ES2432798T3 - Anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Anticuerpo de anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 aislado, en el que dicho anticuerpo, cuando se une a dicha NRR de Notch 1, disminuye la señalización de Notch 1, y en el que dicha NRR de Notch 1 es una NRR de Notch 1 humana que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1735 de SEQ ID NO: 56, o una NRR de Notch 1 de ratón que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1725 de SEQ ID NO: 57.

Description

Anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 y sus usos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La familia de receptores Notch es una clase de receptores de transmembrana conservados en la evolución que transmiten señales que afectan el desarrollo en organismos tan diversos como erizos de mar y humanos. Tanto los receptores Notch como su familia de ligandos Delta y Serrate (denominados Jagged en mamíferos) son proteínas de transmembrana con grandes dominios extracelulares que contienen repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF). El número de parálogos Notch difiere entre especies. Por ejemplo, hay cuatro receptores Notch en mamíferos (Notch 1-Notch4), dos en Caenorhabditis elegans (LIN-12 y GLP-1) y uno en Drosophila melanogaster (Notch). Los receptores Notch se procesan proteolíticamente durante el transporte a la superficie celular por una proteasa de tipo furina en un sitio S1 externo al dominio transmembrana, con producción de una subunidad Notch extracelular (ECN) y una subunidad Notch transmembrana (NTM). Estas dos subunidades permanecen asociadas no covalentemente y constituyen el receptor de superficie celular heterodimérico maduro. Las subunidades ECN de Notch 1 contienen 36 repeticiones de tipo EGF N-terminales, seguidas de tres módulos Lin 12/Notch (LNR) repetidos en tándem que preceden el sitio S1. Cada módulo LNR contiene tres enlaces disulfuro y un grupo de residuos ácidos y polares conservados de los cuales se prevé que coordinan un ión calcio. Dentro de la región de repeticiones de EGF se encuentran sitios de unión para los ligandos activadores. Los módulos LNR, que comprenden un dominio singular de receptores Notch, participan en el mantenimiento de Notch en una conformación en reposo antes de la activación inducida por ligando. La NTM Notch 1 comprende una región extracelular (que alberga el sitio de escisión S2), un segmento transmembrana (que alberga el sitio de escisión S3), y una gran parte intracelular que incluye un dominio RAM, repeticiones de anquirina, un dominio de transactivación y una secuencia PEST carboxiterminal. La asociación estable de las subunidades ECN y NTM depende de un dominio de heterodimerización (HD) que comprende el extremo carboxiterminal del ECN (denominado HD-C) y el extremo aminoterminal extracelular de NTM (denominado HD-N). La unión de un ligando Notch a la subunidad ECN inicia dos escisiones proteolíticas sucesivas que se producen por proteólisis intramembrana regulada. La primera escisión por una metaloproteasa en el sitio S2 hace que la subunidad transmembrana de Notch sea susceptible a la segunda escisión en el sitio S3 cercano a la hojuela interna de la membrana plasmática. La escisión en el sitio S3, que está catalizada por un complejo multiproteico que contiene presenilina y nicastrina, libera la parte intracelular de la subunidad transmembrana de Notch, lo cual le permite trastocarse al núcleo y activar la transcripción de los genes diana.
[0003] Se han identificado cinco ligandos Notch de las clases del tipo Jagged y Delta en seres humanos (Jagged1 (también denominado Serrate1), Jagged2 (también denominado Serrate2), Delta tipo 1 (también denominado DLL1), Delta tipo 3 (también denominado DLL3) y Delta tipo 4 (también denominado DLL4). Cada uno de los ligandos es una proteína transmembrana de paso único con un motivo conservado N-terminal Delta, Serrate, LAG-2 (DSL) esencial para la unión a Notch. Un conjunto de módulos de tipo EGF C-terminales respecto del motivo DSL preceden al segmento que atraviesa la membrana. A diferencia de los receptores Notch, los ligandos tienen colas citoplasmáticas cortas de 70-215 aminoácidos en el C-terminal. Además, se han informado otros tipos de ligandos (por ejemplo, DNER, NB3, y F3/contactina).
[0004] La vía Notch actúa durante diversos procesos de desarrollo y fisiológicos, incluso los que afectan la neurogénesis en moscas y vertebrados. En general, la señalización de Notch interviene en la inhibición lateral, las decisiones de linaje y el establecimiento de límites entre grupos de células (véase, por ejemplo, Bray, Molecular Cell Biology 7: 678-679, 2006). Se ha demostrado que diversas enfermedades humanas, incluso cánceres y trastornos neurodegenerativos son el resultado de mutaciones de los genes que codifican los receptores Notch o sus ligandos (véase, por ejemplo, Nam y col., Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 501-509, 2002). La conexión entre la señalización de Notch no restringida y la malignidad se reconoció por primera vez cuando se detectó una traslocación cromosómica recurrente t(7;9)(q34;q34.3) que crea una variante truncada constitutivamente activa de Notch 1 humano en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas humanas (LLA-T). En modelos murinos, se ha demostrado que la señalización de Notch 1 es esenciales para el desarrollo de linfocitos T y que las señales mediadas por Notch 1 promueven el desarrollo de linfocitos T a expensas del desarrollo de linfocitos B. Además, en modelos murinos, el exceso de señalización de Notch durante el desarrollo conduce a neoplasia de linfocitos T.
[0005] Además, los receptores Notch se expresan en un amplio rango de cánceres humanos y líneas celulares derivadas de tumor y promueven el destino neural en las células madre embrionarias humanas. Por ejemplo, Notch se expresa en gran cantidad en lesiones neoplásicas de la cervix humana y en células de carcinoma de células renales humanas. El documento WO 0020576 se refiere a anticuerpos anti-Notch que se unen a repeticiones tipo EGF para el tratamiento del cáncer. Debido a la implicación de la señalización de Notch en una amplia diversidad de enfermedades humanas, es obvio que continúa la necesidad de agentes que regulen la señalización de Notch que tengan atributos clínicos óptimos para el desarrollo de agentes terapéuticos. La invención descrita en el presente documento cubre esta necesidad y proporciona otros beneficios.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0006] La invención se basa en parte en la identificación de una diversidad de anticuerpos de la región reguladora negativa (NRR) Notch 1, y fragmentos de los mismos. NRR de Notch 1 presenta un agente terapéutico importante y ventajoso, y la invención proporciona composiciones y usos médicos en base a la unción de NRR de Notch 1. Los anticuerpos NRR de Notch 1 de la invención, como se describe en el presente documento, proporcionan importantes agentes terapéuticos y diagnósticos para su uso dirigido a las afecciones patológicas asociadas con la expresión y/o actividad de las vías de señalización de Notch 1. Por consiguiente, la invención proporciona procedimientos, composiciones, kits y artículos de fabricación relacionados con la unión a NRR de Notch 1.
[0007] La presente invención proporciona anticuerpos, como se define en las reivindicaciones, que se unen a NRR de Notch 1, en particular, un anticuerpo aislado que se une a NRR de Notch 1. En un aspecto particular, la invención comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-7 o mayor. En realizaciones deseables, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-8 o superior o una Kd de 1 x 10-9 o superior. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, en el que una forma de IgG de longitud completa del anticuerpo se une a NRR de Notch 1 humano y murino con una Kd de 1 x 10-7 o superior. Como se ha establecido en la técnica, se puede determinar la afinidad de unión de un ligando a su receptor usando cualquiera de una diversidad de ensayos, y se expresa en cuando a una diversidad de valores cuantitativos. Por consiguiente, en una realización, la afinidad de unión se expresa como los valores de Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). En general y preferiblemente, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en una configuración sin células o asociada a células. Se puede usar un número cualquiera de ensayos conocidos en la técnica, incluso los descritos en el presente documento, para obtener mediciones de afinidad de unión, incluyendo, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.
[0008] En un aspecto, la invención comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que comprende:
(a)
al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región variable (HVR) que seleccionadas entre:
(i)
HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en la que A1-A11 es RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7)
(ii)
HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en la que B1-B7 es SASFLYS (SEQ ID NO: 8)
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en la que C1-C9 es QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 9)
(iv)
HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en la que D1-D10 es GFTFSSYWIH (SEQ ID NO: 1)
(v)
HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en la que E1-E18 es ARINPSNGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2) y
(vi)
HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F14, en la que F1-F14 es ARGSGFRWVMDY (SEQ ID NO: 6); y
(b)
al menos una HVR variante, en la que la secuencia variante HVR comprende la modificación de al menos un residuo de la secuencia representada en las SEQ ID NOS: 1-12. De forma deseable, la modificación es una sustitución, inserción o deleción.
[0009] En realizaciones deseables, una variante HVR-L3 comprende 1-4 (1, 2, 3 ó 4) sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: C3 (S o F), C4 (Y o F), C5 (T o S), y C8 (P o A o S). En otra realización deseable, una variante HVR-H2 comprende 1-4 (1, 2, 3 ó 4) sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: E6 (S o P o A); E8 (G o R); E10 (T o A o N); y E11 (N o H o Q o R).
[0010] En otro aspecto, un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR, donde cada HVR comprende, consiste, o consiste básicamente en una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 1-12, y donde SEQ ID NO: 7 corresponde a una HVR-L1, SEQ ID NO:8 corresponde a una HVR-L2, SEQ ID NO:9, 10, 11 ó 12 corresponde a una HVR-L3, SEQ ID NO: 1 corresponde a una HVR-H1, SEQ ID NO: 2, 3, 4 ó 5 corresponde a una HVR-H2, y SEQ ID NO: 6 corresponde a una HVR-H3.
[0011] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo como se define en las reivindicaciones que comprende una región HVR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, 3, 4 ó
5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una HVR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 ó 12.
[0012] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo como se define en las reivindicaciones que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, o los cuatro de las siguientes:
(i)
una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1;
(ii)
una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, 3, 4 ó 5;
una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6;
una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 ó 12.
[0013] En una realización deseable, el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, contiene SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2, 6. En otra realización deseable, el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, comprende SEQ ID NO: 7, 8, 10, 1, 3, 6. En aún otra realización deseable, el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, comprende SEQ ID NO: 7, 8, 11, 1, 4, 6. En una realización adicionalmente deseable, el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, comprende SEQ ID NO: 7, 8, 12, 1, 5, 6.
[0014] Las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NOs: 1-12 se numeran con respecto a la HVR individual (es decir, H1, H2 o H3) como se indica en la figura 1, concordando la numeración con el sistema de numeración de Kabat como se describe a continuación.
[0015] La invención proporciona un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que inhibe, reduce y/o bloquea la señalización de Notch 1. Algunas realizaciones comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo 4D5 humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genetech, Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) (también se hace referencia en la patente de Estados Unidos Nº 6.407.213 y Lee y col., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093) como se representa en la SEQ ID NO: 53 que se muestra a continuación.
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 53) (los residuos de HVR se subrayan)
[0016] En un aspecto, la secuencia de dominio variable de cadena ligera huMAb4D5-8 se modifica en una o más de las posiciones 30, 66 y 91 (Asn, Arg e His como se ha indicado en negrita/cursiva anteriormente, respectivamente). En un aspecto particular, la secuencia huMAb4D5-8 modificada comprende Ser en la posición 30, Gly en la posición 66, y/o Ser en la posición 91. Por consiguiente, en un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia representada en la SEQ ID NO: 54 a continuación:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 54) (los residuos de HVR se subrayan)
[0017] Los residuos sustituidos con respecto al huMAb4D5-8 se indican en negrita/cursiva.
[0018] Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de dominio variable de estructura adecuada, siempre que la actividad de unión a NRR de Notch 1 se mantenga sustancialmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia de estructura consenso de cadena pesada de subgrupo humano III. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia consenso de estructura comprende una sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En un aspecto, estos anticuerpos comprenden secuencias de estructura de dominio variable de cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN® Genentech, Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) (también se hace referencia en las patentes de Estados Unidos Nº 6.407.213 y 5.821.337, y Lee y col., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093. En una realización, estos anticuerpos también comprenden una secuencia de estructura consenso de cadena ligera KI. En un aspecto particular, estos anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena ligera de huMAb4D5-8 como se describe en las patentes de Estados Unidos Nº 6.407.213 y 5.821.337). En un aspecto, estos anticuerpos comprenden secuencias de dominio variable de cadena ligera de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) (también se hace referencia en las patentes de Estados Unidos Nº 6.407.213 y 5.821.337, y Lee y col., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093.
[0019] En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 2 y/o 6, respectivamente. En otro aspecto, la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 3 y/o 6, respectivamente. En aún otro aspecto, la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 4 y/o 6, respectivamente. En un aspecto adicional, la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 5 y/o 6, respectivamente.
[0020] En un aspecto particular un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 9, respectivamente. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 38, 39,40 y/o 41, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 10, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 11, respectivamente. En aún otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 12, respectivamente.
[0021] En otro aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 2 y/o 6, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 3 y/o 6, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 4 y/o 6, respectivamente. En aún otro aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 5 y/o 6, respectivamente.
[0022] En un aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 15, 16, 17 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 9, respectivamente. En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 15, 16, 17 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 10, respectivamente. En aún otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 15, 16, 17 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 11, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 15, 16, 17 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 12, respectivamente.
[0023] En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 42, 43, 47 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 2 y/o 6, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 42, 43, 47 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 3 y/o 6, respectivamente. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 42, 43, 47 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 4 y/o 6, respectivamente. En un aspecto adicional un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 42, 43, 47 y/o 45, y las secuencias HVR H1, H2 y H3 son las SEQ ID NOS: 1, 5 y/o 6, respectivamente.
[0024] En un aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 15, 16, 47 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 9, respectivamente. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 15, 16,47 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 10, respectivamente. En aún otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 15, 16, 47 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 11, respectivamente. En un aspecto adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 15, 16, 47 y/o 18, y las secuencias HVR L1, L2 y L3 son las SEQ ID NOS: 7, 8 y/o 12, respectivamente.
[0025] En aún un aspecto adicional, un anticuerpo se madura por afinidad para obtener la afinidad de unión a diana deseada. En un ejemplo, un anticuerpo madurado por afinidad comprende la sustitución en una o más de las posiciones aminoacídicas H53, H55, H57, H58, L91 y L96. En un ejemplo, un anticuerpo madurado por afinidad comprende una o más de las siguientes sustituciones: (a) en la cadena pesada, S53P, S53A, G55R, T57A, T57N, N58H, N58Q y N58R o (b), en la cadena ligera, S91F, P96A y P96S.
[0026] En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 58. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 59. En un aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 58, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 59. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 60. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 60, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 62. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 63. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 62, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 63. En otro aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 64. En un aspecto, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 65. En un aspecto un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 64, y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 65.
[0027] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos que se han mencionado anteriormente para la unión a NRR de Notch 1. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo o a un epítopo similar en NRR de Notch 1 como cualquiera de los anticuerpos que se han mencionado anteriormente.
[0028] Como se conoce en la técnica, y como se describe con mayor detalle más adelante en el presente documento, la posición/límite del aminoácido que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, según el contexto y las diversas definiciones conocidas en la técnica (como se describe más adelante). Algunas posiciones dentro de un dominio variable se pueden visualizar como posiciones híbridas hipervariables, dado que dichas posiciones se pueden considerar dentro de una región hipervariable según un conjunto de criterios, mientras se consideran fuera de una región hipervariable según un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también se pueden hallar en regiones hipervariables extendidas (como se define adicionalmente más adelante).
[0029] En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otros aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunos aspectos, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, anticuerpo maduro por afinidad, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En ciertos aspectos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es un Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 o scFv.
[0030] En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión a antígeno de un donante no humano injertado con una secuencia heteróloga no humana, humana o humanizada (por ejemplo, secuencias de estructura y/o de dominio constante). En un aspecto, el donante no humano es un ratón. En un aspecto adicional, una secuencia de unión a antígeno es sintética, por ejemplo, obtenida por mutagénesis (por ejemplo, análisis de presentación en fagos, etc.). En un aspecto, un anticuerpo quimérico de la invención tiene regiones murinas V y una región humana C. En un aspecto, la región de cadena ligera murina V se fusiona con una cadena ligera kappa humana. En otro aspecto, la región de cadena pesada murina V se fusiona a una región C de IgGl humana.
[0031] Los anticuerpos humanizados de la invención incluyen los que tienen sustituciones de aminoácidos en la región de estructura (FR) y variantes de maduración por afinidad con cambios en los CDR injertados. Los aminoácidos sustituidos en el CDR o FR no se limitan a los presentes en el anticuerpo del donante o el receptor. En otros aspectos, los anticuerpos de la invención comprenden adicionalmente cambios en los residuos de aminoácidos en la región Fc que conducen a una mejor función efectora, incluyendo un aumento de la función de CDC y/o ADCC y muerte de linfocitos B. Otros anticuerpos incluyen los que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. En otros aspectos, los anticuerpos de la invención comprenden cambios en los residuos de aminoácidos en la región Fc que conducen a reducir la función efectora, por ejemplo, disminución de la función de CDC y/o ADCC, y/o disminución de la muerte de linfocitos B. En algunos aspectos, los anticuerpos se caracterizan por la disminución de la unión (tal como la ausencia de unión) al factor de complemento humano C1q y/o el receptor Fc humano en células asesinas naturales (NK). En algunos aspectos, los anticuerpos se caracterizan por disminución de la unión (tal como la ausencia de unión) a FcyRI, FcyRIIA y/o FcyRIIIA. En algunos aspectos, los anticuerpos son de la clase de IgG (por ejemplo, IgGl o IgG4) y comprenden al menos una mutación en E233, L234, D236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeración de acuerdo con el índice de la UE). En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las mutaciones L234A/L235A o D265A/N297A.
[0032] También se proporcionan polipéptidos anti-NRR de Notch 1 que comprenden cualquiera de las secuencias de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento, en las que los polipéptidos anti-NRR de Notch 1 se unen específicamente a una NRR de Notch 1, por ejemplo, una NRR de Notch 1 humano o murino.
[0033] Los anticuerpos de la invención se unen (tal como por unión específica) a NRR de Notch 1. En algunos aspectos, pueden modular uno o más aspectos de la señalización de Notch 1 y/o alterar cualquier Notch 1 biológicamente relevante y/o vía biológica de ligando Notch 1, y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cáncer; y/o tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de Notch 1 (tal como el aumento de expresión y/o actividad de Notch 1). El anticuerpo NRR de Notch 1 se une específicamente a una NRR de Notch 1 humano o de ratón. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a Notch 1 con una Kd de 1 x 10-7 o superior. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención reduce, inhibe y/o bloquea la actividad de Notch 1 in vivo y/o in vitro.
[0034] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento para tratar cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad neurodegenerativa. En aún otras realizaciones deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0035] En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención y un vehículo que es farmacéuticamente aceptable.
[0036] En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 de la invención.
[0037] En aún otro aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención.
[0038] También se proporcionan composiciones que comprenden uno o más ácidos nucleicos de la invención y un vehículo. En un aspecto, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.
[0039] En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante, tal como un vector de expresión. Puede usarse cualquiera de una diversidad de células huésped. En una realización, una célula huésped es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. En otra realización, una célula huésped es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster Chino (CHO).
[0040] En un aspecto adicional, la invención proporciona procedimientos para preparar un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona procedimientos para preparar un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 (que, como se define en el presente documento, incluye un anticuerpo de longitud completa y fragmentos del mismo), comprendiendo dicho procedimiento expresar en una célula huésped adecuada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o un fragmento del mismo), y recuperar el anticuerpo.
[0041] También se proporciona un artículo de fabricación comprende un recipiente; y una composición contenida en el recipiente, en el que la composición comprende uno o más anticuerpos anti-NRR de Notch 1. En un aspecto, la composición comprende un ácido nucleico. En otro aspecto, una composición que comprende un anticuerpo comprende adicionalmente un vehículo, que en algunos aspectos es farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, un artículo de fabricación comprende adicionalmente instrucciones para administrar la composición (por ejemplo el anticuerpo) a un individuo (tal como instrucciones para cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento).
[0042] También se proporciona un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos anti-NRR de Notch 1; y un segundo recipiente que comprende un tampón. En un aspecto, el tampón es farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, una composición que comprende un anticuerpo, comprende adicionalmente un vehículo, que en algunos aspectos es farmacéuticamente aceptable. En otro aspectos, un kit comprende adicionalmente instrucciones para administrar la composición (por ejemplo el anticuerpo) a un individuo.
[0043] En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 de la invención para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0044] También se desvela el uso de un ácido nucleico en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0045] También se desvela el uso de un vector de expresión en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0046] También se desvela el uso de una célula huésped en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0047] También se desvela el uso de un artículo de fabricación en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0048] También se desvela el uso de un kit en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos el trastorno es una neuropatía o una enfermedad neurodegenerativa. En aún otros aspectos deseables, el trastorno es una afección patológica asociada con la angiogénesis. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0049] La invención proporciona procedimientos y composiciones útiles para modular trastornos asociados con la expresión y/o la señalización de Notch 1, tal como el aumento de la expresión y/o la señalización o una expresión y/o señalización no deseadas.
[0050] La invención también proporciona procedimientos y composiciones útiles para modular trastornos asociados con los receptores Notch 1 activados. Dichos trastornos pueden estar asociados con una traslocación de una mutación activadora en una secuencia aminoacídica de Notch 1. Los trastornos ejemplares asociados con los receptores de Notch 1 activados incluyen leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T).
[0051] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos para el tratamiento de un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular asociado con el aumento de la expresión y/o la actividad de Notch 1 en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo. En una realización, el tumor, cáncer y/o trastorno proliferativo celular implica una mutación de activación de Notch 1.
[0052] También se proporcionan procedimientos para eliminar una célula (tal como una célula cancerosa o tumoral) en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0053] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos para reducir, inhibir, bloquear o prevenir el crecimiento de un tumor o cáncer en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0054] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos para reducir, inhibir, bloquear o prevenir la angiogénesis en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0055] En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar una afección patológica asociada con angiogénesis en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0056] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos para tratar una enfermedad neurodegenerativa. También se proporcionan procedimientos para reparar una célula nerviosa dañada
o trastornos que dan como resultado una desconexión de axones y/o desmielinización en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0057] También se proporcionan procedimientos para promover el desarrollo, la proliferación, el mantenimiento o la regeneración de neuronas en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0058] También se proporcionan procedimientos para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo. En algunos aspectos, se administra un antígeno para el que se desea una respuesta inmune simultáneamente con el anticuerpo anti-NRR de Notch 1. También se proporcionan procedimientos para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un individuo, que comprenden administrar al individuo un agonista de anticuerpo anti-NRR de Notch 1; y en el que la composición se administra al individuo de tal forma que el agonista de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 está presente para las células inmunes (tales como los linfocitos T) del individuo durante o poco después de la imprimación de las células inmunes (tales como los linfocitos T) por el antígeno, por lo que se mejora la respuesta inmune. En algunos aspectos, el antígeno es de cáncer.
[0059] También se proporcionan procedimientos para promover la regeneración y/o reparación tisular, tal como la regeneración de músculo esquelético o músculo cardiaco o hueso en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un agonista de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo.
[0060] También se proporcionan procedimientos para reducir, inhibir, bloquear, o prevenir una respuesta inmune a un antígeno en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un agonista de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo. En un aspecto, la respuesta inmune es un trastorno inmunológico debido al desarrollo o la regulación anormal de linfocitos T.
[0061] También se proporcionan procedimientos para tratar un trastorno autoinmune en un individuo, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un agonista de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo. En algunos aspectos, el trastorno autoinmune es diabetes autoinmune, esclerosis múltiple, rechazo de trasplante o artritis reumatoide.
[0062] Los anticuerpos de la invención se pueden usar para afectar a cualquier estado patológico adecuado. Los ejemplos de trastornos se describen en el presente documento e incluyen un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de cerebro (por ejemplo, neuroblastoma o meningioma), cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células básales o carcinoma de células escamosas), carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR), carcinoma hepatocelular, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y enfermedades malignas hematológicas (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLA-B), leucemia mielógena aguda (AML), linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple).
[0063] En una realización, una célula que se determina como diana por un anticuerpo de la invención es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de carcinoma papilar, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer cervical, una célula de sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula escamosa de carcinoma de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de leucemia y una célula de adenoma de colon. En una realización, una célula que se determina como diana en un procedimiento de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En otro aspecto, una célula que se determina como diana en un procedimiento de la invención es una célula displásica. En aún otro aspecto, una célula que se determina como diana en un método de la invención es una célula metastática.
[0064] Los procedimientos de la invención pueden comprender adicionalmente etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, un procedimiento comprende adicionalmente una etapa en la que una célula y/o tejido diana (por ejemplo, una célula cancerosa) se expone a radioterapia o a un agente quimioterapéutico.
[0065] En un aspecto, la invención proporciona procedimientos que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en combinación con una cantidad eficaz de otro agente terapéutico (tal como un agente antiangiogénesis, otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, radioterapia citotóxica, un corticosteroide, un antiemético, una vacuna contra cáncer, un analgésico o un agente inhibidor del crecimiento). Por ejemplo, se usan anticuerpos anti-NRR de Notch 1 en combinaciones con un agente anti-cáncer o un agente antiangiogénico para tratar diversas afecciones neoplásicas o no neoplásicas. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 se usan en combinación con tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imalinib, sorafenib, lapatinib o trastuzumab).
[0066] El anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se puede administrar en serie o en combinación con el otro agente terapéutico que es eficaz para estos fines, sea en la misma composición o como composiciones separadas. La administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 y el otro agente terapéutico (por ejemplo, agente anti-cáncer) se puede hacer de forma simultánea, por ejemplo, como composición única o como dos o más composiciones diferenciadas, por la misma vía de administración o una diferente. Como alternativa, o adicionalmente, la administración se puede hacer secuencialmente, en cualquier orden. Como alternativa, o adicionalmente, las etapas se pueden realizar como una combinación secuencial y simultáneamente, en cualquier orden. En ciertos aspectos, puede haber intervalos de minutos a días, de semanas a meses, entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el agente anticáncer se puede administrar primero, seguido del anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o la administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en primer lugar. En ciertos aspectos, puede haber intervalos que varían de minutos a días, a semanas o meses, entre las administraciones de las dos o más composiciones.
[0067] En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno (por ejemplo un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular) administrando cantidades eficaces de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 y/o uno o más inhibidores de angiogénesis y uno o más agentes quimioterapéuticos. Se puede usar una diversidad de agentes quimioterapéuticos en los procedimientos de tratamiento combinado de la invención. Se proporciona una lista de ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos contemplados en el presente documento en la sección "Definiciones". La administración de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 y el agente quimioterapéutico se puede hacer simultáneamente, por ejemplo, como una única composición, o como dos o más composiciones diferentes, usando la misma vía de administración o vías diferentes. Como alternativa, o adicionalmente, la administración se puede hacer secuencialmente, en cualquier orden. Como alternativa, o adicionalmente, las etapas se pueden realizar como combinación secuencial y simultáneamente, en cualquier orden. En ciertos aspectos, puede haber intervalos que varían de minutos a días, a semanas o meses, entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico se puede administrar en primer lugar, seguido del anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o la administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en primer lugar. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona procedimientos que comprenden la administración de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 seguida de la administración de un agente quimioterapéutico. En ciertos aspectos, puede haber intervalos que varían de minutos a días, de semanas o meses, entre la administración de las dos o más composiciones.
[0068] También se proporcionan procedimientos para la detección de Notch 1, comprendiendo los procedimientos detectar el complejo Notch 1-anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en la muestra. El término "detección", como se usa en el presente documento, incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control.
[0069] También se proporcionan procedimientos para diagnosticar un trastorno asociad con la expresión y/o la actividad de Notch 1, comprendiendo los procedimientos detectar complejo Notch 1-anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en una muestra biológica de un individuo que padece o se sospecha que padece dicho trastorno. En algunos aspectos, la expresión de Notch 1 es una expresión aumentada o una expresión anormal. En algunos aspectos, el trastorno es un tumor, cáncer y/o un trastorno proliferativo celular.
[0070] También se proporcionan procedimientos para tratar un individuo que tiene un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo, en el que se detecta además la expresión de Notch 1 y/o la expresión del ligando de Notch 1 en la muestra del individuo antes, durante o después de la administración de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1. En algunos aspectos, la muestra biológica es del cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la muestra biológica es del cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular. En algunos aspectos, la sobreexpresión de Notch 1 se detecta antes, durante y/o después de la administración de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1. En algún aspecto, la expresión de ligando Notch 1 se detecta antes, durante y/o después de la administración de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1. La expresión se puede detectar antes; durante; después; antes y durante; antes y después; durante y después; o antes, durante y después de la administración de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1.
[0071] También se proporcionan procedimientos para tratar un individuo que tiene un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo, en el que una muestra biológica del cáncer, tumor y/o trastorno celular o trastorno hepático expresa Notch 1 o ligando Notch 1.
[0072] También se proporcionan procedimientos para seleccionar un tratamiento para un individuo, comprendiendo los procedimientos: (a) detectar la expresión de Notch 1 o la expresión de ligando Notch 1, si la hubiera, en una muestra biológica de un individuo; y (b) posteriormente a la etapa (a), seleccionar el tratamiento para el individuo, en el que la selección del tratamiento se basa en la expresión de Notch 1 o de ligando Notch 1 detectada en la etapa (a). En algunos aspectos, se detecta un aumento de la expresión de Notch 1 o ligando Notch 1 en la muestra biológica del individuo con respecto a un valor de referencia o muestra control. En algunos aspectos, se detecta una disminución de la expresión de Notch 1 o ligando de Notch 1 en la muestra biológica del individuo respecto a un valor de referencia o muestra control. En algunos aspectos, se detecta la expresión de Notch 1 o ligando de Notch 1 y se selecciona el tratamiento con un anticuerpo anti-Notch 1. En algunos aspectos, el individuo tiene un tumor, cáncer y/o un trastorno proliferativo celular.
[0073] En algunos aspectos que implican detección, la expresión de Notch 1 comprende la detección de Notch 1. En algunos aspectos que implican la detección, la expresión de Notch 1 comprende la detección de la eliminación génica, la amplificación génica y/o la mutación génica de Notch 1. En algunos aspectos que implican detección, la expresión de ligando de Notch 1 comprende la detección de la eliminación génica, la amplificación génica y/o la mutación génica de Notch 1.
[0074] Las muestras biológicas se describen en el presente documento, por ejemplo, en la definición de Muestra Biológica. En algunos aspectos, la muestra biológica es un suero o de un tumor.
[0075] En aspectos que implican la detección de la expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 (por ejemplo, Jagged1, Jagged2, Delta tipo 1, Delta tipo 3 y/o Delta tipo 4), se puede detectar la expresión de polinucleótido de Notch 1 y/o ligando de Notch 1, y/o la expresión de polipéptido Notch 1 y/o ligando de Notch 1. En algunos aspectos que implican la detección de la expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1, se detecta la expresión de ARNm de Notch 1 y/o ligando de Notch 1. En otros aspectos, se detecta la expresión de polipéptido de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 mediante un agente anti-NRR de Notch 1 y/o un agente anti-ligando Notch 1. En algunos aspectos, se detecta la expresión de polipéptido de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 mediante un anticuerpo. Se puede usar cualquier anticuerpo adecuado para la detección y/o el diagnóstico, incluyendo anticuerpos monoclonales y/o policlonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, se usa un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 descrito en el presente documento para la detección. En algunas realizaciones, se detecta la expresión de polipéptido de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 mediante inmunohistoquímica ("IHQ"). En algunos aspectos, se puntúa la expresión de Notch 1 en 2 o superior mediante un ensayo IHQ.
[0076] En algunos aspectos que implican la detección de la expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1, se puede detectar la presencia y/o ausencia y/o niveles de expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1. La expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 puede aumentarse. Se entiende que la ausencia de la expresión de Notch 1 y/o ligando de Notch 1 incluye niveles insignificantes o de mínimo. En algunos aspectos, la expresión de Notch 1 en la muestra biológica de prueba es superior a la observada para la muestra biológica de control (o el nivel de expresión de control o de referencia). En algunos aspectos, la expresión de Notch 1 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces superior, o superior en la muestra biológica de prueba que en la muestra biológica de control. En algunos aspectos, la expresión del polipéptido Notch 1 se determina en un ensayo de inmunohistoquímica ("IHQ") para puntuar un valor de al menos 2
o mayor para la intensidad de la tinción. En algunos aspectos, la expresión del polipéptido Notch 1 se determina en un ensayo de IHQ para puntuar un valor de al menos 1 o superior, o al menos 3 o superior para la intensidad de la tinción. En algunos aspectos, la expresión de Notch 1 en la muestra biológica de prueba es inferior a la observada para una muestra biológica de control (o nivel de expresión de control) .
[0077] En otro aspecto, cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 descritos en el presente documento puede comprender una etiqueta detectable.
[0078] También se proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 descritos en el presente documento y Notch 1. En algunos aspectos, el complejo está in vivo o in vitro. En algunos aspectos, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 tiene una etiqueta detectable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0079] Figuras 1-1 y 1-2: secuencias bucle HVR de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos anti-NRR de Notch 1. Las figuras muestran las secuencias HVR de cadena pesada, H1, H2 y H3, y las secuencias HVR de cadena ligera L1, L2 y L3. La numeración de las secuencias es como se indica a continuación: Anticuerpo A (HVR-H1 es SEQ ID NO: 1; HVR-H2 es SEQ ID NO: 2; HVR-H3 es SEQ ID NO: 6; HVR-L1 es SEQ ID NO: 7; HVR-L2 es SEQ ID NO: 8; HVR-L3 es SEQ ID NO: 9); Anticuerpo A-1 (HVR-H1 es SEQ ID NO: 1; HVR-H2 es SEQ ID NO: 3; HVR-H3 es SEQ ID NO: 6; HVR-L1 es SEQ ID NO: 7; HVR-L2 es SEQ ID NO: 8; HVR-L3 es SEQ ID NO: 10); Anticuerpo A-2 (HVR-H1 es SEQ ID NO: 1; HVR-H2 es SEQ ID NO: 4; HVR-H3 es SEQ ID NO: 6; HVR-L1 es SEQ ID NO: 7; HVR-L2 es SEQ ID NO: 8; HVR-L3 es SEQ ID NO: 11); y Anticuerpo A-3 (HVR-H1 es SEQ ID NO: 1; HVR-H2 es SEQ ID NO: 5; HVR-H3 es SEQ ID NO: 6; HVR-L1 es SEQ ID NO: 7; HVR-L2 es SEQ ID NO: 8; HVR-L3 es
SEQ ID NO: 12). Las posiciones de aminoácidos están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración Kabat
como se describe a continuación. [0080] Figura 2: Representa las secuencias aminoacídicas de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera de los Anticuerpos A, A-1, A-2 y A-3 (SEQ ID NOS: 58-65).
[0081] Las figuras 3A, 3B y 4 muestran ejemplos de secuencias de estructura consenso de aceptor humano para su uso en la puesta en práctica de la presente invención con los identificadores de secuencia como se indica a continuación:
Estructuras consenso de variables pesadas (figura 3A, 3B) [0082] Estructura consenso de subgrupo I de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 19) [0083] Estructura consenso de subgrupo I de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID
NOS: 20-22) [0084] Estructura consenso de subgrupo II de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 23) [0085] Estructura consenso de subgrupo II de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID
NOS: 24-26) [0086] Estructura consenso de subgrupo II de VH humano menos extendida [0087] Estructura consenso de subgrupo III de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO:27) [0088] Estructura consenso de subgrupo III de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID
NOS: 28-30) [0089] Estructura aceptora de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 31) [0090] Estructura aceptora de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS: 32-33) [0091] Estructura aceptora de VH humano 2 menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 34) [0092] Estructura aceptora de VH humano 2 menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS: 35-37) Estructuras consenso de variables ligeras (figura 4) [0093] Estructura consenso de subgrupo I de VL kappa humano (SEQ ID NO: 38) [0094] Estructura consenso de subgrupo II de VL kappa humano (SEQ ID NO: 39) [0095] Estructura consenso de subgrupo III de VL kappa humano (SEQ ID NO: 40) [0096] Estructura consenso de subgrupo IV de VL kappa humano (SEQ ID NO: 41) [0097] La figura 5 muestra las secuencias de las regiones de estructura de cadenas ligeras (SEQ ID NOS: 15-18) y
pesadas (SEQ ID NOS: 42-45) de huMAb4D5-8. Los números en superíndice/negrita indican las posiciones de
aminoácidos de acuerdo con Kabat. [0098] La figura 6 muestra las secuencias de las regiones de estructura modificadas/variantes de las cadenas ligeras (SEQ ID NOS: 15, 16, 18 y 46) y pesadas (SEQ ID NOS: 42, 43, 45 y 47) de huMAb4D5-8. Los números en superíndice/negrita indican las posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.
[0099] La figura 7 es un gráfico que muestra que el anticuerpo A es un poderoso inhibidor de Notch 1, medido usando un informador de luciferasa. En cada columna A-L, las células receptoras eran NIH-3T3-Notch 1. En A, la célula ligando era NIH-3T3-Parental y en B-L, la célula ligando era NIH-3T3-Jag1. En A, B y K no se añadió anticuerpo o Compuesto E (un inhibidor de gamma-secretasa); en C, se añadió un anticuerpo de isotipo de control a 400 ng/ml; en D, se añadió el Anticuerpo A a 16 ng/ml; en E, se añadió el Anticuerpo A a 80 ng/ml; en F, se añadió el Anticuerpo A a 400 ng/ml; en G, se añadió el Anticuerpo A a 2000 ng/ml; en H, se añadió el Anticuerpo A a 400 ng/ml; en I, se añadió el Anticuerpo A a 400 ng/ml; en J, se añadió un anticuerpo de isotipo de control a 400 ng/ml; en K, se añadió DMSO al 0,01 %; y en L, se añadió el Compuesto E a 1 !M en DSMO al 0,01%. En H, se añadió proteína NRR de Notch 1 a 5 !g/ml (100 !l); en I, se añadió proteína BSA (albúmina sérica bovina) a 6,5 !g/ml (100 !l); en J, se añadió proteína NRR de Notch 1 a 5 !g/ml (100 !l); en A-G, K y L, no se añadió proteína.
[0100] La figura 8 es un gráfico que muestra que los anticuerpos A, A-1, A-2 y A-3 inhiben Notch 1, medido usando un ensayo informador de luciferasa. Las barras negras muestran los resultados obtenidos mediante el anticuerpo de partida Anticuerpo A y las demás barras muestran los resultados obtenidos mediante el uso del Anticuerpo A-1 (rayas horizontales), Anticuerpo A-2 (sombra de color gris) y Anticuerpo A-3 (rayas diagonales). Como se reveló con 80 ng/ml de anticuerpo, los anticuerpos A-1 y A-2 mostraron un bloqueo más potente de la señal de Notch 1 que el Anticuerpo A de partida. El eje X del gráfico representa la concentración de anticuerpo (ng/ml) y el eje Y del gráfico representa la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga/renilla.
[0101] La figura 9 es un gráfico que muestra que el Anticuerpo A reduce el bloqueo de la diferenciación de miocitos murinos C2C12 causado por la activación de la señalización de Notch. En A-F, el medio era medio de diferenciación. En A, los mioblastos murinos C2C12 no se cocultivaron con células que expresan NIH-3T3 con ligando Jagged1, mientras que en B-F, los mioblastos murinos C2C12 se cocultivaron con células que expresan NIH3T3 con ligando Jagged1. El anticuerpo/tratamiento añadido a las células fue como se indica a continuación: nada para A y B, control de isotipo para C, Anticuerpo A a 200 ng/ml para D, DSMO para E y compuesto E a 1 !M para F.
[0102] Las figuras 10A-10F son imágenes de células de miocitos murinos C2C12 teñidas con MHC/Alexa® 488 (hilera superior) o DAPI (clorhidrato de 4',6'-diamidino-2-fenilindol; hilera inferior). Para A-F, el medio era medio de diferenciación. En A, los mioblastos murinos C2C12 no se cocultivaron con células que expresan NIH-3T3 con ligando Jagged1, mientras que en B-F, los mioblastos murinos C2C12 se cocultivaron con células que expresan NIH3T3 con ligando Jagged1. El anticuerpo/tratamiento añadido a las células fue como se indica a continuación: nada para A y B, control de isotipo para C, Anticuerpo A a 200 ng/ml para D, DSMO para E y compuesto E a 1 !M para F.
[0103] Las figuras 11-1 a 11-4 son un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de Notch 1 humano y murino (SEQ ID NOS: 56 y 57). Se usó la herramienta de alineamiento SIM (disponible en el sitio web de ExPASy) para linear las secuencias completas de las proteínas Notch 1 humanas y murinas. Los parámetros predeterminados se eligieron con un margen de abertura de hueco de 12, una extensión de margen de 4 y BLOSUM62 como matriz de comparación. Los dominios de proteínas están subrayados y marcados. El péptido señal, los límites de dominio transmembrana y EGF se basaron en resultados de Notch 1 humano en Expasy.org; los límites de LNR se basaron en Vardar y col. (Biochemistry, 42: 7061-7067, 2003); los límites de HD-N y HD-C se basaron en Malecki y col. (Mol. Cell Biol. 26: 4642-4651, 2006). La región reguladora negativa (NRR) corresponde a secuencias que comienzan en LNR_A y terminan después de HD-C. Las secuencias inmunogénicas usadas para generar anticuerpos NRR de Notch 1 se sobrescriben con una línea interrumpida e incluyen repeticiones EGF 34-36 más NRR. Abreviaturas: los aminoácidos se muestran en el código de una letra; TM, transmembrana; EGF, repeticiones de factor de crecimiento epidérmico; LNR, repeticiones Lin12-Notch; HD-N, dominio de heterodimerización en el lado amino terminal del sitio de escisión S1; HD-C, dominio de heterodimerización en el lado carboxilo terminal del sitio de escisión S1; S1, sitio de escisión de S1 para furinaproteasas; S2, sitio de escisión de S2 para ADAM proteasas (familia de desintegrina y metaloproteasa).
[0104] Las figuras 12A-12C son gráficos que muestran los resultados de los experimentos de mapeo de epítopos para el Anticuerpo A (figura 12A), Anticuerpo A-1 (figura 12B) y Anticuerpo A-2 (figura 12C).
[0105] La figura 13 es un gráfico que muestra que los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 inhiben la señalización de los receptores de tipo natural y mutantes de Notch 1. Las barras de color negro enteras muestran los resultados obtenidos usando un anticuerpo de control a 2000 ng/ml; las barras de puntos gruesos muestran los resultados obtenidos usando el anticuerpo A a 80 ng/ml; las barras de rayas finas muestran los resultados obtenidos usando el Anticuerpo A a 400 ng/ml; las barras con rayas gruesas muestran los resultados obtenidos mediante el uso del Anticuerpo A a 2000 ng/ml); las barras cruzadas muestran los resultados obtenidos usando el Compuesto E a 10 !M; y las barras con puntos finos muestran los resultados obtenidos usando DMSO (el vehículo del compuesto E). Los resultados de cada condición se midieron con ocho duplicados y después se expresaron como el valor medio, con barras de error que indican la desviación típica.
[0106] La figura 14A es una serie de imágenes que muestran que el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 y anti-D114 causa un notable aumento en la formación de vasos y la longitud vascular en un ensayo de regeneración de células HUVEC (célula endotelial de vena umbilical humana). Los resultados se muestran para células tratadas con PBS (solución salina tamponada con fosfato) como control o con anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A o A-2.
[0107] La figura 14B es una serie de imágenes que muestran el efecto de anticuerpos anti-NRR de Notch 1 sobre la vascularización y la angiogénesis mediante un ensayo de bolsillo de córnea. El tratamiento con anti-NRR de Notch 1 (anticuerpo A-2) aumentó significativamente la densidad de la red vascular.
[0108] La figura 14C es una serie de imágenes que muestran el efecto del tratamiento con anti-D114 y anti-NRR de Notch 1 sobre el flujo a través de los vasos en un ensayo de córnea. La perfusión a través de los vasos tratados con anti-D114 y anti-NRR de Notch 1 estaba restringida.
[0109] La figura 14D es una serie de imágenes que muestran el efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 en un modelo murino de angiogénesis de retina. El tratamiento con anticuerpo anti-NRR de Notch 1 (Anticuerpo A-2) aumentó la densidad de la vasculatura y generó un fenotipo con hiperformación.
[0110] La figura 14E es una serie de imágenes que muestran que, en un modelo murino de angiogénesis de retina, el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 (Anticuerpo A-2) causa un aumento de la cantidad de núcleos, que concuerda con un aumento de la proliferación celular.
[0111] La figura 15A es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 sobre el crecimiento tumoral en un modelo murino in vivo. El tratamiento con anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 detuvo el crecimiento del tumor.
[0112] La figura 15B es un gráfico que muestra que diversas dosis de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 detuvieron o ralentizaron el crecimiento tumoral en un modelo murino in vivo.
[0113] La figura 15C es un gráfico que muestra que, en un modelo murino in vivo, el Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 disminuyó el volumen del tumor.
[0114] La figura 15D es un gráfico que muestra que, en un modelo murino in vivo, el Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 causa pérdida de peso de forma dependiente de la dosis.
[0115] La figura 15E es un gráfico que muestra la eliminación del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 con el paso del tiempo en suero de ratones inmunodeficientes (Balb-C Nu/Nu).
[0116] Las figuras 16A y 16B son una serie de imágenes que muestran ejemplos de criptas y vellosidades intestinales de los intestinos delgado (figura 16A) o grueso (figura 16B) de ratones tratados con un anticuerpo de control (vehículo) o con anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 en una concentración de 10 mg/kg.
[0117] La figura 17 es un gráfico que muestra que los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y los inhibidores de gamma-secretasa disminuyen la viabilidad de ciertas líneas celulares cancerosas. Se usaron el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A-2 y los inhibidores de gamma-secretasa éster t-butílico de N-[N(3,5-difuorofenacetil)-L-alanil]-Sfenilglicina (DAPT) y el compuesto E (CmpE). Las líneas celulares cancerosas se indican en el eje x.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0118] La invención en el presente documento proporciona anticuerpos anti-NRR de Notch 1 como se define en las reivindicaciones, que son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de patologías asociadas con la expresión y/o la actividad de Notch, tales como aumento de la expresión y/o actividad o una expresión y/o actividad no deseadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular.
[0119] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 pueden encontrar utilidad como reactivos para la detección y/o el aislamiento de Notch 1, tal como la detección de Notch 1 en diversos tipos tisulares y celulares.
[0120] La invención proporciona adicionalmente procedimientos para preparar anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-NRR de Notch 1.
Técnicas generales
[0121] Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en el presente documento, en general, se entienden y se emplean habitualmente usando una metodología convencional por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, y col. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G.
R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Definiciones
[0122] Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéutico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. Preferiblemente, el anticuerpo se purificará (1) más del 95% en peso de anticuerpo como se determina mediante el procedimiento de Lowry, y mucho más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico) en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que al menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
[0123] Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada está en una forma o composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian de la molécula de ácido nucleico tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el ácido nucleico (por ejemplo, un anticuerpo que codifica ácido nucleico), donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
[0124] La expresión "residuo de dominio variable que se enumera como en Kabat" o "posición de aminoácido que se enumera como en Kabat", y variaciones de las mismas, se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un recorte o una inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un único aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de residuos Kabat se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia enumerada Kabat "estándar".
[0125] La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo/la misma", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado a un anticuerpo y el otro asociado a un anticuerpo de referencia/comparación), de manera que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene una significancia biológica y/o estadística escasa o nula en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es preferiblemente inferior a aproximadamente el 50%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 40%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 30%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 20%, preferiblemente aproximadamente inferior a aproximadamente el 10% en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.
[0126] "Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). De manera deseable, la Kd es 1 x 10-7, 1 x 10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 10-9, 5 X 10-9, o incluso 1 x 10-10 o más fuerte. La afinidad se puede medir mediante procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad se unen en general a antígenos lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que anticuerpos de afinidad elevada se unen en general a antígenos más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conocen diversos procedimientos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención A continuación se describen realizaciones ilustrativas específicas.
[0127] En una realización, la "Kd" o "el valor Kd" se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con una versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de Fab para el antígeno mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado (125l) en presencia de una serie de titulaciones de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, y col., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) se cubren durante una noche con 5 !g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 ºC). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de [125l]-antígeno se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistentes con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y col., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599). El Fab de interés se incuba a continuación durante una noche; sin embargo la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Por lo tanto, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 !I/pocillo de centelleador (MicroScint-20; Packard), y se recuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o igual a un 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva. Según otro aspecto, la Kd o el valor de Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips biodetectores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y Nhidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, en 5 !g/ml (~0,2 !M) antes de la inyección a un caudal de 5 !I/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25 ºC a un caudal de aproximadamente 25 !l/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proparte koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., y col., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Si la velocidad "on" supera 106 M-1S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar utilizando una técnica de "inactivación" fluorescente que mide el aumento o descenso de la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 ºC de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación.
[0128] Una "velocidad on" o "velocidad de asociación" o "kon" también se puede determinar con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial que se ha descrito anteriormente utilizando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips biodetectores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, en 5 !g/ml (~0,2 !M) antes de la inyección a un caudal de 5 !I/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25 ºC a un caudal de aproximadamente 25 !l/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la proparte koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., y col., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Sin embargo, si la velocidad "on" supera 106 M-1S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad "on" se puede determinar utilizando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o descenso en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 ºC de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación.
[0129] El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que pueden estar unidos segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que los segmentos de ADN adicionales pueden estar unidos en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden estar integrados en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más utilizada habitualmente.
[0130] "Polinucleótido" o "ácido nucleico", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos se puede realizar antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir mediante componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante la conjugación con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "bloqueadores", "sustitución de uno o más nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicos, tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen grupos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido
o polinucleótidos. Además, se puede sustituir cualquier grupo hidroxilo presente normalmente en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar con soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos protectores orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tales como metil ribósido. Se pueden sustituir uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que opcionalmente contienen una unión éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las uniones en un polinucleótido necesitan ser idénticas. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos denominados en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.
[0131] "Oligonucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a polinucleótidos cortos, de una cadena, generalmente sintéticos, que tienen, en general, pero no necesariamente menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se excluyen entre sí. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y totalmente aplicable a oligonucleótidos.
[0132] "Porcentaje (%) de identidad de secuencia aminoacídica" con respecto a una secuencia peptídica o polipeptídica se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia específica de péptido o polipéptido, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para obtener un máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que pertenecen a la técnica, por ejemplo, mediante el uso de software informático disponible para el público, por ejemplo software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir los alineamientos, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento para toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático para la comparación de secuencias ALIGN-2, en el que se proporciona el código de fuente completo para el programa ALIGN-2 en la Tabla A que se muestra a continuación. El programa informático para comparación de secuencias ALlGN-2 es de Genentech, Inc. y el código de fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está registrado con el número de registro de Copyright de los Estados Unidos Nº TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado, por ejemplo, en el documento WO 2007/001851. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se fijan por el programa AL1GN-2 y no varían.
[0133] En situaciones en las cuales se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que como alternativa se puede frasear como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como se indica a continuación:
100 veces la fracción de X/Y
donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B del programa, y donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia aminoacídica A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.
[0134] De forma deseable, dos o más secuencias de aminoácidos tienen al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de identidad. De forma más deseable, dos o más secuencias de aminoácidos tienen al menos 95%, 97%, 98% 99% o incluso el 100% de identidad. A menos que se establezca específicamente otra cosa, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior mediante el programa informático ALIGN-2.
[0135] El término "Notch 1", como se usa en el presente documento, se refiere, a menos que se indique otra cosa específicamente o por contexto, a cualquier polipéptido Notch 1 nativo o variante (ya sea nativo o sintético). La expresión "secuencia sin tratar" incluye específicamente las formas truncadas de origen natural (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular o una secuencia de subunidad de transmembrana), formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales. La expresión "Notch 1 de tipo natural" en general se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de una proteína Notch 1 natural. La expresión "secuencia Notch 1 de tipo natural" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos hallada en el Notch 1 natural.
[0136] La expresión "ligando de Notch 1", como se usa en el presente documento, se refiere, a menos que se indique otra cosa específicamente o por contexto, a cualquier polipéptido ligando de Notch 1 nativo o variante (ya sea nativo o sintético) (por ejemplo, Jagged1, Jagged2, Delta tipo 1, Delta de tipo 3 y/o Delta de tipo 4). La expresión "secuencia nativa" incluye específicamente las formas truncadas naturales (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular o una secuencia de subunidad de transmembrana), formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales. La expresión "ligando de Notch 1 de tipo natural" se refiere en general a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de una proteína de ligando de Notch 1 de origen natural. La expresión "secuencia de ligando de Notch 1 de tipo natural" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos hallada en un ligando de Notch 1 natural.
[0137] La expresión "NRR de Notch 1", como se usa en el presente documento, se refiere, a menos que se indique otra cosa específicamente o por contexto a cualquier región polipeptídica nativa o variante (sea nativa o sintética) de Notch 1 que consiste en los módulos 3 LNR y secuencias de aminoácido carboxiterminales de los módulos LNR que se extienden al dominio transmembrana, por ejemplo, los números de aminoácidos de aproximadamente 1446 a aproximadamente 1735 de la secuencia de aminoácidos de Notch 1 humano (SEQ ID NO: 56), y los números de aminoácidos de aproximadamente 1446 a aproximadamente 1725 de la secuencia de aminoácidos de Notch 1 murina (SEQ ID NO: 57). La expresión "secuencia nativa" incluye específicamente las formas truncadas naturales, formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales. La expresión "NRR de Notch 1 de tipo natural" se refiere en general a un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica de NRR de Notch 1 natural. El NRR de Notch 1 es un polipéptido que contiene los aminoácidos 1446 a 1735 de SEQ ID NO: 56 o los aminoácidos 1446 a 1725 de SEQ ID NO: 57. En algunos aspectos, una NRR de Notch 1 está contenida en un Notch 1, tal como, por ejemplo, un Notch 1 procesado en los sitios S1, S2 y/o S3, o un Notch 1 no procesado. En algunos aspectos, una NRR de Notch 1 contiene dos o más fragmentos no ligados covalentemente de una secuencia de aminoácidos de NRR de Notch 1, por ejemplo, un fragmento que contiene los aminoácidos 1446 a 1664 de SEQ ID NO: 56 está ligado covalentemente a un fragmento que contiene los aminoácidos 1665 a 1735 de SEQ ID NO: 56. En otro aspecto, un fragmento que contiene los aminoácidos 1446 a 1654 de SEQ ID NO: 57 está ligado no covalentemente a un fragmento que contiene los aminoácidos 1655 a 1725 de SEQ ID NO: 57.
[0138] La expresión "aumento de señalización de Notch 1", como se usa en el presente documento, se refiere a un aumento de la señalización de Notch 1 que está al menos dos veces por encima del nivel de señalización de Notch 1 observado en un control en condiciones idénticas, por ejemplo, usando el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento en los Ejemplos 5 y 6. De manera deseable, el aumento de señalización de Notch 1 es al menos de tres veces, cuatro veces, cinco veces o incluso diez veces superior (o más) al nivel observado en el control.
[0139] La expresión "disminución de la señalización de Notch 1", como se usa en el presente documento, se refiere a un descenso de la señalización de Notch 1 que es al menos dos veces inferior al nivel de señalización de Notch 1 observado en un control en condiciones idénticas, por ejemplo mediante el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento en los Ejemplos 5 y 6. De manera deseable, el descenso de señalización de Notch 1 es al menos de tres veces, cuatro veces, cinco veces o incluso diez veces inferior (o más) al nivel observado en el control.
[0140] Las expresiones "mutación activadora de Notch 1" y "mutación que activa la señalización de Notch 1" se refieren a una inserción de uno o más aminoácidos, una eliminación de uno o más aminoácidos o una sustitución de uno o más aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos Notch 1 de tipo natural que da como resultado un aumento de la señalización de Notch 1, en comparación con la señalización de Notch 1 de la correspondiente secuencia de aminoácidos Notch 1 de tipo natural o a una inserción de uno o más nucleótidos, una eliminación de uno o más nucleótidos, una traslocación de uno o más nucleótidos, o una sustitución de uno o más nucleótidos respecto de una secuencia de ácidos nucleicos de Notch 1 de tipo natural que da como resultado un aumento de señalización de Notch 1 en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico mutante, en comparación con las señales de Notch 1 en una célula que contiene la correspondiente secuencia de ácido nucleico de Notch 1 de tipo natural. La señalización de Notch 1 de un receptor de Notch 1 que contiene una mutación activadora puede ser dependiente de ligando o independiente de ligando.
[0141] Las expresiones "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, siempre que muestren la actividad biológica deseada), y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (tal como se describe en detalle en el presente documento). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado para afinidad.
[0142] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, ambas en los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan la región de estructura ("framework") (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro regiones FR, que mayoritariamente ampliamente una configuración de lámina 1, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos conforman, la estructura de lámina 1. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas de manera próxima por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación de sitios de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
[0143] La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales posee un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antígeno y que incluso es capaz de entrecruzar el antígeno.
[0144] "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento a antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de una cadena, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un péptido enlazador flexible, de manera que las cadenas ligera y pesada se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDR específicas de antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.
[0145] El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en el presente documento para Fab', en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes transportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
[0146] Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominadas kappa (K) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
[0147] Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, s, y y !, respectivamente. Se conocen bien las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas. "Fragmentos de anticuerpos" comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, en los que la parte mantiene preferiblemente al menos una, preferiblemente la mayoría o todas, las funciones normalmente asociadas con la parte cuando está presente en un anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En un aspecto, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y de este modo mantiene la capacidad de unirse a antígeno. En otro aspecto, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, mantiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, la función de ADCC y la unión a complemento. En un aspecto, un
Bucle
Kabat AbM Chothia Contacto
L1
L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2
L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3
L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1
H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Numeración de Kabat)
H1
H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Nu
meración de Chothia)
H2
H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3
H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno unido a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.
[0148] La expresión "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1, H2, H3), y tres en VL (L1, L2, L3). En el presente documento se utilizan y se incluye un conjunto de delineaciones de la región hipervariable. Las regiones determinantes de complementariedad de Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el software de modelaje de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristales complejos disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.
Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL y 26-35 (H1), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95102 (H3) en VH. Los residuos de los dominios variables se enumeran según Kabat y col., anteriormente para cada una de estas definiciones.
[0149] Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se define en el presente documento.
[0150] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) donde los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann y col., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428433 (1994).
[0151] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" tienen una parte de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas son idéntica con u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81: 6851-6855 (1984)). El anticuerpo humanizado como se usa en el presente documento es un subgrupo de anticuerpos quiméricos.
[0152] Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios se presentan en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido scFv comprende adicionalmente un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994).
[0153] Un "antígeno" es un antígeno predeterminado al que se puede unir selectivamente un anticuerpo. El antígeno diana puede ser un polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto de origen natural o sintético. Preferiblemente, el antígeno diana es un polipéptido.
[0154] El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
[0155] Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia aminoacídica que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
[0156] Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más de CDR del mismo que dan como resultado a una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esta alteración o alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tienen afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks y col. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) describen la maduración por afinidad por redistribución de los dominios de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los residuos de CDR y/o de estructura se describe por: Barbas y col. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier y col. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton y col. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); y Hawkins y col., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
[0157] Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y la activación de células B.
[0158] "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas ("killer") naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y, posteriormente, eliminan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha eliminación. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan únicamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIl y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337, o patente de Estados Unidos Nº 6.737.056 de Presta. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes y col. PNAS (USA), 95: 652-656 (1998).
[0159] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMC y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
[0160] El "receptor Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas de forma alterna ("spliced") de estos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRIlA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación FcyRIlA contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, se incluyen por el término "FcR" en el presente documento. La expresión "receptor Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24: 249 (1994)) y regula la homeostasis de inmunoglobulinas. El documento WO 00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con una unión mejorada o disminuida a FcR. El contenido de esta publicación de patente se incorpora específicamente en la presente por referencia. Véase también Shields y col. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
[0161] Se conocen procedimientos para medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). Se puede analizar la unión a FcRn humano in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión con afinidad elevada a FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates administrados con los polipéptidos variantes de Fc.
[0162] "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta de complemento clásico se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno afín. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).
[0163] Las variantes polipeptídicas con las secuencias de aminoácidos de la región Fc alteradas y la capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida se describen en la patente de Estados Unidos Nº 6.194.551B1 y WO 99/51642. El contenido de estas publicaciones de patente se incorpora específicamente en la presente por referencia. Véase, también, Idusogie y col. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0164] La expresión "polipéptido que comprende la región Fc" se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o inmunoadhesina, que comprende una región Fc. La lisina C terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de la UE) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Por consiguiente, una composición que comprende un polipéptido que tiene una región Fc de acuerdo con esta invención puede comprender polipéptidos con K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo K447.
[0165] Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. De manera deseable, la actividad biológica se reduce al 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso al 100%.
[0166] Un "anticuerpo agonista", como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que simula al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
[0167] Una "estructura humana aceptora" para los fines en el presente documento es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulina humana, o de una estructura consenso humana. Una estructura aceptora humana "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o estructura consenso humana puede comprender su misma secuencia de aminoácidos, o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos preexistentes. Cuando están presentes cambios de aminoácidos preexistentes, preferiblemente no hay presentes más de 5 y preferiblemente 4 o menos, o 3 o menos cambios de aminoácidos preexistentes. Cuando los cambios de aminoácidos preexistentes están presentes en un VH, preferiblemente dichos cambios están solo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en dichas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una realización, la estructura aceptora humana VL es idéntica en secuencia a la secuencia de estructura de la inmunoglobulina humana VL o la secuencia de estructura consenso humana.
[0168] Una "estructura consenso humana" es una estructura que representa el residuo de aminoácido más común que aparece en una selección de secuencias de estructura de inmunoglobulina VL o VH humanas. Generalmente, la selección de las secuencias de inmunoglobulinas humanas VL o VH es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo de Kabat y col. En una realización, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat y col. En una realización, para el VH, el subgrupo es subgrupo III de Kabat y col.
[0169] Una "estructura consenso de subgrupo III de VH" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácido en el subgrupo variable pesado III de Kabat y col. En una realización, la secuencia aminoacídica de estructura consenso de subgrupo III de VH comprende al menos una parte o la totalidad de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 45).
[0170] Una "estructura consenso de subgrupo 1 de VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I variable kappa ligero de Kabat y col. En una realización, la secuencia de aminoácidos de estructura consenso de subgrupo I de VH comprende al menos una parte o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGORVTITC (SEQ ID NO: 15)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ 10 NO: 16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18).
[0171] Un "trastorno" o "enfermedad" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o un procedimiento de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen tumores malignos y benignos; carcinoma, blastoma y sarcoma.
[0172] Las expresiones "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer.
[0173] "Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no se excluyen mutuamente como se hace referencia en el presente documento.
[0174] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracterizan habitualmente por un crecimiento/proliferación celular no regulada. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeña, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio
o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer gástrico, melanoma, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. La desregulación de la angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que se pueden tratar mediante composiciones y procedimientos de la invención. Estos trastornos incluyen afecciones tanto no neoplásicas como neoplásicas. Las neoplásicas incluyen, pero sin limitación, las que se han descrito anteriormente. Los trastornos no neoplásicos incluyen, pero sin limitación, hipertrofia no deseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis, placas de psoriasis, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatías proliferativas diabéticas y otras, incluyendo retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización del injerto de córnea, rechazo del injerto de córnea, neovascularización retinal/coroidea, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de Grave), el trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones malignas pulmonares, edema cerebral (por ejemplo, asociado con accidente cerebrovascular agudo/lesión cerrada de cabeza/trauma), inflamación sinovial, formación de pannus en AR, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, osteoarthtis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquístico, endometriosis, tercer espaciamiento de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad del intestino), fibromas uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseado o aberrante (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del pelo, síndrome de Osler-Weber, fibroplasias retrolentales granuloma piógeno, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con la pericarditis), y efusión pleural.
[0175] Las expresiones "enfermedad neurodegenerativa" y "trastorno neurodegenerativo" se usan en el sentido más amplio para incluir todos los trastornos cuya patología incluye degeneración neuronal y/o disfunción, incluyendo, sin limitación, neuropatías periféricas; trastornos de neurona motora, tales como esclerosis lateral amiotrófica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig), parálisis de Bell, y diversas afecciones que incluyen atrofia muscular espinal o parálisis; y otras enfermedades neurodegenerativas humanas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, esclerosis múltiple, corea de Huntington, síndrome de Down, hipoacusia nerviosa y enfermedad de Meniere.
[0176] "Neuropatía periférica" es un trastorno neurodegenerativo que afecta los nervios periféricos, con mayor frecuencia manifestada como una o una combinación de disfunción motora, sensorial, sensorimotora o autonómica.
Las neuropatías periféricas pueden ser, por ejemplo, adquiridas genéticamente, ser el resultado de una enfermedad sistémica, o pueden ser inducidas por un agente tóxico, tal como un fármaco neurotóxico, por ejemplo, un agente antineoplásico, o un contaminante industrial o ambiental.
[0177] La "neuropatía sensorial periférica" se caracteriza por la degeneración de las neuronas sensoriales periféricas, que puede ser idiomática, puede ocurrir, por ejemplo, como consecuencia de diabetes (neuropatía diabética), fármacos citostáticos, terapia de cáncer (por ejemplo, tratamiento con agentes quimioterapéuticos tales como vincristina, cisplatino, metotrexato, 3'-azido,3'-desoxitimidina, o taxanos, por ejemplo paclitaxel [TAXOL®, Bristol, Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.] y doxetaxel [TAXOTERE® Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia]), alcoholismo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), o predisposición genética. Las neuropatías periféricas generalmente adquiridas incluyen, por ejemplo, enfermedad de Refsum, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de Dejerine-Sottas, Abetalipoproteinemia y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (también denominada atrofia muscular proneal o neuropatía sensorial motora hereditaria (HMSN)). La mayor parte de los tipos de neuropatía periférica se desarrollan lentamente, durante el transcurso de varios meses o años. En la práctica clínica, dichas neuropatías se denominan crónicas. En ocasiones, una neuropatía se desarrolla rápidamente, en el transcurso de pocos días, y se denomina aguda. La neuropatía periférica suele afectar los nervios motores y sensitivos juntos, por lo que causan una neuropatía sensitiva y motora mixta, pero también se conocen neuropatías sensitivas puras y motoras puras.
[0178] Una "enfermedad autoinmune", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier trastorno cuya patología implique una respuesta inmune contra el tejido propio del individuo. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (AR), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, rinitis alérgica, urticaria alérgica, enfermedad de Crohn, enfermedad de Hirschsprung, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, enfermedades inflamatorias intraoculares alérgicas, espondilitis anquilosante, dermatitis atópica, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, síndrome de Cogan, dermatitis de contacto, síndrome de Cushing, dermatomiositis, diabetes mellitus, lupus eritematoso discoide, nefritis lúpica, fascitis eosinófila, eritema nodoso, dermatitis exfoliativa, glomerulosclerosis focal o segmentaria, arteritis de células gigantes, gota, artritis gotosa, eczema de mano, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hirsutismo, ceratoescleritis idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, dermatosis inflamatoria, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miositis, osteoartritis, pancreatitis, penfigoide gestacional, pénfigo vulgar, periodontitis; poliarteritis nodosa, polimialgia reumática, pruritus scroti, prurito/inflamación, psoriasis, artritis psoriásica, histoplasmosis pulmonar, policondritis recidivante, rosácea, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de shock séptico, tendiditis del hombro o bursitis, síndrome de Sjogren, enfermedad de Still, enfermedad de Sweet, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, necrólisis epidérmica tóxica, rechazo de trasplante, tuberculosis, diabetes tipo 1, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis y granulomatosis de Wegener.
[0179] Un "trastorno inmunológico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier trastorno cuya patología implique el desarrollo o regulación anormal del sistema inmune en un individuo. De manera deseable, el trastorno inmunológico incluye un desarrollo o regulación anormal de linfocitos T.
[0180] Un "medicamento" es un fármaco activo para tratar el trastorno en cuestión o sus síntomas, o efectos secundarios.
[0181] Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar la evolución natural del individuo o la célula en tratamiento, y se puede realizar por profilaxis o durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o reaparición de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o cura parcial de la patología y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, se utilizan los anticuerpos para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.
[0182] Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente, un mamífero, más preferiblemente, un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales de competición, mascotas (tales como gatos, perros o caballos), primates, ratones y ratas.
[0183] "Mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, eventos deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
[0184] Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
[0185] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista, puede variar según factores, tales como la patología, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula agonista o antagonista para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella cantidad en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula, agonista o antagonista, se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Habitualmente, pero no necesariamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
[0186] La expresión "agente citotóxico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa la destrucción celular. La expresión pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas, tales como toxinas que son moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos desvelados a continuación. A continuación se describen otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.
[0187] Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes alquilantes, tales como la tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®; los alquilsulfonatos tales como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas tales como la benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; las etileniminas y metilamelaminas, incluyendo la altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; las acetogeninas (especialmente la bullatacina y la bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabiol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); la briostatina; la calistatina; el CDC1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofílico; teniposide; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la criptoficina 8); la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); la eleuterobina; la pancratistatina; una sarcodictina; la espongistatina; las mostazas nitrogenadas tales como el clorambucilo, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida, la mostaza de uracilo; las nitrosureas tales como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina, y la ranimustina; los antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, la caliqueamicina, especialmente la caliqueamicina gamma I y la caliqueamicina omega 1 (véase, por ejemplo, Andrew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina; así como el cromóforo de la neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamicina®) (incluyendo la morfolino-doxorubicina, la cianomorfolino-doxorubicina, la 2-pirrolino-doxorubicina y la desoxidoxorubicina), la epirubicina, la esorubicina, la idarubicina, la marcelomicina, las mitomicinas tales como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la zinostatina, la zorubicina; los anti-metabolitos tales como el metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico tales como la denopterina, el metotrexato, la pteropterina, el trimetrexato; los análogos de purina tales como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina, la tioguanina; los análogos de pirimidina tales como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina, la floxuridina; los andrógenos tales como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, la mepitiostana, la testolactona; los anti-adrenales tales como la aminoglutetimida, el mitotano, el trilostano; los rellenadores de ácido fólico tales como el ácido frolínico; la aceglatona; el glicósido de aldofosfamida; el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucilo; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfomitina; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinano; la lonidainina; los maitansinoides tales como la maitansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona; el mopidanmol; la nitraerina; la pentostatina; el fenameto; la pirarubicina; la losoxantrona; la 2-etilhidrazida; la procarbazina; el complejo de polisacáridos ASK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); la razoxana; la rizoxina; el sizofirano; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la triaziquona; la 2,2',2"-triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, la verracurina A, la roridina A y la anguidina); el uretano; la vindesina (ELDISIN®, FILDESIN®); la dacarbazina; la manomustina; el mitobronitol; el mitolactol; el pipobromano; la gacitosina; el arabinósido ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulación en nanopartículas de paclitaxel diseñado en
albúmina, libre de Cremóforos ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y el
doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); el cloranbucilo; la gemcitabina (Gemzar®); la 6tioguanina; la mercaptopurina; el metotrexato; los análogos de platino tales como el cisplatino y carboplatino; la vinblastina (VELBAN®); el platino; el etopósido (VP-16); la ifosfamida; la mitoxantrona; la vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovina; la vinorelbina (Navelbine®); la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina; el ibandronato; el inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; la difluorometilornitina (DMFO); los retinoides tales como el ácido retinoico; la capecitabina (XELODA®); y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviación para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina.
[0188] También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear
o inhibir los efectos de hormonas que pueden inducir el crecimiento del cáncer y, a menudo, en forma de tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Pueden ser hormonas en sí. Los ejemplos incluyen antiestrógenos y modulares de receptores de estrógeno selectivos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX® tamoxifeno), EVTSTA® raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; anti-progesteronas; subreguladores del receptor de estrógeno (ERD); agentes que actúan para suprimir o desactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH), tales como LUPRON® y acetato de leuprolide ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®. Además, dicha definición de agentes quimioterapéuticos incluye bifosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA ®, tiludronato SKELID®, o risedronato ACTONEL®; así como troxacitabina (un análogo del 1,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en mecanismos de señalización implicados en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas con terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAPID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina cinasa dual de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0189] Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula (tal como una célula que expresa Notch 1), in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el porcentaje de células (tal como una célula que expresa Notch 1) en la fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que interrumpen G1 también afectan a la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloroetamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami y col., (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerosos derivados del tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos mediante la prevención de la despolimerización, lo que da lugar a la inhibición de la mitosis en células.
[0190] "Doxorrubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8Scis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1metoxi-5,12-naftacenodiona.
[0191] La expresión "composición antineoplásica" se refiere a una composición de utilidad para el tratamiento de cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "un agente anticáncer". Los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anticáncer, también denominados "agentes antineoplásicos" en el presente documento) incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agente citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénesis, agentes apoptóticos, agentes antitubulina, toxina, y otros agentes para tratar cáncer, por ejemplo, anticuerpo neutralizante anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER2, anti-CD20, un antagonista de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosinaquinasa), inhibidor de HERl/EGFR, erlotinib, un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se fijan a uno
o más de los receptores ErbB2, ErbB3, ErbB4 o VEGF, inhibidores de tirosinaquinasa para factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y/o factor de células madre (SCF) (por ejemplo, mesilato de imatinib (Gleevec® Novartis)), TRAIL/Apo2, y otros agentes bioactivos y de química orgánica, etc.
[0192] El término "profármaco", como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o un derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales, en comparación con el fármaco original y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma original más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th Reunión Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero sin limitación, profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen tiosulfatos, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen D-aminoácidos modificados, profármacos glucosilados, profármacos que contienen beta-lactamo, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en una forma de profármaco para su uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, los agentes quimioterapéuticos que se han descrito anteriormente.
[0193] Un "agente antiangiogénesis" o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de peso molecular pequeño, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis, vasculogénesis o la permeabilidad vascular no deseable, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista para un agente angiogénico, como se ha definido anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VEGF, anticuerpos para receptores de VEGF, moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706). Los agentes antiangiogénesis también incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003) (por ejemplo, la Tabla 3 que enumera la terapia antiangiogénica en melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini y col., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 2 que enumera factores antiangiogénicos); y, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1 enumera agentes antiangiogénicos usados en pruebas clínicas).
[0194] Una "muestra biológica" (indistintamente denominada "muestra" o "muestra tisular o celular") comprende una diversidad de tipos de muestra obtenidas de un individuo y se puede usar en un ensayo de diagnóstico o monitorización. La definición incluye sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como muestras de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de las mismas, y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier modo después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o que se sumergen en una matriz semisólida o sólida con fines de separación. La expresión "muestra biológica" comprende una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido. La fuente de la muestra biológica puede ser tejido sólido de una muestra de órgano o tejido o biopsia o aspirado fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales, tales como fluido espinal cerebral, fluido amniótico, fluido peritoneal o fluido intersticial; células de cualquier momento en la gestación o desarrollo del sujeto. En algunos aspectos, la muestra biológica se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra biológica puede contener compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza, tal como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares.
[0195] Para los fines del presente documento, una "sección" de una muestra de tejido se refiere a una parte individual o trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, una tira delgada de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Se entiende que se pueden tomar múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a un análisis según la presente invención. En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se analiza tanto a nivel morfológico como molecular, o se analiza con respecto tanto a la proteína como al ácido nucleico.
[0196] La palabra "etiqueta" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o se fusiona directa o indirectamente a un reactivo, tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al que se conjuga o se fusiona. La etiqueta puede detectarse por sí misma (por ejemplo, etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la modificación química de un compuesto o una composición de sustrato que es detectable.
Receptor Notch 1 y mutaciones activadoras
[0197] Los receptores Notch se procesan proteolíticamente durante el transporte a la superficie celular por una proteasa similar a furina en un sitio S1 a unos 70 aminoácidos externo al dominio transmembrana, produciendo una subunidad extracelular Notch (ECN) y una subunidad Notch transmembrana (NTM). Estas dos subunidades permanecen asociadas no covalentamente y constituyen el receptor heterodimérico maduro de superficie celular. La subunidad Notch 1 ECN contiene 36 repeticiones similares a EGF N-terminales seguidas de tres módulos LNR repetidos en tándem (LNR_A, LNR_B y LNR_C). Cada módulo LNR contiene tres enlaces disulfuro y un grupo de residuos ácidos y polares conservados que se predice que coordinan un ión de calcio. Dentro de la región de repeticiones EGF se encuentran sitios de unión para los ligandos activadores. Los módulos LNR participan en el mantenimiento de Notch en una conformación en reposo antes de la activación inducida por ligando. El Notch 1 NTM comprende una región extracelular, un segmento transmembrana y una gran parte intracelular que incluye un dominio RAM (molécula asociada a RBP JK), repeticiones de anquirina, un dominio de transactivación y una secuencia carboxi-terminal PEST. La asociación estable de las subunidades ECN y NTM depende de un dominio de heterodimerización (HD) que incluye el extremo carboxi-terminal del ECN (denominado HD-C) y el extremo aminoterminal extracelular de NTM (denominado HD-N). La unión de un ligando de Notch a la subunidad ECN inicia dos escisiones proteolíticas sucesivas que tienen lugar a través de proteólisis intramembrana regulada. La primera escisión por una metaloproteasa en el sitio de escisión S2 (ubicado en NTM) hace a la subunidad transmembrana de Notch susceptible a la segunda escisión en el sitio de escisión S3 cercano a la hojuela interna de la membrana plasmática. La escisión en el sitio S3, que se cataliza por un complejo multiproteico que contiene presenilina y nicastrina, libera la parte intracelular de la subunidad transmembrana de Notch (también denominada Notch intracelular; "CN"), y le permite traslocarse al núcleo y activar la transcripción de los genes diana.
[0198] Las figuras 11-1 a 11-4 muestran un alineamiento entre las secuencias aminoacídicas humana (SEQ ID NO: 56) y murina (SEQ ID NO: 57) de Notch 1. El péptido señal cubre aproximadamente los aminoácidos 1-18 de la SEQ ID NO: 56 ó 57, las repeticiones EGF (EGF1 a EGF36) cubren aproximadamente los aminoácidos 20-1426 de SEQ ID NO: 56 ó 57, LNR_A cubre aproximadamente los aminoácidos 144 6-1489 de SEQ ID NO: 56 ó 57, LNR_B cubre aproximadamente los aminoácidos 1490-1527 de SEQ ID NO: 56 ó 57, LNR_C cubre aproximadamente los aminoácidos 1528-1562 de SEQ ID NO: 56 ó 57, HD-N cubre aproximadamente los aminoácidos 1563-1664 de SEQ ID NO: 56 o los aminoácidos 1563-1654 de SEQ ID NO:57, HD-C cubre aproximadamente los aminoácidos 16651733 de SEQ ID NO: 56 o los aminoácidos 1655-1723 de SEQ ID NO:57, y el dominio PEST cubre aproximadamente los aminoácidos 2484-2555 de SEQ ID NO: 56 o aproximadamente los aminoácidos 2459-2530 de SEQ ID NO: 57. El dominio HD, que incluye HD-N y HD-C, cubre aproximadamente los aminoácidos 1563-1733 de SEQ ID NO: 56 o los aminoácidos 1563-1723 de SEQ ID NO: 57. El sitio de escisión S1 está entre los aminoácidos 1664 y 1665 de SEQ ID NO: 56 y entre los aminoácidos 1654 y 1655 de SEQ ID NO: 57. El sitio de escisión S2 se encuentra entre los aminoácidos 1720 y 172 1 de SEQ ID NO: 56 y los aminoácidos 1710 y 1711 de SEQ ID NO: 57. La parte transmembrana cubre aproximadamente los aminoácidos 1736-1747 de SEQ ID NO: 56 y aproximadamente los aminoácidos 1726-1737 de SEQ ID NO: 57.
[0199] Se han identificado y caracterizado varios tipos de mutaciones de Notch 1 que afectan las señales de Notch
1. Las mutaciones de Notch 1 que activan la señalización de Notch 1 pertenecen a dos clases generales, concretamente mutaciones activadoras independientes de ligando y dependientes de ligando. Sin embargo, algunas mutaciones activadoras independientes de ligando responden aún al ligando. Las mutaciones que activan la señalización de Notch 1 se han asociadas con LLA-T (Weng y col., Science 306: 269-271, 2004; Malecki y col., Mol. Cell. Biol. 26: 4642-4651, 2006). En particular, se han detectado mutaciones activadoras de Notch 1 asociadas con LLA-T en la región HD y en el dominio PEST. Además, las translocaciones pueden dar como resultado la señalización de Notch 1 aberrante. Por ejemplo, se descubrió que Notch 1 como gen compañero en una translocación cromosómica (7;9)(q34;q34.3). Esta translocación se encuentra en un subconjunto poco frecuente de LLA-T y fusiona el extremo 3' del gen Notch 1 con el promotor/potenciador 1 del receptor de linfocitos T (Weng y col., Science 306: 269-271, 2004).
[0200] Los ejemplos de mutaciones independientes de ligando que señalan en la ausencia de la unión del ligando pero retienen la capacidad para responder a la unión de ligando son mutaciones en la región HD de Notch 1. Las mutaciones activadoras de la región HD-N de Notch 1 humano incluyen, por ejemplo, L1575P, V1577E, F15935, L1594P, L1597H, R1599P, L1601P e I1617T/N. Los ejemplos de mutaciones activadoras de la región HD-C de Notch 1 humano incluyen V1677D, L1679P, I1681N, A1702P, I1719T, y una inserción (ARLGSLNIPYKIEA; SEQ ID NO: 52) en el sitio de escisión S2 (la inserción P12). Las mutaciones L1575P, V1577E, F1593S, L1594P, L1597H, R1599P, L1601P, I1617T/N, V1677D, L1679P, I1681N, A1702P e I1719T y la inserción P12 causan un aumento de la escisión S2 y S3 y la señalización de Notch 1 es mayor que la señalización del receptor Notch 1 de tipo natural.
[0201] Un subconjunto de mutaciones activadoras de Notch 1 reduce la estabilidad heterodimérica, debilitan la interacción de la región ECN y la NTM. Los ejemplos de mutaciones que reducen la estabilidad heterodimérica en Notch 1 humano incluyen L1575P, V1577E, F15935, L1594P, L1597H, R1599P, I617T, I1617N, I1681N, A1702P e I1719T. Las inserciones P12 provienen de una duplicación directa que se predice que repone el dominio endógeno HD-C lejos del sitio de escisión S2, y puede aumentar el acceso al sitio S2 por parte de las metaloproteasas (Malecki y col., Mol. Cell. Biol. 26: 4642-4651, 2006).
[0202] Los ejemplos de mutaciones activadoras de Notch 1 que son dependientes de ligando incluyen mutaciones en el dominio PEST, tales inserciones o eliminaciones que inducen un cambio del marco de lectura o mutaciones puntuales que crean codones de detención prematuros. Se cree que la eliminación del dominio inhibidor PEST aumenta la semivida de ICN. Una mutación ejemplar en el dominio PEST es DelPEST, que es una deleción carboxi terminal que comienza en el aminoácido 2473 de la secuencia aminoacídica de Notch 1 humano (SEQ ID NO: 57). Se conocen en la técnica otras mutaciones en el dominio PEST y se describen, por ejemplo, en Weng y col. (Science 306: 269-271, 2004).
Composiciones de la invención y procedimientos para preparar las mismas
[0203] Esta invención incluye composiciones como se definen en las reivindicaciones que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo anti-NRR de Notch 1; y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Como se usa en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a NRR de Notch 1, y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen a NRR de Notch 1. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente vehículos adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que se conocen bien en la técnica.
[0204] La invención también incluye realizaciones de anticuerpos y polinucleótidos aislados. La invención también incluye realizaciones de anticuerpos y polinucleótidos sustancialmente puros.
[0205] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 son preferiblemente monoclonales. También se incluyen dentro del alcance de la invención los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH y F(ab')2 de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 previstos en el presente documento. Estos fragmentos de anticuerpo se pueden crear por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o se pueden generar por técnicas recombinantes. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos o humanizados. Estos fragmentos son de utilidad para los fines diagnósticos y terapéuticos establecidos a continuación.
[0206] Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no compuesto por una mezcla de distintos anticuerpos.
[0207] Los anticuerpos monoclonales anti-NRR de Notch 1 de la invención se pueden preparar mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kobler y col., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (patente de Estados Unidos Nº 4.816.567).
[0208] En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, tales como hámster, se inmuniza para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína usada para la inmunización. Los anticuerpos para NRR de Notch 1 generalmente se generan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de NRR de Notch 1 y un coadyuvante. Se puede preparar NRR de Notch 1 mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen también en el presente documento. Por ejemplo, la producción recombinante de NRR de Notch 1 humano y murino se describe a continuación. En una realización, los animales se inmunizan con una NRR de Notch 1 fusionada a la parte Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Los animales se inmunizan preferiblemente con proteína de fusión NRR de Notch 1-IgG1. Los animales generalmente se inmunizan contra conjugados inmunogénicos o derivados de NRR de Notch 1 con monofosforil-lípido A (MPL)/dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la solución se inyecta por vía intradérmica en múltiples sitios. Dos semanas más tarde los animales se estimulan. De 7 a 14 días más tarde se extrae la sangre de los animales y se ensaya el suero para determinar el título de anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Los animales se estimulan hasta alcanzar una meseta de titulación.
[0209] Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
[0210] Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantinaguanínafosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
[0211] Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan de forma eficaz, soportan un nivel elevado de producción de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre ellas se prefieren las líneas celulares de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores murino MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Instituto Cell Distribution Center, San Diego, California, Estados Unidos, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
[0212] El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra NRR de Notch 1. Preferiblemente, se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma por inmunoprecipitación o por un ensayo de fijación in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).
[0213] La afinidad de unión del anticuerpo puede, por ejemplo, determinarse por análisis Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0214] Después, se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, la afinidad y/o la actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitantes y cultivarse por procedimientos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press., 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal.
[0215] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, el fluido ascítico o el suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía por afinidad.
[0216] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 de la invención se pueden preparar usando bibliotecas combinatorias para analizar los clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o las actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante selección de las bibliotecas de fagos que contienen fagos que muestran diversos fragmentos de región variable de anticuerpo (Fv) fusionados a la proteína de cubierta de fago. Dichas bibliotecas de fagos se procesan por cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado se adsorben para el antígeno y se separan de este modo de los clones de no unión en la biblioteca. Después, los clones de unión se eluyen del antígeno, y se pueden enriquecer adicionalmente mediante ciclos adicionales de adsorción/elusión del antígeno. Cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 de la invención se puede obtener mediante el diseño de un procedimiento de análisis de antígeno adecuado para seleccionar el clon del fago de interés seguido de la construcción de un clon de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 de longitud completa usando las secuencias Fv del clon del fago de interés y las secuencias adecuadas de región constante (Fc) descritas en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición, NDI Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3.
[0217] El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo se forma por dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH), donde ambas presentan tres bucles hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden mostrar funcionalmente en fagos, como fragmentos monocatenarios Fv (scFv), en los que VH y VL se unen covalentemente a través de un péptido corto flexible, o como fragmentos Fab, en los que cada uno se fusiona a un dominio constante e interactúan de forma no covalente, como se describe en Winter y col., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como se usa en el presente documento, los clones de fagos codificantes de scFv y los clones codificantes de Fab se refieren de forma conjunta como clones de fagos Fv" o "clones Fv".
[0218] Los repertorios de genes VH y VL se pueden clonar por separado por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recombinarse al azar en bibliotecas de fagos, que después se pueden analizar para determinar los clones de unión a antígeno, como se describe en: Winter y col., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Como alternativa, el repertorio sin tratar se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos para un amplio rango de antígenos propios y no propios sin inmunización, como se describe Griffiths y col., EMBO J. 12: 725-734, (1993). Por último, las bibliotecas sin tratar también se pueden fabricar de forma sintética mediante la clonación de los segmentos no ordenados de genes V procedentes de células madre, y usando cebadores PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y realizar el reordenamiento in vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
[0219] El fago filamentoso se usa para presentar fragmentos de anticuerpos por fusión a la proteína de cubierta menor pIII. Los fragmentos de anticuerpo se pueden mostrar como fragmentos monocatenarios Fv, en los que los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena polipeptídica mediante un espaciador polipeptídico flexible, por ejemplo, como se describe en Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otra se secreta al periplasma de la célula huésped, donde se muestra el ensamblado de una estructura proteica de cubierta Fab sobre la superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de cubierta de tipo natural, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom y col., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
[0220] En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos génicos de anticuerpo se obtienen a partir de células inmunes cosechadas de seres humanos o animales. Si se desea una biblioteca con sesgo a favor de los clones anti-NRR de Notch 1, el individuo se inmuniza con NRR de Notch 1 para generar una respuesta de anticuerpo, y se recuperan células del bazo y/o B circulantes y otros linfocitos de sangre periférica (PBL) para la construcción de la biblioteca. En una realización preferida, se obtiene una biblioteca de fragmentos génicos de anticuerpo humano con sesgo a favor de los clones anti-NRR de Notch 1 mediante la generación de una respuesta de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en ratones transgénicos portadores de una disposición de genes de inmunoglobulina humana funcionales (y carentes de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcionales) de tal forma que la inmunización con NRR de Notch 1 da lugar a linfocitos B que producen anticuerpos humanos contra NRR de Notch 1. A continuación, se describe la generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos.
[0221] El enriquecimiento adicional de poblaciones celulares reactivas para anti-NRR de Notch 1 se puede obtener usando un procedimiento de exploración adecuado para aislar linfocitos B que expresan anticuerpo unido a membrana específico de NRR de Notch 1, por ejemplo, por separación celular con cromatografía por afinidad de NRR de Notch 1 o adsorción de células a NRR de Notch 1 marcada por fluorocromo seguido de clasificación celular activada por flujo (FACS).
[0222] Como alternativa, el uso de células de bazo y/o linfocitos B u otras PBL procedentes de un donante no inmunizado proporciona una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos, y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos usando cualquier especie animal (humano o no humano) en la que NRR de Notch 1 no es antigénico. Para las bibliotecas que incorporan la construcción génica de anticuerpo in vitro, se cosechan células madre del individuo a fin de proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos génicos de anticuerpo no reordenados. Las células inmunes de interés se pueden obtener a partir de una diversidad de especies animales, tales como humano, ratón, rata, lagomorfo, lupino, canino, felino, porcino, bovino, equino, y especies de aves, etc.
[0223] Se recuperan los segmentos génicos variables del anticuerpo (incluso segmentos VD y VL) que codifican ácido nucleico de las células de interés y se amplifican. En el caso de las bibliotecas génicas VD y VL reordenadas, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN genómico o el ARNm de linfocitos seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que corresponden con los extremos 5' y 3' de los genes VH y VL reordenados como se describe en Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), por lo que se preparan diversos repertorios génicos V para la expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir de ADNc y ADN genómico, con cebadores posteriores en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y cebadores directos en base en el segmento J como se describe Orlandi y col. (1989) y Ward y col., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir de ADNc, los cebadores posteriores también se pueden basar en el exón líder como se describe en Jones y col., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), y cebadores directos dentro de la región constante como se describe en Sastry y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). A fin de maximizar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe en Orlandi y col. (1989) o Sastry y col. (1989). Preferiblemente, la diversidad de la biblioteca se maximiza usando cebadores de PCR dirigidos a cada familia de genes V a fin de amplificar todas las disposiciones VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de la célula inmune, por ejemplo como se describe en el procedimiento de Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 551-597 (1991) o como se describe en el procedimiento de Orum y col., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en los vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción poco frecuentes dentro del cebador de PCR como una etiqueta en un extremo, como se describe en Orlando y col. (1989), o por una amplificación por PCR posterior con un cebador marcado como se describe en Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991).
[0224] Los repertorios de genes V reordenados sintéticamente se pueden derivar in vitro a partir de segmentos de genes V. La mayor parte de los segmentos génicos VH humanos se han clonado y secuenciado (informado en Tomlinson y col., J. Mol. Biol, 227: 776798 (1992)), y se mapearon (informado en Matsuda y col., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones principales del bucle H1 y H2) se pueden usar para generar diversos repertorios génicos VH con cebadores PCR que codifican los bucles H3 de las diversas secuencias y longitudes como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también se pueden hacer con todas las diversidades de secuencia focalizadas en un bucle H3 largo de longitud única como se describe en Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos VK y VA humanos se han clonado y secuenciado (informado en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden usar para hacer repertorios sintéticos de cadenas ligeras. Los repertorios de genes V sintéticos, en base a un rango de plegamientos de VH y VL, y de longitudes de L3 y H3, codificarán los anticuerpos de diversidad estructural considerable. Tras la amplificación de ADN codificantes de genes V, los segmentos de genes V de línea germinal se pueden reordenar in vitro de acuerdo con los procedimientos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
[0225] Los repertorios de los fragmentos de anticuerpo se pueden construir combinando repertorios de genes VH y VL juntos de diversas maneras. Cada repertorio se puede crear en diferentes vectores, y los vectores se recombinan in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe y col., Gene, 128: 119-126 (1993), o por infección combinatoria in vivo, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse y col., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). El enfoque de recombinación in vivo aprovecha la naturaleza bicatenaria de los fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de la biblioteca impuesto por la eficiencia de la transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL no tratados se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector de fagos. Después, las dos bibliotecas se combinan por infección de fagos de bacterias que contienen fagémidos, de manera que cada célula contenga una combinación diferente y el tamaño de la biblioteca se limite únicamente por la cantidad de células presentes (aproximadamente 1012 clones). Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo de manera que los genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se introducen juntos en viriones de fagos. Estas inmensas bibliotecas proporcionan gran cantidad de anticuerpos diversos con buena afinidad (Kd-1 de aproximadamente 10-8 M).
[0226] Como alternativa, los repertorios se pueden clonar de forma secuencial en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblados juntos por PCR y después se clonan, por ejemplo, como se describe en Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991). El conjunto por PCR también se puede usar para unir los ADN de VH y VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv (scFv) monocatenarios. En otra técnica más, "en un conjunto por PCR celular" se usa para combinar los genes VH y VL dentro de los linfocitos por PCR y después clonar los repertorios de los genes ligados como se describe en Embleton y col., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
[0227] Los anticuerpos producidos por las bibliotecas no tratadas (naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kd-1 de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración por afinidad también se puede simular in vitro construyendo y seleccionando de nuevo a partir de bibliotecas secundarias como se describe en Winter y col. (1994), anteriormente. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones aleatorias in vitro mediante el uso de polimerasa con tendencia a error (informado por Leung y col., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA,
89: 3576-3580 (1992). Además, se puede realizar la maduración por afinidad por mutación aleatoria de uno o más CDR, por ejemplo, usando PCR con cebadores portadores de secuencias aleatorias que cubren el CDR de interés, en clones Fv seleccionados del individuo y con análisis para clones de mayor afinidad. El documento WO 96/07754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describió un procedimiento para inducir mutagénesis en una región determinante de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina a fin de crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro enfoque eficaz consiste en recombinar los dominios VH o VL seleccionados por presentación en fagos con repertorios de variantes de dominio V de origen natural que se obtienen a partir de donantes no inmunizados y explorar la mayor afinidad en varias rondas de remezclado de cadenas como se describe en Marks y col., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo de 10-9 M.
[0228] Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de NRR de Notch 1 se conocen en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica NRR de Notch 1 se puede diseñar usando la secuencia aminoacídica de la región deseada de NRR de Notch 1. Las secuencias pueden incluir la secuencia de SEQ ID NOS: 55, 13 ó 14. Como alternativa, se puede usar la secuencia ADNc (o los fragmentos de la misma) de GenBank Nº de acceso NM_017617. Pueden prepararse ácidos nucleicos que codifican NRR de Notch 1 por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, la síntesis química por cualquiera de los procedimientos descritos en Engels y col., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), tales como los procedimientos de triéster, fosfito, fosforamidita y H-fosfonato. En una realización, se usan los codones preferidos por la expresión de la célula huésped en el diseño de ADN que codifica NRR de Notch 1. Como alternativa, se puede aislar el ADN que codifica la NRR de Notch 1 a partir de una biblioteca genómica o de ADNc.
[0229] De acuerdo con la construcción de la molécula de ADN que codifica NRR de Notch 1, la molécula de ADN está operativamente unida a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión, tal como un plásmido, donde la secuencia de control se reconoce por una célula huésped transformada con el vector. En general, los vectores plasmídicos contienen secuencias de replicación y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector lleva ordinariamente un sitio de replicación, así como secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Los vectores apropiados para la expresión en células huésped procariotas y eucariotas se conocen en la técnica y algunos también se describen en el presente documento. Se pueden usar organismos eucariotas, tales como levaduras, o células derivadas de organismos multicelulares, tales como mamíferos.
[0230] Opcionalmente, el ADN que codifica NRR de Notch 1 está operativamente unido a una secuencia líder secretora que da como resultado la secreción del producto de expresión por la célula huésped en el medio de cultivo. Los ejemplos de secuencias líder secretoras incluyen stII, ecotina, lamB, herpes GD, 1pp, fosfatasa alcalina, invertasa y factor alfa. También es apropiado para su uso en el presente documento la secuencia líder de 36 aminoácidos de proteína A (Abrahamsen y col., EMBO J., 4: 3901 (1985)).
[0231] Las células huésped se transfectan y se transforman preferiblemente con los vectores de expresión o clonación que se han descrito anteriormente de esta invención y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados como apropiados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
[0232] La transfección se refiere a la asunción de un vector de expresión por una célula huésped cuando se haya expresado o no de hecho cualquier secuencia codificante. Se conocen numerosos procedimientos de transfección por el experto en la técnica, por ejemplo, precipitación de CaPO4 y electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando cualquier indicación de operación de este vector ocurre en la célula huésped. Los procedimientos para la transfección se conocen bien en la técnica, y algunos se describen adicionalmente en el presente documento.
[0233] Transformación se refiere a introducir ADN en un organismo de manera que el ADN es replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o por un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. Los procedimientos de transformación se conocen bien en la técnica, y algunos se describen adicionalmente en el presente documento.
[0234] Las células huésped procariotas usadas para producir NRR de Notch 1 se pueden cultivar como se describe en general en Sambrook y col., anteriormente.
[0235] Las células huésped de mamíferos usadas para producir NRR de Notch 1 se pueden cultivar en una diversidad de medios que se conocen bien en la técnica y algunos de los cuales se describen en el presente documento.
[0236] Las células huésped mencionadas en esta divulgación incluyen células en cultivo in vitro, así como células que están dentro de un animal huésped.
[0237] La purificación de NRR de Notch 1 se puede realizar usando procedimientos reconocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en el presente documento.
[0238] La NRR de Notch 1 purificada se puede unir a una matriz apropiada, tal como perlas de agarosa, perlas de acrilamida, perlas de vidrio, celulosa, diversos copolímeros acrílicos, geles de hidroxilmetacrilato, copolímeros poliacrílicos y polimetacrílicos, nylon, portadores neutros e iónicos, y similares, para su uso en la separación por cromatografía por afinidad de clones de visualización de fagos. La unión de la proteína NRR de Notch 1 a la matriz se puede realizar mediante los procedimientos descritos en Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Una técnica comúnmente empleada para unir ligandos de proteínas con matrices de polisacáridos, por ejemplo, agarosa, dextrano o celulosa, implica la activación del portador con haluros de cianógeno y el acoplamiento posterior de las aminas alifáticas o aromáticas primarias del ligando peptídico a la matriz activada.
[0239] Como alternativa, NRR de Notch 1 se puede usar para recubrir los pocillos de las placas de adsorción, expresado en las células huésped fijadas a placas de adsorción o usadas en la clasificación celular, o conjugadas con biotina para la captura con perlas recubiertas de estreptavidina, o usadas en cualquier otro método conocido en la técnica para selección de bibliotecas de visualización de fagos.
[0240] Las muestras de bibliotecas de fagos están en contacto con NRR de Notch 1 inmovilizada en condiciones apropiadas para la unión de al menos una parte de las partículas de fagos con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluyendo pH, resistencia iónica, temperatura y similares, se seleccionan para asemejarse a las condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y después se eluyen con ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, como se describe en Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o con competición de antígeno NRR de Notch 1, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición de antígenos de Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer de 20 a 1000 veces en una ronda única de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivo bacteriano y se pueden someter a otras rondas de selección.
[0241] La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpos en un único fago pueden unirse simultáneamente con antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débil) se pueden retener por medio del uso de lavados cortos, visualización de fagos multivalente y alta densidad de recubrimiento de antígeno en fase sólida. La alta densidad no sólo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que también favorece de reunión del fago que se ha disociado. La selección de anticuerpos con cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) se puede promover usando largos lavados y visualización de fagos monovalente, como se describe en Bass y col., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento de patente WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento de antígeno, como se describe en Marks y col., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
[0242] Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieren ligeramente, para NRR de Notch 1. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas de las técnicas de maduración por afinidad que se han descrito anteriormente) probablemente da origen a muchos mutantes, la mayoría de unión a antígeno, y unos pocos con mayor afinidad. Al limitar NRR de Notch 1, raramente un fago de gran afinidad podría establecer competencia. Para retener todos los mutantes de mayor afinidad, se pueden incubar fagos con exceso de NRR de Notch 1 biotinilada, pero con la NRR de Notch 1 biotinilada en una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar diana para NRR de Notch 1. Después, los fagos de unión por alta afinidad se pueden capturar por medio de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Dicha "captura de equilibrio" permite que los anticuerpos sean seleccionados de acuerdo con sus afinidades de unión, con sensibilidad que permite el aislamiento de clones mutantes con afinidad mayor doble de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para discriminarlos en base a la cinética de disociación.
[0243] Los clones de NRR de Notch 1 se pueden seleccionar según su actividad. En una realización, la invención proporciona anticuerpos anti-NRR de Notch 1 que bloquean la unión entre un receptor de Notch 1 y su ligando (tal como Jagged1, Jagged2, Delta tipo 1, Delta tipo 3 y Delta tipo 4) o escisión proteolítica de Notch 1 inducida después de la unión del ligando. Los clones Fv correspondientes a dichos anticuerpos anti-NRR de Notch 1 se pueden seleccionar (1) aislando clones anti-NRR de Notch 1 de una biblioteca de fagos como se ha descrito anteriormente, y amplificando opcionalmente la población aislada de clones de fagos por cultivo de la población en un huésped bacteriano apropiado; (2) seleccionando NRR de Notch 1 y una segunda proteína contra la que se desea la actividad bloqueante y no bloqueante, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos anti-NRR de Notch 1 para NRR de Notch 1 inmovilizada; (4) usando un exceso de la segunda proteína para eluir cualquier clon indeseado que reconoce los determinantes de unión a NRR de Notch 1 que se superponen o se comparten con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) eluyendo los clones que quedan adsorbidos después de la etapa (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades deseadas de bloqueo/no bloqueo se pueden enriquecer adicionalmente repitiendo los procedimientos de selección descritos en el presente documento o varias veces.
[0244] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de hibridoma o clones Fv de visualización de fagos de la invención se aísla con facilidad y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificantes de cadena pesada y ligera de interés del hibridoma o plantilla de ADN de fagos). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes. Los artículos de reseña de expresión recombinante en bacterias de ADN codificante de anticuerpos incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) y Plucktuhn, Immunol. Revs. 130: 151 (1992).
[0245] El ADN que codifica los clones Fv de la invención se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y/o de cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener de Rabat y col., anteriormente) para formar clones que codifican cadenas pesadas y/o ligeras de longitud parcial o total. Se apreciará que pueden usarse regiones constantes de cualquier isotipo para este fin, incluyendo la región constante IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal. Se incluye un clon Fv derivado del ADN de dominio variable de un animal (como un ser humano) y después fusionado con un ADN de región constante de otra especie animal para formar secuencias codificantes para cadena pesada y/o cadena ligera de longitud total "híbrida" en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido", como se usan en el presente documento. En una realización preferida, un clon Fv derivado de un ADN variable humano se fusiona con un ADN de región constante humano para formar una secuencia o secuencias codificantes para todas las cadenas pesadas y/o ligeras humanas de longitud total o parcial.
[0246] El ADN que codifica el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de secuencias murinas homologas derivadas del clon de hibridoma (por ejemplo, como en el procedimiento de Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81: 6851-6855 (1984). El ADN que codifica un hibridoma o anticuerpo derivado de clon Fv o fragmento se puede modificar adicionalmente mediante unión covalente con la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o una parte de la secuencia codificante para un polipéptido de no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión del clon Fv o anticuerpos derivados del clon de hibridoma de la invención.
Fragmentos de anticuerpos
[0247] La presente invención incluye fragmentos de anticuerpos. En ciertas circunstancias, hay ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, más que de anticuerpos enteros. El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida eliminación, y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos.
[0248] Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan y col., Science 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos en y secretarse de E. coli, permitiendo así la producción simple de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de anticuerpos en fagos que se han descrito anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(Ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con una mayor semivida in vivo que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor salvaje se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv) (véase, por ejemplo, el documento WO 93/16185; la Patente de Estados Unidos Nº 5.571.894; y la Patente de Estados Unidos Nº 5.587.458). Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos carentes de regiones constantes; de este modo, son adecuadas para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión con sFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, anteriormente. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Anticuerpos humanizados
[0249] La presente invención incluye anticuerpos humanizados. En la técnica se conocen diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o varios residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se mencionan a menudo como residuos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar básicamente según el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 15341536), sustituyendo secuencias de región hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido con la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR están sustituidos con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
[0250] La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado procedimiento "best fit", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se controla frente a toda la biblioteca de secuencias humanas conocidas de dominio variable. La secuencia humana que está más cercana a la de los roedores se acepta entonces como la estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims y col. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia y col. (1987) J. Mol/ Biol. 196: 901. Otro procedimiento usa una estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras
o pesadas. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta y col. (1993) J. Immunol., 151: 2623.
[0251] También es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un procedimiento, se preparan anticuerpos humanizados por medio de un proceso de análisis de las secuencias principales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias principales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay a disposición programas informáticos que ilustran y muestran estructurales conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas muestras permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que ejercen influencia sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse con su antígeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar desde las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como un aumento de la afinidad para el antígeno o los antígenos diana. En general, los residuos de región hipervariable están implicados directa y en su mayoría sustancialmente en la influencia sobre la unión a antígeno.
Anticuerpos humanos
[0252] Los anticuerpos humanos anti-NRR de Notch 1 de la invención se pueden construir combinando una o más secuencias de dominio variable de clones seleccionadas de bibliotecas de visualización de fagos derivados de humanos con secuencias de dominio constante humanas conocidas, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los anticuerpos monoclonales humanos anti-NRR de Notch 1 de la invención se pueden preparar por medio del procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murinohumano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 5163 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y col., J. Immnunol., 147: 86 (1991).
[0253] Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de inmunizarlos, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la disposición de genes de inmunoglobulina humana de línea germinal en estos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación génica. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann y col., Year in Immunol., 7: 33 (1993).
[0254] La transposición génica también se puede usar para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares con el anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se denomina "impresión de epítopo", la región variable de cadena pesada o de cadena ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de visualización de fagos como se ha descrito anteriormente se reemplaza por un repertorio de genes de dominio humano V, creando una población de quimeras scFv o Fab de cadena no humana/de cadena humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena no humana/de cadena humana, donde la cadena humana restaura el sitio de unión del antígeno destruido después de la eliminación de la correspondiente cadena no humana en el clon de visualización de fagos primario, es decir, el epítopo gobierna (imprime) la elección de la pareja de cadena humana. Cuando el proceso se repite a fin de reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase el documento PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). De modo distinto a la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por injerto CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR ni CDR de origen no humano.
Anticuerpos biespecíficos
[0255] Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para NRR de Notch 1, y la otra para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes de NRR de Notch 1. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos para células que expresan NRR de Notch 1. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a NRR de Notch 1 y un brazo que se une con el agente citotóxico (por ejemplo, saponina, anti-interferón a, alcaloide de la vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).
[0256] Se conocen en la técnica procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos. La producción habitual de anticuerpos específicos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein y col., Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
[0257] De acuerdo con un enfoque diferente y más preferido, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen particular importancia.
[0258] En un enfoque preferido, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Este enfoque se desvela en el documento WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
[0259] Según otro enfoque, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
[0260] Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la técnica y se desvelan en la Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980 junto con varias técnicas de reticulación.
[0261] Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan y col., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenita sódica, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
[0262] El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizado. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor de HER2 y linfocitos T humanos normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
[0263] Se han descrito también diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber y col., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
[0264] Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt y col., J. Immunol. 147: 60 (1991).
Anticuerpos multivalentes
[0265] Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno amino terminales a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (y preferiblemente dos cadenas polipeptídicas), donde la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender VD1-(X1)nVD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-cadena de región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento comprende preferiblemente además al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, además, comprenden un dominio CL.
Variantes de Anticuerpos
[0266] La modificación o modificaciones de secuencias aminoacídicas de los anticuerpos descritos en el presente documento son como se definen en las reivindicaciones. Por ejemplo, puede desearse mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento de producirse la secuencia.
[0267] Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son las localizaciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Well (1989) Science, 244: 1081-1085. Aquí se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen con un aminoácido neutro o negativamente cargado (mucho más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Entonces, aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan introduciendo más u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, mientras que el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, el barrido de ala o la mutagénesis al azar se realiza en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se criban para la actividad deseada.
[0268] Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que oscilan en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
[0269] La glucosilación de polipéptidos está típicamente ligada a N o a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato con la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento de la unión enzimática del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en el polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
[0270] La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia aminoacídica de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas que se han descrito anteriormente (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también se puede realizar por adición o sustitución con uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación ligados a O) .
[0271] Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato unido al mismo se puede alterar. Por ejemplo, se describen anticuerpos con un estructura de carbohidrato maduro que carece de fucosa unidos a una región Fc del anticuerpo en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/0157108 (Presta, L.). Véase también el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Se hace referencia a anticuerpos con una Nacetilglucosamina bisecante (GlcNAc) en el carbohidrato unido a una región Fc del anticuerpo en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet y col. y la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.684, Umana y col. Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fc del anticuerpo se indican en el documento WO 1997/30087, Patel y col. Véase también el documento WO 1998/58964 (Raju, S.) y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.) en relación con los anticuerpos con carbohidrato alterado unido a la región Fc de los mismos. Véase también el documento US 2005/0123546 (Umana y col.) sobre moléculas de unión al antígeno con glucosilación modificada.
[0272] La variante de glucosilación preferida en el presente documento comprende una región Fc, donde una
estructura de carbohidrato unida a la región Fc carece de fucosa. Dichas variantes tienen una función de ADCC mejorada. Opcionalmente, la región Fc comprende adicionalmente una o más sustituciones aminoacídicas en la misma que mejoran adicionalmente ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración de residuos Eu). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos 5 "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO-2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki y col. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares productoras de anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO
10 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka y col. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); solicitud de patente de Estados Unidos Nº: US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams y col., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares knockout, tales como células CHO knockout deficientes en el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8 (Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
15 [0273] Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituida con un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "Sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más
20 sustanciales, denominados "Sustituciones a modo de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y los productos se criban.
Tabla 1
Residuo Original
Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas
Ala (A)
Val; Leu; Ile Val
Arg (R)
Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D)
Glu; Asn Glu
Cys (C)
Ser; Ala Ser
Gln (Q)
Asn; Glu Asn
Glu (E)
Asp; Gln Asp
Gly (G)
Ala Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Leu (L)
Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P)
Ala Ala
Ser (S)
Thr Thr
Thr (T)
Val; Ser Ser
Trp (W)
Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Norleucina Leu
[0274] Se realizan modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades de las cadenas laterales comunes:
(1)
hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, ile;
(2)
hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3)
ácidos: Asp, Glu;
(4)
básicos: His, Lys, Arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de cadenas: Gly, Pro; y
(6)
aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0275] Las sustituciones no conservativas supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases con otra clase.
[0276] Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental del que se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica maduración por afinidad usando expresión en fago. En resumen, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones aminoacídicas posibles en cada sitio. Por lo tanto, los anticuerpos generados se expresan en partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto génico III de M13 encapsidado dentro de cada partícula. Entonces, las variantes expresadas en fago se criban para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se desvela en el presente documento. Con el fin de identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, la mutagénesis por barrido de alanina puede realizarse para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el posterior desarrollo.
[0277] Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una versión de variante o de no variante preparada anteriormente del anticuerpo.
[0278] Puede ser deseable introducir una o más modificaciones aminoacídicas en una región Fc de los polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que incluyen la de una cisteína bisagra.
[0279] De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más alteraciones en comparación con el anticuerpo de la contraparte de tipo natural, por ejemplo, en la región Fc. No obstante, estos anticuerpos deberían retener sustancialmente las mismas características necesarias para la utilización terapéutica en comparación con su contraparte de tipo natural. Por ejemplo, se considera que se pueden realizar ciertas alteraciones en la región Fc que producirían una unión alterada (es decir, mejorada o disminuida) a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/51642. Véase también Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); la patente de Estados Unidos Nº 5.648.260; la patente de Estados Unidos Nº 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de las regiones Fc. El documento WO 00/42072 (Presta) y el documento WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpo con unión a FcR mejorada o disminuida. El contenido de estas publicaciones de patentes se incorpora específicamente en el presente documento por referencia. Véase, también, Shields y col. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24: 249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton y col.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Las variantes de polipéptido con secuencias aminoacídicas de la región Fc alterada y capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 6.194.551B1, documento WO 99/51642. Véase, además, Idusogie y col., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Derivados de anticuerpos
[0280] Los anticuerpos de la presente invención se pueden modificar adicionalmente para contener restos no proteináceos adicionales que se conocen en la técnica y de fácil acceso. Preferiblemente, los restos adecuados para la derivación de anticuerpos son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros al azar), y dextrano o poli(nvinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si están unidos más de un polímero, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivación se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado del anticuerpo será usado en una terapia en condiciones definidas, etc.
Selección de anticuerpos con propiedades deseadas
[0281] Los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar por sus propiedades físico/químicas y funciones biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos se caracterizan por una o más de reducción o bloqueo de la activación de Notch 1, reducción o bloqueo de la señalización molecular en la dirección 3' de Notch 1, alteración o bloqueo de la unión de Notch 1 a un ligando (por ejemplo, Jagged1, Jagged2, Delta tipo 1, Delta tipo 3 o Delta tipo 4), y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cáncer; y/o tratamiento y/o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de Notch 1 (tal como expresión y/o actividad de Notch 1 aumentadas). Los anticuerpos se caracterizan para una o más de inducir o aumentar la activación de Notch 1, inducir o aumentar la señalización molecular en la dirección 3' de Notch 1, y/o tratamiento y/o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de Notch 1.
[0282] Los anticuerpos purificados se pueden caracterizar adicionalmente por una serie de ensayos que incluyen, pero sin limitación, secuenciación de N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta presión por exclusión de tamaño no desnaturalizante (HPLC), espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.
[0283] Los anticuerpos producidos en el presente documento se analizan para determinar su actividad biológica. Los anticuerpos de la presente invención se examinan para determinar su actividad de unión al antígeno. Los ensayos de unión a antígeno que se conocen en la técnica y se pueden usar en el presente documento incluyen sin limitación cualquiera de los ensayos de unión directos o competitivos usando técnicas tales como transferencia western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorbancia ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Los ensayos de unión al antígeno ilustrativos se proporcionan más adelante en la sección de Ejemplos.
[0284] En aún otra realización, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-NRR de Notch 1 que compiten con Anticuerpo A, Anticuerpo A-1, Anticuerpo A-2 y/o Anticuerpo A-3 para la unión a NRR de Notch 1. Dichos anticuerpos competidores incluyen anticuerpos que reconocen un epítopo de NRR de Notch 1 que es igual o se superpone con el epítopo de NRR de Notch 1 reconocido por el Anticuerpo A, el Anticuerpo A-1, el Anticuerpo A2 y/o el Anticuerpo A-3. Dichos anticuerpos competidores se pueden obtener por la selección de sobrenadantes del hibridoma anti-NRR de Notch 1 para la unión a NRR de Notch 1 inmovilizada en competición con Anticuerpo A, Anticuerpo A-1, Anticuerpo A-2 y/o Anticuerpo A-3 marcados. Un sobrenadante del hibridoma que contiene anticuerpo competidor reducirá la cantidad de anticuerpo marcado unido que se detecta en la mezcla de unión competitiva del sujeto en comparación con la cantidad de anticuerpo marcado unido que se detecta en la mezcla de unión competitiva de control que contiene cantidades irrelevantes de anticuerpo (o no). Cualquiera de los ensayos de unión competitiva descritos en el presente documento es adecuado para su uso en el procedimiento precedente.
[0285] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-NRR de Notch 1 que comprende una o más HVR (tales como 2, 3, 4, 5 y/o 6) del Anticuerpo A, Anticuerpo A-1, Anticuerpo A-2 o Anticuerpo A-3. Un anticuerpo monoclonal anti-NRR de Notch 1 que comprende una o más HVR del Anticuerpo A, el Anticuerpo A-1, el Anticuerpo A-2 y/o el Anticuerpo A-3 se puede construir por el injerto de una o más HVR de Anticuerpo A, Anticuerpo A-1, Anticuerpo A-2 y/o Anticuerpo A-3 en una secuencia del anticuerpo de plantilla, por ejemplo una secuencia de anticuerpo humano que es más cercana a la secuencia murina del anticuerpo parental correspondiente, o una secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos del subgrupo particular de la cadena ligera o pesada del anticuerpo precursor y que expresa la(s) secuencia(s) de la región variable de cadena ligera y/o pesada quimérica resultante, con o sin secuencia(s) de la región constante adjuntas, en células huésped recombinantes como se describe en el presente documento.
[0286] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 de la invención que poseen las propiedades únicas descritas en el presente documento se pueden obtener por la identificación de clones del hibridoma de anti-NRR de Notch 1 para determinar las propiedades deseadas mediante cualquier procedimiento conveniente. Por ejemplo, si se desea un anticuerpo monoclonal anti-NRR de Notch 1 que bloquee o no bloquee la unión del ligando de Notch 1 a Notch 1, el anticuerpo candidato se puede probar en un ensayo de unión competitiva, tal como ELISA de unión competitiva, donde los pocillos de la placa se recubren con Notch 1, y se coloca una solución de anticuerpo en exceso de Notch 1 sobre las placas recubiertas, y el anticuerpo unido se detecta de forma enzimática, por ejemplo, poniendo en contacto el anticuerpo unido con anticuerpo anti-Ig conjugado con HRP o anticuerpo anti-Ig biotinilado, y desarrollando la reacción de color del HRP, por ejemplo, mediante el desarrollo de la placas con estreptavidina-HRP y/o peróxido ácido y la detección del color de HRP por espectrofotometría a 490 nm con un lector de placas de ELISA.
[0287] Si se desea un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 que inhiba el crecimiento celular, el anticuerpo candidato se puede analizar en ensayos in vitro y/o in vivo que miden la inhibición del crecimiento celular. Dichos ensayos se conocen en la técnica y se describen y ejemplifican adicionalmente en el presente documento.
[0288] También se proporciona un anticuerpo alterado que posee algunas aunque no todas las funciones efectoras, lo que lo convierte en un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que es importante la semivida del anticuerpo in vivo pero ciertas funciones (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o peligrosas. Se miden las actividades de Fc de la inmunoglobulina producida para asegurar que únicamente se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión al FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero retiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para la mediación de ADCC, células NK, expresan únicamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRH y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Amu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Se describe un ejemplo de un ensayo in vitro para medir la actividad de ADCC de una molécula de interés en la Patente de Estados Unidos Nº 5.500.362 ó 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede ensayar in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como el que se describe en Clynes y col. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). Los ensayos de unión a C1q también se pueden realizar para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por lo tanto, carece de actividad CDC. Para medir la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). También se puede realizar la unión a FcRn y las determinaciones de depuración/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección de Ejemplos.
Vectores, Células Huésped y Procedimientos Recombinantes
[0289] Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. La elección del vector depende en parte de la célula huésped que vaya a usarse. Generalmente, las células huésped preferidas son de origen tanto procariota como eucariota (generalmente de mamífero). Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este fin, incluyendo regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener a partir de cualquier especie humana o animal.
a.
Generación de anticuerpos usando células huésped procariotas:
i.
Construcción de vectores
[0290] Las secuencias de polinucleótidos que codifican componentes de polipéptido del anticuerpo de la invención pueden obtenerse usando técnicas recombinantes convencionales. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de células productoras de anticuerpos tales como células de hibridoma. Como alternativa, los polinucleótidos pueden sintetizarse usando sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante que puede replicarse y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procariotas. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica pueden usarse con el fin de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que van a insertarse en el vector y de la célula huésped particular que va a transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo, o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero sin limitación: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.
[0291] En general, los vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se usan junto con estos huéspedes. El vector generalmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadores que pueden proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma normalmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, por lo tanto, proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófago también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden usarse por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Carter y col., patente de Estados Unidos Nº
5.648.237.
[0292] Además, los vectores de fago que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con el microorganismo huésped pueden usarse como vectores transformantes junto con estos huéspedes. Por ejemplo, puede utilizarse un bacteriófago, tal como AGEM.TM.-11 en la preparación de un vector recombinante que puede usarse para transformar células huésped susceptibles, tales como LE392 de E. coli.
[0293] El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón que codifican cada uno los componentes del polipéptido. Un promotor es una secuencia reguladora sin traducir localizada en la dirección 5' con respecto a un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas normalmente se clasifican en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles elevados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en la condición de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
[0294] Se conocen bien un gran número de promotores reconocidos mediante una diversidad de células huésped potenciales. El promotor seleccionado puede estar operativamente ligado a ADN de cistrón que codifica la cadena ligera o pesada eliminando el promotor del ADN fuente por una digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos pueden usarse para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones se utilizan promotores heterólogos, ya que generalmente permiten mayor transcripción y mayores rendimientos del gen diana expresado con respecto al promotor de polipéptido diana nativo.
[0295] Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas de promotores de 1-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fago conocidos). Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, permitiendo así que un experto los ligue operablemente a cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas diana (Siebenlist y col. (1980) Cell 20: 269) usando ligadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.
[0296] En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de la secreción que dirige la translocalización de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el fin de la presente invención debería ser una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas para los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal está sustituida con una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en los conductores de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina estable al calor II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En un aspecto, las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal de STII o variantes de las mismas.
[0297] En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención puede producirse en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. En ese aspecto, las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina se expresan, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas huésped (por ejemplo, las cepas trxB de E. coli) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiéndose así el plegamiento y ensamblaje apropiado de subunidades de proteína expresada. Proba y Pluckthun Gene, 159: 203 (1995).
[0298] Las células huésped procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), bacilos (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. En una realización se usan células Gram-negativas. En una realización se usan células de E. coli como huéspedes para la invención. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; depósito de ATCC Nº 27.325) y derivados de las mismas, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 MAfhuA (MtonA) ptr3 lac Iq lacL8 MompTM(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de Estados Unidos Nº 5.63***). También son adecuadas otras cepas y derivados de las mismas, tales como 294 de E. coli (ATCC 31.446), E. coli B., 1776 de E. coliA (ATCC 31.537) y RV308 de E. coli (ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. Se conocen en la técnica procedimientos para construir derivados de cualquiera de las bacterias que se han mencionado anteriormente que tienen genotipos definidos, y se describen en, por ejemplo, Bass y col., Proteins, 8: 309-314 (1990). Es generalmente necesario seleccionar bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, pueden usarse adecuadamente especies de E. coli, Serratia o Salmonella como huésped cuando se usan plásmidos muy conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón. Normalmente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y pueden incorporarse de forma deseable inhibidores de proteasas adicionales en el cultivo celular.
ii. Producción de Anticuerpos
[0299] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión que se han descrito anteriormente y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes que codifican las secuencias deseadas.
[0300] Transformación significa introducir ADN en el huésped procariota de manera que el ADN sea replicable, tanto como un elemento extracromosómico como por integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se hace usando técnicas convencionales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio se usa generalmente para células bacterianas que contienen barreras sustanciales de las paredes celulares. Otro procedimiento para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Todavía otra técnica usada es la electroporación.
[0301] Las células procariotas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen caldo Luria (LB) más complementos nutritivos necesarios. En algunos aspectos, los medios también contienen un agente de selección elegido basándose en la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina al medio para el crecimiento de células que expresan gen de resistencia a ampicilina.
[0302] También puede incluirse cualquier complemento necesario, además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, a concentraciones apropiadas introducido solo o como una mezcla con otro complemento o medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.
[0303] Las células huésped procariotas se cultivan a temperatura adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varía de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 39 ºC, más preferiblemente de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 37 ºC, incluso más preferiblemente a aproximadamente 30 ºC. El pH del medio puede ser cualquier pH que oscile de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y más preferiblemente aproximadamente 7,0.
[0304] Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de proteínas se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto, los promotores PhoA se usan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Por consiguiente, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante con fosfato para la inducción. Preferiblemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P. (véase, por ejemplo, Simmons y col., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Puede usarse una diversidad de inductores diferente según la construcción de vectores empleada, como se conoce en la técnica.
[0305] En un aspecto, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en y se recuperan del periplasma de las células huésped. La recuperación de proteínas normalmente implica romper el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez se han roto las células, el residuo de células o las células completas pueden eliminarse por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, por cromatografía en resina de afinidad. Como alternativa, las proteínas pueden transportarse en los medios de cultivo y aislarse en su interior. Las células pueden eliminarse del cultivo y el sobrenadante de cultivo filtrarse y concentrarse para una purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden aislarse adicionalmente e identificarse usando procedimientos comúnmente conocidos, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.
[0306] En un aspecto, la producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad por un proceso de fermentación. Diversos procesos de fermentación de lotes alimentados a gran escala están disponibles para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente de aproximadamente 1.000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores usan hélices agitadoras para distribuir el oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energía preferida). Fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros en capacidad volumétrica y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.
[0307] En un proceso de fermentación, la inducción de expresión de proteínas se inicia normalmente después de que las células se hayan cultivado en condiciones adecuadas a una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, en cuyo estadio las células están en la fase estacionaria temprana. Puede usarse una variedad de inductores, según la construcción de vector empleada, como se conoce en la técnica y se ha descrito anteriormente. Las células pueden cultivarse durante periodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque puede usarse un tiempo de inducción más largo o más corto.
[0308] Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención pueden modificarse diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento apropiado de los polipéptidos de anticuerpo secretados, pueden usarse vectores adicionales que expresan en exceso proteínas de chaperona, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis,transisomerasa con actividad de chaperona) para co-transformar las células procariotas huésped. Se ha demostrado que las proteínas de chaperona facilitan el plegamiento apropiado y la solubilidad de proteínas heterólogas producidas en células huésped bacterianas. Chen y col. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou y col., patente de Estados Unidos Nº 6.083.715; Georgiou y col., patente de Estados Unidos Nº 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem 275: 17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie y col. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.
[0309] Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles), pueden usarse ciertas cepas huésped deficientes para enzimas proteolíticas para la presente invención. Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar una mutación o mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas, tales como proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, proteasa I, proteasa Mi, proteasa V, proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas deficientes para proteasas de E. coli están disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly y col. (1998), anteriormente; Georgiou y col., patente de Estados Unidos Nº 5.264.365; Georgiou y col., patente de Estados Unidos Nº 5.508.192; Hara y col., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).
[0310] En un aspecto, las cepas de E. coli deficientes para enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que expresan en exceso una o más proteínas de chaperona se usan como células huésped en el sistema de expresión de la invención.
iii. Purificación de Anticuerpos
[0311] Pueden emplearse procedimientos de purificación de proteínas convencionales conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.
[0312] En un aspecto, la proteína A inmovilizada sobre una fase sólida se usa para la purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpo de longitud completa de la invención. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con alta afinidad a la región Fc de anticuerpos. Lindmark y col. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. La fase sólida a la que la proteína A se inmoviliza es preferiblemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferiblemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por prevenir la adherencia no específica de contaminantes.
[0313] Como primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular como se ha descrito anteriormente, se aplica sobre la proteína A inmovilizada sobre la fase sólida para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. Entonces, la fase sólida se lava para eliminar contaminantes no específicamente unidos a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida por elución.
b. Generación de anticuerpos usando células huésped eucariotas:
[0314] Los componentes de vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
(i) Componente de secuencia señal
[0315] Un vector para su uso en una célula huésped eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que se reconoce y se procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. En la expresión de células de mamífero están disponibles secuencias señal de mamífero, además de conductores secretores víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.
[0316] El ADN para dicha región precursora está ligado en el marco de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo.
(ii) Origen de replicación
[0317] Generalmente, no es necesario un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamífero. Por ejemplo, el origen de SV40 puede usarse normalmente sólo debido a que contiene el promotor temprano.
(iii) Componente de gen de selección
[0318] Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador de selección. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metrotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, cuando sean relevantes, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos.
[0319] Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por lo tanto, sobrevive a la pauta de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[0320] Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para la captación del ácido nucleico de anticuerpo, tal como DHFR, timidina cinasa; metalotioneína-l y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.
[0321] Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metrotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).
[0322] Como alternativa, pueden seleccionarse células huésped (particularmente huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína de DHFR natural y otro marcador de selección, tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente de Estados Unidos Nº
4.965.199.
(iv) Componente de promotor
[0323] Los vectores de expresión y de clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente ligado al ácido nucleico del polipéptido del anticuerpo. Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada de aproximadamente 25 a 30 bases en la dirección 5' del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en la dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias están adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucariotas.
[0324] La transcripción de polipéptidos de anticuerpos de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
[0325] Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de Hindlll E. Se desvela un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma bovino como vector en la patente de Estados Unidos Nº 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.601.978. Como alternativa, como promotor puede usarse la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.
(v) Componente de elemento potenciador
[0326] La transcripción de ADN que codifica el polipéptido de anticuerpo de esta invención por eucariotas superiores aumenta frecuentemente insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante de polipéptidos del anticuerpo, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor.
(vi) Componente de terminación de la transcripción
[0327] Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas también contendrán normalmente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducir de 5' y, ocasionalmente 3', de ADN eucariotas o víricos o ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte sin traducir del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/1102 y el vector de expresión desvelado en el mismo.
(vii) Selección y transformación de células huésped
[0328] Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento incluyen células eucariotas superiores descritas en este documento, que incluyen células huésped de vertebrado. La propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W 138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
[0329] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación que se han descrito anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
(viii) Cultivo de células huésped
[0330] Las células huésped usadas para producir un anticuerpo de la presente invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el mercado, tales como F10 de Ham (Sigma), medio mínimo esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz.
58: 44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem, 102: 255 (1980), las patentes de Estados Unidos Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente de Estados Unidos Re. 30.985 puede usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas que se han usado previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para el experto habitual en la técnica.
(ix) Purificación de anticuerpo
[0331] Al usar técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, o directamente secretarse en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, el residuo particulado, tanto células huésped como fragmentos usados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Si el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa, tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las anteriores etapas para inhibir la proteólisis, y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos.
[0332] La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio de Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss y col., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que está unida el ligando de afinidad es lo más frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con
etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™,
cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que vaya a recuperarse.
[0333] Tras cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, realizado preferiblemente a bajas concentraciones de sales (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).
Inmunoconjugados
[0334] También se proporcionan inmunoconjugados (denominados de forma intercambiable "conjugados anticuerpo-fármaco" o "ADC"), que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 que se describen en el presente documento conjugados con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
[0335] El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; la patente de Estados Unidos 4.975.278) permite la administración dirigida del resto del fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes de fármaco sin conjugar puede producir niveles inaceptables de toxicidad para células normales, además de las células tumorales buscadas para ser eliminadas (Baldwin y col., (1986) Lancet pp. (15 de marzo de 1986): 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera y col. (ed.s), pág. 475-506). Así se busca la eficacia máxima con toxicidad mínima. Se ha informado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland y col., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Los fármacos usados en estos procedimientos incluyen daunomicina, doxorubicina, metrotrexato y vindesina (Rowland y col., (1986) anteriormente). Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas, tales como toxina diftérica, toxinas de plantas, tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas, tales como geldanamicina (Mandler y col. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler y col. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler y col. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu y col., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode y col. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman y col. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos o ligandos de receptores de proteínas grandes.
[0336] ZEVALIN® (tiuxetano de ibritumomab, Biogen/ldec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal lgG1 kappa murina dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos y unido al radioisótopo 111ln o 90Y por un ligador-quelante de tiourea (Wiseman y col. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman y col. (2002) Blood 99 (12): 4336-42; Witzig y col. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig y col. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no Hodgkin (LNH) de linfocitos B, la administración produce citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (ozogamicina de gemtuzumab, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo CD33 humano ligado a caliqueamicina, se autorizó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs in the Future (2000) 25 (7): 686; patentes de Estados Unidos Nº 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo C242 humano ligado por el ligador de disulfuro SPP al resto del fármaco maitansinoide, DM1, está avanzando en ensayos de fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal dirigido contra el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) ligado al resto del fármaco maitansinoide, DM1, está en desarrollo para el posible tratamiento de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAC 10 (específico para CD30 en tumores malignos hematológicos) (Doronina y col. (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784) y están en desarrollo terapéutico.
[0337] En el presente documento (por ejemplo, anteriormente) se describen agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados. La toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Una diversidad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi,131I,131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una diversidad de agentes de acoplamiento a proteína bifuncionales, tales como N-succinimidil3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCI de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta y col., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.
[0338] En este documento también se contemplan conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolostatinas, auroestatinas, un tricoteceno y CC 1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
i. Maitansina y maitansinoides
[0339] En algunos aspectos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoide.
[0340] Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto del África oriental Maytenus serrata (patente de Estados Unidos Nº 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de Estados Unidos Nº 4.151.042). Se desvelan maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nº 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
Los restos de fármacos de maitansinoides son restos de fármacos atractivos en los conjugados de fármacos y anticuerpos porque: (i) son relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivación de productos de fermentación, (ii) son fáciles de derivar con grupos funcionales apropiados para la conjugación a través de ligadores no disulfuro para anticuerpos; (iii) son estables en plasma y (iv) son eficaces contra una diversidad de líneas celulares tumorales.
[0341] Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, procedimientos de preparación de los mismos y su uso terapéutico se desvelan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1, cuyas divulgaciones se incorporan expresamente en la presente por referencia. Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 ligado con el anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugó mediante un ligador de disulfuro al anticuerpo A7 murino que se une a un antígeno sobre líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide se probó in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie de HER-2 por célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco de maitansinoide libre, que podría aumentarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.
[0342] Se preparan conjugados de anticuerpo-maitansinoide uniendo químicamente un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de tanto el anticuerpo como la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.208.020 (cuya divulgación se incorpora expresamente en la presente por referencia). Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugado por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en la potenciación de la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo potenciara la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislarse a partir de fuentes naturales. Se desvelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones de no patente que se han citado anteriormente en el presente documento. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como diversos ésteres de maitansinol.
[0343] Hay muchos grupos de unión conocidos en la técnica para la preparación de conjugados de anticuerpomaitansinoide que incluyen, por ejemplo, los desvelados en la patente de Estados Unidos Nº 5.208.020 o la patente EP 0 425 235 B1, Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992), y la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoides que comprenden el componente ligador SMCC se pueden preparar como se desvela en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 10/960.602 presentada el 8 de octubre de 2004. Los grupos de unión incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles de ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa o grupos lábiles de esterasa, como se ha desvelado en las patentes que se han identificado anteriormente, prefiriéndose grupos disulfuro y tioéter. En el presente documento se describen y ejemplifican grupos de unión adicionales.
[0344] Los conjugados de anticuerpo y maitansinoide pueden prepararse usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCI de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson y col., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
[0345] El ligador puede unirse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster mediante reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
ii. Auristatinas y dolastatinas
[0346] En algunos aspectos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos de dolastatina y derivados, las auristatinas (patentes de Estados Unidos Nº
5.635.483 y 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica dé los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke y col. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584 y tienen actividad anticáncer (patente de Estados Unidos Nº 5.663.149) y actividad antifúngica (Pettit y col. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965). El resto de fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir con el anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
[0347] Las realizaciones ejemplares de la auristatina incluyen los restos de fármaco de monometilauristatina ligados al término N DE y DF, desvelados en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Nº de serie US 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004.
[0348] Típicamente, los restos de fármaco a base de péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase E. Schröder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, págs. 76-136, 1965, Academic Press) que se conoce bien en el campo de la química de péptidos. Los restos de fármaco de auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos de: las patentes de Estados Unidos Nº 5.635.483 y 5.780.588; Pettit y col. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit y col. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G. R. y col., Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit y col. (1996) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1 5: 859-863. Véase, también Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784; "Monometylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Nº de serie US 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada en la presente por referencia en su totalidad (que desvela, por ejemplo, ligadores y procedimientos de preparación de compuestos de monometilvalina, tales como MMAE y MMAF conjugados con ligadores).
iii. Caliqueamicina
[0349] En otros aspectos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina puede producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones inferiores a picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina véanse las patentes de Estados Unidos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, y11, a21 a31, N-acetil-y11, PSAG y e11 (Hinman y col., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode y col., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos que se han mencionado anteriormente de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelular y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes por la internalización mediada por anticuerpos potencia enormemente sus efectos citotóxicos.
iv. Otros agentes citotóxicos
[0350] Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida conjuntamente el complejo LL-E33288 descrito en las patentes de Estados Unidos 5.053.394 y 5.770.710, así como esperamicinas (patente de Estados Unidos 5.877.296).
[0351] Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.
[0352] También se proporciona un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; ADNsa).
[0353] Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están disponibles una diversidad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Si el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una marca de espín para la obtención de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes de resonancia magnética, irm), tal como yodo-123 de nuevo, yodo131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
[0354] Las radioetiquetas u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 e ln111 pueden unirse por un residuo de cisteína en el péptido. ltrio-90 puede unirse por un residuo de lisina. El procedimiento IODOGEN (Fraker y col. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 4957 puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros procedimientos en detalle.
[0355] Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxiato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCI de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y col., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un ligador lábil de ácido, un ligador sensible a peptidasa, un ligador fotolábil, un ligador de dimetilo o un ligador que contiene disulfuro (Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente de Estados Unidos Nº 5.208.020).
[0356] Los compuestos contemplan expresamente, pero sin limitación, ADC preparado con reactivos de ligador cruzado: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4vinilsulfona)benzoato) que están disponibles en el mercado (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco
[0357] En los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), un anticuerpo (Ab) está conjugado con uno o más restos de fármaco (D), por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo, a través de un ligador (L). El ADC de fórmula I puede prepararse por varias rutas empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo de ligador bivalente para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo ligador de bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. En el presente documento se describen procedimientos adicionales para la preparación de ADC.
Ab-(L-D)p I
[0358] El ligador puede estar compuesto por uno o más componentes ligadores. Los componentes ligadores de ejemplo incluyen 6-maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alaninafenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato ("SPP"), Nsuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxilato ("SMCC") y N-succinimidil-(4-yodo-acetil)aminobenzoato ("SIAB"). Se conocen componentes ligadores adicionales en la técnica y algunos se describen en el presente documento. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Nº de serie US 10/983.340 presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyos contenido se incorpora en la presente en su totalidad por referencia.
[0359] El ligador también puede comprender residuos aminoacídicos. Los componentes ligadores de aminoácidos ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicinavalina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente ligador de aminoácidos incluyen aquellos de origen natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no son de origen natural, tal como citrulina. Los componentes ligadores de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática mediante una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
[0360] Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitación: (i) grupos amina del extremo N, (ii) grupos amina de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en los que el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de ligador y reactivos de ligador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros entre cadenas reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos de ligador mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Por tanto, cada puente de cisteína formará teóricamente dos nucleófilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) produciendo la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoacídicos de cisteína no nativos).
[0361] Los conjugados de anticuerpo-fármaco también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo de ligador o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos o restos de ligador de fármaco. Los grupos de base de Schiff de iminas resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. La reacción de la parte de hidrato de carbono de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Las proteínas que contienen residuos de serina o treonina del extremo N pueden reaccionar con meta-peryodato sódico, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; patente de Estados Unidos 5.362.852). Dicho aldehído puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo ligador.
[0362] Asimismo, los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, pero sin limitación: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de ligador y reactivos de ligador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida.
[0363] Como alternativa, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado tanto adyacentes entre sí como separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
[0364] En otro aspecto más, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como estreptavidina) para la utilización en la elección previa como diana de tumores en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado sin unir de la circulación usando un agente de limpieza y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
Formulaciones farmacéuticas
[0365] Se preparan formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edición (2000)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras secas. Los vehículos, excipientes
o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, histidina u otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); un polipéptido de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mannosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de proteína Zn); y/o
tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
[0366] La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que esté siendo tratada, preferiblemente, aquéllos con actividades complementarias que se no afecten negativamente entre sí. Dichas moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para los efectos deseados.
[0367] Los ingredientes activos se pueden también entrampar en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se desvelan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edición (2000).
[0368] La formulación que se usará para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se cumple fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
[0369] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos con una determinada forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o alcohol poli(vinílico), poliláctidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable,
copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables
compuestas por copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos de tiempo. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios de la inmunogenicidad. Pueden preverse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlace S-S intramolecular a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los residuos de sulfhidrilo, mediante liofilización en soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando los aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Usos
[0370] Un anticuerpo de la presente invención se puede usar en, por ejemplo, procedimientos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo.
[0371] También se proporcionan procedimientos para tratar o prevenir un tumor, un cáncer, y/o un trastorno proliferativo celular relacionado con el aumento de la expresión y/o actividad (señalización) de Notch 1, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento.
[0372] En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para reducir, inhibir o impedir el crecimiento de un tumor o cáncer, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento.
[0373] Más aún, al menos algunos de los anticuerpos de la invención pueden unirse a antígenos de otras especies. De forma deseable, un anticuerpo Notch 1 NRR se une a Notch 1 NRR humano y de ratón; de forma deseable con una Kd de 1 x 10-7 o mayor. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención se pueden usar para unir actividad de antígeno específica, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene el antígeno, en individuos humanos
o en otros mamíferos que tienen el antígeno con el que el anticuerpo de la invención reacciona de forma cruzada (por ejemplo, chimpancé, babuino, tití, macacos y rhesus, cerdo o ratón). En una realización, el anticuerpo de la invención se puede usar para inhibir las actividades antigénicas al poner el contacto el anticuerpo con el antígeno de tal forma que se inhiba la actividad del antígeno. Preferiblemente, el antígeno es una molécula de proteína humana.
[0374] Un anticuerpo de la invención se puede usar en un procedimiento para unir un antígeno en un individuo que padece un trastorno asociado con un aumento de expresión y/o actividad (señalización), que comprende administrar al individuo un anticuerpo de la invención de modo tal que se una al antígeno del individuo. Se considera que el aumento de la actividad de Notch 1 (señalización) incluye el aumento de actividad de Notch 1 debido a las mutaciones de activación de Notch, el aumento de la actividad de Notch 1 debido al aumento de expresión y/o actividad de los ligandos de Notch, así como un aumento de la actividad de Notch 1 debido a otros mecanismos. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteica humana y el individuo es un ser humano. Como alternativa, el individuo puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que se une un anticuerpo de la invención. Aún adicionalmente, el individuo puede ser un mamífero en el que se ha introducido el antígeno (por ejemplo, por administración del antígeno o por expresión del transgen antigénico). Puede administrarse un anticuerpo de la invención a un individuo humano con fines terapéuticos. Además, puede administrarse un anticuerpo de la invención a un mamífero no humano que expresa un antígeno con el que la inmunoglobulina reacciona de forma cruzada (por ejemplo, un primate, cerdo o ratón) con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Respecto de esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para la. evaluación de la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, ensayo de dosificación y duración de la administración).
[0375] Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar, inhibir, retrasar la progresión, evitar/retrasar la reaparición, mejorar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones patológicas asociados con la expresión y/o la actividad de una o más moléculas antigénicas.
[0376] Los ejemplos de trastornos incluyen carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de células pequeñas, cáncer de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamosos del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer del aparato urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peneano, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B, cáncer de cerebro, así como de cabeza y cuello y metástasis asociadas. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer pulmonar de células pequeñas, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR) y carcinoma hepatocelular.
[0377] Los anticuerpos de la invención también son útiles en el tratamiento (que incluye la prevención) de trastornos cuya patología implica degeneración o disfunción celular, tal como el tratamiento de diversos trastornos neurodegenerativos (crónicos) y lesiones celulares nerviosas agudas. Dichos trastornos neurodegenerativos incluyen, sin limitación, neuropatías periféricas; trastornos de la neurona motora, tales como esclerosis lateral amiotrófica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig), parálisis de Bell y diversas enfermedades que implican atrofia o parálisis muscular espinal; y otras enfermedades neurodegenerativas humanas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, esclerosis múltiple, corea de Huntington, síndrome de Down, sordera nerviosa, y enfermedad de Meniere, y lesiones celulares nerviosas agudas, por ejemplo debidas a trauma o lesión de la médula espinal.
[0378] La actividad de Notch 1 se ha visto implicada en el desarrollo de diversos sistemas de células madre y progenitoras tempranas, tanto en las fases de desarrollo como adultas. Véase, por ejemplo, Chirba, S. (2006) Stem Cells 24: 2437-2447. Por consiguiente, también se proporcionan procedimientos para la expansión de células no terminalmente diferenciadas ("células precursoras") por la modulación de la ruta de Notch en una célula precursora de tal forma que se inhiba la diferenciación de la célula precursora. Como se usa en el presente documento, "células precursoras" se referirá a células no terminalmente diferenciadas. La célula precursora es preferiblemente una célula madre o progenitora. También se proporcionan procedimientos para la expansión de las células precursoras en poblaciones que contienen células precursoras mediante la activación de la vía Notch en las células de tal forma que se inhiba la diferenciación de la célula madre. Además, las células precursoras se pueden aislar de una población celular, si se desea, antes o después de la activación de la vía Notch. La activación de la vía Notch se obtiene preferiblemente al poner en contacto la célula con un anticuerpo agonista anti-NRR de Notch 1.
[0379] Un aspecto es tratar la población de células deseada con agonistas de la vía Notch y después permitir que estas células proliferen en cultivos antes de trasplantarlas de nuevo en la región apropiada, o trasplantarlas directamente sin dejarlas necesariamente proliferar in vitro. Se pueden usar antagonistas para invertir o neutralizar la acción del agonista de la función de Notch.
[0380] Las poblaciones de células madre expandidas de la presente invención se pueden trasplantar en un individuo para el tratamiento de la enfermedad o lesión, o para una terapia génica, mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica que sea apropiado para el tipo de células madre trasplantadas y el sitio de trasplante. Las células madre hematopoyéticas se pueden trasplantar por vía intravenosa, ya que las células madre hepáticas se localizarán en el hígado. Las células madre neuronales se pueden trasplantar directamente en el cerebro en el sitio de la lesión o enfermedad.
[0381] Además de los usos de los anticuerpo antagonistas anti-NRR de Notch 1 descritos en el presente documento, los anticuerpos agonistas anti-NRR de Notch 1 también son útiles para los tratamientos o composiciones para la modulación de las patologías asociadas con la expresión y/o la actividad de Notch 1 y/o una alteración de cualquier vía biológica de Notch 1 y/o del ligando de Notch 1 biológicamente relevante.
[0382] También se proporcionan procedimientos para tratar o prevenir un trastorno inmunológico, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento. En algunos aspectos, el trastorno inmunológico es un trastorno resultante del desarrollo o regulación anormal de linfocitos T (véase, por ejemplo, McKenzie y col., Expert. Opin. Ther. Targets 9: 395-410, 2005).
[0383] También se proporcionan procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento. En algunos aspectos, la enfermedad autoinmune es diabetes autoinmune, esclerosis múltiple o artritis reumatoide.
[0384] También se proporcionan procedimientos para tratar o prevenir el rechazo del trasplante, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento.
[0385] También se proporcionan procedimientos para promover la degeneración y/o reparación tisular, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento. En algunos aspectos, el procedimiento implica promover la regeneración y/o reparación del músculo esquelético o cardíaco o el hueso.
[0386] La invención también proporciona procedimientos y composiciones útiles para modular patologías asociadas con la expresión y/o la actividad de Notch 1, tales como el aumento de la expresión y/o la actividad o disminuidas, o una expresión y/o actividad no deseadas.
[0387] En un aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar o prevenir un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular asociado con el aumento de la expresión y/o la actividad de Notch 1, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad eficaz de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento.
[0388] En un aspecto, la invención proporciona procedimientos para inhibir la angiogénesis que comprenden administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento.
[0389] En un aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar una afección patológica asociada con la angiogénesis que comprenden administrar una cantidad eficaz de anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a un individuo que necesita dicho tratamiento. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con la angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la afección patológica asociada con la angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.
[0390] En ciertos aspectos, se administra al individuo un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado y/o antígeno al que se une está/están interiorizados en la célula, lo que da como resultado el aumento de la eficacia terapéutica del inmunoconjugado para destruir la célula diana a la que se une. En un aspecto, el agente citotóxico se dirige o interfiere en el ácido nucleico de la célula diana. En un aspecto, el agente citotóxico se dirige o interfiere en la polimerización de los microtúbulos. Los ejemplos de dichos agentes citotóxicos incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos indicados en el presente documento (tales como maitansinoide, estatina, dolastatina o caliqueamicina), un isótopo radioactivo o una ribonucleasa o una ADN endonucleasa.
[0391] Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones en una terapia: Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede coadministrar con otro anticuerpo, agente(s) quimioterapéuticos(s) (que incluyen cócteles de agentes quimioterapéuticos), otros agentes citotóxicos, agentes antiangiogénicos, citocinas y/o agentes inhibidores del crecimiento. Cuando un anticuerpo de la invención inhibe el crecimiento tumoral, puede ser particularmente deseable combinarlo con uno o más agentes terapéuticos que también inhiben el crecimiento tumoral. Como alternativa, o adicionalmente, el individuo puede recibir terapia de radiación combinada (por ejemplo, irradiación externa de rayos o terapia con un agente marcado radiactivo, tal como un anticuerpo). Dichas terapias combinadas que se han indicado anteriormente incluyen la administración combinada (donde los dos o más agentes están incluidos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes y/o después de la administración de la terapia o terapias adjuntas.
Terapias de Combinación
[0392] Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona terapias combinadas en las que un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se administra con otra terapia. Por ejemplo, los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 se usan en combinaciones con productos terapéuticos anticancerosos o un producto terapéutico antineovascularización para tratar diversas afecciones neoplásicas o no neoplásicas. La afección neoplásica o no neoplásica se caracteriza por un trastorno patológico asociado con angiogénesis aberrante o no deseada. El anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se puede administrar en serie o en combinación con otro agente que es eficaz para estos fines, en la misma composición o en forma de composiciones separadas. Como alternativa, o adicionalmente, se pueden administrar múltiples inhibidores de Notch 1.
[0393] La administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se puede realizar de forma simultánea, por ejemplo, como una composición única o como dos o más composiciones distintas usando vías de administración iguales o diferentes. Como alternativa, o adicionalmente, la administración se puede hacer de forma secuencial, en cualquier orden. En ciertos aspectos, pueden estar presentes intervalos que varían de minutos a días, a semanas a meses entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el agente anticáncer se puede administrar primero, seguido del inhibidor de Notch 1. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o administración en primer lugar del anticuerpo anti-NRR de Notch 1.
[0394] Las cantidades eficaces de los agentes terapéuticos administrados en combinación con un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 estarán bajo la discreción del médico o veterinario. Se realiza la administración y el ajuste de la dosificación para obtener la máxima administración de la enfermedad tratada. La dosis dependerá adicionalmente de factores tales como el tipo de agente terapéutico usado y el individuo específico que se trata. Las dosificaciones adecuadas para el agente anticáncer son las usadas actualmente y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente anticáncer y el anticuerpo anti-NRR de Notch 1. En ciertos aspectos, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un único inhibidor. El término "potenciar" se refiere a una mejora de la eficacia de un agente terapéutico en su dosis común o aprobada.
[0395] Típicamente, los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y los agentes anticáncer son adecuados para enfermedades iguales o similares para bloquear o reducir un trastorno patológico, tal como el crecimiento tumoral o el crecimiento de una célula cancerosa. En una realización, el agente anticáncer es un agente antiangiogénesis.
[0396] Los agentes anticáncer ejemplares incluyen un agente alquilante, un antagonista folato, un antagonista pirimidina, un antibiótico citotóxico, un compuesto de platino o un compuesto a base de platino, un taxano, un alcaloide de vinca, un inhibidor de c-Kit, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor de antiangiogénesis, tal como un inhibidor de anti-VEGF, un inhibidor de HER-2, un inhibidor de GFR o un inhibidor dual de EGFR/HER-2 cinasa, un antiestrógeno, tal como fulvestrant, y un agente de terapia hormonal, tal como carboplatino, cisplatino, gemcitabina, capecitabina, epirrubicina, tamoxifeno, un inhibidor de aromatasa y prednisona. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer colorrectal y el segundo medicamento es un inhibidor de EGFR, tal como erlotinib, un inhibidor de anti-VEGF, tal como bevacizumab, o es cetuximab, arinotecano, irinotecano o FOLFOX, o el cáncer es cáncer de mama y el segundo medicamento es un modulador antiestrógeno, tal como fulvestrant, tamoxifeno o un inhibidor de aromatasa, tal como letrozol, exemestano o anastrozol, o es un inhibidor de VEGF, tal como bevacizumab, o es un agente quimioterapéutico, tal como doxorrubicina y/o un taxano, tal como paclitaxel, o es un inhibidor de anti-HER-2, tal como trastuzumab, o un inhibidor dual de EGFR/HER-2 cinasa, tal como lapatinib o un regulador por disminución de HER-2, tal como 17AAG (derivado de geldanamicina, que es un veneno de la proteína de choque térmico 90 [Hsp]) (por ejemplo, para cánceres de mama que han avanzado a trastuzumab). En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células pequeñas, y el segundo medicamento es un inhibidor de VEGF, tal como bevacizumab, o un inhibidor de EGFR, tal como, por ejemplo, erlotinib o un inhibidor de c-Kit, tal como por ejemplo, imatinib.
[0397] La terapia antiangiogénica en relación con el cáncer es una estrategia de tratamiento del cáncer dirigida a inhibir el desarrollo de los vasos sanguíneos del tumor necesario para proporcionar nutrientes para mantener el crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis está involucrada en el crecimiento del tumor primario y la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico en el sitio primario, así como de prevenir la metástasis de los tumores en los sitios secundarios, de este modo permite el ataque de los tumores por otros agentes terapéuticos.
[0398] Se han identificado, y se conocen en la técnica, muchos agentes antiangiogénicos, que incluyen los enumerados en el presente documento, por ejemplo, enumerados en Definiciones, y por ejemplo, en Carmeliet y Jain, Nature 407: 249-257 (2000); Ferrara y col., Nature Reviews: Drug Discovery, 3: 391-400 (2004); y Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003). Véase también, solicitud de patente de Estados Unidos US20030055006. En un aspecto, se usa un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 en combinación con un anticuerpo neutralizante anti-VEGF (o fragmento) y/u otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF que incluye, pero sin limitación, por ejemplo, framentos del receptor de VEGF soluble (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por ejemplo, NRP1, NRP2)), aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de bajo peso molecular de tirosinas cinasas (RTK) de VEGFR, estrategias antisentido para VEGF, ribozimas contra VEGF o receptores de VEGF, variantes de antagonistas de VEGF; y cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, o adicionalmente, pueden coadministrarse opcionalmente dos o más inhibidores de angiogénesis al individuo además del antagonista de VEGF y otro agente. En ciertos aspectos, se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes anticáncer, en combinación con un anticuerpo anti-NRR de Notch 1, el antagonista de VEGF y un agente antiangiogénesis.
[0399] En ciertos aspectos de la invención, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia tumoral de combinación con un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 incluyen otras terapias para el cáncer (por ejemplo, cirugía, tratamientos radiológicos (por ejemplo, que incluyen irradiación o administración de sustancias radiactivas), quimioterapia, tratamiento con agentes anticáncer enumerados en el presente documento y conocidos en el técnica,
o combinaciones de los mismos). Como alternativa, o adicionalmente, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antígeno o dos o más antígenos diferentes desvelados en el presente documento se pueden coadministrar al individuo. A veces, también puede ser beneficioso administrar una o más citocinas al individuo.
Agentes quimioterapéuticos
[0400] En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos para su uso en un procedimiento para bloquear o reducir el crecimiento tumoral o el crecimiento de las células cancerosas, mediante la administración de cantidades eficaces de un antagonista de Notch 1 y/o un inhibidor(es) de la angiogénesis y uno o más agentes quimioterapéuticos a un individuo susceptible, o diagnosticado con cáncer. Se puede usar una diversidad de agentes quimioterapéuticos en los procedimientos de tratamiento combinados de la invención. Una lista ejemplar y no limitante de agentes quimioterapéuticos contemplados se proporciona en el presente documento en la sección "Definiciones" y algunos se han descrito anteriormente.
[0401] Como se entenderá por los expertos en la técnica, las dosis apropiadas de los agentes quimioterapéuticos estarán generalmente alrededor de las ya empleadas en las terapias clínicas en las que los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. La variación en la dosificación se producirá probablemente dependiendo de la afección tratada. El médico que administra el tratamiento podrá determinar la dosis apropiada para el individuo.
Crecimiento Tumoral de Recaída
[0402] La invención también proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos y composiciones para inhibir
o impedir el crecimiento tumoral de recaída o el crecimiento de las células cancerosas de recaída. El crecimiento tumoral de recaída o el crecimiento de las células cancerosas de recaída se usa para describir una afección en la que los individuos que se someten o tratados con una o más de las terapias disponibles actualmente (por ejemplo, terapias del cáncer, tales como quimioterapia, terapia de radiación, cirugía, terapia hormonal y/o terapia/inmunoterapia biológica, terapia con anticuerpo anti-VEGF, en particular un régimen terapéutico convencional para el cáncer particular) no es clínicamente adecuado para tratar los individuos, o los individuos ya no reciben ningún efecto beneficioso de la terapia, de tal forma que estos individuos necesitan una terapia eficaz adicional. Como se usa en el presente documento, la frase también puede referirse a una afección del de individuo "que no responde/refractario", por ejemplo, que describe individuos que responden a la terapia pero padecen efectos secundarios, desarrollan resistencia, no responden a la terapia, no responden satisfactoriamente a la terapia, etc. En diversas formas de realización, un cáncer es un crecimiento tumoral de recaída o un crecimiento de las células cancerosas de recaída cuando el número de células cancerosas no se ha reducido significativamente o ha aumentado, o el tamaño del tumor no se ha reducido significativamente o ha aumentado, o falla cualquier reducción del tamaño o el número de células cancerosas. La determinación respecto de si las células cancerosas son de crecimiento tumoral de recaída o de crecimiento de células cancerosas de recaída se puede realizar in vivo o in vitro por cualquier procedimiento conocido en la técnica para ensayar la eficacia del tratamiento de las células cancerosas, usando los significados aceptados en la técnica de "recaída" o "refractario" o "que no responde" en un contexto de este tipo. Un tumor resistente al tratamiento con anti-VEGF es un ejemplo de un crecimiento tumoral de recaída.
[0403] La invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral de recaída o el crecimiento de las células cancerosas de recaída en un individuo mediante la administración de uno o más anticuerpos anti-NRR de Notch 1 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral de recaída o el crecimiento de las células cancerosas de recaída en un individuo. En ciertas realizaciones, el antagonista se puede administrar posteriormente a la terapia del cáncer. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se administra de forma simultánea con la terapia del cáncer. Como alternativa, o adicionalmente, la terapia del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se alterna con otra terapia del cáncer, que se puede realizar en cualquier orden. La invención también incluye procedimientos para administrar uno o más anticuerpos inhibidores para impedir el comienzo o reaparición del cáncer en individuos predispuestos a tener cáncer. En general, el individual estaba o está sometiéndose de forma concurrente a terapia del cáncer. En una realización, la terapia del cáncer es un tratamiento con un agente de antiangiogénesis, por ejemplo, un antagonista de VEGF. El agente de antiangiogénesis incluye los conocidos en la técnica y los hallados en la sección Definiciones del presente documento. En una realización, el agente de antiangiogénesis es un anticuerpo o fragmento anti-VEGF neutralizante (por ejemplo, A4.6.1 humanizado, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc.). Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; los documentos WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; solicitudes de patente de Estados Unidos US 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004); y el documento WO 2005012359. Se pueden administrar agentes adicionales en combinación con el antagonista de VEGF y el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral de recaída o el crecimiento de las células cancerosas de recaída, por ejemplo, véase la sección titulada Terapias de Combinación en el presente documento.
[0404] Los compuestos de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-NRR de Notch 1) se administran a un individuo (por ejemplo, un paciente humano), de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa en forma de un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por ejemplo, por vía oral, tópica o inhalación, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea, para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intracerobroespinal, intrasinovial, intratecal o subcutánea. La administración local es particularmente deseada si los efectos secundarios extensos o la toxicidad se asocian con la inhibición de la señalización de Notch 1. También se puede usar una estrategia ex vivo para las aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo implican, por ejemplo, la transfección o transducción de las células obtenidas de individuos con un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Después, las células transfectadas o transducidas regresan al individuo. Las células pueden ser cualquiera de una amplia gama de tipos que incluyen, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, linfocitos T o linfocitos B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos o células musculares.
[0405] Además, el anticuerpo se puede administrar de forma adecuada por infusión por pulsos, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se da en inyecciones, con máxima preferencia, inyecciones intravenosas o subcutáneas, que dependen en parte de si la administración es breve o crónica.
[0406] En otro ejemplo, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se administra por vía local, por ejemplo, por inyecciones directas, cuando el trastorno o ubicación del tumor lo permite, y las inyecciones se pueden repetir de forma periódica. El anticuerpo anti-NRR de Notch 1 también se pueden administrar por vía sistémica al individuo o de forma directa a las células tumorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho tumoral después de la escisión quirúrgica del tumor, con el fin de evitar o reducir la reaparición o metástasis local.
[0407] Como alternativa, se puede administrar una molécula de ácido nucleico o polinucleótido inhibidor que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 a las células apropiadas en el individuo. En ciertos aspectos, el ácido nucleico se puede dirigir al propio tumor.
[0408] El ácido nucleico se puede introducir en las células por cualquiera de los medios apropiados para el vector empleado. Muchos de dichos procedimientos se conocen bien en la técnica (Sambrook y col., anteriormente, y Watson y col., Recombinant DNA, Capítulo 12, 2ª edición, Scientific American Books, 1992). Los ejemplos de procedimientos de administración génica incluyen procedimientos de transfección mediada por liposoma, electroporación, fosfato de calcio/DEAE dextrano, pistola génica y microinyección.
[0409] La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, que dependen en parte de si la administración es breve o crónica. La composición del anticuerpo de la invención se formulará, dosificará y administrará de una forma compatible con la buena práctica médica. Los factores para considerar en este contexto incluyen el trastorno particular tratado, el mamífero particular tratado, la patología clínica del individuo, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos por los profesionales médicos. El anticuerpo no necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores que se han analizado anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se han usado anteriormente en el presente documento o aproximadamente del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta este momento.
[0410] Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con otros agentes tales como agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y fase de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, los antecedentes clínicos del individuo y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico asistente. El anticuerpo se administra de forma adecuada al individuo de una vez o durante una serie de tratamientos. De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 !g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) del anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al individuo, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas como por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 !g/kg a 100 mg/kg o más, lo que depende de los factores que se han mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos) al individuo. Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el individuo reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial superior seguida de una o más dosis menores. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros esquemas de dosificación. El avance de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
[0411] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 de la invención también son útiles en los ensayos de detección de la expresión de Notch 1 (tales como ensayos diagnósticos o pronósticos), en células o tejidos específicos donde los anticuerpos se marcan como se describe a continuación y/o se inmovilizan en una matriz insoluble.
[0412] También se proporcionan procedimientos para la detección de Notch 1, comprendiendo los procedimientos detectar el complejo de anticuerpo Notch 1-anti-NRR de Notch 1 de la muestra. El término "detección", como se usa en el presente documento, incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia con respecto a un control.
[0413] También se proporcionan procedimientos para diagnosticar un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de Notch 1, comprendiendo los procedimientos la detección del complejo anticuerpo Notch 1-anti-NRR de Notch 1 de una muestra biológica de un individuo que padece o se sospecha que padece del trastorno. En algunas realizaciones, la expresión de Notch 1 es la expresión aumentada o expresión anormal (no deseada). En algunos aspectos, el trastorno es un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular. Como alternativa o además de la detección de la expresión de Notch 1, en los procedimientos de diagnóstico o tratamiento descritos en el presente documento, se puede determinar la expresión de los ligandos de Notch 1 en una muestra biológica. La expresión del ligando de Notch 1 se puede determinar usando procedimientos convencionales en la técnica.
[0414] En otro aspecto, cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 descritos en el presente documento puede comprender una etiqueta detectable.
[0415] También se proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 descritos en el presente documento y Notch 1. En algunos aspectos, el complejo está in vivo o in vitro. En algunos aspectos, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se marca de forma detectable.
[0416] Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 se pueden usar para la detección de Notch 1 en uno cualquiera de varios procedimientos de ensayos de detección bien conocidos. Por ejemplo, se puede analizar una muestra biológica para determinar Notch 1 mediante la obtención de una fuente deseada, mezclando de la muestra con el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para permitir que el anticuerpo forme el complejo anticuerpo/Notch 1 con cualquier Notch 1 presente en la mezcla, y detectando cualquier complejo anticuerpo/Notch 1 presente en la mezcla. La muestra biológica se puede preparar para el ensayo mediante procedimientos conocidos en la técnica que son adecuados para la muestra particular. Los procedimientos de mezcla de la muestra con los anticuerpos y los procedimientos de detección del complejo anticuerpo/Notch 1 se seleccionan de acuerdo con el tipo de ensayo usado. Dichos ensayos incluyen ensayos inmunohistoquímicos, competitivos y sándwich, y ensayos de inhibición estérica.
[0417] Los procedimientos analíticos para Notch 1 usan uno o más de los siguientes reactivos: análogo de Notch 1 marcado, análogo de Notch 1 inmovilizado, anticuerpo anti-NRR de Notch 1 marcado, anticuerpo anti-NRR de Notch 1 inmovilizado y conjugados estéricos. Los reactivos marcados también se conocen como "indicadores".
[0418] La etiqueta usada es cualquier funcionalidad detectable que no interfiere en la unión del Notch 1 y el anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Se conocen numerosas etiquetas para su uso en los inmunoensayos, los ejemplos incluyen restos que se pueden detectar directamente, tales como etiquetas fluorocrómicas, quimioluminiscentes y radioactivas, así como los restos, tales como enzimas, que deben reaccionar o derivarse para ser detectados. Los ejemplos de dichas etiquetas incluyen los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelados de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de Estados Unidos Nº 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazinodionas, peroxidasa de rábano rusticano (HRP), fosfatasa alcalina, 1-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido ácido para oxidar un precursor de colorante, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, etiquetas de spin, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
[0419] Los procedimientos convencionales están disponibles para unir estas etiquetas de forma covalente a las proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bencidina bis-diazotados y similares se pueden usar para marcar los anticuerpos con las etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticas que se han descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry 13: 1014-1021 (1974); Pain y col., J. Immunol Methods, 40: 219-230); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982). Las etiquetas preferidas en el presente documento son enzimas, tales como peroxidasa de rábano rusticano y fosfatasa alcalina. La conjugación de dicha marca, que incluye las enzimas, para el anticuerpo es un procedimiento de manipulación convencional para un experto en la técnica en las técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan y col., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzime Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nueva York, 1981), págs. 147-166.
[0420] La inmovilización de reactivos es necesaria para ciertos procedimientos de ensayo. La inmovilización supone la separación del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 de cualquier Notch 1 o NRR de Notch 1 que permanece libre en solución. Esto se logra de forma convencional por la insolubilización del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 o el análogo de NRR de Notch 1 antes del procedimiento de ensayo, por la adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich y col., Patente de Estados Unidos Nº 3.720.760), por acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento de glutaraldehído), o por la insolubilización del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 o análogo de NRR de Notch 1 después, por ejemplo, por inmunoprecipitación.
[0421] La expresión de proteínas en una muestra se puede examinar usando protocolos de inmunohistoquímica y tinción. La tinción inmunohistoquímica de las secciones de tejido ha demostrado ser un procedimiento fiable para evaluar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica ("IHQ") utilizan un
anticuerpo para analizar y visualizar los antígenos celulares in situ, generalmente por procedimientos cromogénicos
o fluorescentes. Para la preparación de muestras, se puede usar una muestra de tejido o célula de un mamífero (típicamente un ser humano). Los ejemplos de muestras incluyen, pero sin limitación, células cancerosas, tales como células cancerosas de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. La muestra se puede obtener por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En un aspecto, la muestra se fija e incluye en parafina o similares. La muestra del tejido se puede fijar (es decir, conservar) mediante una metodología convencional. Un experto en la técnica apreciará que la elección de un fijador se determina por el propósito para el que la muestra se tiñe histológicamente o se analiza de otro modo. Un experto en la técnica también apreciará que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra tisular y el fijador usado.
[0422] Se puede realizar la IHQ en combinación con técnicas adicionales, tales como tinción morfológica y/o fluorescencia de la hibridación in situ. Dos procedimientos generales de IHQ están disponibles; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, se determina directamente la unión del anticuerpo al antígeno diana (por ejemplo, NRR de Notch 1). Este ensayo directo usa un reactivo marcado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario marcado con una enzima, que se puede visualizar sin interacción adicional con el anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y después un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta enzimática, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación de la señal se produce porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con epítopos diferentes sobre el anticuerpo primario.
[0423] El anticuerpo primario y/o secundario usado para la inmunohistoquímica normalmente se marcará con un resto detectable. Están disponibles numerosas etiquetas que generalmente se pueden agrupar en las siguientes categorías:
Aparte de los procedimientos de preparación de muestras que se han analizado anteriormente, se puede desear un tratamiento adicional de la sección tisular antes, durante o después de la IHQ. Por ejemplo, pueden realizarse procedimientos de recuperación del epítopo, tal como, calentamiento de la muestra tisular en tampón de citrato (véase, por ejemplo, Leong y col. Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)).
[0424] Después de una etapa de bloqueo opcional, la sección tisular se expone al anticuerpo primario durante un período suficiente de tiempo y en condiciones adecuadas de tal forma que el anticuerpo primario se una al antígeno proteico diana en la muestra tisular. Las condiciones apropiadas para obtener esto se pueden determinar por experimentación de rutina. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina usando una cualquiera de las etiquetas detectables que se han analizado anteriormente. Preferiblemente, la etiqueta es una etiqueta enzimática (por ejemplo, HYPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico, tal como el cromógeno 3,3'diaminobencidina. Preferiblemente, la etiqueta enzimática se conjuga con el anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es un anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-conejo de cabra).
[0425] Los especímenes preparados de esta manera se pueden montar y colocar un cubreobjetos. Después, se realiza la evaluación del portaobjetos, por ejemplo usando un microscopio, y se pueden emplear criterios de intensidad de tinción, usados rutinariamente en la técnica. Los criterios de intensidad de tinción se pueden evaluar como se indica a continuación:
TABLA 2
Patrón de Tinción
Puntuación
No se observa tinción en las células.
0
Se detecta una tinción pálida/apenas perceptible en más del 10% de las células.
1+
Se observa una tinción débil a moderada en más del 10% de las células.
2+
Se observa una tinción moderada a fuerte en más del 10% de las células
3+
[0426] Generalmente, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 2+ o más en un ensayo de IHQ es diagnóstico y/o pronóstico. En algunos aspectos, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 1+ o más es diagnóstico y/o pronóstico. En otros aspectos, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 3 o más es diagnóstico y/o pronóstico. Se considera que cuando las células y/o tejido de un tumor o adenoma de colon se examinan usando IHQ, en general se determina o evalúa la tinción de la célula y/o tejido tumoral (a diferencia de tejido del tejido estromal o circundante que puede estar presente en la muestra).
[0427] Otros procedimientos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o sandwich, están bien establecidos y se usan ampliamente en la industria de procedimientos diagnósticos comerciales.
[0428] Los ensayos competitivos dependen de la capacidad de un análogo NRR de Notch 1 del indicador para competir con la NRR de Notch 1 de la muestra de ensayo para un número limitado de sitios de unión del antígeno del anticuerpo anti-NRR de Notch 1. El anticuerpo anti-NRR de Notch 1 generalmente se insolubiliza antes o después de la competición y después el indicador y el Notch 1 o NRR de Notch 1 unidos al anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se separan del indicador no unido y Notch 1 o NRR de Notch 1. Esta separación se realiza por decantación (donde el compañero de unión se insolubilizó previamente) o por centrifugación (donde el compañero de unión se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de Notch 1 o NRR de Notch 1 en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de indicador unido según se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de dosis respuesta con cantidades conocidas de NRR de Notch 1 y se comparan con los resultados de ensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de Notch 1 o NRR de Notch 1 presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se llaman sistemas ELISA cuando se usan enzimas como marcadores detectables.
[0429] Otra especie de ensayo competitivo, llamado ensayo "homogéneo" no requiere una separación de fases. Aquí, se prepara un conjugado de una enzima con el Notch 1 o NRR de Notch 1 y se usa de modo tal que cuando el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se une al Notch 1 o NRR de Notch 1, la presencia del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 modifica la actividad enzimática. En este caso, el Notch o NRR de Notch 1 o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan con un puente orgánico bifuncional a una enzima tal como peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para su uso con el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 de manera que la unión del anticuerpo anti-NRR de Notch 1 inhiba o potencie la actividad enzimática de la etiqueta. Este método per se se practica ampliamente con el nombre de EMIT.
[0430] Se usan conjugados estéricos en procedimientos de impedimento estérico para un ensayo homogéneo. Estos conjugados se sintetizan por la unión covalente de un hapteno de bajo peso molecular a un fragmento pequeño de NRR de Notch 1 de modo que el anticuerpo para el hapteno sea sustancialmente incapaz de unirse al conjugado al mismo tiempo que el anticuerpo anti-NRR de Notch 1. Con este procedimiento de ensayo, la NRR de Notch 1 presente en la muestra de ensayo se unirá al anticuerpo anti-NRR de Notch 1, permitiendo así que el antihapteno se una al conjugado, dando como resultado un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio de fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo.
[0431] Los ensayos sandwich son particularmente útiles para la determinación de anticuerpos Notch 1, NRR de Notch 1 o anti-NRR de Notch 1. En ensayos sandwich secuenciales, se usa un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 inmovilizado para adsorber el Notch 1 o NRR de Notch 1 de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo elimina por lavado, el Notch 1 o NRR de Notch 1 unida se usa para adsorber un segundo anticuerpo anti-NRR de Notch 1 marcado y después el material unido se separa del indicador residual. La cantidad de indicador unido es directamente proporcional al Notch 1 o NRR de Notch 1 de la muestra de ensayo. En ensayos sandwich "simultáneos" la muestra de ensayo no se separa antes de la adición de la anti-NRR de Notch 1 marcada. Un ensayo sandwich sucesivo que usa un anticuerpo monoclonal anti-NRR de Notch 1 como un anticuerpo y un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 policlonal como el otro es útil para examinar muestras para determinar Notch 1 o NRR de Notch 1.
[0432] Los anteriores son únicamente ejemplos de ensayos de detección para Notch 1 o NRR de Notch 1. Otros procedimientos actuales o desarrollados en lo sucesivo aquí que usan el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para la determinación de Notch 1 o NRR de Notch 1 se incluyen dentro del alcance del mismo, incluyendo los ensayos biológicos descritos en el presente documento.
[0433] También se proporcionan procedimientos para detectar (por ejemplo, la presencia o la ausencia de una cantidad) un polinucleótido o polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de Notch 1) en una muestra biológica de un individuo, tal como un individuo humano. Se puede emplear una diversidad de procedimientos para detectar polinucleótidos e incluyen, por ejemplo, RT-PCR, ensayo de expresión génica TagMan®, procedimientos de amplificación, micromatriz de polinucleótidos y similares.
[0434] Los procedimientos para la detección de polinucleótidos (tales como ARNm) se conocen bien e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que usan sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas de Notch 1 marcadas), transferencia Northern y técnicas relacionadas, y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para Notch 1, y otros procedimientos de detección de tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SPIA (amplificación isotérmica de cebador único), Ribo-SPIA, SISBA, NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos), TMA (amplificación mediada por transcripción) y similares.
[0435] Las muestras biológicas de los mamíferos se pueden ensayar de forma conveniente, por ejemplo, para determinar ARNm de Notch 1 usando transferencia Northern, transferencia puntual o análisis de PCR. Por ejemplo, los ensayos RT-PCR, tales como ensayos de PCR cuantitativa se conocen bien en la técnica. Un procedimiento para detectar ARNm de Notch 1 en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción reversa usando al menos un cebador; amplificación de ADNc así producido usando un polinucleótido de Notch 1 como cebadores directo e indirecto para amplificar en el mismo ADNc de Notch 1; y detección de la presencia o la ausencia del ADNc de Notch 1 amplificado. Además, dichos procedimientos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar la cantidad (niveles) de ARNm de Notch 1 en una muestra biológica (por ejemplo, por examen simultáneo de los niveles de una secuencia del ARNm de control comparativa de un gen constitutivo, tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente, se puede determinar la secuencia del ADNc de Notch 1 amplificado.
[0436] Las sondas y/o cebadores se pueden marcar con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metal o una enzima. Dichas sondas y cebadores se pueden usar para detectar la presencia de polinucleótidos de Notch 1 en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa las proteínas de Notch 1. Como se entenderá por los expertos en la técnica, se puede preparar una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes (por ejemplo, en base a las secuencias proporcionadas en el presente documento) y usarse de forma eficaz para amplificar, clonar y/o determinar la presencia o ausencia de y/o la cantidad de ARNm de Notch 1.
[0437] Los procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que comprenden la detección de polinucleótidos, tales como polinucleótido de Notch 1, en una muestra tisular o celular mediante tecnologías de micromatrices. Por ejemplo, mediante micromatrices de ácidos nucleicos, las muestras de ARNm de ensayo y de control de muestras de tejido de ensayo y de control se transcriben de forma inversa y se marcan para generar sondas de ADNc. Después, las sondas se hibridan con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La matriz se configura de forma que la secuencia y posición de cada miembro de la matriz sea conocida. Por ejemplo, una selección de genes que tienen potencial para expresarse en ciertas patologías se puede disponer en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de la matriz particular indica que la muestra de la que se obtuvo la sonda expresa el gen. El análisis de la expresión génica diferencial del tejido enfermo puede proveer información valiosa. La tecnología de micromatrices utiliza técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de computación para evaluar el perfil de expresión del ARMm de miles de genes en un solo experimento (véase, por ejemplo, el documento WO 01/75166 publicado el 11 de octubre de 2001). (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.700.637; Patente de Estados Unidos Nº 5.445.934; Patente de Estados Unidos Nº 5.807.522; Lockart, Nature Biotechnology, 14: 1675-1680 (1996); y Cheung, V. G. y col., Nature Genetics 21 (Supl.): 15-19 (1999) para obtener una descripción de la fabricación de matrices). Las micromatrices de ADN son matrices en miniatura que contienen fragmentos génicos que se sintetizan de forma directa o transferida en un cristal u otros sustratos. Normalmente se representan miles de genes en una única matriz. Un experimento de micromatriz típico incluye las siguientes etapas: (1) preparación de diana marcada por fluorescencia de ARN aislado de la muestra, (2) hibridación de la diana dirigida a la micromatriz, (3) lavado, tinción y barrido de la matriz, (4) análisis de la imagen barrida y (5) generación de perfiles de expresión génica. En la actualidad se usan dos tipos de micromatrices de ADN: matrices oligonucleotídicas (normalmente de 25 a 70 meros) y matrices de expresión génica que contienen productos de PCR preparados a partir de los ADNc. Para formar una matriz, los oligonucleótidos se pueden prefabricar y transferir a la superficie o sintetizarse directamente en la superficie (in situ).
[0438] El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatrices disponible en el mercado que comprende matrices fabricadas por síntesis directa de oligonucleótidos en una superficie de vidrio. Matrices de sonda/gen: Los oligonucleótidos ("oligos"), normalmente de 25 mer, se sintetizan directamente en una oblea de vidrio por una combinación de fotolitografía basada en semiconductores y tecnologías de síntesis química en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligonucleótidos diferentes y cada oligonucleótido está presente en millones de copias. Puesto que las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en localizaciones conocidas de la matriz, los patrones de hibridación y las intensidades de señal se pueden interpretar en cuanto a la identidad génica y los niveles de expresión relativa mediante el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen está representado en la matriz por una serie de sondas de oligonucleótido diferentes. Cada par de sondas consiste en un oligonucleótido apareado prefecto y un oligonucleótido mal apareado. La sonda apareada perfecta presenta una secuencia exactamente complementaria con el gen particular y de este modo mide la expresión del gen. La sonda mal apareada difiere de la sonda apareada perfecta en una única sustitución de base en la posición de la base central, lo que altera la unión del transcrito del gen diana. Esto ayuda a determinar el fondo y la hibridación no específica que contribuye a la señal medida para el oligonucleótido apareado prefecto. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridación de las sondas mal apareadas de las de las sondas apareadas perfectas para determinar el valor de intensidad absoluta o específica para cada conjunto de sondas. Las sondas se seleccionan en base a la información actual de GenBank y otros depósitos de nucleótidos. Se considera que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se usa un horno de hibridación GeneChip (horno "giratorio") para realizar la hibridación de hasta 64 matrices de una vez. La estación de fluídica realiza el lavado y la tinción de las matrices de sondas. La estación está completamente automatizada y contiene cuatro módulos, cada módulo contiene una matriz de sonda. Cada módulo se controla de forma independiente mediante el software Microarray Suite usando protocolos de fluídica preprogramados. El escáner es un escáner de fluorescencia láser confocal que mide intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las matrices de sondas. La estación de trabajo informática con el software Microarray Suite controla la estación fluídica y el escáner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones fluídicas usando protocolos preprogramados de hibridación, lavado y tinción para la matriz de la sonda. El software también obtiene y convierte los datos de intensidad de hibridación en presencia/ausencia de una llamada para cada gen usando los algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta cambios en la expresión génica entre los experimentos mediante análisis de comparación y formatea los resultados en archivos .txt, que se pueden usar con otros programas informáticos para el análisis de datos adicional.
[0439] En algunas realizaciones, se detecta la supresión del gen Notch 1, mutación génica o la amplificación génica. La supresión del gen Notch 1, la mutación génica o la amplificación génica se puede medir mediante uno cualquiera de una amplia diversidad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN), o hibridación in situ (por ejemplo, hibridación fluorescente in situ ("FISH")), usando una sonda marcada de forma apropiada, procedimientos citogenéticos o hibridación genómica comparativa (CGH) usando una sonda marcada de forma apropiada. Además, estos procedimientos se pueden emplear para detectar la supresión del gen del ligando de Notch 1, la mutación de ligando
o la amplificación génica. Como se usa en el presente documento, "detección de la expresión de Notch 1" incluye la detección de la supresión del gen Notch 1, la mutación del gen o la amplificación génica.
[0440] Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilación del gen Notch 1 en una muestra tisular o celular. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de islas de CpG en las regiones reguladoras del gen 5' con frecuencia tiene lugar en células inmortalizadas y transformadas, y puede dar como resultado la expresión alterada de diversos genes. Se conocen bien en la técnica numerosos ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, en los procedimientos de hibridación Southern, se pueden utilizar enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de las islas de CpG. Además, la MSP (PCR específica de la metilación) puede dar rápidamente un perfil del estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en la isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN con bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilo) seguido de la amplificación mediante cebadores específicos para el ADN metilado frente a no metilado. También pueden encontrarse protocolos que implican la interferencia de la metilación también en, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995; De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7: 531-536 (1998)); y Lethe y col., Int.
J. Cancer 76(6): 903-908 (1998). Como se usa en el presente documento, "detección de la expresión de Notch 1" incluye la detección de la metilación del gen Notch 1.
Artículos de Fabricación
[0441] También se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos que se han descrito anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que está sola o cuando se combina con otra u otras composiciones eficaces para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección, y puede tener una boca de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección, tal como cáncer. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico adicional. El artículo de fabricación de esta realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que la primera y la segunda composición de anticuerpos se pueden usar para tratar una afección particular, por ejemplo, cáncer. Como alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación también puede comprender un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
[0442] Los siguientes son ejemplos de los procedimientos y composiciones de la invención. Se considera que se pueden poner en práctica otras formas de realización, dada la descripción general que se ha proporcionado anteriormente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación del Inmunógeno para Generar Anticuerpos anti-NRR de Notch 1
[0443] El inmunógeno que contiene NRR de Notch 1 humano (NRR de hNotch 1) se obtuvo de la siguiente manera.
Subclonación de Expresión
[0444] Usando un clon de longitud completa de Notch 1 humano (Nº de acceso de GenBank NM_017617) como secuencia y plantilla de referencia, se diseñó un conjunto de 4 cebadores de PCR para amplificar una región de Notch 1 que abarca desde el aminoácido V1307 a Q1733 de la SEQ ID NO: 56. Esta región incluye las repeticiones EGF 34-36 y los extremos inmediatamente antes del dominio transmembrana. Se diseñaron los cebadores 5' para añadir una etiqueta Flag N-terminal inmediatamente corriente arriba de la secuencia génica específica. El producto de PCR correspondiente a este dominio se clonó en el vector B9.1 para la expresión secretada de las células de insecto Sf-9 usando el procedimiento de clonación independiente de restricción (RIC). En resumen, los cebadores contenían extensiones 5' necesarias para añadir porciones de los sitios de restricción BamHI y EcoRl a dos productos de PCR independientes generados usando Pfu polimerasa (Stratagene). La desnaturalización y rehibridación de estos productos de PCR produjeron una población de ADN en la que el 25% de los productos contenían los nucleótidos apropiados para representar las proyecciones de BamHI y EcoRl en sus extremos 5' y 3', respectivamente. Después, esta mezcla de ADN se ligó en el vector B9.1 preparado por digestión de restricción con BamHl y EcoRl. La construcción resultante se verificó con respecto a la secuencia de ADN y se le dio el nombre de 696.G40.V2.Notch 1.V1307-Q1733(N-Flag).B9. El vector B9.1 es una versión modificada del vector de transferencia de ADN del baculovirus pACGP67 (BD Pharmingen) que contiene una señal de secreción Gp 67 antes del sitio de clonación BamHI, un sitio de escisión de trombina C-terminal y la etiqueta His.
[0445] Las secuencias relevantes para la clonación de la construcción Notch 1 humano se muestran a continuación:
Cebadores de PCR:
[0446]
Directo: rPhosplgatccGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGC AAAGGCAAG (SEQ ID NO: 48)
Inverso: cCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG (SEQ ID NO: 49)
Directo: cGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG (SEQ ID NO: 50)
Inverso: [phosp]aattcCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG (SEQ ID NO: 51)
[0447] Las mayúsculas representan las secuencias específicas del gen Notch 1; las minúsculas representan los sitios de restricción añadidos; el subrayado representa la etiqueta Flag.
Secuencia de ADN de la Proteína Expresada:
[0448]
[0449] Secuencia de la proteína expresada:
[0450] Las mayúsculas representan las secuencias específicas del gen Notch 1 y las minúsculas representan la
señal de secreción Gp67, la etiqueta Flag N-terminal, el sitio de trombina, la etiqueta Flag C-terminal y cualquier residuo añadido por el vector de expresión.
Generación de Estirpes de Baculovirus y Producción de Proteína
[0451] La construcción que codifica los aminoácidos V1307-Q1733 de Notch 1 humano se expresó en las células Sf-9. Las estirpes de baculovirus se produjeron usando los vectores de transferencia de ADN [101V-1]: 696.G40.V2.Notch 1.V1307-Q 1733(N-Flag).B9.1 (véase la sección de subclonación de la expresión). El ADN del vector de transferencia se cotransfectó en células de insecto Sf-9 adherentes cultivadas en el medio libre de proteínas E.SF921 (Expression Systems LLC, Woodland CA.) a 27 ºC con ADN vírico linealizado con BacPak6™ (BD Clontech, Palo Alto CA) y Bacfectin™ (BD Clontech) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El
patrón vírico P1 resultante se amplificó dos veces para producir el patrón vírico P3 usado para la producción de proteínas a gran escala. Las células Sf-9 cultivadas en suspensión en el medio ESF921 se infectaron con una densidad celular de 1 a 2 x 106 células/ml usando una multiplicidad estimada de infección (MOI) de 0,3 partículas virales por célula y se recolectaron 3-5 días después de la infección. Las células Sf-9 se eliminaron por centrifugación, la estirpe viral resultante se filtró para asegurar la esterilidad y se añadió un 3% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) para la estabilidad viral. Todas las estirpes virales se conservaron a 4 ºC. Se demostró que el patrón viral que contiene la construcción [101V-1]: 696.G40.V2.Notch 1.V1307-Q1733(NFlag).B9.1 infecta las células Sf-9 de forma eficaz y expresa la proteína recombinante.
[0452] La construcción [101V-1]: 696.G40.V2.Notch 1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1 se expresó en 2 realizaciones de fermentación en escala de 11 y 16 litros. Se usaron células Sf-9 adaptadas al crecimiento en suspensión en el medio libre de proteína para las realizaciones de fermentación. Las células se inocularon con una densidad de ~2 x 106 células/ml en un biorreactor de siembra con condiciones operativas similares en el recipiente de producción. Las fermentaciones se realizaron a 27 ºC en el medio ESF 921 y se controló el nivel de oxígeno disuelto a un 50% de saturación de aire usando oxígeno rociado a demanda y aeración frontal continua. Los biorreactores se operaron con una agitación de 100 rpm usando 2 impulsores de hoja inclinada o una paleta de hoja plana, dependiendo del recipiente usado. Las células se cultivaron al punto de infección, con una densidad de ~2,0 x a 2,7 x 106 células/ml, durante un período de 24 a 48 horas y después se infectaron a una MOI de 0,5 partículas virales/célula con el polipéptido de Notch 1 codificando la estirpe viral. Las células se controlaron por los signos de infección (cese del crecimiento, aumento del diámetro celular) y se cultivaron durante 65 a 72 horas más. El medio resultante se enfrió, se recolectó por centrifugación y se sometió a una purificación de proteína inmediata.
Purificación del inmunógeno que contiene NRR hNotch 1
[0453] Se diluyó el medio sobrenadante de las células SF9 que expresan los polipéptidos codificados por la construcción 696.G40.V2.Notch 1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1 (v/v = 1:4) con el tampón enfriado con hielo A (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM y fluoruro de fenilmetansulfonilo 0,5 mM) y el lote se unió durante 15-20 minutos a la resina superflow Ni-NTA preequilibrada (Qiagen, Producto Nº 30450) con una proparte de 2 ml de resina por litro de medio. La resina de afinidad Ni-NTA se recogió por filtración a través de un filtro de 0,8 !m (Nalgene, Producto Nº 450-0080) y posteriormente se metió en una columna de goteo por gravedad apropiada (d:h 1:10). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (VC) de tampón enfriado con hielo B (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 1000 mM, CaCl2 5 mM y imidazol v) seguido de 10 VC del tampón A sin PMSF. Después, la columna se eluyó con 5 VC de tampón A que contenía imidazol 250 mM (sin PMSF). La proteína eluida se concentró usando un concentrador Amicon Ultra (3.000 MWCO) y se intercambió el tampón con un tampón de almacenamiento (Hepes 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y CaCl2 5 mM) usando columnas PD-10 (GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se estimó que la pureza de la proteína era de >90% por SDS-PAGE con tinción de Coomassie. La concentración de la proteína purificada se calculó por el ensayo de Bradford (kit Coomassie Plus, Pierce, Cat. Nº 23236) usando BSA como estándar. Se usó la secuenciación peptídica por espectrometría de masas de un digesto tríptico de la proteína para confirmar la identidad.
NRR mNotch 1
[0454] El inmunógeno que contiene el NRR de Notch 1 de ratón (NRR mNotch 1) se obtuvo de la siguiente manera:
[0455] La secuencia que abarca los aminoácidos V1307 a Q1723 de Notch 1 de ratón (SEQ ID NO: 57) se subclonó y expresó generalmente como se ha descrito anteriormente para el inmunógeno de Notch 1 humano. Esta región de Notch 1 de ratón incluye las repeticiones 34-36 de EGF y extremos inmediatamente antes del dominio transmembrana. La construcción que expresa el inmunógeno se denomina como 64794.G1.Notch 1.V1307-Q1723 (N-Flag, C-His).pRK5-GNE. La secuencia aminoacídica de la proteína expresada para el inmunógeno usado para generar anticuerpos contra la NRR de Notch 1 de ratón es como se indica a continuación, y contiene una etiqueta FLAG N-terminal y una etiqueta His C-terminal:
[0456] El extremo N de la secuencia anterior (aminoácidos MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRG de la SEQ ID NO: 14) se retira por escisión por las células que expresan la proteína. Como tal, el inmunógeno usado para generar anticuerpos específicos de NRR de Notch 1 de ratón carece de esta secuencia N-terminal.
Producción de proteína
[0457] La construcción que codifica los aminoácidos V1307-Q1723 de Notch 1 de ratón se expresó de forma transitoria en células Freestyle 293-F que se han adaptado para un cultivo en suspensión libre de suero (Células FreeStyle 293-F Invitrogen catálogo Nº R790-07).
[0458] Las células se cultivaron en medio de expresión GIBCO® FreeStyle 293 (Invitrogen catálogo Nº 12338018). Las células se mantuvieron a una densidad de 0,3 a 3 x 106 células viables/ml en un matraz de agitación incubado a 37 ºC en una atmósfera humidificada de CO2 al 8% en una plataforma agitadora orbital que gira a 125 rpm. El día antes de la transfección se sembraron las células a una densidad de 5 x 105 células viables/ml. El día de la transfección, se examinaron las células para determinar su viabilidad y densidad (>90% y 1 x 106 células/ml). Para cada transfección, se preparó un complejo de lípidos-ADN como se indica a continuación: Para 500 ml de células en 1 x 106 células/ml, se añadieron lentamente 500 !g de ADN plasmídico a 40 ml de Opti-MEM® I (Invitrogen catálogo Nº 51985-034), 500 ul de polietilenimina 1,5 !g/ml de solución (PEI Polietilenimina, Lineal, PM 25.000 Polysciences catálogo Nº 9002-98-6). La mezcla se mezcló suavemente y se incubó durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se forme el complejo de lípidos-ADN. Después, el complejo ADN-lípidos se añadió lentamente a las células y se incubó durante 3 días antes de la recolección del medio.
[0459] La construcción de mNotch 1 se expresó en dos realizaciones de 1 litro. Las células se transfectaron a una densidad de 0,9 a 1 x 106 células/ml, el medio se recolectó 65 a 75 horas después cuando las células tenían una densidad de 2,2 a 2,5 x 106/ml y una viabilidad del 75 al 78%.
[0460] El medio resultante se enfrió, se recolectó por centrifugación y se usó inmediatamente para la purificación del polipéptido de Notch 1 de ratón que contenía la NRR.
Purificación del inmunógeno que contiene NRR mNotch 1
[0461] El inmunógeno se purificó a partir del medio secretado HEK 293 en modo discontinuo usando agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich; producto Nº A2220). Se añadió agarosa anti-FLAG M2 en el tampón B (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM) al medio secretado que contenía el producto Completo sin inhibidores de proteasa EDTA (20 comprimidos por litro de medio, Roche) en una proparte de 5 ml de agarosa por litro de medio. Después, el medio se incubó a 4 ºC con rotación constante durante 3 horas. Se recogió agarosa anti-FLAG por filtración a través de un filtro de 0,8 !m (Nalgene, producto Nº 450-0080) y se metió en una columna de flujo de gravedad (BioRad, producto Nº 731-0003). Se lavó la agarosa con 10 volúmenes de columna del tampón B y la proteína se eluyó posteriormente con 4 volúmenes de columna de 0,1 mg/ml de péptido FLAG (Sigma-Aldrich, producto Nº F3290) en el tampón B. El polipéptido de Notch 1 de ratón eluido se concentró en un concentrador Amicon Ultra (10.000 MWCO, Millipore, producto Nº UFC 901096) y el tampón se intercambió con el tampón de almacenamiento (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, glicerol al 5%) usando columnas PD-10 (GE Healthsciences, producto Nº 17-0851-01). Se estimó que pureza era >92% por HPLC de fase reversa. La concentración se determinó por un ensayo de Bradford (kit Coomassie Plus, Pierce, producto Nº 23236) usando BSA como un estándar. La identificación de la proteína se confirmó por secuenciación peptídica de un digesto tríptico de
proteína por espectrometría de masas.
Ejemplo 2: Generación de Anticuerpos anti-NRR de Notch 1
Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 se generaron como se indica a continuación.
Clasificación y Selección de Biblioteca para Identificar los Anticuerpos anti-NRR de Notch 1
[0462] Se usó el inmunógeno proteico de NRR de Notch 1 humano (como se ha descrito anteriormente) como antígeno. Las inmunoplacas de 96 pocillos Nunc Maxisorp se recubrieron durante una noche a 4 ºC con el antígeno diana (10 !g/ml) y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con el tampón de bloqueo de fagos PBST (solución salina tamponada con fosfato (PBS) y albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y Tween-20 al 0,05% (v/v)). Se añadieron las bibliotecas fagos del anticuerpo que muestran fragmentos Fab (véase, por ejemplo, Lee y col., J. Immunol. Meth. 284: 119-132, 2004) a las placas de antígenos y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. El día siguiente las placas recubiertas con antígeno se lavaron diez veces con PBT (PBS con Tween-20 al 0,05%), y los fagos unidos se eluyeron con HCl 50 mM y NaCl 500 mM durante 30 minutos y se neutralizaron con un volumen igual de base Tris 1 M (pH 7,5). Los fagos recuperados se amplificaron en células de
E. coli XL-1 Blue. Durante las rondas de selección posteriores, la incubación de los fagos de anticuerpo con las placas recubiertas con antígeno se redujo a 2-3 horas y aumentó gradualmente la rigurosidad del lavado de la placa.
[0463] Después de 4 rondas de separación, se observó un enriquecimiento significativo. Se eligieron 190 clones para determinar si se unen específicamente a NRR de Notch 1 humano y las regiones variables de los 190 clones se secuenciaron por PCR para identificar clones de secuencia única.
[0464] Para identificar los anticuerpos de fagos que se unieron a NRR de Notch 1 humano y murino, todos los clones únicos se examinaron para determinar la unión a Notch 1 humano y murino por ELISA. Las afinidades de los anticuerpos de fago se clasificaron usando ELISA de competición puntual individual como se describe a continuación en este Ejemplo. Los valores de CI50 del anticuerpo de fago se determinaron adicionalmente usando ELISA de unión a fagos competitivo descrito esencialmente en Lee, C. V., y col. (2004) J Mol Biol 340, 1073-93. En resumen, las inmunoplacas de 96 pocillos NUNC Maxisorp se recubrieron durante una noche a 4 ºC con 1 !g/ml de NRR1 humano o NRR1 murino y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo PBST (PBS y BSA al 1% y Tween 20 al 0,05%). El fago se mezcló con diluciones seriadas de dilución NRR1 humano o murino a temperatura ambiente durante 1 hora antes de añadir la mezcla a la placa recubierta con NRR1 humano y murino. Se detectaron los fagos unidos con conjugados anti-M13 HRP, se desarrollaron con sustrato TMB durante aproximadamente 5 minutos, se inactivaron con H3PO4 1 M, y se leyeron por espectrofotometría a 450 nm. Las curvas de competición se ajustaron con un programa de ajuste de curvas de regresión no lineal de cuatro parámetros (Kaleidagraph, Synergy Software) para determinar los valores de CI50 que se calcularon como la concentración de antígeno en la fase de unión de solución que inhibió el 50% del anticuerpo desplegado en el fago a partir de la unión al antígeno inmovilizado.
[0465] Los anticuerpos A, B y C se reformatearon en IgG mediante la clonación de las regiones VL y VH de los clones individuales en los vectores LPG3 y LPG4 respectivamente, mediante la expresión de forma transitoria en células de mamífero CHO y mediante la purificaron con una columna de proteína A. Estos clones se examinaron para determinar la reactividad cruzada con uno o más de los NRR Notch2, NRR Notch3 y NRR Notch4 humanos y murinos, y para bloquear la actividad usando el ensayo de cocultivo descrito en el Ejemplo 5. Los resultados de esta caracterización se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Caracterización de IgG anti-NRR de Notch 1
Anticuerpo anti-NRR de Notch 1
Unión de NRR1 humano/ratón Unión de NRR2 humano/ratón Unión de NRR3 humano/ratón Unión de NRR4 humano/ratón Bloqueo de cocultivo
Anticuerpo B
Sí No ND ND Débil
Anticuerpo A
Sí No No No Fuerte*
Anticuerpo C
Sí No ND ND Débil
*CI50 ~100 ng/ml ND = No Determinado
Bibliotecas de Construcción para Mejora de la Afinidad de los Clones Derivados de la Biblioteca de VH
[0466] El anticuerpo A se seleccionó para la mejora de la afinidad. El fagémido pW0703 (derivado del plásmido pV0350-2b (Lee y col., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)), que contenía el codón de detención (TAA) en todas las posiciones CDR-L3 y que mostraban Fab monovalente en la superficie del bacteriófago M13) sirvió como plantilla de la biblioteca para injertar dominios variables de cadena pesada (VH) de los clones de interés de la biblioteca de VH para la maduración de afinidad. Se usaron tanto estrategias de aleatorización severas como leves para la maduración de afinidad. Para la aleatorización severa, se aleatorizó una biblioteca de cadena ligera con posiciones seleccionadas de las tres CDR de cadena ligera usando aminoácidos diseñados para simular anticuerpos humanos naturales y la degeneración del ADN diseñada fue como se describe en Lee y col. (J Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)). Para la aleatorización leve, se dirigieron residuos a las posiciones 91-94 y 96 de CDR-L3, 28-31 y 34-35 de CDR-H1, 50, 52, y 53-58 de CDR-H2, 95-99 y 100A de CDR-H3; y se seleccionaron dos combinaciones diferentes de los bucles de CDR, L3/H1/H2 y L3/H3, para la aleatorización. Para obtener estas condiciones de aleatorización leve, que introdujeron la tasa de mutación de aproximadamente el 50% en las posiciones seleccionadas, se sintetizó ADN mutagénico con mezclas de bases de 70-10-10-10 que favorecen los nucleótidos de tipo natural (Gallop y col., Journal of Medicinal Chemistry 37: 1233-1251 (1994)).
Estrategia de Clasificación de Fagos para Generar la Mejora de la Afinidad
[0467] Para la selección de mejora de la afinidad, las bibliotecas de fagos se sometieron a la clasificación en placa para la primera ronda, seguida de tres rondas de clasificación de la solución. En la primera ronda de la clasificación en placa, se clasificaron tres bibliotecas contra la placa recubierta con (NRR de Notch 1-ECD humano) diana (placa NUNC Maxisorp) de forma separada con una entrada de fagos de aproximadamente 3 D.O./ml en BSA al 1% y Tween 20 al 0,05% durante 2 horas a 37 ºC. Después de la primera ronda de clasificación en placa, se realizaron de tres a cuatro rondas de clasificación de la solución para aumentar la rigurosidad de la selección. Para la clasificación de la solución, se incubó 1 O.D/ml de fagos propagados de la primera ronda de clasificación en placa con 20 nM de proteína diana biotinilada (aquí la concentración se basa en el valor de CI50 del fago del clon progenitor) en 100 !l de tampón que contenía Superblock al 1% (Pierce Biotechnology) y Tween 20 al 0,05% durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó adicionalmente 10 x con Superblock al 1%, y se aplicaron 100 !l/pocillo a los pocillos recubiertos con neutravidina (5 !g/ml) durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave de tal forma que se biotiniló el fago unido a diana. Los pocillos se lavaron diez veces con PBS-Tween 20 al 0,05%. Para determinar la unión del fondo, los pocillos control que contenían fagos con dianas que no se biotinilaron se capturaron en placas recubiertas con neutravidina. El fago unido se eluyó con HCl 0,1 N durante 20 minutos, se neutralizó con un volumen de 1/10 de Tris 1 M a pH 11, se tituló y se propagó para la próxima ronda. A continuación, se realizaron dos o tres rondas de clasificación de la solución junto con dos procedimientos de aumento de la rigurosidad de la selección. El primero de los cuales es por la selección de asociación mediante la disminución de la concentración de la proteína diana biotinilada de 2 nM a 0,1 nM, y el segundo de los cuales es la selección de disociación mediante la adición de cantidades en exceso de proteína diana no biotinilada (100~1000 veces más) para competir con los aglutinantes más débiles. Asimismo, disminuyó el ingreso de fagos (0,1~0,5 D.O./ml) para reducir la unión de fagos de fondo.
ELISA de Selección de Afinidad de Alto Rendimiento (Competitivo puntual)
[0468] Se seleccionaron colonias de las pruebas de la tercera y la cuarta rondas y se cultivaron durante una noche a 37 ºC en 150 !l/pocillo del medio 2YT con 50 !g/ml de carbenicilina y 1E10/ml K07 en placas de 96 pocillos (Falcon). De la misma placa se eligió una colonia de fagos progenitora infectada con XL-1 como control. Las placas Nunc Maxisorp de 96 pocillos se recubrieron con 100 !l/pocillo de la proteína diana (2 !g/ml) en PBS a 4 ºC durante una noche a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se bloquearon con 65 !l de BSA al 1% durante 30 min y 40 !l de Tween al 1% durante 30 minutos más.
[0469] El sobrenadante del fago se diluyó 1:10 en tampón ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) (PBS con BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%) con o sin proteína diana 10 nM en 100 !l de volumen total y se incubó al menos durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa F (NUNC). Se transfirieron 75 !l de una mezcla con o sin proteína diana conjuntamente a las placas recubiertas con proteína diana. La placa se agitó suavemente durante 15 min para permitir la captura del fago no unido a la placa recubierta con la proteína diana. La placa se lavó al menos cinco veces con PBS-Tween 20 al 0,05%. Se cuantificó la unión añadiendo el anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) en tampón ELISA (1:5000) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron al menos cinco veces con PBS-Tween 20 al 0,05%. A continuación, se añadieron 100 !l/pocillo de una relación 1:1 de sustrato de peroxidasa 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y solución de Peroxidasa B (H2O2) (Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) al pocillo y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 100 !l de ácido fosfórico 1 M (H3PO4) a cada pocillo y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la DO (densidad óptica) del color amarillo en cada pocillo usando un lector de placas ELISA estándar a 450 nm. Se calculó la reducción de DO (%) por la siguiente ecuación.
% de reducción de DO450 nm = [(DO450 nm de pocillos con competidor)/(DO450 nm de pocillo sin competidor)]*100
[0470] En la comparación de la reducción de DO450 nm (%) del pocillo del fago precursor (100%), se seleccionaron clones que tenían la reducción de DO450 nm (%) menor del 50% para el análisis de secuencia. Se seleccionaron clones únicos para la preparación de fagos para determinar la afinidad de unión (CI50 del fago) por la comparación con los clones precursores (Tabla 4).
Tabla 4: Caracterización de clones de anticuerpos de afinidad madura
Nombre del Clon
Cambios de CDR CI50 del fago (nM) Bloqueo del co-cultivo
NRR1 Humana
NRR1 de Ratón
Anticuerpo A-1
L3/H2 0,8 0,6 +
Anticuerpo A-2
L3/H2 0,5 0,5 +
Anticuerpo A-3
L3/H2 0,5 2,5 +
NRR1 = NRR de Notch 1
Ejemplo 3: Caracterización de Anticuerpos anti-NRR de Notch 1
5 [0471] Para caracterizar adicionalmente la afinidad de unión y cinética de unión de los Mab anti-NRR de Notch 1, se usó la medición de resonancia de plasmón superficial (SRP) con un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). En resumen, se activaron chips de biodetectores carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etilN'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del
10 proveedor. Se diluyó anticuerpo anti-humano de conejo (Pierce) con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, en 20 !g/ml antes de la inyección a un caudal de 5 !l/minuto para obtener aproximadamente 3000 unidades de respuesta (UR) del anticuerpo acoplado. Después, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reactivos. Se capturó mab anti-NRR1 (formateado como IgG de longitud completa) con IgG anti-humana de conejo recubierto en los chips para obtener aproximadamente 200 unidades de respuesta (UR). Para las mediciones cinéticas, se inyectaron
15 diluciones seriadas dos veces de proteínas de NRR1-ECD humano o NRR1-ECD murino (de 3,9 nM a 500 nM) en tampón PBT (PBS con Tween 20 al 0,05%) a 25 ºC con un caudal de 30 !l/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calcularon usando el modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2). La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la proparte kon/koff.
20 [0472] Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 5. "NA" significa que no se realizó la medición.
Tabla 5: Afinidad de unión y cinética de unión de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 para NRR de Notch 1 humano y murino que contienen polipéptidos. 25
Anticuerpo Anti-NRR de Notch 1
NRR de Notch 1 de ratón NRR de Notch 1 humano
kon(1/ms)
koff/(1/s) Kd(M) kon(1/ms) koff/(1/s) Kd(M)
Anticuerpo A
9,10E+04 2,10E-02 2,31 E-07 8,20E+04 1,10E-02 1,34E-07
Anticuerpo A-1
8,50E+04 3,30E-04 3,88E-09 6,70E+04 2,30E-04 3,43E-09
Anticuerpo A-2
1,10E+05 3,40E-04 3,09E-09 8,70E+04 2,20E-04 2,53E-09
Anticuerpo A-3
9,20E+04 1,20E-03 1,30E-08 6,80E+04 4,00E-04 5,88E-09
Ejemplo 4: Caracterización del Epítopo de Anticuerpos anti-NRR de Notch 1
[0473] Para examinar el determinante de unión de los Anticuerpos A, A-1 y A-2, se realizaron experimentos de 30 unión usando fragmentos de Notch 1 humanos y de ratón.
[0474] Se usaron las siguientes proteínas en estos experimentos:
(1) hFLAG-EGF34+NRR-His6 (101V): el inmunógeno de Notch 1 humano descrito en el Ejemplo 1, anteriormente. 35
(2) hFLAG-NRR-His6 (102V): contiene los aminoácidos E1447-Q1733 de Notch 1 humano, una etiqueta FLAG, una etiqueta HIS y un sitio de escisión de trombina. La parte de Notch 1 incluye las secuencias de LNR_A, LNR_B, LNR_C, HD_N, HD_C. Esta proteína no incluye ninguna de las secuencias de repetición tipo EGF.
40 (3) hFLAG-HD-His6 (103V): contiene los aminoácidos R1568 a Q1733 de Notch 1 humano, una etiqueta FLAG, un sitio de escisión de trombina y una etiqueta HIS. La parte de Notch 1 incluye las secuencias de HD_N y HD_C. Esta proteína no contiene ninguna de las secuencias de repetición tipo EGF y no contiene las tres regiones LNR.
(4) mFLAG-EGF34+NRR-His6: el inmunógeno murino, se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente. 45
(5) mEGF34+NRR-L1597H-FLAG-TEV-Fc: contiene los aminoácidos V1307 a Q1723 de Notch 1 de ratón con una mutación L1597H, una etiqueta FLAG, una etiqueta Fc y un sitio de proteasas TEV. La mutación L1597H da como resultado la activación de Notch 1, y se describe en, por ejemplo, Weng y col., Science 306: 269-271, 2004.
50 (6) Control de Flag: es un polipéptido de control que comprende una etiqueta FLAG.
(7) Control de His: es un polipéptido de control que comprende una etiqueta HIS.
Protocolo ELISA:
[0475] 1 !g/ml de proteínas en PBS, pH 7,4 se recubrieron sobre placas ELISA (Nunc Maxisorp) a 4 ºC durante la noche. Las placas se bloquearon con bloqueador de Caseína en PBS (solución salina tamponada con fosfato; Pierce) durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron diluciones seriadas tres veces de IgG anti-NRR de Notch 1 o IgG irrelevantes en tampón PBST (tampón PBT (PBS + de Tween 20 al 0,05% (v/v)) con BSA al 0,5% (p/v)) a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron con PBST y se detectaron anticuerpos unidos con IgG específica de Fab anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa (Sigma). Se usó el sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) y se leyó la absorbancia a 650 nM usando un lector de placas ELISA estándar. La absorbancia se representó gráficamente frente a concentraciones de IgG usando KaleidaGraph (Synergy Software).
[0476] El resultado de este experimento se muestra en las figuras 12A (Anticuerpo A-hlgG1), 12B (Anticuerpo A-1hlgG1) y 12C (Anticuerpo A-2-hIgG1). Los anticuerpos A, A-1 y A-2 se unieron a los polipéptidos hFLAGEGF34+NRR-His6 (101V), hFLAG-NRR-His6 (102V), hFLAG-HD-His6 (103V), mFLAG-EGF34 +NRR-His6 y no se unieron a los polipéptidos de control que carecían de las secuencias de Notch 1. Estos resultados demuestran que el dominio de NRR de Notch 1 es suficiente para la unión del Anticuerpo A, el Anticuerpo A-1 y el Anticuerpo A-2. Los anticuerpos A, A-1 y A-2 también se unieron a mEGF34+NRR-L1597H-FLAG-TEV-Fc, que contiene la mutación activadora de Notch 1 L1597H. Este resultado demuestra que los anticuerpos son capaces de unirse a un receptor de Notch 1 mutante.
Ejemplo 5: Ensayos Funcionales para los Anticuerpos Anti-NRR de Notch 1
Ensayo del Indicador Notch 1
[0477] Se realizó un ensayo del indicador Notch 1 (también denominado "ensayo de cocultivo" en el presente documento) para medir la capacidad de un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para inhibir la señalización de Notch. En resumen, el ensayo incluyó los siguientes pasos:
(1)
Las células NIH-3T3 que expresan Notch 1 humano se transfectaron con un plásmido indicador con luciferasa que responde a la señalización de Notch;
(2)
Las células se trataron con anticuerpos o diversos reactivos de control;
(3)
La señalización se inició con la adición de células NIH-3T3 que expresan de forma estable Jagged1 humano; y
(4)
Se evaluó el nivel de señalización de Notch por la medición de la actividad de luciferasa, expresada a partir del plásmido indicador.
[0478] En más detalle, el ensayo se realizó como se indica a continuación:
(1)
Las células NIH-3T3 que expresan de forma estable Notch 1 humano (N1) se pusieron en una placa de pared negra de 96 pocillos transparentes a razón de 5000 células por pocillo en un medio DMEM rico en glucosa que contenía FBS al 10% y sin antibióticos. Las células se incubaron a 37 ºC durante 16 horas con el 5% de CO2. Después, el medio se cambió a DMEM sin suero, y las células se transfectaron con 100 ng/pocillo de un plásmido de luciferasa TP-1 (promotor CSL, que responde a la activación de Notch) (véase, por ejemplo, Minoguchi y col., Mol. Cell. Biol. 17: 2679-2687 (1997)) y 5 ng/ml del indicador de luciferasa pRL-CMV Renilla (Promega). La transfección continuó durante 6 horas a 37 ºC, al 5% de CO2 con suero añadido de nuevo al comienzo de la hora 4.
(2)
Al final de la hora seis, el medio que contenía los reactivos de transfección se eliminó por aspiración, y se añadieron 50 !l de DMEM/FBS con los siguientes: A. Medio fresco (después de recibir las células precursoras NIH3T3 de control para una estimulación simulada); B. Medio fresco (DMEM con FBS al 10%); C. Anticuerpo de control del isotipo de IgG humana a 400 ng/ml; anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A a cuatro concentraciones diferentes (D. 16 ng/ml, E. 80 ng/ml, F. 400 ng/ml, G. 2000 ng/ml); H. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A a 400 ng/ml preincubado con proteína NRR de Notch 1 purificada (5 !g por pocillo) durante 30 minutos; I. Anticuerpo de control del isotipo de IgG humana a 400 ng/ml con proteína NRR de Notch 1 tratada como en H; J. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 A a 400 ng/ml preincubado durante 30 minutos con proteína BSA añadida de nuevo (6,5 !g/pocillo); K. Compuesto E (un inhibidor de gamma-secretasa; C27H24F2N4O3; Seiffert y col., J. Biol. Chem. 275: 34086, 2000) a 1 !M; y L. Control de DMSO (solo solvente del Compuesto E). Los reactivos que se han enumerado anteriormente se incubaron con las células NIH-3T3-Notch 1 transfectadas durante 1 hora a 37 ºC, CO2 al 5%.
[0479] A cada pocillo se le añadieron 5000 células NIH-3T3 que expresaban de forma estable el ligando Jagged I humano, excepto en J, en el que las células eran la línea precursora de NIH-3T3. Después, la placa se incubó a 37 ºC, CO2 al 5% durante 23 horas.
[0480] Se midieron las actividades de luciferasa de Firefly (TP1) y de renilla (pRL-CMV) con el kit Dual-Glo Luciferasa (Promega). Se calcularon los niveles de señalización de Notch por la división de la lectura de Firefly por la lectura de Renilla y el promedio de 8 duplicados de cada condición. Los resultados se muestran en la figura 7, donde las barras de error representan la desviación típica de los duplicados.
[0481] Como se muestra en la figura 7, el Anticuerpo A es un potente inhibidor de Notch 1. El anticuerpo A inhibe la señalización de Notch, medida mediante el indicador TP1-Luc. Se muestra una titulación del anticuerpo; a 400 ng/ml de anticuerpo, se inhibió la señalización de Notch al 18% del control, nivel de "asociación" (el nivel de señalización observado usando el control del isotipo a 400 ng/ml). La adición adicional de la proteína NRR soluble, pero el control de BSA, liberó el bloqueo inducido por el anticuerpo de la señalización, lo que demuestra que la inhibición de la señalización del anticuerpo se debió a una interacción de la NRR de Notch 1 del anticuerpo. El compuesto E, un inhibidor de gamma-secretasa, se usó como control para demostrar la inhibición. Como otro control, el reemplazo de las células que expresan Jagged1 con células precusoras (NIH-3T3 solas, no Jagged1), fracasó para inducir la señalización completa, lo que demuestra que la señalización requiere Jagged1.
[0482] El procedimiento del ensayo del cocultivo que se ha usado anteriormente se usó para comparar el Anticuerpo A con sus contrapartes de afinidad madura Anticuerpo A-1, Anticuerpo A-2 y Anticuerpo A-3, con tratamiento en varias concentraciones. Como se demostró a 80 ng/ml de anticuerpo, el Anticuerpo A-2 y el Anticuerpo A-3 mostraron un bloqueo más potente de la señalización de Notch que el Anticuerpo A (figura 8).
Ensayo de Diferenciación de Mioblastos C2C12
[0483] Los mioblastos de ratón C2C12 se diferencian en miotubos cuando se tratan con un medio de diferenciación. El cocultivo con células que expresan el ligando Jagged1 inhibe la diferenciación mediante la estimulación de la señalización de Notch. Como se detalla a continuación, de forma compatible con la capacidad del Anticuerpo A de inhibir la señalización de Notch 1, la adición del Anticuerpo A restauró la diferenciación. Como control, un inhibidor de gamma secretasa también restauró la diferenciación.
[0484] En particular, las células de mioblastos de ratón C2C12 se pusieron en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos con un cubreobjetos redondo estéril de 10 mm en el fondo a razón de 2,5 x 104 células por ml, usando 1 ml por pocillo. Las células se dejaron fijar y se cultivaron durante 22 horas en un medio de crecimiento (DMEM con FBS al 10%) a 37 ºC, CO2 al 5%. Después, el medio de crecimiento se aspiró y se añadió medio de diferenciación (DM) (DMEM con suero de caballo al 6%). Las células se trataron con: A. DM solo; B. DM con células 3T3-J1; C. DM con NIH-3T3-Jagged1 y anticuerpo de control de isotipo de IgG humana, D. DM con células 3T3-J1 y Anticuerpo A a 200 ng/ml; E. DM con células MH-3T3-Jagged1 y DMSO (vehículo); F. DM con células 3T3-J1 y Compuesto E (inhibidor de gamma-secretasa) a 1 uM. Las células se incubaron a 37 ºC, CO2 al 5% en estas condiciones durante cuatro días. Se recuperaron los cubreobjetos y las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,2% en PBS. Después, las células se bloquearon con FBS al 10% en PBS. Un anticuerpo que reconoce la cadena pesada de miosina (Millipore, Anti-Myosin HC, clon A4.1025 ascitis) y se usó un anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con Alexa® 488 (Molecular Probes) para teñir los miotubos diferenciados. Se usó DAPI como coloración de contraste para los núcleos. Se tomaron imágenes de tres campos diferentes para cada condición. Un subconjunto de las imágenes se muestra en la figura 10. Se usó el software Metamorph (Molecular Devices) para contar el número de núcleos y el área de tinción de Alexa® 488. El área de tinción de Alexa® 488 se dividió por el número de núcleos, se promedió y se representó gráficamente. Las barras de error representan la desviación típica de las imágenes triplicadas. Estos resultaos se muestran en la figura 9.
Ejemplo 6: Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 inhiben la señalización por los receptores Notch 1 de tipo natural y mutantes
[0485] Se realizó un ensayo de cocultivo del indicador de luciferasa usando células NIH-3T3 que se transfectaron de forma transitoria con los plásmidos TP-1 y pRL-CMV que codifican el receptor de Notch 1 mutante L1594P, receptor de Notch 1 mutante DelPEST y el receptor de Notch 1 de tipo natural (wt) usando Lipofectamina y Lipofectamina más Reactivo (Invitrogen), y células NIH-3T3 que expresan de forma estable Jagged-1 humano, esencialmente como se ha descrito anteriormente. La mutación L1594P representa una mutación de leucina a prolina en el aminoácido (aa) 1594 del dominio HD-N (véase, por ejemplo, Weng y col., Science 306: 269-271, 2004). DelPEST representa una supresión de carboxilo terminal en el dominio de PEST que comienza en el aa 2473 (véase, por ejemplo, Malecki y col., Mol. Cell. Biol. 26: 4642-4651, 2006). De forma coherente con los resultados publicados, los resultados mostrados en la figura 13 confirman que ambas mutaciones L1594P y DelPEST activan la señalización de Notch 1. Con respecto al control negativo que usa un anticuerpo monoclonal irrelevante derivado de fago del mismo isotipo, el Anticuerpo A inhibió la señalización a través de cada uno de los tres receptores de forma dependiente de la dosis. El Compuesto E inhibidor de gamma secretasa (CmpE), disuelto en DMSO, se usó como control positivo para la inhibición de la señalización de Notch. Las barras sólidas de color negro muestran los resultados obtenidos usando un anticuerpo control a 2000 ng/ml; las barras de puntos gruesos muestran los resultados obtenidos usando el Anticuerpo A a 80 ng/ml; las barras de rayas finas muestran los resultados obtenidos usando el Anticuerpo A a 400 ng/ml; las barras de rayas gruesas muestran los resultados obtenidos usando el Anticuerpo A a 2000 ng/ml; las barras con rayas cruzadas muestran los resultados obtenidos usando el compuesto E a 10 !M; y las barras de punteado fino muestran los resultados obtenidos usando DMSO (el vehículo para el compuesto E). Los resultados de cada condición se midieron en ocho réplicas y después se expresaron como el valor medio con las barras de error indicando la desviación típica.
Ejemplo 7: Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 alteran la vascularización y la angiogénesis
[0486] Se investigó el efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 sobre la vascularización y la angiogénesis usando un ensayo de brote regenerativo de células HUVEC. Este ensayo es similar al descrito por Nakatsu y col. (Microvasc. Res. 66 (2): 102-12, 2003). Las células HUVEC se recubrieron sobre microesferas Cytodex 3® (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey), que después se implantaron en un gel de fibrina. Los fibroblastos de piel humana se pusieron en placas sobre una capa de gel de fibrina, que después se cubrió con medio de cultivo tisular. Se examinó la generación de vasos de las células HUVEC 4 a 9 días después. De forma similar a los resultados observados para el tratamiento con anti-DH4, el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 causó un notable aumento de la regeneración y longitud de los vasos, como se muestra en la figura 14A. Los resultados se muestran para las células tratadas con PBS como control o con el Anticuerpo A o A-2, como se indicó. La anti-NRR de Notch 1 altera la vascularización y la angiogénesis aumentando la regeneración de vasos y la densidad de la red vascular.
[0487] El efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 en la vascularización y la angiogénesis también se investigó usando un ensayo de la angiogénesis en el bolsillo corneano. Como se indica por el protocolo resumido en la figura 14B, se implantaron córneas de roedores, que son normalmente avasculares, con un gránulo de VEGF (#63, #132 y #390) para inducir la angiogénesis o se dejaron sin tratar como control negativo (#381). Posteriormente se trataron dos córneas con anti-D114 como control positivo para determinar el aumento en la densidad de la red vascular (#132) o con el Anticuerpo A-2 (#390). Los vasos se visualizaron con una técnica de tinción inmunofluorescente basada en anti-CD31 (rojo). Como se muestra en la figura 14B, el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 aumentó significativamente la densidad de la red vascular. Los vasos de las córneas tratadas como se ha descrito anteriormente en la figura 14B también se perfundieron con FITC-dextrano (verde) para evaluar el flujo a través de los vasos. La perfusión a través de los vasos tratados con anti-D114 y anti-NRR de Notch 1 fue restringida, como se muestra en la figura 14C.
[0488] También se investigó el efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 en un modelo de angiogénesis en retina de ratón. Como se indica por el protocolo resumido en la figura 14D, se trataron retinas de ratón de P1 (día posnatal 1) o P3 (día posnatal 3) con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-ambrosía como control negativo o el Anticuerpo A-2. Se recogieron las retinas en P5 (día posnatal 5). Se usó isolectina B4 para visualizar la vasculatura. De acuerdo con los resultados mostrados en las figuras 14A-14C, el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 aumentó la densidad de la vasculatura y generó un fenotipo de hiperformación de brote. Las retinas de ratón tratadas como se ha descrito anteriormente para la figura 14D se tiñeron con DAPI para visualizar el ADN nuclear. Como se muestra en la figura 14E, el tratamiento con anti-NRR de Notch 1 produjo un aumento de la cantidad de núcleos, lo que sugiere un posible aumento de la proliferación.
Ejemplo 8: Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 inhiben el crecimiento tumoral in vivo
[0489] Se investigó el efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 sobre el crecimiento tumoral usando un modelo de ratón in vivo. Se usaron ratones inmunodeficientes (Balb-C Nu/Nu) en un estudio de xenoinjerto con la línea celular HM7 (adenocarcinoma de colon). Se implantaron cinco millones de células en 0,1 ml de Matrigel (BD Biosciences, San José, California), que se usó para inocular a los ratones por vía subcutánea. Los tumores se dejaron crecer aproximadamente 250-300 milímetros cúbicos antes de que los ratones se agruparan al azar en cada una de las tres clases de tratamiento para comenzar la dosificación, como se indicó. El tratamiento con el Anticuerpo A-2 frenó el crecimiento tumoral, como se muestra en la figura 15A. El anti-ambrosía y anti-VEGF actúan como controles negativo y positivo, respectivamente. En un experimento similar al que se ha descrito anteriormente para la figura 15A, se ensayaron diversas dosis de Anticuerpo A-2 para determinar la capacidad de detener o ralentizar el crecimiento del tumor. Los resultados se muestran en la figura 15B. En un experimento similar al que se ha descrito anteriormente para la figura 15A, excepto que se usó la línea celular CALU6 (línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas) en lugar de la línea celular HM7, se descubrió que el anticuerpo A-2 aumenta el volumen del tumor, como se muestra en la figura 15C. Tomados en conjunto, los resultados mostrados en las figuras 15A-15C indican que los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 inhiben el crecimiento del tumor.
[0490] En un experimento similar al que se ha descrito anteriormente para la figura 15B, se descubrió que el tratamiento con el Anticuerpo A-2 produce pérdida de peso de forma dependiente de la dosis, como se muestra en la figura 15D. En un experimento similar al que se ha descrito anteriormente para la figura 15B, se examinó el aclaración del Anticuerpo A-2 por la medición de la concentración de Fc humano en el suero de ratones tratados en los puntos de tiempo indicados. Los resultados se muestran en la figura 15E.
Ejemplo 9: Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 afectan a la proliferación y diferenciación de las células intestinales
[0491] Se investigó el efecto de los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 sobre las células del tracto intestinal de ratones. Se aislaron intestinos de ratones de control (vehículo) y tratados después de aproximadamente 10 días de dosificación con el Anticuerpo A-2 cada tres a cuatro días. Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina, más Azul Alcián para la mucina (azul, como marcador de células secretoras) o anti-Ki-67 (marrón; procedimiento de tinción inmunohistoquímica basada en anticuerpos), para la proteína marcadora proliferativa usada comúnmente, Ki
67. Las figuras 16A y 16B muestran ejemplos de criptas y vellosidades de los intestinos delgados o intestinos gruesos, respectivamente, de los ratones tratados con un anticuerpo de control (vehículo) o con el Anticuerpo A-2 en la concentración indicada. Los resultados muestran que anti-NRR de Notch 1 detiene la proliferación de las células amplificadoras del tránsito y aumenta el número de células secretoras, incluyendo células caliciformes y de Paneth.
Ejemplo 10: Los anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y los inhibidores de gamma-secretasa disminuyen la viabilidad de ciertas líneas celulares cancerosas
[0492] Se examinaron los efectos de anti-NRR de Notch 1 y los inhibidores de gamma secretasa DAPT y el "Compuesto E" (CmpE) en un panel de líneas celulares cancerosas. Las líneas de células indicadas en la figura 17 (eje x) se cultivaron en presencia o ausencia del Anticuerpo A-2, DAPT, CpmE o DMSO (control, vehículo para los inhibidores de gamma-secretasa) como se indicó, y se evaluó la viabilidad de las células usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glon™ (Promega, Madison, WI). Este ensayo determina el número de células viables en el cultivo en base a la cuantificación de ATP presente, que es una indicación de células metabólicamente activas. Se cuantifica la luminiscencia como "unidades luminiscentes relativas" en la figura 17 (eje y). Como se muestra en la figura 17, MT-3, que se informa como una línea de carcinoma de mama y OVCAR-3, una línea celular de cáncer ovárico, mostró niveles de ATP reducidos, lo que indica una proliferación reducida y/o un aumento de muerte celular, después de la incubación en presencia de DAPT, CmpE o anti-NRR de Notch 1.
LISTA DE SECUENCIAS
[0493]
<110> Genentech, Inc. y col.
<120> Anticuerpos Anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos
<130> 50474/013WO3
<150> US 60/994.646
<151> 20/09/2007
<150> US 60/933.072
<151> 04/06/2007
<160> 65
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 1
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 2
<210> 3 10 <211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 15 <223> sintético
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20
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial
25
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<223> Sintético
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30
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<213> Artificial
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<212> PRT
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
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<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
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<223> sintético
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<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
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<223> Sintético
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<210> 11
<211> 9
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<213> Artificial
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<223> Sintético
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<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223>
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<223>
Sintético 10
<400> 20
15 <210> 21
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
<400> 21
<210> 22
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 22
15 <210> 23
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<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
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<223> Sintético 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
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<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
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<213> Artificial
<220>
<223> sintético 10
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<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
<400> 33
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<211> 87 <212> PRT
<213> Artificial
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<223> Sintético
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10
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<213> Artificial
15
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<223> Sintético
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20
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<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 36
5
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<213> Artificial
10
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Sintético 25
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<223>
Sintético 10
<400> 39
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<213> Artificial
20 <220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
15 <220>
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<213> Artificial
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40 <223> Sintético
<400> 46
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 47
<210> 48
<211> 62
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
15 <223> Sintético
<400> 48
25
<210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sintético
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cctgcgccgg cgggggcggc tccacg
26
35
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<220> <223> Sintético
<400> 50
cgattacaaa gatgacgatg acaagggctc tggtgtcatc aatggctgca aaggcaag
58
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<210> 51 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> sintético
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55
aattcctgcg ccggcggggg cggctccacg 30
<210> 52 <211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
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10
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<213> Artificial
15
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<223> Sintético
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20
<210> 54
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 30
<400> 54
<210> 55
<211> 1491
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 55
5 <210> 56
<211> 2555
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 56
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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<210> 58
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<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
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<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético 10
<400> 60
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<220>
<223> Sintético
10 <400> 61
<210> 62 15 <211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 20 <223> sintético
<400> 62
<210> 63
<213> Artificial
<220>
<223>
Sintético 10
<400> 63
<210> 65
<213> Artificial
<220>
<223>
Sintético 20
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
5
<220>
<223> Sintético
<400> 64
10
<400> 65

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Anticuerpo de anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 aislado, en el que dicho anticuerpo, cuando se une a dicha NRR de Notch 1, disminuye la señalización de Notch 1, y en el que dicha NRR de Notch 1 es una NRR de Notch 1 humana que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1735 de SEQ ID NO: 56, o una NRR de Notch 1 de ratón que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1725 de SEQ ID NO: 57.
  2. 2.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a la NRR de Notch 1 humana y a la NRR de Notch 1 de ratón.
  3. 3.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-7 o mayor.
  4. 4.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha unión es con (i) una Kd de 1 x 10-8 o mayor, o (ii) una Kd de 1 x 10-9 o mayor.
  5. 5.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:
    (a)
    al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región hipervariable (HVR) seleccionadas del grupo que consiste en:
    (i)
    HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en la que A1-A11 es RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7)
    (ii)
    HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en la que B1-B7 es SASFLYS (SEQ ID NO: 8)
    (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en la que C1-C9 es QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 9)
    (iv)
    HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en la que D1-D10 es GFTFSSYWIH (SEQ ID NO: 1)
    (v)
    HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en la que E1-E18 es ARINPSNGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2) y
    (vi)
    HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F14, en la que F1-F14 es ARGSGFRWVMDY (SEQ ID NO:6); y
    (b)
    al menos una HVR variante, en el que la secuencia de HVR variante comprende la sustitución de al menos un residuo de la secuencia representada en las SEQ ID NOS: 1-12.
  6. 6.
    Anticuerpo, según la reivindicación 5, en el que una variante de HVR-L3 comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: C3, C4, C5 y C8, en el que C3 es S o F, C4 es Y o F, C5 es T o S, y C8 es P o A o S; o en el que una variante de HVR-H2 comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: E6, E8, E10 y E11, en el que E6 es S o P o A, E8 es G o R, E10 es T o A o N, y E11 es N o H o Q o R.
  7. 7.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, o las cuatro de las siguientes:
    (i)
    una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1;
    (ii)
    una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, 3, 4 ó 5;
    (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6; y
    (iv) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 ó 12.
  8. 8. Anticuerpo, según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en el que cada una, en orden, comprende:
    (i)
    SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2, 6;
    (ii)
    SEQ ID NO: 7, 8, 10, 1, 3, 6;
    (iii) SEQ ID NO: 7, 8,11, 1, 4, 6; o
    (iv) SEQ ID NO: 7, 8, 12, 1, 5, 6.
  9. 9. Anticuerpo que (i) compite con un anticuerpo, según la reivindicación 8 para unirse a NRR de Notch 1,
    o (ii) se une al mismo epítopo en NRR de Notch 1 como un anticuerpo, según la reivindicación 8.
  10. 10.
    Anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el anticuerpo comprende (i) una secuencia de estructura, en el que al menos una parte de la secuencia de estructura es una secuencia de estructura consenso humana, (ii) una secuencia de estructura consenso del sub-grupo K humana, o (iii) una secuencia de estructura consenso del sub-grupo III humana de cadena pesada.
  11. 11.
    Anticuerpo, según la reivindicación 10(iii), en el que el anticuerpo comprende una sustitución en una o más de las posiciones 71, 73 ó 78, y en el que, opcionalmente, la sustitución es una o más de R71A, N73T o N78A.
  12. 12.
    Polinucleótido que codifica un anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
  13. 13.
    Vector que comprende el polinucleótido, según la reivindicación 12, en el que, el vector es un vector de expresión.
  14. 14.
    Célula huésped que comprende un vector, según la reivindicación 13, en la que, opcionalmente, la célula huésped es procariótica, eucariótica o de mamífero.
  15. 15.
    Procedimiento para preparar un anticuerpo anti-NRR de Notch 1, comprendiendo dicho procedimiento
    (a) expresar un vector de expresión, según la reivindicación 13 en una célula huésped adecuada, y (b) recuperar el anticuerpo.
  16. 16.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un procedimiento de tratamiento.
  17. 17.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un individuo que tiene un trastorno asociado con un aumento de la señalización de Notch 1, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo, en el que dicho trastorno (i) es un cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular, (ii) es un trastorno neurodegenerativo, o (iii) comprende una afección patológica asociada con la angiogénesis, que es una enfermedad neovascular intraocular.
  18. 18.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, para su uso, según la reivindicación 17, en el que el trastorno es un cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular seleccionados del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T) y melanoma.
  19. 19.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 18, en el que el trastorno es adenocarcinoma o adenoma de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario o carcinoma de mama.
  20. 20.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, comprendiendo adicionalmente el procedimiento administrar al individuo una cantidad eficaz de un segundo medicamento, en el que el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 es un primer medicamento.
  21. 21.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 20, en el que el segundo medicamento es (i) otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticosteroide, un antiemético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento, o
    (ii) tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib o trastuzumab.
  22. 22.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 20 ó 21, en el que el segundo medicamento se administra anterior o posteriormente a la administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1, o simultáneamente con el anticuerpo anti-NRR de Notch 1.
  23. 23.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 17-22, en el que dicho individuo es un ser humano.
  24. 24.
    Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 17, en el que el trastorno está relacionado con una mutación de activación en una secuencia aminoacídica de Notch 1.
  25. 25.
    Composición que comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un vehículo farmacéutico.
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