos celulares es independiente de la abundancia de células, para las abundancias de células mayores que el umbral de detección del ensayo. La identificación genética molecular y los métodos de enumeración han indicado umbrales de detección del orden de 10-100 células por l-1 de especies de Alexandrium usando sondas de qPCR y FISH, dependiendo del volumen de agua (típicamente 1-8 l) muestreado usando estos métodos. Dado que las concentraciones tan bajas como de 200 células por l-1 de especies de Alexandrium se han asociado con la absorción 25 de STX en marisco, la detección fiable de especies a bajas abundancias celulares es una ventaja importante de los métodos de enumeración basados en qPCR sobre los recuentos microscópicos según se pone en práctica actualmente en la mayor parte de los programas de monitorización de fitoplancton.
Aunque se han observado muchas ventajas en los métodos de monitorización basados en genética molecular, los 30 métodos actuales tienen varios inconvenientes. La qPCR para la enumeración de especies usando genes marcadores requiere el uso de múltiples sondas en hábitats donde se producen varias especies de Alexandrium, Pyrodinium bahamense y Gymnodinium catenatum y producen STX. Las especies no documentadas previamente en un hábitat particular se identifican ocasionalmente, y es posible que no se aprecien si no está disponible una sonda adecuada para su identificación. Además, la enumeración de ciertas especies diana requiere investigación para 35 cultivar y determinar la toxicidad de las especies locales productoras de STX, ya que esto puede variar entre regiones. Las altas abundancias de Alexandrium catenella en las regiones en las que esta especie generalmente produce STX no siempre se han correlacionado con STX en marisco, lo que sugiere que pueden producirse diferencias en el nivel de población en la producción de STX.
40 Un inconveniente final de la mayoría de los métodos de recuento basados en qPCR es que los genes de ARN ribosómico, que se usan comúnmente para detección, ya que sus velocidades de divergencia relativamente rápidas permiten el diseño de marcadores específicos de especie, pueden variar significativamente en el número de copias entre las cepas de algunas especies de Alexandrium, y en algunos casos, durante el crecimiento de las especies. Esto puede deberse a la presencia de pseudogenes de ADNr inestables en algunas especies de Alexandrium, y 45 posiblemente a la presencia de moléculas de ADNr extracromosómico. El efecto de esta variación es causar disparidades entre el número de genes estimado y el número de células, y en consecuencia, inconsistencias entre las estimaciones de abundancia basadas en microscopía y aquellas basadas en qPCR. Por esta razón, en el presente estudio, se determinó el número de copias de los genes de ADNr LSU en réplicas de tres cepas de A. catenella aisladas de aguas locales, con el fin de obtener una estimación fiable del número de células basado en el 50 número de copias de ADNr LSU.
El nuevo método presentado aquí se basa en la detección directa de un gen (sxtA) involucrado en la síntesis de STX. Por lo tanto, puede estar más estrechamente relacionado con la producción de STX que la abundancia de cualquier especie en particular. Además, es considerablemente más rápido y más económico detectar sxtA que las 55 toxinas reales usando instrumentos analíticos. Usando el par de cebadores descrito, sxtA4 no se amplificó a partir de dos especies de Alexandrium no productoras de STX probadas, sino que se amplificó a partir de la especie de Gymnodinium catenatum, productora de STX relacionada de forma relativamente distante. Esto permite el uso de un único ensayo para detectar simultáneamente varios géneros productores de STX diferentes, incluyendo las especies productoras de STX potenciales que no se conocían previamente en un sitio particular. Sin embargo, el ensayo
también amplificó un producto de una cepa de Alexandrium tamarense ATCJ33 que no se ha encontrado que produzca sTx, lo que refleja los hallazgos en el Ejemplo uno anterior de que esta cepa poseía sxtAI y sxtA4, y mostrando que este ensayo puede no ser indicativo, en un pequeño porcentaje de casos, de la presencia de STX.
5 La regulación del nivel de transcripción puede desempeñar un papel relativamente menor en la expresión de muchos genes de dinoflagelados, en comparación con la regulación en otros organismos, ya que se ha informado que los genes que se regulan positivamente aumentan en la abundancia de la transcripción en no más de aprox. 5 veces, en comparación con los niveles durante el crecimiento estándar. Esto ha llevado a la teoría de que la duplicación de copias genómicas de genes altamente expresados en dinoflagelados puede funcionar como un medio para 10 aumentar su transcripción. Si esto fuera cierto, puede haber una relación entre el número de copias de sxtA por célula'1 y la cantidad de STX producidas por una cepa en particular. En este estudio, las especies evaluadas tenían cuotas de células STX relativamente similares y ninguna diferencia significativa en sxtA por célula-1.
Ejemplo 3: Investigación de secuencias sxtA en especies de dinoflagelados productoras y no productoras 15 de saxitoxina
Objetivo
Para amplificar y secuenciar genes implicados en la síntesis de saxitoxina (STX) en dinoflagelados que se sabe que 20 producen saxitoxina y aquellos que no se sabe que producen STX.
Materiales y métodos
Se cultivaron cepas de dinoflagelados en medio GSe y se mantuvieron en un armario de cultivo a 18 grados, y un 25 ciclo de luz 12/12. El ADN se extrajo de 20 ml de cultivo de crecimiento exponencial mediante cosecha centrifugando a 3000 g durante 5 minutos, después usando el método CTAB.
La plantilla de ADN se amplificó por PCR usando PCR polimerasa rica en Advantage GC (Clontech), que contiene BSA al 10%, en un termociclador con las siguientes condiciones de PCR: una desnaturalización inicial de 5 minutos 30 a 95 °C antes de 35 ciclos de (1) 30 s a 94 °C de desnaturalización, (2) 30 s de hibridación (temperatura variable), y (3) 1-2 minutos a 72 °C de extensión, con una extensión final de 10 minutos a la misma temperatura. Los productos de PCR se escindieron en gel usando Promega Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega), antes de la secuenciación directa con un analizador de ADN ABI3730 (Applied Biosystems) usando cebadores como se indica a continuación.
35 _______________________________________________________________
Sxt001 F TGCAGCGMTGCTACTCCTACTAC (SEQ ID NO: 200) 57,1
Sxt002 R GGTCGTGGTCYAGGAAGGAG (SEQ ID NO: 201) 55,9
Las especies recientemente investigadas para este estudio fueron la especie productora de STX: Alexandrium tamarense, cepa CAWD121, y las especies no productoras Alexandrium sp, cepa AAKT01, Amphidinium massartii CS-259, Amphidinium mootonorum CAWD161, Coolia monotis CAWD98, Gambierdiscus australes CAWD148, 40 Prorocentrum lima CAWD, Protoceratium reticulatum CAWD, Gonyaulax spinifera CAWD.
Resultados
Se identificó un gen del dominio sxtA1 del tamaño correcto a partir de la cepa CAWD121 de la especie Alexandrium 45 tamarense (SEQ ID NO: 224), y la presunta especie productora de saxitoxina de Alexandrium catenella, cepa ACNC50 (SEQ ID NOs: 225-226 muestra secuencias de dominio sxtA1 de dos clones de la cepa ACNC50). Se encontró que esto es un 99% similar al gen correspondiente de la cepa ACSH02 de Alexandrium catenella.
Un gen para sxtA1 (SEQ ID NO: 227) también se amplificó a partir de la cepa AAKT01 de Alexandrium, que no se ha 50 notificado previamente que produzca saxitoxina.
No se podrá amplificar ningún gen de ninguna de las especies no productoras de dinoflagelados restantes.
Conclusión
La presencia de genes supuestamente implicados en la síntesis de saxitoxina en dinoflagelados se ha confirmado en todas las especies que producen saxitoxina. En este estudio, se encontraron en una cepa productora adicional que
ha causado proliferaciones de algas nocivas que contienen saxitoxina en Nueva Zelanda, aislada como CAWD121. Además, se encontró que una especie de Alexandrium, cepa AAKT01, estrechamente relacionada con especies que producen saxitoxina, posee el gen sxtA1. No se ha notificado previamente que esta especie produzca saxitoxina, pero ahora se sugiere que puede producirla bajo ciertas circunstancias. Se pueden requerir análisis de toxinas 5 usando técnicas de detección más sensibles para verificar esta hipótesis. Por ejemplo, Negri et al (2003) notificaron que la cepa A. tamarense, ATBB01 mostró actividad de STX al ensayarse con el ensayo de saxifilina, pero no tenía toxinas detectables cuando se analizó con métodos de HPLC (véase Negri, et al. (2003). "Paralytic shellfish toxins are restricted to few species among Australia's taxonomic diversity of cultured microalgae", J. Phycol. 39(4), 663-667.
10 No se encontró que ninguna de las especies de otras órdenes de dinoflagelados investigadas en este estudio, que no se sabe que producen saxitoxina y que no están estrechamente relacionadas con las especies productoras de saxitoxina, poseyera el gen sxtAI.
Ejemplo 4: Alexandrium catenella de Opua Bay, Nueva Zelanda, según se monitoriza mediante un ensayo de 15 qPCR basado en sxtA
Objetivo
Para determinar si el número de copias del gen sxtA implicado en la síntesis de saxitoxina en dinoflagelados 20 marinos, se correlaciona con un recuento manual del número de células de Alexandrium catenella en muestras ambientales marinas.
Métodos
25 Las muestras se recogieron en Opua Bay, en la región sudeste de la bahía de Onapua en Queen Charlotte Sound, Isla Sur, Nueva Zelanda. Una vez a la semana durante 4 semanas (22/2/12 - 13/3/12), se tomaron por triplicado muestras de 500 ml de una muestra integrada de 0-15 m de profundidad desde la columna de agua y se almacenaron a -80 °C. Después de la descongelación, se filtraron 200 ml de cada muestra a través de un filtro Millipore de 0,45 pm. El filtro se aclaró en ~50 ul de agua de mar en un tubo Eppendorf, se agitó vorticialmente y se 30 centrifugó. El sedimento se extrajo utilizando el kit de suelo de ADN Mobio, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó dos veces en 100 ul (el mismo eluato se enjuagó a través del filtro dos veces). El ADN se concentró en 20 ul de muestra usando una alta precipitación de sal/etanol.
Las secuencias de los cebadores fueron sxtA4F 5'-CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3' (SEQ ID NO: 198) y sxtA4R 5'- 35 TACAGATMGGCCCTGTGARC-3' (SEQ ID NO: 199), dando como resultado un producto de 125 pb.
Las curvas estándar para sxtA4 se construyeron usando una serie de diluciones de una concentración conocida de producto de PCR fresco, que variaba de 5,7-5,7 x 10'5 ng (n = 6). Se usaron curvas estándar usando producto de PCR para determinar la eficacia del ensayo, así como para determinar el número de copias. Las moléculas de 40 producto de PCR se determinaron: (A x 6,022 x 1023) x (660 x B)'1 con A: concentración del producto PCR, 6,022 x 1023: número de Avogadro, 660: peso molecular promedio por par de bases y B: longitud del producto de PCR.
El ciclado de qPCR se realizar en un Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science) usando SSOFast Evagreen supermix (Biorad). Se realizaron ensayos de qPCR en un volumen final de 20 pl que consistía en 10 pl de mezcla maestra 45 Evagreen (que contenía colorante intercalante de ADN, tampón y Taq polimerasa), 1 pl de ADN plantilla, 0,5 pM de cada cebador y 1 pl de BSA. Los ensayos qPCR se realizaron por triplicado con los siguientes ciclos: 95°C durante 10 s, y 35 réplicas de 95°C durante 15 s y 60°C durante 30 s. El análisis de la curva de fusión se realizó al final de cada ciclo para confirmar la especificidad de amplificación, y los productos de PCR seleccionados se secuenciaron.
50 Resultados
Se encontró que el número de copias de sxtA4 por l-1 detectado alcanzó un pico en la tercera semana de muestreo y luego cayó (Figura 10), similar al cambio en la abundancia de las células de Alexandrium catenella. Se encontró que número de copias de sxtA4 t1 en las muestras de agua por triplicado estaba correlacionado significativamente con la 55 abundancia media de células de Alexandrium catenella t1 (Figura 11, R2 = 0,86).
Conclusión
Se encontró que el ensayo cuantitativo de qPCR basado en el gen sxtA es un método fiable para determinar el
potencial de presencia de saxitoxina en muestras ambientales marinas que contenían Alexandrium catenella. Se encontró que la abundancia de copias del gen sxtA estaba correlacionada significativamente con la abundancia de la especie Alexandrium catenella.
5 Ejemplo 5: Amplificación de las secuencias de sxtAI y sxtA4 e investigación de la producción de saxitoxina y sxtA en el clado del grupo V de Alexandrium tamarense "no tóxico"
Resumen
10 Las tres especies de Alexandrium A. tamarense. A. fundyense y A. catenella incluyen cepas que pueden ser potentes productores de la neurotoxina saxitoxina (STX) y sus análogos, los agentes causantes de la intoxicación paralizante por marisco (PSP). Estas tres especies son morfológicamente muy similares, difieren entre sí solo en la posesión de un poro ventral, o en la capacidad de formar cadenas. La idoneidad de estos caracteres morfológicos para la delimitación de especies ha sido ampliamente debatida. Un clado distintivo de este complejo de especie, el 15 Grupo V, el clado de Tasmania, se encuentra en el sur de Australia, y ocasionalmente se produce en proporciones de proliferación. Este clado ha sido considerado no tóxico, y no se han encontrado toxinas PSP en los marisco después de la proliferación de esta especie. En el presente estudio, se identificó una cepa de Tasmania de Alexandrium tamarense, Grupo V, que produce STX y posee el gen, sxtA que está supuestamente involucrado en la producción de STX. El perfil de la toxina se determinó y es inusual, incluyendo una alta proporción de GTX5 y una 20 pequeña cantidad de STX, y difiere de la de A. catenella co-ocurrente (Grupo IV). Una proliferación putativa de A. tamarense que se produjo en octubre de 2010, y el posterior hallazgo de STX en ostras de la roca de Sydney (Saccostrea glomerata), puede sugerir que algunas cepas de origen natural de esta especie podrían producir STX.
Introducción
25
Tres especies comunes y generalizadas del género dinoflagelado Alexandrium, A. catenella, A. tamarense y A. fundyense, poseen características morfológicas muy similares, a veces superpuestas (Balech, 1995, Fukuyo, 1985, Steidinger, 1990). Se considera que este clado comprende un "complejo de especies", ya que consiste en cinco grupos genéticamente distintos (John et al., 2003; Orr et al., 2011; Scholin et al., 1994; Lilly et al., 2007). Las 30 características que se utilizan para la identificación de estas especies incluyen la forma de la célula, la forma del complejo de poro apical (APC), la presencia (A. tamarense) o la ausencia (A. catenella/A. fundyense) de un poro ventral en la primera placa apical, y si las células muestran una tendencia a la formación de cadenas (A. catenella) o no (A. tamarense/A. fundyense) (Balech, 1995). También se han observado algunas formas con morfologías intermedias entre estas tres especies (Cembella et al., 1988; Gayoso y Fulco, 2006; Orlova et al., 2007; Sako et al., 35 1990; Orr et al., 2011).
En contraste con la información basada en la morfología, los numerosos estudios filogenéticos de especies de Alexandrium, en base a regiones del operón de ARNr, incluyendo los genes SSU, ITS/5.8s y LSU, tienen clados claramente diferenciados (Grupos IV) de entre sí (John et al., 2003; Scholin et al., 1994); (Kim y Sako, 2005; Leaw et 40 al., 2005; Lilly et al., 2007; Montresor et al., 2004; Rogers et al., 2006; Orr et al., 2011). Basándose en un estudio de la diversidad de dinoflagelados y su relación con las secuencias de ADNr, Litaker et al. (2007) sugirieron que un marcador conservador de "nivel de especie" en dinoflagelados podría considerarse una diferencia del 4% (= distancia genética no corregida de 0,04) en regiones alineadas de ADNr ITS1/5.85/ITS2. Estos clados de Alexandrium tamarense/catenella/fundyense difieren entre sí en un 13-18% en secuencias alineadas de 45 ITS1/5.8S/ITS2 (Orr et al., 2011), por lo tanto, a un nivel 3-4 veces mayor que en otras especies de dinoflagelados.
La identificación de cepas de Alexandrium tamarense/catenella/fundyense con respecto a un clado genético particular (Grupo I-V) se ha considerado más predictiva de su propensión para la producción de STX que las identificaciones de especies basadas en la morfología (Scholin et al., 1994; John et al., 2003; Kim y Sako, 2005; 50 Leaw et al., 2005; Montresor et al., 2004; Lilly et al., 2007; Rogers et al., 2006). Todas las cepas de los Grupos I y IV analizadas hasta la fecha producen cantidades variables de STX, con diversos perfiles de toxinas (Tabla 7, Anderson et al., 1994), mientras que no se han notificado cepas del Grupo II que produzcan STX (John et al. 2003). La toxicidad de las cepas de los Grupos III y V no está clara. Generalmente se han considerado no tóxicas (Lilly et al., 2007; Scholin et al., 1994; Genovesi et al., 2011; Bolch y de Salas, 2007; Hallegraeff et al., 1991). Se ha 55 informado que una sola cepa con una secuencia genética que la ubica dentro del Grupo III, CCMP116, es tóxica (Penna y Magnani, 1999). Si bien las cepas del Grupo V en general se han considerado no tóxicas (Hallegraeff et al., 1991; Bolch y de Salas, 2007), se ha sugerido que la cepa ATBB01/CS298 de Bell Bay, Tasmania puede producir niveles muy bajos de STX (Scholin et al., 1994; Negri et al., 2003). El perfil de la toxina no se determinó.
En las aguas marinas australianas, las especies de Alexandrium A. catenella y A. minutum producen STX, y han tenido lugar en proporciones de proliferación, lo que da como resultado la captación de STX en los mariscos (Hallegraeff et al., 1988; Hallegraeff et al., 1991; Bolch y de Salas, 2007). De las especies del complejo de especies A. tamarense, se han encontrado dos grupos consistentemente en la región: A. tamarense del Grupo V y A. 5 catenella del Grupo IV (Bolch y de Salas, 2007). No se han encontrado otros grupos de este complejo de especies durante las investigaciones realizadas en los últimos 20 años (Hallegraeff et al., 1988; Hallegraeff et al., 1991; Bolch y de Salas, 2007). Se han presentado varias teorías sobre los orígenes de estas cepas de de "complejo de especies" de A. tamarense en aguas marinas australianas, incluida su introducción en aguas de lastre (Grupo IV), o su presencia a largo plazo en la región (Grupo V) (Bolch y de Salas, 2007).
10
Las proliferaciones de A.catenella (Grupo IV), A. minutum y las especies Gymnodinium catenatum, se han asociado con la captación de STX en vectores de moluscos en múltiples ocasiones en sitios en Nueva Gales del Sur, Australia Meridional, Victoria y Tasmania, Australia. (revisado en Bolch y de Salas, 2007). Los posibles vectores de moluscos que se han investigado para determinar la presencia de STX, ya sea experimentalmente o en el transcurso de la 15 monitorización, en aguas australianas son ostras de la roca de Sidney (Saccostrea glomerata), ostras del pacífico (Crassostrea gigas) y ostras perla Pinctada imbricata (Murray et al., 2009). Las proliferaciones de A. tamarense del Grupo V se han producido de forma intermitente en toda la región, pero no se ha notificado que causen la captación de STX en los mariscos (Hallegraeff et al., 1991).
20 En el transcurso de la investigación de la base genética de la producción de STX, se descubrieron genes para los supuestos dominios de sxtA sxtA1 y sxtA4 en tres cepas de A. tamarense del Grupo V (Stüken et al., 2011). Estas cepas se investigaron de nuevo para determinar sus afinidades genéticas y su potencial para la producción de STX.
Este estudio describe el perfil de la toxina, la morfología y la filogenia molecular de una cepa de A. tamarense que se 25 encontró que producía STX. Además, se informa un hallazgo de presencia de STX en muestras de S. glomerata de Nueva Gales del Sur en 2010, después de una supuesta proliferación de esta especie.
Materiales y métodos
30 Mantenimiento de cultivos
Los cultivos de dinoflagelados se mantuvieron en medios GSe a 18 °C. La luz se proporcionó por bombillas fluorescentes blancas (Crompton Light), con un flujo de fotones de 60-100 pmol de fotones m-2 s-1 en un ciclo de oscuridad/luz de 12/12 horas. Las cepas utilizadas fueron ATCJ33, aislada de Cape Jaffa, Australia del Sur, 35 Australia (-36,94, 139,70); ATNWB01, aislada de North West Bay, Tasmania, Australia (-43,08,147,31); y ATEB01, aislada de Emu Bay, Burnie, Tasmania, Australia (-41,05,145,91), por M de Salas. Los cultivos a granel para la determinación de toxinas se inocularon el mismo día en matraces Erlenmeyer de 2 l y se cosecharon juntos, durante la fase logarítmica tardía o estacionaria temprana, para la extracción de toxinas. La abundancia celular se determinó contando submuestras de 1 ml usando una cámara de recuento de Sedgewick Rafter bajo un microscopio de luz 40 invertida Leica DMIL. Los cultivos se centrifugaron e inmediatamente se congelaron a -20 °C antes del análisis por HPLC o la extracción de ADN. Los sedimentos celulares para el análisis de HPLC contenían 1,25 - 2,25 x 106 células.
LM y SEM
45
Se determinó el tamaño y la forma de la célula usando un Microscopio de Luz Invertida Leica DMIL con 40 o 100 aumentos. Para el microscopio electrónico de barrido, se utilizaron dos métodos, con el fin de mantener intacta la membrana celular o exponerla. Los cultivos se fijaron en tetróxido de osmio al 2% durante 10 minutos, o en glutaraldehído al 4% durante 1-2 horas. Se colocaron en cubreobjetos recubiertos de polilisina o en filtros Millipore 50 de 5 pm, se aclararon en agua destilada, y se deshidrataron en una serie de concentraciones crecientes de etanol (30, 50, 70, 90, 100%), seguido de un secado crítico puntual (Baltec). Cuando se secaron por completo, se montaron o en portaobjetos y se recubrieron por pulverización con oro. Se observaron usando un Microscopio Electrónico de Barrido de Emisión de Campo Zeiss Ultra Plus (FESEM) en la University of Sydney (Australian Centre for Microscopy and Microanalysis) a 5-15 kV.
55
Extracción de ADN y PCR
Se extrajo ADN de los sedimentos celulares usando el método CTAB, con una precipitación adicional de ADN durante una noche a -20 °C. La calidad y cantidad de ADN se determinó utilizando un Nanodrop (Thermoscientific), y
amplificando un gen de dinoflagelado de control (cytb), de acuerdo con los protocolos de (Lin et al., 2009), usando el par de cebadores 4f y 6r, que amplifican un fragmento de 440 pb.
Se amplificaron secuencias parciales de los genes de ARNr LSU y SSU y genes 5.8s/ITS completos usando 5 cebadores publicados previamente: SS3, SS5 (Medlin et al., 1988), D1R, D3b (Scholin et al., 1994) y Alex5.8s (Orr et al., 2011). Las condiciones típicas de ciclado para las PCR consistieron en una etapa de desnaturalización inicial de 94 °C durante 2 min, seguida de 35 ciclos de 94 °C durante 20 s, 56 °C durante 30 s, y 72 °C durante 1 min, seguido de una etapa final de extensión de 7 min. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron mediante transiluminación con UV. Los fragmentos a 10 secuenciar se escindieron del gel, el ADN se purificó usando un kit de purificación de gel Bioline (Bioline, Estados Unidos), se eluyó en 2 x 10 pl de tampón de elución, y la concentración se verificó mediante el uso de un Nanodrop. Después, se usaron aproximadamente 40 ng de producto de PCR para la secuenciación directa con los mismos cebadores usados para la amplificación inicial del producto.
15 Determinación de toxinas
Los sedimentos celulares de dinoflagelados se analizaron mediante HPLC, de acuerdo con el Método oficial AOAC 2005.06 para toxinas paralizantes por mariscos en el Cawthron Institute, Nueva Zelanda. No se usó un modificador de matriz como se describe en el protocolo original; en cambio, se usaron recuperaciones de pico promedio para 20 cada compuesto por separado. El análisis por HPLC se realizó en un sistema Waters Acquity UPLC (Waters) acoplado a un detector Waters Acquity FLR. La separación se logró con una columna Waters Acquity C18 BEH de 1,7 pm de 2,1 x 50 mm a 30 °C, eluida a 0,2 ml min-1. Las fases móviles eran formiato de amonio 0,1 M (A) y formiato de amonio 0,1 M en acetonitrilo al 5% (B), ambos ajustados a pH 6. El gradiente consistió en el 100% de A durante 0,5 min, un gradiente lineal al 80% de B durante 3,5 min, después volviendo a las condiciones iniciales 25 durante 0,1 min y se mantuvieron durante 1,9 min. El detector de fluorescencia tenía una excitación ajustada a 340 nm y una emisión a 395 nm. Los estándares analíticos para los análogos de STX se obtuvieron del National Research Council, Canadá. El límite de detección del HPLC de los cultivos celulares se consideró que era de 0,1 pg por celula-1 para NEO y STX, 0,2 pg por célula-1 para GTX1/4, GTX6 (B2) y GTX5 (B1), 0,5 pg por célula-1 para C1,2, y <0,3 pg por célula-1 para los análogos C3,4.
30
Análisis filogenéticos
Nuevas secuencias de Alexandren tamarense del Grupo V que se generaron en este estudio; (1) ADNr 18S (Subunidad pequeña), (2) ADNr 1 y 2 más 5.8S de la región de transcripción interna (ITS), y (3) ADNr 28S 35 (Subunidad grande), se concatenaron para construir una región de 2.821 caracteres del operón de ADNr para la cepa ATNWB01 (GenBank números de acceso JQ991015, JQ991016, JQ991017). Además, se generaron nuevas secuencias de ADNr LSU a partir de las cepas ATCJ33 (874 pb) y ATEB01 (longitud de 678 pb, GenBank números de acceso JQ991018 y JQ991019). Esto se alineó junto con todos los ortólogos de los datos de secuencia del Grupo V en la base de datos de nucleótidos NCBInr http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/ (a partir de 10.2010), y un grupo externo 40 de A. affine. El modelo MAFFTv6 Q-INS-I (Hofacker et al., 2002; Katoh y Toh, 2008; Kiryu et al., 2007), considerando la estructura secundaria del ARN, se utilizó para alinear el conjunto de datos (se usaron parámetros predeterminados) y la alineación resultante se comprobó manualmente usando MacClade v4.07 (Madison y Madison, 1992). La alineación se infirió entonces con Gblocks v0.91b (Castresana, 2000), bajo los parámetros menos estrictos, para excluir las posiciones mal alineadas y las regiones divergentes de la inferencia filogenética. 45 MODELTEST (Posada y Crandall, 1998) estableció el modelo óptimo de evolución de nucleótidos; para todas las alineaciones se prefirió GTR tanto para el criterio de información de Akaike como bayesiano (AiC y BiC). Los análisis de máxima probabilidad (ML) se realizaron con RAxML-VI-HPC v7.2.6, modelo GTRCAT con 25 tipos de categorías (Stamatakis, 2006). La topología más probable se estableció a partir de 100 búsquedas separadas y se realizaron análisis bootstrap con 100 pseudo-réplicas. Las inferencias Bayesianas se realizaron utilizando Phylobayes v3.2e 50 (Lartillot et al., 2007; Lartillot y Philippe, 2004) bajo el modelo de sustitución GTRCAT con un número libre de categorías de mezcla y una discreta variación entre sitios en 4 categorías. Los árboles se dedujeron cuando la diferencia máxima más grande entre las biparticiones (cadenas) fue <0,1. Toda la estimación del modelo y los análisis filogenéticos se realizaron en el Bioportal disponible gratuitamente (Kumar et al., 2009) en la Universidad de Oslo (
http://www.bioportal.uio.no/).
55
Recogida, recuento e identificación de muestras de fitoplancton y marisco
El fitoplancton se recogió como parte de la monitorización quincenal del NSW Shellfish Program en el río Hastings, Nueva Gales del Sur, Australia (-31,42 E, 152,87 S) durante dos semanas consecutivas en octubre y noviembre de
2010, 25/10/10 y 9/11/10. En la segunda semana, se recogieron ostras de la roca de Sidney (Saccostrea glomerata) de granjas y se analizaron mediante una prueba PSP de Jellett (Jellett Rapid Testing Ltd, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5 Para el recuento de muestras en frascos, se concentraron células de fitoplancton en 500 ml de muestras conservadas de Lugol por filtración de membrana asistida por gravedad sobre filtros de éster de celulosa de 5 pm (Advantec) antes del lavado en 4 ml y el recuento. Las especies de Alexandrium se identificaron y se contaron usando una célula Sedgewick Rafter y un microscopio Zeiss Axiolab equipado con óptica de contraste de fase. Las especies se identificaron por el Dr. S. Brett, quien identificó fitoplancton dañino como parte del NSW Shellfish 10 Program desde 2003. Las especies de Alexandrium se encuentran comúnmente en aguas de NSW, siendo las especies más comúnmente identificadas A. catenella y A. pseudogonyaulax. El número de células contadas varió entre las muestras, dependiendo de la abundancia de Alexandrium, y las tasas de error estándar se calcularon usando la ecuación: Error = 2/Vn, donde n es el número de células observadas en la muestra.
15 Resultados
Microscopía de electrónica de luz y barrido
Las células de ATNWB01 se redondearon, 25 - 45 pm de largo (p = 34,2, n = 20), 27 - 40 pm de ancho (p = 33,6, n = 20 20) (Figura 12, A-B). Las células casi siempre eran individuales. Las cadenas de dos células rara vez se observaron. La primera placa apical se extendió al complejo de poros apicales y contenía un poro pequeño, el poro ventral (Figura 12, C). La placa de poro apical (Po) tenía una forma de coma característica, rodeada por pequeños poros marginales (Figura 12E). Ocasionalmente se observaron células con un poro en la placa sulcal posterior (Figura 12 F). La mayoría de las células carecían de un poro en la placa sulcal posterior.
25
Las células de los cultivos ATCJ33 (Figura 13 A-D), ATEB01 (Figura 13, E, F, H) y ATBB01 (Figura 13 G) tenían células redondeadas. Las células eran en su mayoría individuales, ocasionalmente en cadenas de 2 células (Figura 13 A). Las células de ATCJ33 tenían 23-38 pm de largo (p = 30,6, n = 20), 23 - 38 pm de ancho (p = 29,5, n = 20), las células de ATEB01 tenían 25-40 pm de largo (p = 33,5, n = 20), 23 - 35 pm de ancho (p = 31,6, n = 20). La 30 primera placa apical se extendió al poro apical y contenía un poro ventral (Figura 13B, D, H). La placa de poro apical mostró una forma de coma característica (Figura 13C, G, H).
Análisis filogenético
35 Los análisis filogenéticos que incluían las nuevas secuencias de ADNr (Figura 14, Figura 16), las secuencias de ADNr SSU, ITS/5.8s y LSU parcial de la cepa productora de toxina ATNWB01 y las secuencias LSU de las dos cepas no tóxicas ATCJ33 y ATEB01, muestran que todas estas forman un clado bien soportado (1,00/100, para soporte de PP/BS) junto con otras cepas de A. tamarense del Grupo V. No se pudo observar ninguna diferencia en este clado basado en ADNr de longitud completa, incluyendo las regiones ITS más variables.
40
Comparación de los dominios sxtA1 y sxtA4 de los genes sxtA en las cepas
Se comparó el contenido de nucleótidos de las secuencias para los dos dominios de sxtA en cepas de A. tamarense del Grupo 5, previamente secuenciadas (Stüken et al., 2011). Una secuencia de 440 pb del dominio sxtA4 mostró 45 que la cepa ATNWB01 difería de las otras dos cepas del Grupo 5 de A. tamarense analizadas, ATEB01 y ATCJ33, en solo 2 nucleótidos (99,5% de identidad de secuencia). Por el contrario, estas tres cepas mostraron un 89-98% de identidad de secuencia con estos genes de otras especies de Alexandrium y Gymnodinium catenatum. En una comparación de una región de 450 pb del dominio sxtA1, la cepa ATNWB01 difirió de las otras 2 cepas del Grupo 5 en un 2-2,5% (97,5-98% de identidad de secuencia), en comparación con una identidad de secuencia del 70-93% 50 para otras secuencias de Alexandrium y Gymnodinium catenatum del dominio sxtA1.
Toxinas
De las tres cepas de A. tamarense, Grupo V, se ensayaron aproximadamente 1,5 - 2,2 x 106 células para determinar 55 la toxicidad usando HPLC. Dos cepas, ATCJ33 y ATEB01, tenían perfiles negativos, sin toxinas detectables. Una cepa, ATNWB01, mostró resultados positivos con un perfil que consistía principalmente en GTX5, con parte de STX, C1,2 y deSTX (Figura 15, Tabla 7), y una cuota celular de 15,3 fmol célula'1.
Muestras ambientales
Se detectaron células de Alexandrium a niveles de 350 células por i'1 en muestras de monitorización de rutina recogidas del río Hastings el 25/10/10 (Tabla 6). Las pruebas de Jellet posteriores en muestras de ostras del mismo sitio recogidas el 11 de septiembre de 2010 fueron positivas para las toxinas de PSP. Las células de Alexandrium en 5 las muestras eran células individuales y tenían una forma generalmente redondeada. Las células tenían 35 pm de longitud, y 32-35 pm de ancho. El examen de Alexandrium theca reveló un poro ventral en la placa de 1', una placa de 1' del tamaño y la forma de A. tamarense, y la ausencia de un poro de conexión en el APC.
De las especies de Alexandrium observadas en aguas australianas, el tamaño y la forma de las células, la forma de 10 la placa de 1', la presencia del poro ventral en la placa de 1', y la forma de la APC, parecen más consistentes con Alexandrium tamarense. Sin embargo, no se establecieron cultivos a partir de este evento de proliferación, y ni las secuencias moleculares ni los perfiles de toxinas pudieron confirmarse.
Tabla 6: Resultados de la monitorización de la toxicidad de fitoplancton y ostras, río Hastings.
Sitio
Especie Células l- 1 Fecha Resultado de la prueba de Jellet en muestras de ostras
Río Hastings
Alexandrium tamarense 350 25/10/2010 Negativo
Alexandrium tamarense 350 9/11/2010 Positivo (PSP)
15
Tabla 7. Perfiles de toxinas de cepas del complejo del complejo de especies de Alexandrium catenella/fundyense/tamarense, que muestran el % molar y el contenido total
de toxina. ND = no detectado
Especie
Cepa Clado Perfil C1,2 C3,4 GTX 1,4 GTX 2,3 GTX5 (B1) GTX6 (B2) neoSTX STX dcSTX Contenido de toxina fmol/célula Referencia
Alexandrium tamarense
ATBR2c I 70 - 10 3 16 1 - 42-199* Persich et al 2006
Alexandrium tamarense
ATBR2d I 80 - 10 2 - - 8 - - 42-199 Persich et al 2006
Alexandrium tamarense
ATBR2e I 60 - 19 2 - - 19 - - 42-199 Persich et al 2006
Alexandrium tamarense
ATBR2g I 63 - 33 2 - - 2 - - 42-199 Persich et al 2006
Alexandrium catenella
PFB38 I - - 23,0 77,1 - - - - - 18,5 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB39 I 44,4 - 9,2 4,2 14,2 26,4 - 1,6 - 24,7 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB36 I 26,2 - 13,7 13,7 33,7 0,1 12,5 - - 92,0 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB42 I - - 25,9 74,0 - - - - - 18,3 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB45 I 1,1 - 13,3 27,6 15,9 15,5 20,1 2,5 - 96,9 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB37 I - - 59,6 40,3 - - - - - 11,7 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium catenella
PFB41 I - - 38,1 60,2 - - - - - 8,5 Aguilera-Belmonte et al 2011
Alexandrium tamarense
SZN01 II ND John et al 2003
Alexandrium tamarense
SZN08 II ND John et al 2003
Alexandrium tamarense
SZN19 II ND John et al 2003
Alexandrium tamarense
SZN21 II ND John et al 2003
Alexandrium
Diversas II ND Higman et al 2001
tamarense
cepas
Alexandrium catenella
ATTL01 IV 54 2 - - 44 - - - - 44,3 Lilly et al 2002
Alexandrium catenella
ATTL02 IV 33 20 1 - 46 - - - - 5,3 Lilly et al 2002
Alexandrium catenella
ACPP09 IV 22,2 13,7 30,1 0,5 1,9 30,4 1,0 - Hallegrae ff et al 1991
Alexandrium catenella
ACPP02 IV 11,9 4,6 21,3 0,2 4,0 57,3 0,4 - - Hallegraeff et al 1991
Alexandrium catenella
CAWD44 IV 53 35 8 2 - - 2 - - 150,2 MacKenzie et al 2004*(media de 13 aislados)
Alexandrium tamarense
CAWD12 1 IV 8 90 2 - - - - - - 328,5 MacKenzie et al 2004
Alexandrium catenella
ACSH02 IV 41 - 35 - 10 13 - - - 12,1 Murray et al 2011
Alexandrium catenella
ACCC01 IV 36 14 16 - - 34 - - - 14,7 Murray et al 2011
Alexandrium catenella
ACTRA02 IT 59 - 40 - - - - - - 3,5 Murray et at 2011
Alexandrium tamarense
ATBB01 V ND Orr et al 2011
Alexandrium tamarense
ATBB01 V ND con HPLC, pero alguna respuesta con el ensayo de saxifilina Negri et al 2003
Alexandrium tamarense
ATCJ33 V ND Este estudio
Alexandrium tamarense
ATEB01 V ND Este estudio
Alexandrium tamarense
ATNWB0 1 V 0,1 - - - 86 - - 11 2 15,3 Este estudio
Análisis
En general, entre las cepas de especies tóxicas del género Alexandrium, el perfil de la toxina parece permanecer en gran medida constante a lo largo del tiempo (Cembella y Destombe, 1996) aparte de situaciones de agotamiento 5 extremo de nutrientes (Boczar et al., 1988). Por el contrario, se ha encontrado que la cantidad de toxina producida (cuota celular) varía con el tiempo. Mientras que los perfiles de toxinas parecen ser estables dentro de una cepa, la relación entre un perfil de toxina particular y la identificación de una cepa para un grupo genético particular (I-V) de este complejo de especie no está clara. Se han encontrado variaciones considerables en los perfiles de toxinas entre cepas de cada grupo examinado (Tabla 7).
10
Este estudio es el primer informe del perfil de toxinas de una cepa de Alexandrium tamarense, Grupo V. El estudio muestra que, en base a las características morfológicas, tal como la presencia del poro ventral, y las secuencias largas de genes de ADNr, incluyendo las regiones ITS1/5.8s/ITS2 variables, la cepa ATNWB01 era miembro del Grupo V. Previamente, las cepas de este grupo se han ensayado para determinar la toxicidad por medio de HPLC y 15 se han encontrado no tóxicas (Hallegraeff et al., 1991; Salas et al., 2001; Bolch y De Salas, 2007). Negri et al (2003) notificaron que la cepa A. tamarense, ATBB01 mostró actividad de STX al ensayarse con el ensayo de saxifilina, pero no tenía toxinas detectables cuando se analizó con métodos de HPLC. En el mismo estudio, se encontró que un cultivo que se había identificado como A. tamarense de aguas australianas (cepa ATTRA03) producía STX (Negri et al., 2003). La cepa ATTRA03 murió posteriormente sin verificación de su identidad y, por lo tanto, no está claro 20 qué especie o grupo representaba esta cepa. Puede haberse derivado de un quiste introducido, ya que se aisló como un quiste de un puerto de envío utilizado para exportaciones (Bolch y de Salas, 2007).
Se descubrió que tres cepas de Japón, incluyendo At304, aisladas de Mikawa Bay, Japón, eran miembros del clado del Grupo V en el análisis filogenético (Figura 14). Este es el primer informe de una cepa del Grupo V presente en la 25 región del Pacífico noroccidental, ya que anteriormente se pensaba que estaba confinada al sur de Australia (Bolch y de Salas 2007). La toxicidad de las cepas de Japón no se determinó, y es necesario que se examinen.
La cepa ATNWB01 tenía una cuota de células de STX dentro del intervalo detectable usando métodos de HPLC estándar (15,3 fmol célula-1 Tabla 7). Esto es similar a la cuota de toxinas informada para muchas cepas comunes 30 productoras de STX de este complejo de especies (Tabla 7, 3.5-328 fmol célula-1, 0,66 - 9,8 pg de equivalentes de STX por célula-1). El perfil de la toxina de esta cepa fue relativamente inusual, ya que no se ha notificado comúnmente que GTX5 sea una parte principal del perfil de toxina de cepas del complejo de especies de Alexandrium tamarense (Tabla 7, Anderson et al., 1994). En general, las cepas de Alexandrium catenella (Grupo IV), la fuente más común de PST en moluscos en Nueva Gales del Sur, han contenido altas proporciones de C1/2 y 35 GTX1/4 como componentes principales (Murray et al, 2011; Negri et al. 2003; Hallegraeff et al., 1991). Se ha encontrado que GTX5 es un componente principal de una cepa de Alexandrium tamarense del Grupo I de Chile, (33,7%, Aguilera-Belmonte et al., 2011), y dos cepas de Alexandrium catenella (Grupo IV) de Francia, (44-46%, Lilly et al., 2002).
40 No se hicieron cultivos de la cepa A. tamarense identificada a partir de la muestra del río Hastings, y no se determinaron secuencias moleculares, por lo tanto, no es posible identificarla definitivamente como A. tamarense del Grupo V. Se ha realizado una monitorización quincenal de fitoplancton en 69 sitios en 32 estuarios en Nueva Gales del Sur durante los últimos 7 años. Se ha identificado Alexandrium catenella en 8 ocasiones de muestreo en 2010 y 2011. En 7 de estas, las toxinas PSP se encontraron posteriormente en ostras de muestra de las zonas de 45 recolección de ostras vecinas, utilizando pruebas de Jellet de PSP (NSW Food Authority, datos no publicados). Se identificó Alexandrium tamarense a partir de 4 muestras en 2010 y 2011. La muestra del río Hastings es el primer informe de que se asocia con la toxicidad de PSP en ostras australianas. Los análogos producidos por Alexandrium tamarense del Grupo V, en particular, la alta proporción de GTX5, tiene una baja toxicidad equivalente en comparación con los análogos más tóxicos, tales como STX, y se estima que son aproximadamente un 10% tan 50 tóxicos como STX (Oshima, 1995). Esta baja toxicidad equivalente de STX puede explicar por qué este es el primer informe de un incidente de toxicidad por marisco en esta región que supuestamente está relacionado con una proliferación de esta especie. Se requiere un muestreo adicional de las poblaciones del Grupo V de Alexandrium tamarense en las aguas costeras de Nueva Gales del Sur para verificar si las poblaciones locales pueden producir toxinas.
55
Se ha encontrado que las tres cepas de A. tamarense poseen el gen sxtA (Stüken et al., 2011). Se encontró que los genes sxtA estaban estrechamente relacionados entre sí en todas las cepas del Grupo V (diferencias del 0,5 - 2,5% en las secuencias alineadas para los dominios sxtAI y sxtA4). Por lo tanto, la presencia o ausencia de estos genes en estas cepas parece no estar relacionada con la producción de toxinas.
Las diferencias en el crecimiento y la producción de toxinas en las especies Alexandrium catenella, Alexandrium tamarense y Alexandrium minutum se han notificado previamente, relacionadas con las condiciones ambientales del cultivo, tales como salinidad, luz y nutrientes, y la fase de crecimiento del cultivo (Hamasaki et al., 2001; Hu et al., 5 2006; Lippemeier et al., 2003; Anderson et al. 1990; Grzebyk et al., 2003). En el presente estudio, cada una de las tres cepas de A. tamarense se cultivaron en condiciones de luz idéntica, en los mismos medios y agua de mar, y se inocularon y después se cosecharon los mismos días. Por lo tanto, parece poco probable que la falta de toxicidad encontrada en las otras dos cepas del Grupo V de Alejandrium tamarense sea el resultado de las diferencias en las condiciones ambientales que promueven la expresión diferencial de la producción de STX.
10
Algunas cepas cultivadas de Alexandrium pueden perder toxicidad en el tiempo en cultivo, por ejemplo, en Alexandrium minutum (indicado como A. lusitanicum en Martins et al., 2004). Inicialmente, se pensó que esto estaba relacionado con la exposición a antibióticos, ya que se ha demostrado que las bacterias cocultivadas y simbióticas desempeñan un papel en la mediación de la producción de toxinas en las especies de Alexandrium (Ho et al., 2006).
15 En el presente estudio, los cultivos del Grupo V examinados probablemente contienen comunidades bacterianas mixtas en línea con las del agua de mar en el sitio de aislamiento, y ninguna ha estado expuesta a antibióticos.
Los experimentos de apareamiento han encontrado que los subclones de una cepa clonal tóxica de Alexandrium tamarense (Grupo IV) pueden ser no tóxicos (Cho et al., 2008). Las características no tóxicas de una cepa de A.
20 tamarense, un subclón axénico no tóxico de una cepa tóxica, se confirmaron a nivel de atomoles por célula. Tres de los nueve subclones tóxicos de esta misma cepa se volvieron no tóxicos en un período de tiempo relativamente corto (4-6 años), mientras que los otros subclones tóxicos conservaron su toxicidad y los subclones no tóxicos permanecieron no tóxicos (Cho et al., 2008).
25 Se han encontrado altos niveles de diferencias genéticas poblacionales dentro de la especie Alexandrium catenella del Grupo IV (Masseret et al., 2009), Alexandrium tamarense del Grupo I (Nagai et al., 2007), (Alpermann et al., 2009), A. fundyense del Grupo I (Erdner et al., 2011) y A minutum (McCauley et al., 2009), usando marcadores microsatélites. Esto, en combinación con los resultados de cepas con diferente producción de toxina tras experimentos de apareamiento intraespecífico (Cho et al., 2008), sugiere que también pueden existir diferencias
30 significativas en el nivel de población en la producción de toxinas dentro de A. tamarense (Grupo V). Estudios adicionales que usando marcadores microsatélites en cultivos clónicos múltiples de esta cepa pueden ayudar a determinar si la producción de toxinas está restringida a una población particular de esta especie, lo que puede permitir el diseño de herramientas genéticas predictivas para la identificación de esta población.
35 Bibliografía
Aguilera-Belmonte, A., Inostroza, I., Franco, J.M., RiobÁ, P., Gomez, P.I., 2011. The growth, toxicity and genetic characterization of seven strains of Alexandrium catenella (Whedon and Kofoid) Balech 1985 (Dinophyceae) isolated during the 2009 summer outbreak in southern Chile. Harmful Algae. In Press.
40 Alpermann, T.J., Beszteri, B., John, U., Tillmann, U., Cembella, A.D., 2009. Implications of life history
transitions on the population genetic structure of the toxigenic marine dinoflagellate Alexandrium tamarense. Mol. Ecol. 18(10), 2122-2133.
Anderson, D., Kulis, D., Doucette, G., Gallagher, J., Balech, E., 1994. Biogeography of toxic dinoflagellates in the genus Alexandrium from the northeastern United States and Canada. Mar. Biol. 120(3), 467-478.
45 Anderson, D., Kulis, D., Sullivan, J., Hall, S., 1990. Toxin composition variations in one isolate of the
dinoflagellate Alexandrium fundyense. Toxicon 28(8), 885-893.
Balech, E. 1995. The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata). Shenkin Island Press.
Boczar, B.A., Beitler, M.K., Liston, J., Sullivan, J.J., Cattolico, R.A., 1988. Paralytic shellfish toxins in Protogonyaulax tamarensis and Protogonyaulax catenella in axenic culture. Plant Physiol. 88(4), 1285.
50 Bolch, C.J.S., de Salas, M.F., 2007. A review of the molecular evidence for ballast water introduction of the
toxic dinoflagellates Gymnodinium catenatum and the Alexandrium. Harmful Algae 6(4), 465-485. Castresana, J., 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 17(4), 540-552.
Cembella, A., Destombe, C., 1996. Genetic differentiation among Alexandrium populations from eastern
55 Canada. In: Harmful and Toxic Algal Blooms. Intergovernmental Oceanographic Commission, UNESCO,
Paris, 447-450.
Cembella, A., Taylor, F., Therriault, J.C., 1988. Cladistic analysis of electrophoretic variants within the toxic dinoflagellate genus Protogonyaulax. Bot. Mar. 31(1), 39-52.
Cho, Y., Hiramatsu, K., Ogawa, M., Omura, T., Ishimaru, T., Oshima, Y., 2008. Non-toxic and toxic
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
subclones obtained from a toxic clonal culture of Alexandrium tamarense (Dinophyceae): Toxicity and molecular biological feature. Harmful Algae 7(6), 740-751.
de Salas, M.F., Emmerik, M.J., Hallegraeff, G., Negri, A., Vaillancourt, R., Bolch, C., 2001. Toxic Australian Alexandrium Dinoflagellates: Introduced or indigenous? In: Hallegraeff, G.M., Blackburn, S.I., Bolch,C.J., Lewis, R.J. (Eds.), Proceedings of the Ninth International Conference on Harmful Algal Blooms. Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, Hobart, Tasmania,Harmful Algal Blooms 2000., pp 477-480.
Erdner, D.L., Richlen, M., McCauley, L.A .R., Anderson, D.M., 2011. Diversity and dynamics of a widespread bloom of the toxic dinoflagellate Alexandrium fundyense. PloS One 6(7), e22965.
Fukuyo, Y., 1985. Morphology of Protogonyaulax tamarensis (Lebour) Taylor and Protogonyaulax catenella (Whedon and Kofoid) Taylor from Japanese coastal waters. Bull. Mar. Sci. 37(2), 529-537.
Gayoso, A.M., Fulco, V.K., 2006. Occurrence patterns of Alexandrium tamarense (Lebour) Balech populations in the Golfo Nuevo (Patagonia, Argentina), with observations on ventral pore occurrence in natural and cultured cells. Harmful Algae 5(3), 233-241.
Genovesi, B., Shin-Grzebyk, M.S., Grzebyk, D., Laabir, M., Gagnaire, P.A., Vaquer, A., Pastoureaud, A., Lasserre, B., Collos, Y., Berrebi, P., 2011. Assessment of cryptic species diversity within blooms and cyst bank of the Alexandrium tamarense complex (Dinophyceae) in a Mediterranean lagoon facilitated by semi- multiplex PCR. J. Plankt. Res. 33(3), 405. Grzebyk, D., Bechemin, C., Ward, C.J., Verite, C., Codd, G.A., Maestrini, S.Y., 2003. Effects of salinity and two coastal waters on the growth and toxin content of the dinoflagellate Alexandrium minutum. J. Plankt. Res. 25(10), 1185.
Hallegraeff, G., Bolch, C., Blackburn, S., Oshima, Y., 1991. Species of the toxigenic dinoflagellate genus Alexandrium in southeastern Australian waters. Bot. Mar. 34(6), 575-588.
Hallegraeff, G., Steffensen, D., Wetherbee, R., 1988. Three estuarine Australian dinoflagellates that can produce paralytic shellfish toxins. J. Plankt. Res. 10(3), 533.
Hamasaki, K., Horie, M., Tokimitsu, S., Toda, T., Taguchi, S., 2001. Variability in toxicity of the dinoflagellate Alexandrium tamarense isolated from Hiroshima Bay, western Japan, as a reflection of changing environmental conditions. J. Plankt. Res. 23(3), 271.
Higman, W.A., Stone, D.M., Lewis, J.M., 2001. Sequence comparisons of toxic and non-toxic Alexandrium tamarense (Dinophyceae) isolates from UK waters. Phycologia 40 (3), 256-262.
Ho, A.Y.T., Hsieh, D.P.H., Qian, P.Y., 2006. Variations in paralytic shellfish toxin and homolog production in two strains of Alexandrium tamarense after antibiotic treatments. Aquat. Microb. Ecol. 42(1), 41-53.
Hofacker, I.L., Fekete, M., Stadler, P.F., 2002. Secondary structure prediction for aligned RNA sequences. J. Mol. Biol. 319(5), 1059-1066.
Hu, H., Chen, W., Shi, Y., Cong, W., 2006. Nitrate and phosphate supplementation to increase toxin production by the marine dinoflagellate Alexandrium tamarense. Mar. Poll. Bull. 52(7), 756- 760.
John, U., Fensome, R.A., Medlin, L.K., 2003. The application of a molecular clock based on molecular sequences and the fossil record to explain biogeographic distributions within the Alexandrium tamarense species complex (Dinophyceae). Mol. Biol. Evol. 20(7), 1015-1027. Katoh, K., Toh, H., 2008. Recent developments in the MAFFT multiple sequence alignment program. Briefings Bioinf. 9(4), 286-298.
Kim, C.J., Sako, Y., 2005. Molecular identification of toxic Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes. Harmful Algae 4(6), 984-991.
Kiryu, H., Tabei, Y., Kin, T., Asai, K., 2007. Murlet: a practical multiple alignment tool for structural RNA sequences. Bioinformatics 23(13), 1588-1598.
Kumar, S., SkjÁ¡veland, Á., Orr, R., Enger, P., Ruden, T., Mevik, B.H., Burki, F., Botnen, A., Shalchian- Tabrizi, K., 2009. AIR: A batch-oriented web program package for construction of supermatrices ready for phylogenomic analyses. BMC Bioinformatics 10(1), 357.
Lartillot, N., Brinkmann, H., Philippe, H., 2007. Suppression of long-branch attraction artefacts in the animal phylogeny using a site-heterogeneous model. BMC Evol. Biol. 7(Suppl 1), S4.
Lartillot, N., Philippe, H., 2004. A Bayesian mixture model for across-site heterogeneities in the amino-acid replacement process. Mol. Biol. Evol. 21(6), 1095-1109.
Leaw, C.P., Lim, P.T., Ng, B.K., Cheah, M.Y., Ahmad, A., Usup, G., 2005. Phylogenetic analysis of Alexandrium species and Pyrodinium bahamense (Dinophyceae) based on theca morphology and nuclear ribosomal gene sequence. J. Phycol. 44(5).
Lilly, E., Kulis, D., Gentien, P., Anderson, D., 2002. Paralytic shellfish poisoning toxins in France linked to a human-introduced strain of Alexandrium catenella from the western Pacific: evidence from DNA and toxin analysis. J. Plankt. Res. 24(5), 443.
Lilly, E.L., Halanych, K.M., Anderson, D.M., 2007. Species boundaries and global biogeography of the Alexandrium tamarense complex (Dinophyceae) 1. J. Phycol. 43(6), 1329-1338.
Lin, S., Zhang, H., Hou, Y., Zhuang, Y., Miranda, L., 2009. High-level diversity of dinoflagellates in the
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
natural environment, revealed by assessment of mitochondrial coxl and cob genes for dinoflagellate DNA barcoding. Appl. Environ. Microbiol. 75(5), 1279.
Lippemeier, S., Frampton, D.M.F., Blackburn, S.I., Geier, S.C., Negri, A.P., 2003. Influence of phosphorous limitation on toxicity and photosynthesis of Alexandrium minutum (Dinophyceae) monitored by online detection of variable chorlophyll fluorescence. J. Phycol. 39(2), 320-331.
Litaker, R.W, Vandersea, M.W., Kibler, S.R., Reece, K.S., Stokes, N.A., Lutzoni, F.M., Yonish, B.A., West, M.A., Black, M.N.D., Tester, P.A., 2007. Recognizing dinoflagellate species using ITS rDNA sequences. J. Phycol. 43(2), 344-355.
Madison, W., Madison, D., 1992. MacClade: interactive analysis of phylogeny and character evolution. Sunderland, Massachusetts: Sinnauer Associates.
Martins, C.A., Kulis, D., Franca, S., Anderson, D.M., 2004. The loss of PSP toxin production in a formerly toxic Alexandrium lusitanicum clone. Toxicon 43(2), 195-205.
Masseret, E., Grzebyk, D., Nagai, S., Genovesi, B ., Lasserre, B., Laabir, M., Collos, Y., Vaquer, A., Berrebi, P., 2009. Unexpected genetic diversity among and within populations of the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella as revealed by nuclear microsatellite markers. Appl. Environ. Microbiol. 75(7), 2037-2045. McCauley, L.A.R., Erdner, D.L., Nagai, S., Richlen, M.L., Anderson, D.M., 2009. Biogeographic analysis of the globally distributed harmful algal bloom species Alexandrium minutum (Dinophyceae) based on rRNA gene squences and microsatellite markers. J. Phycol. 45(2), 454-463.
Medlin, L., Elwood, H.J., Stickel, S., Sogin, M.L., 1988. The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene 71(2), 491-499.
Montresor, M., John, U., Beran, A., Medlin, L.K., 2004. Alexandrium tamatum sp. nov. (dinophyceae): A new nontoxic species in the genus Alexandrium. J. Phycol. 40(2), 398-411. Murray, S.A., O'Connor, W.A., Alvin, A., Mihali, T.K., Kalaitzis, J., Neilan, B.A., 2009. Differential accumulation of paralytic shellfish toxins from Alexandrium minutum in the pearl oyster, Pinctada imbricata. Toxicon 54(3), 217-223.
Murray, S.A., Wiese M., Strüken, A., Brett, S. Kellmann, R., Hallegraeff, G.M., Neilan, B.A, 2011. sxtA-based quantitative molecular assay to identify saxitoxin-producing harmful algal blooms in marine waters. Appl. Environ. Microbiol. 77:7050-7057.
Nagai, S., Lian, C., Yamaguchi, S., Hamaguchi, M., Matsuyama, Y., Itakura, S., Shimada, H., Kaga, S., Yamauchi, H., Sonda, Y., 2007. Microsatellite markers reveal population genetic structure of the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense (dinophyceae) in Japanese coastal waters. J. Phycol. 43(1), 43-54. Negri, A., Llewellyn, L., Doyle, J., Webster, N., Frampton, D., Blackburn, S., 2003. Paralytic shellfish toxins are restricted to few species among Australia's taxonomic diversity of cultured microalgae. J. Phycol. 39(4), 663-667.
Orlova, T.Y., Selina, M.S., Lilly, E.L., Kulis, D.M., Anderson, D.M., 2007. Morphogenetic and toxin composition variability of Alexandrium tamarense (Dinophyceae) from the east coast of Russia. J. Phycol. 46(5).
Orr, R.J.S., Stüken, A., Rundberget, T., Eikrem, W., Jakobsen, K.S., 2011. Improved phylogenetic resolution of toxic and non-toxic Alexandrium strains using a concatenated rDNA approach. Harmful Algae 10(6), 676688.
Oshima, Y., 1995. Postcolumn derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins. J. AOAC International 78(2), 528-532.
Parkhill, J.P., Cembella, A.D., 1999. Effects of salinity, light and inorganic nitrogen on growth and toxigenicity of the marine dinoflagellate Alexandrium tamarense from northeastern Canada. J Plankt. Res. 21(5), 939-955.
Penna, A., Magnani, M., 1999. Identification of Alexandrium (Dinophyceae) species using PCR and rRNA targeted probes. J. Phycol. 35(3), 615-621.
Persich, G., Kulis, D., Lilly, E, Anderson D. M., Garcia V.M.T. 2006. Probable origin and toxin profile of Alexandrium tamarense (Lebour) Balech from southern Brazil. Harmful Algae 5, 36-44.
Posada, D., Crandall, K.A., 1998. Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14(9), 817-818.
Rogers, J.E., Leblond, J.D., Moncreiff, C.A., 2006. Phylogenetic relationship of Alexandrium monilatum (Dinophyceae) to other Alexandrium species based on 18s ribosomal RNA gene sequences. Harmful Algae 5(3), 275-280.
Sako, Y., Kim, C.H., Ninomiya, H., Adachi, M., Ishida, Y., 1990. Isozyme and cross analysis of mating populations in the Alexandrium catenella/tamarense species complex. In: Toxic Marine Phytoplankton. Elsevier, New York, 320-323.
Scholin, C.A., Herzog, M., Sogin, M., Anderson, D.M., 1994. Identification of group and strain specific genetic markers for globally distributed Alexandrium (dinophyceae). II Sequence analysis of a fragment of the LSU rRNA gene. J. Phycol. 30(6), 999-1011.
Stamatakis, A., 2006. RAxML-VI-HPC: máximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22(21), 2688.
Steidinger, K.A., 1990. Species of the tamarensis/catenella group of Gonyaulax and the fucoxanthin derivative-containing gymnodiniods. In: Graneli, E., Sundsstrom, B., Edler, L., Anderson, D.M. (Eds.), Toxic 5 Marine Phytoplankton. Elsevier, New York,, pp. 11-16.
Strüken, A., Orr, R.J.S., Kellmann, R., Murray, S.A., Neilan, B.A., Jakobsen, K.S., 2011. Discovery of nuclear-encoded genes for the neurotoxin saxitoxin in dino flagellates. PloS One 6(5), e20096.
Wohlrab, S., M. H. Iversen, and U. John. 2010. A molecular and co-evolutionary context for grazer induced toxin production in Alexandrium tamarense. PloS One 5:e15039.
10 Yang, I., U. John, S. Beszteri, G. Glockner, B. Krock, A. Goesmann, and A. D. Cembella. 2010. Comparative
gene expression in toxic versus non-toxic strains of the marine dinoflagellate Alexandrium minutum. BMC Genomics 11:248.
Ejemplo 6: Reacciones de qPCR para la detección de sxtA4 y discernimiento entre cepas tóxicas y no 15 tóxicas de Alexandrium minutum
Materiales y métodos
Se realizaron reacciones de qPCR de 10 pl o 20 pl en un sistema Roche LightCycler®480 en una placa blanca de 96 20 pocillos. Cada reacción contenía 5 o 10 pl de LightCycler® 480 SYBR Green I Master, 125 nM de cada cebador (sxt072 y sxt073) y plantilla (ADNc o ADNg de Alexandrium). Las reacciones se realizaron por duplicado. Se incluyeron curvas estándar y controles sin plantilla en cada placa. Las curvas estándar se generaron con 10x diluciones en serie de un amplicón de PCR purificado en gel generado a partir de la cepa CCMP113 con los cebadores sxt007 y sxt008 (pCr para obtener amplicón como se describe en Stüken et al. 2011, PlosOne). Los 25 parámetros de ciclado de qPCR fueron: inicio en caliente: 1x (95 °C, 10 min); amplificación: 45x (94 °C, 10 s; 64 °C, 20 s; 72 °C, 10 s, adquisición única; curva de fusión: 1x (95 °C, 5 s; 65 °C, 1 min; mediciones continuas de hasta 97 °C); Enfriamiento: 1x (40 °C, 10 s). El punto de cruce y los análisis de la curva de fusión se realizaron usando el software suministrado por Roche.
30 Los cebadores de qPCR usados para la detección de sxtA en estos experimentos fueron:
sxt072 CTTGCCCGCCATATGTGCTT (SEQ ID NO: 228) sxt073 GCCCGGCGTAGATGATGTTG (SEQ ID NO: 229)
35 Resultados
Las siguientes cepas se ensayaron por la qPCR descrita anteriormente.
Especie
Cepa ¿Síntesis de SXT? Resultado
Alexandrium minutum
1022 Rance en investigación doble pico
Alexandrium minutum
771 Penzé en investigación doble pico
Alexandrium tamarense
ATNWB01 sí pico individual
Alexandrium tamarense
ATCJ33 no pico individual
Alexandrium tamarense
ATEB01 no pico individual
Alexandrium catenella
ACTRA sí pico individual
Alexandrium catenella
ACCC01 sí pico individual
Alexandrium andersonii
CCMP2222 no *confuso
Alexandrium insuetum
CCMP2082 no *confuso
Alexandrium affine
CCMP112 no *confuso
Alexandrium affine
PA8V no sin amplificación
Alexandrium minutum
CCMP113 sí pico individual
Alexandrium minutum
AL24V sí pico individual
Alexandrium minutum
Min3 sí pico individual
Alexandrium minutum
VGO650 no doble pico
Alexandrium minutum
VGO651 no doble pico
Alexandrium minutum
AL10C sí pico individual
Alexandrium catenella
CCMP1493 sí pico individual
Alexandrium fundyense
CCMP1719 sí pico individual
Alexandrium fundyense
MDQ1096 sí pico individual
Las secuencias para cepas productoras de saxitoxina se generaron como se indica a continuación:
Alexandrium minutum CCMP113_sxtA4_gDNA_consensus (SEQ ID NO: 230)
5 Alexandrium minutum CCMP113_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 231)
Alexandrium minutum AL24V_sxtA4_gDNA_consensus (SEQ ID NO: 232)
Alexandrium minutum AL24V_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 233)
Alexandrium minutum Min3_sxtA4_gDNA_consensus (SEQ ID NO: 234)
Alexandrium minutum Min3_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 235)
10 Alexandrium minutum VGO650_sxtA4_gDNA_consensus (SEQ ID NO: 236)
Alexandrium minutum VGO651_sxtA4_gDNA_consensus (SEQ ID NO: 237)
Alexandrium minutum VGO651_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 238)
Alexandrium minutum AL10C_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 239)
Alexandrium catenella CCMP1493_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 240)
15 Alexandrium fundyense CCMP1719_sxtA4_cDNA_consensus (SEQ ID NO: 241)
Alexandrium fundyense MDQ1096_sxtA4_cDNA_consensus (SeQ ID NO: 242)
Los cebadores utilizados detectaron sxtA en especies productoras de STX y también pueden discriminar entre cepas tóxicas y no tóxicas de Alexandrium minutum. A. minutum no tóxicos tienen dos copias de sxtA diferentes en su 20 genoma, lo que da como resultado una curva de fusión bimodal, cuando se usa un ensayo Sybr Green (véase la Figura 17: A. minutum tóxico AL1V, dos curvas, A. minutum no STX VGO651, una curva). Otras especies también tienen curvas de fusión características, pero la discriminación entre especies tóxicas y no tóxicas basada en la curva de fusión solo funciona para A. minutum.
25 También se demostró que los cebadores sxt072 y sxt073 funcionan bien con la sonda Universal Probe Library de Roche, #142 (datos no mostrados). Este ensayo es muy específico y útil para la detección de sxtA en muestras ambientales.
Ejemplo 7: sxtAI y sxtA4 están ausentes en las cepas de dinoflagelados que no producen saxitoxinas
30
Materiales y métodos
Las PCR de sxtA1 y sxtA4 se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
35 Resultados
sxtA (1/4) no se detectó en ninguna de las cepas de dinoflagelados enumeradas a continuación:
Especie/Taxón sxtA (1/4)

Adenoides eludens CCMP1891 n.d.

Alexandrium insuetum CCMP2082 n.d.

Amphidinium carteri UIO081 n.d.

Amphidinium mootonorum CAWD161 n.d.

Azadinium spinosum RCC2538 n.d.

Ceratium longipes CCMP1770 n.d.

Coolia monotis n.d.

Gambierdiscus australes CAWD148 n.d.

Gymnodinium aureolum SCCAP K-1561 n.d.

Heterocapsa triquetra RCC2540 n.d.

Karlodinium veneficum RCC2539 n.d.

Lepidodinium chlorophorum RCC2537 n.d.

Lingulodinium polyedrum CCMP1931 n.d.

Pentapharsodinium dalei SCCAP K-1100 n.d.

Polarella glacialis CCMP2088 n.d.

Prorocentrum micans UIO292 n.d.

Prorocentrum minimum UIO085 n.d.

Protoceratium reticulatum n.d.

Pyrocystis noctiluca CCMP732 n.d.

Scrippsiella trochoideae BS-46 n.d.

Thecadinium kofoidii SCCAP K-1504 n.d.

Claims (12)

1. Un método para detectar un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, comprendiendo el
método:
obtener una muestra para su uso en el método; y
analizar la muestra para detectar la presencia de uno o más de un polinucleótido de dominio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido; en el que:
10 el dominio catalítico de saxitoxina se selecciona de: dominio catalítico de saxitoxina A4 o un fragmento de
un dominio catalítico de saxitoxina A4; y
la presencia de dicho polinucleótido o polipéptido indica la presencia de un dinoflagelado productor de saxitoxina en la muestra.
15 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de
nucleótidos de saxitoxina A seleccionada de las expuestas en cualquiera de las SEQ ID NOS: 230-242 o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina 20 A4 o fragmento de la misma comprende los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la
SEQ ID NO: 3, los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho análisis 25 comprende:
(i) amplificación de polinucleótidos de la muestra mediante reacción en cadena de la polimerasa; o
(ii) amplificación de polinucleótidos de la muestra mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando
uno o más cebadores que comprenden una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 19830 199, 228-229 y 243-244, o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de saxitoxina A4 como se expone en los residuos 947-1281 de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de la misma.
35
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dinoflagelado productor de saxitoxina es:
(i) del género Alexandrium, Pyrodinium o Gymnodinium; y/o
40 (ii) se selecciona del grupo que consiste en A. catenella, A. fundyense, A lusitanicum, A. minutum, A.
ostenfeldii, A. tamarense, G. catenatum y P. bahamense var compressum.
7. Uso de un kit para la detección de un dinoflagelado productor de saxitoxina en una muestra, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de un polinucleótido de dominio catalítico de
45 saxitoxina A de dinoflagelado o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido, en el que el dominio catalítico de saxitoxina se selecciona de: dominio catalítico de saxitoxina A4, o un fragmento de un dominio catalítico de saxitoxina A4.
8. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el agente se une específicamente a un 50 polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de saxitoxina A seleccionada de las expuestas en una
cualquiera de las SEQ ID NOS: 230-242 o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
9. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia del dominio catalítico de saxitoxina A4 o fragmento de la misma comprende los nucleótidos 3115-4121 de la secuencia de polinucleótidos
55 indicada en la SEQ ID NO: 3, los nucleótidos 3597-3721 de la secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o variante de cualquiera de las secuencias.
10. Uso de un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el agente es un cebador, sonda o anticuerpo.
11. Uso de un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el agente es un cebador que comprende una secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 198-199, 228-229 y 243244, o un fragmento o variante de una cualquiera de esas secuencias.
5
12. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el agente se une específicamente a una secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de saxitoxina A4 como se expone en los residuos 947-1281 de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de la misma.
imagen1
>i.i. i i .T~^n>r^i
líder con corte y 'empalme de dlnoflagelado
región no traducida (5 0 3' UTR)
dominio catalítico
FIGURA 1
■
•Alexandrium largo
indrium corto aena
•APha™2ornenon
FIGURA 2
imagen2
Genómico + Transcripción larga Dinoflagelado
i. ,r»*i iiniM »m i fr*
■'. .••• ■
■; ••
í.í;
-i
Wéw
Genómico + Transcripción corta
Cianobacteria
beta-cetoacil sintasa
GRUPO EXTERIOR
FIGURA 3
imagen3
' « "v:r*~V ■
Dinoflagelado
sxtA4
Genómico + transcripción
100/1.00

'V . • ' ■■•-

Cianobacteria . ,
sxtA4

i .
Actinóbacteria
• •
aminotransferasa
' ¡ ■ •
' i ■ S
GRUPO EXTERIOR
¿jjfv vv<h, «fcí* J- FIGURA 4A
>jfW
¡f- ’*•
temprano (M=~0,35) exp tardío (u=-0,10) estacionario (u=0)
toa'voo
imagen4
■A mínutum CCMP113 001/19
• A. tnnutum AMAD 16 002/02 ■ A. mtnutum CCMP1868 d0$
• A. /nrutum CCMP1688 d06/04 A mtnutum CCMP18M 006/03
• A. mtnutum CCMP113 d01/17 A. mnutum AMAD 16 d02
• A mtnutum CGMP113 d01/20 A mínutum AMAD 16 002/03 A mms.wo AMA018 CC2/01 A mtnutum CCMP113 001/01 A mtnutum CCMP113 001/16 A mínutum AMAD 16 004
• A mtnutum CCMP1888 d06/02 A mnutum CCMP113 001/03 •A m*n/ft*nCCM0113dO1ft>5 A. tomáronlo ATCJ33 r A tomo'onso CCMP115 d01 'A. tamwe/TMCCIylPl15d03 A. fundyenso long RACÉ transcrlpt A. fundyorm CCMP1979 d03 A tund/mnio CCMP1979 d04 A tundyonto CCMP1719 002 A tundyonto CCMP1719 002/05 A. tun&yonio CCMP1719 <302.08 A tundyonto CCMP1719 002/04 A tundyonto CCMP1719 002/07
G cotonatum GCTRAOt d04 G eatonotum GCTRAOt d03 G. eatonotum GCTRAOt dOt G. eatonotum CS395 - G eatonotum GCTRAOt c.02
G catanafum GCTRAOt '
A cotooatia ACOC01 d22 A cotonada CCMP1493 d07 A cotonada CCMP 1493 005 A catonotu CCMP1493 006 A cotonada CCMP 1493 008 •A catonofta ACTRA02 A catonada ACTRA02 033 A. cotonotlé ACCCOt c<24 A catonoda ACOC01 A tomáronlo ATNWB01 -A mtnutum AMAD 16 A rain»roo»# ATEB01 006 A tomáronlo A TE 801 d03 A tamarons# ATEBOI A lomáronlo ATBB01 d03 A tamaronto ATBB01 dOW2 A tomáronlo ATBBOt dOt A Utmororn» ATBBOt cKM/01 A tundyonto CCMP1719 002/02 A fcwx/y#na#CCMP1719tí03 A tundyonto CCMP1719 002/03 A tundyonto CCMP1719 d02/06
A. tundyonso ehort RACE transcrlpt A. 7undyenso4S4contlg repc7707 A tundyonso CCMP1719 dOl A fundyansa CCMP1719 002/01 A tomáronlo ATBB01 002 |__f- A tomáronlo CCMP115 d04 A. caían*#* ACTRA02 036 A carañada CCMP 1493 003 A. entono)» ACCCOt 025 — A. mlnutum 4$4contlg repc16S37 Aphomtomonon ip NH5 (ACG63601)
AnjOaan# cirtinad» AWOC131C (ABI75123)
Lyngbyo wollot (ACG63626)
C>1*KtrospormofiSi3 rmtíbonlu T3 (A8I75094)
Rophhikxms bmoM D9 (ZP_06305237)
----------Candidotus ErdobugOa «oída (ABM63529)
- Yontrls krtstonsonH ATCC33638 (ZP.04622165)
9M.C0
Dinoflagelado
sxtA1
---------------- My¡rococcua rantfiua 0K1622 (YP_«32116)
r- Burihoidono ubonanait Bu (ZP.023604S6) BurimoVorlo ombáeno AMMO (YP_777804)
-------------------------Kortf#a*ictfaOT1 (ZP_021fl1699)
---------Dokdonio dongAoomi* MEDI 34 (ZP_0tO5O532)
- Nottoc punettorma PCC73102 (YP_001866558)
Cianobacteria
sxtA1
| Proteobacteria
¡GRUPO EXTERIOR
FIGURA 5
imagen5
52/0,51
A. minutum AMAD 16 CI03/01 A. minutum AMAD 16 CI03/02 A. minutum AMAD 16 d03/04 A. minutum CCMP113 d03/02 A. minutum CCMP1888 CI07/01 A. minutum ALSPOI d04 A. minutum CCMP113 cl03/06 A. minutum 454contlg repc1730 A. minutum CCMP1888 c!31 A. minutum AMAD16 d03/03 A. minutum CCMP113 CI03/05 A. minutum CCMP1888 d07/03 A. minutum CCMP113 CI03/10 A. minutum AMAD16 A. minutum CCMP113 d03/01 A. minutum CCMP1888 d07/02 A. minutum CCMP113 d03 A. minutum CCMP113 d03/07 A. minutum CCMP1888 d01
■ A. minutum AMAD16 CI03/05 G. catonatum GCTRA01
A. temáronse ATBB01 d.0S/02 A temáronse ATB0O1 CI05/O3 A. temáronse ATEB01 A temronse ATNWB01 A. temáronse ATBB01 d02 A. tamarense ATBB01 d05/04 A. temáronse ATBB01 c¡05/01 A. tomáronse ATCJ33
A. fundyonso 454contlg ropc51370 A. fundyonso 454contlg repelí370
A. fundyonso CCMP1719 d07 A. fundyonso CCMP1979 d39 A. coto noli a ACTRA02
• A. fundyonso CCMP1719 CI04/04
• A. fundyonso CCMP1719 d04/0l A. fundyonso CCMP1719 d25 A. fundyonso CCMP1979 d36
■ A. cntono/la ACSH02 A. catenella CCMP1493 d01 A. caten olla ACOC01
- A. fundyonso CCMP1719 d04/05 r A. fundyonso CCMP1719 d28 ‘ A. fundyonso CCMP1979 d38 A. fundyonso CCMP1719 d04/06 . A. fundyonso CCMP1719 d24 • A. fundyonso CCMP1719 d27 A. minutum ALSP02 d10 minutum ALSP02 el 12 A. minutum ALSP02 d01 A. minutum ALSP02 d11 A. minutum ALSP02 d09 A. minutum ALSP02 di3 L— A. fundyonso CCMP1979 d02 i A. femáronse CCMP116 d02 ■ A. temáronse CCMP115 d20 A. fundyonso CCMP1719 d04/02 A. fundyonso 454contig repc3425 A. fundyonso long RACE transcrlpt A. fundyonso 454contig repc21538 A. fundyonse CCMP1979 d35 A. fundyonso 454contlg repc51400
Anebeona circinalis AWQC131C (ACF94637) Aphonlzomenon sp. NHS (ACG63801)
Rophldiops/s brookii D9 (2P_06305237) Cylindrospormopsls raclborskil T3 (ACF94636)
Lyngbya woiloi slr Carmlcbael Alabama (ACF94632) Frankio sp. EANIpec (YP_001505355)
Frankia sp. EUN1f (EFC84918)
Frankla alnl ACN14a (YP_716114)
Frankia sp. Cd3 (YP_482822)
Plasmodium viva» Salí (XP_001616796) Plasmodlum borghel ANKA (XP_676780) Plasmodium knovtlesi H (XP_002260835) Plasmodium falclparum 3D7 (XP_001348328)
Cryptosporidium murls RN66 (XP_002140281) Toxoplasma gondli ME49 (XP_002368482)
• Synocbococcus sp. PCC7002 (YP_001735222)
i
J
'1,001 »
'Li
___r*
30/1,001 L— /
Lr“ Fra
>— Fra t Pías
i—
1 Plasn
1 I------ To
Dinoflagelado
sxtA4
■ Blastopirollula marina DSM3645 (ZP_01092227)
------Acaryochlons monna MBIC11017 (YP_001515086)
Cianobacteria
sxtA4
Actinobacteria
GRUPO EXTERIOR
imagen6
imagen7
35,00
y = -3,1528x ♦ 33,79
R* = 0.9666
30,00
y = -3,4316x> 31,779
RJ = 0.9809
O 25,00
y - -3.5119x* 34,959
R! = 0,9459
20,00
♦ ACTRA01
□ ACCC01
15,00 ¡
ACSH02
10,00
o,so
1.50
3,50
Numero de células logarítmicas
FIGURA 8
-e-sxt
-*-LSU
—x— recuento celular
15-Nov 16-Nov 17-Nov 18Nov 19-Nov 20-Nov
LSU
recuento
celular
15-Nov 16-Nov 17-Nov 18-Nov 19-Nov 20-Nov
Fecha
153
M
Kj Ui «T» 00
O
o o o o o o o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
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Ut
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Fecha de muestreo
D
c:
JO
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Célula por I en base a microscopía
70000
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FIGURA 12
imagen10
imagen11
i .
Grupoll
.
I «Grupo IV
AoíM«CCMPi:3(JfM!t;i8>
FIGURA 14
imagen12
QMh
r
■“ A &
1X)(V97
0.87/-
1,00/67
A. nrxjyerwe CCMP1980 (JF521628)
A £/rxjypnjf CC41P1B46 (JF521625)
- A fU/XJ/WW IVIR_D_1B2D06 (JF521629)
A A/nttyense CCMP1978 (JF521626)
A fUld>WtteCCMP1719(JF52l624)
A ttmarww HY974&3M (00785688)
0,96*91 A O WWW AX-OJ <00785690) i^oncor A ******* 8BMVJ5X3H)
^ A OmarwwSZNOI </U5iS36.AM2386S2. AJ53S366)
A. C4ÍW3«*aAXHHan (00785586) 0,99.341 A Cátente Ajsp-KDI (OQ76S88S) A CJt*n*ta AxCt-KOI (AY347308) A oafroeto (AY347308)
A MfpneJM Axsp-KOS (00785837) A amatwo3* CCMP1493 (JF521641) A B/njffWÍ (U44933)
A O.WWWAQMA(AB196481)
A. fomí.'WW AT503 (AS 196480)
100/99
ll
0,01
A. Omjjmse ATCJ33
1,00100 f" A B/ni'm» MUCC99 (AF022191) A fcWSfW ATEB01 (EF178147)
A t3 WWW ATCJ24(EY 178149)
A Bvnarww ATBB01 (JFS21639).
A BWWW ATMVBOl 1,C0>1X| A amérense CCMP115(JF521W0)
* A SamanwwCCAP1119/9(00785891)
IA »*ine CCMP112 (JF321618)
A tmr.e AAfidDi.Oi (JFS21616)
Grupo I
Grupo II
Grupo IV
Grupo V
| Grupo III
I GRUPO | EXTERIOR
FIGURA 16
complejo de A tdmQfGnsQ
imagen13
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016011086A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Fry Laboratories, LLC Method and kit for protozoa characterization
CN105441579A (zh) * 2016-01-25 2016-03-30 国家***第三海洋研究所 一种鉴定珊瑚共生光合藻类温度敏感型的引物、探针及鉴定方法
GB201602576D0 (en) 2016-02-12 2016-03-30 Bergen Teknologioverforing As Process
CN106832296B (zh) * 2017-01-10 2020-04-17 宁波大学 一种石房蛤毒素分子印迹纳米荧光材料的制备方法及应用
KR102550154B1 (ko) * 2023-03-14 2023-07-03 대한민국 실린드로스페르몹시스 속 검출용 프라이머 세트

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356270A (en) 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
US5296348A (en) 1989-05-16 1994-03-22 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods for screening monoclonal antibodies for therapeutic use
US6995243B2 (en) 2002-08-13 2006-02-07 New York University Antibodies that recognize and bind phosphorylated human glucocorticoid receptor and methods of using same
WO2009129558A1 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Newsouth Innovations Pty Limited Cyanobacteria saxitoxin gene cluster and detection of cyanotoxic organisms

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