JP5616216B2 - 酵素によるタンパク質の改質方法 - Google Patents

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Description

［関連出願の記載］
本発明は、日本国特許出願：特願２００８−０６６７６５号（２００８年 ３月１４日出願）及び特願２００８−２９４８９０号（２００８年１１月１８日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、タンパク質中のグルタミン残基を修飾する酵素であるトランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼの両方を作用させて２つの酵素反応を行うことを特徴とするタンパク質の改質方法に関する。また、本発明は、この方法を使用して改質されたタンパク質を含有する食品や、プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を特定の比率で含有したタンパク質改質用酵素製剤、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの基質タンパク質への適正添加量比を見出す方法等にも関する。
トランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧと略すことがある）は、タンパク質及びペプチド中のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基と１級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する酵素である。ＴＧがアシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基に作用すると、タンパク質の架橋重合反応が起こる。また、１級アミンが存在しない場合には、水がアシル受容体として機能し、グルタミン残基をグルタミン酸残基に変換する脱アミド反応を触媒する。食品への応用の際にはほとんどが、タンパク質の架橋反応によるものであり、現在、タンパク質のゲル形成性付与あるいは向上、未加熱でのタンパク質のゲル化、接着などの性質を利用して、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類、豆腐、パンなど様々な用途に応じたＴＧ製剤が開発されている。
一方、プロテイングルタミナーゼ（以下、ＰＧと略すことがある）は、タンパク質中のグルタミン残基のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素である。その詳細な記述は、特許文献１、特許文献２、非特許文献１等に開示されている通りである。これらによればＰＧはタンパク質中のアミド基に直接作用し、それによってタンパク質中のグルタミン残基はグルタミン酸残基に変換され、カルボキシル基が生じることから、タンパク質の負電荷の増加、静電反発力の上昇、等電点の低下、水和力の増加等が起こる。その結果、タンパク質の溶解性、水分散性の増加、乳化力、乳化安定性の向上など様々な機能特性の向上をもたらし、タンパク質の用途拡大が期待される。
このように、ＴＧもＰＧも産業上有用な酵素であることが知られているが、これらの酵素を併用することで新たな付加価値を得るという試みについて、具体的な例はほとんど報告されていない。むしろ、特許文献１にＴＧ反応制御剤としてのＰＧの利用例が示されており、非特許文献２にもＰＧ・ＴＧが共存した場合、ＴＧによる架橋反応は進行しないことが記載されている。さらに、ＴＧとＰＧの反応性の相違に関するこれまでの知見をより詳しく述べる。両酵素とも、その基質タンパク質中のターゲットは同じグルタミン残基である。しかしながら、タンパク質中の個々のグルタミン残基に対する基質特異性はＴＧに比べ、ＰＧの方が広い。これは、ＴＧの場合、グルタミン残基の他にリジン残基のε−アミノ基が必要であるのに対し、ＰＧの場合、グルタミン残基の他には反応環境中豊富に存在する水を必要とするだけであるためと考えられる。例えば、カゼイン中のグルタミン残基に対する反応性は、Ｋｍ値、ｋｃａｔ値からみてもＰＧはＴＧに比べ触媒効率が圧倒的に高く、両者が共存した場合、ＰＧの反応の方が優先して起こり、脱アミド化されたグルタミン残基はもはやＴＧの基質にならず、架橋反応は進行しない。実際に、ＴＧによるカゼインの架橋高分子化反応の途中にＰＧを添加する実験によって、カゼインの高分子化は添加と同時に停止する結果が示されている。さらに、ＰＧにより予め十分脱アミド化を施したカゼインはもはやＴＧの基質にならない、すなわち架橋高分子化されないことも確認されている（非特許文献２）。また、Y.S.Guらは、本酵素のα−ラクトアルブミンに対する反応性について調べ、６つのグルタミン残基のうち４つを脱アミド化すると報告している（非特許文献３）。一方、放線菌ＴＧはその４つのうち一つであるグルタミン５４にしか作用しないことから、ＰＧの基質特異性がＴＧに比べて広いことがそこで述べられている。また、特許文献１には、ＰＧのグルタミン残基に対する高い反応性を利用することで、ＴＧ反応を適当な時点で停止させることでき、ＰＧが、食品への添加には好まれないＥＤＴＡや塩化アンモニウムなど一般に知られるＴＧ阻害剤を代替できる可能性が挙げられている。
しかしながら、ＰＧによるＴＧ反応の停止以外の観点から両者の併用方法が提案されている例はこれまでに挙げられていない。それだけでなく、ＴＧとＰＧの両方を基質タンパク質に作用させて目的とする効果を得る条件、より詳しくは、ＴＧ反応がＰＧによって停止されることなく、ＰＧが共存する条件下でもＴＧ反応ならびにその改質効果が損なわれることのない条件については、従来の知見だけでは知る由もない。さらに、様々な基質タンパク質に対して、ＴＧとＰＧをどのような割合で作用させた場合に、どのような効果が現れるのかなど、両酵素を効果的に用いるための具体的な方法が示された例はなく、したがって、全く新しい試みと言うべき、ＴＧ、ＰＧにより改質されたタンパク質製品の開発を行うとするならば、各用途別に最適な反応条件を模索するしかないのが現況なのである。
また、酵素反応は、処理時間、温度、酵素添加量、基質の種類、状態、基質特異性等、様々な因子によってその反応量並びにその効果の程度が異なるため、基質を共通とする２つの酵素を使いこなすことは容易なことでなく、開発者、加工業者が用途ごとに、求める食品の製造条件を決定するためには多大な時間、労力を要する。なぜなら、酵素反応は、処理時間、温度、酵素添加量、基質の種類、状態、基質特異性など様々な因子によってその反応量ならびにその効果の程度が異なる上、２つの酵素を同時に作用させようとすると、ありとあらゆる組み合わせを検討する必要があるからである。したがって基質を共通とする２つの酵素を使いこなす方法の開発が求められる。
ところで、これまでにＴＧの基質特異性を調べる方法として、ＮＭＲを利用する方法が知られている（特許文献３）。すなわち、１５Ｎ標識塩化アンモニウム存在下において任意のタンパク質をＴＧと作用させ、ＴＧの基質となるグルタミン残基のカルボキシアミド窒素を１５Ｎ標識したものをＮＭＲにて観測することで、ＴＧの反応を追跡する方法である。この方法を用いると、タンパク質基質を用いて反応性と基質特異性を同時に解析することができる。しかしながら、特許文献３には、ＰＧが反応するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素が、１５Ｎ標識されることは記載されていない。
特開２０００-５０８８７号公報 特開２００１-２１８５９０号公報 特開２００２-３３２２９５号公報 Yamaguchi ら、Eur.J.Biochem. Vol.268, 2001,1410-1412頁 食品酵素化学の最新技術と応用-フードプロテオミクスへの展望-（シーエムシー出版）、１４６〜１５３ページ Y.S.Guら、J. Agric. Food Chem. Vol.49,2001, 5999-6005頁
以上の特許文献１〜３及び非特許文献１〜３の全開示内容は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。
以下の分析は、本発明の観点から与えられる。
本発明の目的は、タンパク質にプロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を作用させてタンパク質を改質する方法を提供すること、両酵素により改質されたタンパク質を含有する食品を提供すること、両酵素を含有したタンパク質改質用酵素製剤を提供すること、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を簡便に見出す方法を提供することである。
本発明者らは、上述したことを鑑みて鋭意研究を重ねた結果、これまで、ＰＧが存在する場合はＴＧは作用せず、ＰＧ，ＴＧの併用効果は得られにくいと考えられていたが、所定条件下では、ＰＧとＴＧが共存した場合においても、基質タンパク質に両酵素が作用し、両酵素の併用効果が得られることを見出した。さらに、ＰＧがＴＧと同様、タンパク質中のグルタミン残基の脱アミド化を触媒するほかに、アンモニウム塩との交換反応も触媒する事実を発見した。すなわち、ＴＧ又はＰＧが反応するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素は、１５Ｎ標識される。そこで、１５Ｎ標識されたことを検出する測定法、例えば１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を実施すると、１５Ｎ標識率がＮＭＲシグナル強度から見積もられ、各々の反応性の相違を知ることができることを見出した。さらに、様々なタンパク質についてＴＧとＰＧの存在比率が、それぞれのＮＭＲシグナル強度比率と良好な相関があることを見出した。さらに、ＴＧに対するＰＧのシグナル強度比率（以下、ＰＧ／ＴＧシグナル強度比と記す）が０．２〜３．０の範囲を与えるＰＧ／ＴＧ酵素重量比または活性比が、ＴＧ反応がＰＧによって停止されることなく、ＰＧが共存する条件下でもＴＧ反応ならびにその改質効果が損なわれることのない条件であることを見出した。つまり、１５Ｎ標識アンモニウム存在下でＴＧ又はＰＧをそれぞれ基質に作用させ、ＮＭＲを用いて両者の基質特異性を比較することにより、両酵素の併用効果の得られる条件を簡便に見出すことができることを発見した。我々はＰＧとＴＧを同時に作用させる利点を見出した上に、その条件を現実的に、かつ容易に決定する方法を編み出すことに成功したのである。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼをタンパク質に作用させてタンパク質を改質する方法において、プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が、トランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時である、又はトランスグルタミナーゼが該タンパク質に作用する前であるタンパク質の改質方法。
（２）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１である（１）記載の方法。
（３）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１である（１）又は（２）記載の方法。
（４）タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件である（１）乃至（３）記載の改質方法。
（５）タンパク質が乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、プラズマ、筋肉タンパク質、コラーゲン及びゼラチンより選ばれる１又は２以上のものである（１）乃至（４）の何れか記載の方法。
（６）（１）乃至（５）の何れか記載の方法にて改質されたタンパク質を含有する食品。
（７）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
（８）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１であるタンパク質改質用酵素製剤。
（９）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質改質用酵素製剤。
（１０）トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼをそれぞれ別々に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定することにより、該タンパク質におけるプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を見出す方法。
（１１）プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼをタンパク質に作用させてタンパク質を改質する方法において、プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が、トランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時である、又はトランスグルタミナーゼが該タンパク質に作用する前であり、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１であるか、または、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１であるか、または、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質の改質方法。
（１２）タンパク質が乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、プラズマ、筋肉タンパク質、コラーゲン及びゼラチンより選ばれる１又は２以上のものである（１１）に記載の方法。
（１３）（１１）または（１２）に記載の方法にて改質されたタンパク質を含有する食品。
（１４）トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１であるか、または、トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１であるか、または、トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質改質用酵素製剤。
本発明によれば、ＴＧ又はＰＧの何れかの酵素を単独で使用した場合とは異なるタンパク質の改質効果、すなわちＴＧ及びＰＧの併用効果、具体的には、食品に含有されるタンパク質の、当該食品に及ぼす性質が改質され、その結果タンパク質含有食品の食感（硬さ、なめらかさ等）が改良されるという効果を得ることができる、タンパク質の新規改質方法を提供することができる。また、このような改質方法を用いて得られる新規特徴を有するタンパク質を含有する食品を提供することができる。また、タンパク質においてＴＧ及びＰＧの両方の酵素が共に基質に作用して前記効果が得られるようにするのに適切な条件（添加条件）を簡便に見出す方法を提供することができる。
１５ＮＨ４Ｃｌ存在下におけるα−ＬａｃｔａｌｂｕｍｉｎのＮＭＲにおける１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。（実験例１）
本発明に用いるＴＧは、ゼラチン、チーズ、ヨーグルト、豆腐、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類などの食品の製造や食肉の肉質改善等に広く利用されている（特開昭６４−２７４７１号公報〈参考文献１〉）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上種々の目的に使用されている酵素である。ＴＧは、タンパク質分子のペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する。ＴＧがタンパク質分子中のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体として作用すると蛋白質分子中及び分子間においてε−（γ−グルタミン酸）−リジン結合が形成される。なお、参考文献１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
ＴＧとしてはカルシウム非依存性のものとカルシウム依存性のものがあり、何れも本発明に使用することができる。前者の例としては、放線菌、枯草菌等の微生物由来のもの（例えば、特開昭６４-２７４７１号公報〈参考文献２〉参照。）を挙げることができる。後者の例としてはモルモット肝臓由来のもの（例えば、特公平１-５０３８２号公報〈参考文献３〉参照。）、ヒト表皮ケラチン細胞ＴＧ（Phillips, M. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 9333.〈参考文献４〉）、ヒト血液凝固因子XIII（Ichinose, A. et al. (1990) Biochemistry 25, 6900.〈参考文献５〉）、卵菌等の微生物由来のもの、牛血液、豚血液等の動物由来のもの、サケ、マダイ等の魚由来のもの（例えば、関信夫等、「日本水産学会誌」５６巻１２５〜１３２頁、１９９０年〈参考文献６〉）、カキ由来のもの、等を挙げることができる。この他、遺伝子組み換えにより製造されるもの（例えば、特開平１-３００８８９号公報〈参考文献７〉、特開平６-２２５７７５号公報〈参考文献８〉、特開平７-２３７３７号公報〈参考文献９〉参照。）等、を挙げることができる。本発明には何れのものでも使用することができ、起源及び製法に限定されることはない。尚、同位体標識するタンパク質の性質によってはカルシウムを含む溶媒中での酵素反応が好ましくない場合もあるため、そのようなタンパク質についてはカルシウム非依存性のＴＧを使用することが好ましい。例えば、上記微生物由来の（ＭＴＧ）（例えば、特開昭６４-２７４７１号公報〈参考文献１０〉参照。）等はこの条件をも満足するものであり、現時点では最適と言うことができる。例えば、ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneum ）ＩＦＯ １２７７６、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum ）ＩＦＯ １２８５２、ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）ＩＦＯ １３８１９等に由来するである。以下、ストレプトベルチシリウム・モバラエンスに由来するトランスグルタミナーゼをＭＴＧと呼ぶ場合がある。なお、上記参考文献２〜１０の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
本発明に使用するＴＧの活性単位は、次のようにして測定され、かつ定義される。即ち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）とヒドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロル酢酸存在下で鉄錯体に変換させた後、５２５ｎｍの吸光度で、その量を測定する。このようにしてヒドロキサム酸の量より検量線を作成し、１分間に１μモルのハイドロキサメートを生成させる酵素量を活性単位、１ユニットと定義する。この測定法の詳細は既に報告されている通り（例えば、特開昭６４−２７４７１号公報〈参考文献１１〉等参照。）である。なお、参考文献１１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
本発明に用いるＰＧは、タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。この様な酵素の例として、特許文献１あるいは特許文献２に開示された酵素があるが、これらに特に限定されるものではない。ＰＧは、ＰＧを産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。ＰＧの調製に用いられる微生物は特に限定されないが、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属、エンペドバクター属の微生物が例示される。
微生物の培養液からのＰＧの調製方法については、公知のタンパク質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
本発明のＰＧの活性単位は、特許文献１記載の方法を改良した方法、すなわち、下記の方法で測定する。
（１）３０ｍＭ Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１００μｌにＰＧを含む水溶液１０μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。このとき、酵素濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で適宜希釈する。
（２）遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ−ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ−ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いての３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ−ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）タンパク質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）ＰＧの活性を以下の式により求めた。
Figure 0005616216
本発明において、ＰＧ及びＴＧを改質しようとするタンパク質に添加する時期は、ＰＧのタンパク質への添加時期が、ＴＧの添加時期と実質的に同時である、又はＴＧが該タンパク質に作用する前である。従って、特許文献１に記載されているＴＧ反応をＰＧ添加により停止させる方法は、ＰＧのタンパク質への添加時期がＴＧが該タンパク質に作用する後であるので、本発明には含まれない。尚、ＰＧ及びＴＧのタンパク質への添加時期が実質的に同時であるとは、一連の原料投入工程で、ＰＧとＴＧが投入されることを意味する。すなわち、商業規模の製造においては、原料Ａを投入後、原料Ｂ、原料Ｃ・・・を順に投入するといったように、複数の原料をあらかじめ混合することなく、順番に投入するのが一般的であるが、一連の原料投入工程で、ＰＧとＴＧが投入される限り、本発明の「トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が実質的に同時である」に含まれる。もちろん、ＰＧ、ＴＧを含む複数の原料を予め混合し、添加する場合も、本発明の「実質的同時」に含まれることは言うまでもない。
ＰＧ，ＴＧを反応させる温度は一般に、３℃〜６０℃程度であり、この温度に保持すると約１分〜約４８時間程度で両者の反応が進行する。しかし、好ましくは５℃〜５０℃程度で約５分〜約２４時間程度行うのがよい。食品へのＰＧ、ＴＧの添加方法は、基質となるタンパク質を含む原料にＰＧ、ＴＧのみを添加する、あるいは他の原料とともに添加すればよい。ＰＧとＴＧの添加量は改質するタンパク質の種類、最終製品や目的とする効果に応じて自由に変化させることができるが、例えばＴＧの添加量は、食品原材料中のタンパク質グラム重量当たり、標準的には０．１〜１００ユニットである。一方ＰＧは、食品原材料中のタンパク質グラム重量当たり、標準的には０．０１〜１２０ユニット添加すればよい。もっとも、両者の上記添加量は目安であり、本発明の所期の効果を奏される限りは必ずしもこれらに限定されるものではない。
本発明において、タンパク質に作用させるＰＧとＴＧの比率が重要である。ＰＧのタンパク質への添加時期がＴＧの添加時期と実質的に同時である、又はＴＧが該タンパク質に作用する前である場合、タンパク質に添加するプロテイングルターゼとトランスグルタミナーゼの添加量は、活性比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０５〜３：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０５〜２：１であれば、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。あるいは重量比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．７：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．４：１、より好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．３：１であれば、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。ＰＧの比率が上記比率よりも大きい場合は、ＰＧの作用がＴＧに比べて効きすぎて併用による効果は発揮されないし、また小さい場合は逆にＰＧの作用が弱すぎて併用効果はあまり期待できない。
また、タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、ＰＧ：ＴＧ＝０．２〜３．０：１、好ましくは０．２〜２．３：１となる条件であれば、ＰＧ，ＴＧの添加時期によらず、ＰＧ、ＴＧはともにタンパク質に作用するので、タンパク質を改質することができる。ＰＧの比率が上記比率よりも大きい場合は、ＰＧの作用がＴＧに比べて効きすぎて併用による効果は発揮されないし、また小さい場合は逆にＰＧの作用が弱すぎて併用効果はあまり期待できない。
本発明のＮＭＲシグナル強度比は、ＴＧ又はＰＧを同位体標識アンモニウム塩（１５Ｎあるいは１４Ｎ）存在下で、基質タンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基を同位体標識した上で、標識されたタンパク質のＮＭＲスペクトルを測定し、ＮＭＲシグナル強度より算出できる。ＮＭＲの測定法は特に限定されないが、例えば、１５Ｎ標識されたグルタミン残基を検出する場合には、１Ｈと１５Ｎの相関スペクトル、例えばＨＳＱＣスペクトルを測定すれば良い。シグナルが２個以上得られる場合は各シグナル強度の総和をシグナル強度として算出する。すなわち、ＮＭＲシグナル強度比は「ＰＧを作用させた場合のシグナル強度の和」÷「ＴＧを作用させた場合のシグナル強度の和」で表される。標識化合物としてはアンモニウム塩であればよく、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなど広く挙げることができる。１５Ｎ標識するのであればアンモニウム塩の窒素が１５Ｎのものを用い、１４Ｎ標識するのであればアンモニウム塩の窒素が１４Ｎのものを用いればよい。標識方法は、水性溶媒中で約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０の範囲、好ましくは約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０の範囲で、温度約４℃〜約６５℃の範囲で、更に好ましくは約２５℃〜約６０℃の範囲で、標識すべきタンパク質及びアンモニウム塩を保持すればよい。反応時間には特に制限はないが、約３０秒〜一週間、より好ましくは約１分〜約１日とすればよい。この反応において、標識すべきタンパク質の濃度に対してアンモニウム塩の濃度を約１０倍以上、好ましくは約２００倍以上とすることが好ましく、標識すべきタンパク質の濃度が約１μＭ〜約４０ｍＭの範囲で、アンモニウム塩の濃度が約１０μＭ〜約１０Ｍの範囲であることがより好ましい。尚、α−ラクトグロブリン、カゼイン、大豆グロブリン、ミオシン、アクトミオシン等食品中に含まれるタンパク質が同位体標識され得るので、本発明のＮＭＲシグナル強度比は、タンパク質を含む食品全般において測定することができる。
ＴＧ又はＰＧの作用により、タンパク質を同位体標識塩化アンモニウムと反応させた例を示す。α−ラクトアルブミン（α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ，以後α−Ｌａと略す）を基質として用いる場合、基質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ α−Ｌａ、２００ｍＭ １５ＮＨ４Ｃｌ、５％ Ｄ２Ｏ ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））を調製し、基質−酵素比が１０００：１となるようＴＧまたはＰＧを添加後、３７℃、２６．５時間インキュベートする。インキュベート後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ６００等を用いて、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ 測定を実施する。カルボキシアミド窒素が１５Ｎ標識されると、１５Ｎに２つの１Ｈが結合しているために、１つの１５Ｎの化学シフトに対して２つのシグナルがペアとして観測される。「ＰＧを作用させた場合のシグナル強度の和」÷「ＴＧを作用させた場合のシグナル強度の和」を算出し、ＮＭＲシグナル強度比とする。
本発明のタンパク質は、特に制限はされないが、乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、筋肉タンパク質、プラズマ、コラーゲン、ゼラチンなどが挙げられる。またこれらのタンパク質を２種以上混合したものであってもよい。本発明に該当する食品としては、上記したタンパク質をＰＧ、ＴＧの併用により改質したものを含むものであれば、原料の種類や加工状態は問わない。例えば、殺菌された状態、脱脂した状態、希釈された状態、濃縮された状態、乾燥された状態、その他、様々な加工を施した状態もこれに含まれる。
次に、本発明の酵素製剤について説明する。本発明のタンパク質改質用酵素製剤は、必須構成成分であるトランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０５〜３：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０５〜２：１であるものや、重量比においてＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．７：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．４：１、より好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．０１〜０．３：１であるものや、ＮＭＲシグナル強度比において、ＰＧ：ＴＧ＝０．２〜３．０：１、好ましくはＰＧ：ＴＧ＝０．２〜２．３：１となる条件であるものであればよく、ＰＧ、ＴＧ以外にこの分野で通常使用されている乳糖、蔗糖、マルチトール、ソルビトール、デキストリン、分岐デキストリン、サイクロデキストリン、澱粉類、多糖類、ガム類、ペクチン等様々の任意成分を配合することもできる。また、動物性タンパク質や、大豆タンパク質、小麦タンパク質などの植物性タンパク質を含有させることもできる。更にまた、重曹、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの生理学的に許容される無機塩類も必要に応じて本酵素製剤に配合することができる。更にまた、調味料、砂糖、香辛料、着色料、発色剤、アスコルビン酸、その塩類などの有機塩類、乳化剤、油脂なども適宜配合することができる。
本発明は、プロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を簡便に見出す方法も含む。すなわち、上述の通り、ＰＧとＴＧをそれぞれ別に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定し、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１、好ましくは０．２〜２．３：１となる条件を見出すことにより、ＰＧとＴＧの適正添加量比を見出すことができる。ＰＧとＴＧのＮＭＲシグナル強度比の上記適正範囲は、基質タンパク質の種類に因らずプロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１、好ましくは０．２〜２．３：１であり、ＮＭＲシグナル強度比と各基質タンパク質におけるＰＧとＴＧの適正添加量比（活性比、重量比）との間には相関があるため、ＰＧとＴＧの適正添加量比（活性比、重量比）を多くの実験により試行錯誤を繰り返すことなく、簡単に見出すことができる。
以下に実験例、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これら実施例により何ら限定されるものではない。
 実験例１
α−ラクトアルブミン（α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ，以後α−Ｌａと略す）（Ｓｉｇｍａ製）を基質として用いた。基質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ α−Ｌａ、２００ｍＭ １５ＮＨ４Ｃｌ、５％ Ｄ２Ｏ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））を調製し、基質−酵素比が１０００：１となるようＴＧ（味の素「アクティバ」ＴＧからの酵素精製品）またはＰＧ（特許文献１記載のクリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のもの）を添加後、３７℃、２６．５時間インキュベートした。インキュベート後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ６００）を用い、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を実施した。２６．５時間後の１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を行った結果を図１に示す。カルボキシアミド窒素が１５Ｎ標識されると、１５Ｎに２つの１Ｈが結合しているために、１つの１５Ｎの化学シフトに対して２つのシグナルがペアとして観測される。図１より、α−Ｌａに存在するグルタミン残基のカルボキシアミド窒素のうち一部が１５Ｎ標識されることが判明し、ＰＧによる１５Ｎ標識を示すことに成功した。このように、本方法によって、ＴＧと同様に、ＰＧも脱アミド反応のみならず塩化アンモニウムをグルタミン残基と反応させることができることが示された。尚、ＮＭＲシグナル強度は図１の楕円状のスポットのエリア面積の総和であり、このエリア面積が大きいほど反応量が多いことを示す。
市販牛乳、０．２Ｍ １５ＮＨ４Ｃｌ、５％Ｄ２Ｏに実験例１記載のＴＧ又はＰＧをそれぞれ単独で添加して、各添加濃度におけるシグナル強度を算出した。ＴＧは基質／酵素比（Ｓ／Ｅ比）が重量比７４００／１となるように添加した。一方、ＰＧは、重量比でＴＧの０．００２〜５倍添加した。用いたＴＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇあたり２６ユニット、ＰＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇあたり１２０ユニットであった。酵素添加後の溶液を３７℃で３時間インキュベートさせた後、ＮＭＲサンプル管へ移し、実験例１記載のＮＭＲを用い、１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を実施した。ＴＧ添加量を基準とし、それに対するＰＧ添加量をそれぞれの酵素重量比（ＰＧ／ＴＧ）ならびに活性比（ＰＧ／ＴＧ）で表した。そして、それぞれの比に対応するＰＧ／ＴＧシグナル強度比を求めた結果を表１に示す。
Figure 0005616216
市販牛乳を用いてヨーグルトを調製した。市販牛乳４００ｇを５０℃に加温し、実験例１記載のＴＧ、ＰＧを表２に記載した量添加した。用いたＴＧの比活性は酵素タンパク質１ｍｇ当たり２６ユニット、ＰＧの比活性は１２０ユニットであった。５０℃、９０分の酵素反応を行った後、沸騰浴中でかき混ぜながら加熱した。９０℃に達したら直ちに氷水につけ、４５℃まで冷却させた。２０ｇ（対原料５％）のスターター（明治乳業（株）ブルガリアヨーグルト）を添加し、よくかき混ぜてから４０ｇずつ試飲カップに分注した。
アルミホイルでふたをし、３８℃でｐＨが４．５に低下するまで約３〜４時間発酵させた。低温（４℃）で保存し、翌日、物性評価および官能評価を行った。
物性は、テクスチャーアナライザー（英弘精機製）を用いて破断応力を測定した。１０ｍｍ径円柱型プランジャーを使用し、破断速度は６ｃｍ／ｍｉｎ（１ｍｍ／秒）とした。
その結果を表３に示す。ＴＧのみ添加した比較品Ｔの破断応力は対照品に比べて顕著に増加した。これは、ＴＧによる乳タンパク質の架橋による効果である。本発明品１〜４についても、やはり対照品に比べると破断応力は大きく、ＴＧによる破断応力を増加させる効果は損なわれていなかった。しかしながら、比較品Ｔ-Ｐの破断応力は、比較品Ｐとほとんど変わりがなかったことから、ＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止し、ＴＧの効果がほとんど現れなかったことが確認された。
Figure 0005616216
Figure 0005616216
官能評価でかたさを６名のパネラーで評価した。対照品を０点としたとき、かたいほど＋５点、やわらかいほど−５点となるよう採点し、平均値を求めた。その結果を表４に示す。対照品に比べ、ＴＧのみ添加した比較品Ｔは顕著に硬さが増加した。本発明品１〜４においても、ＴＧによる硬さの増加は保っていた。しかしながら、比較品Ｔ−Ｐのかたさは、比較品Ｐと同様、ヨーグルトを軟化させ、これはＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止し、ＴＧの効果がほとんど現れなかったことを意味するものである。本結果は、上で示した物性測定の結果を概ね反映するものである。総合的な食感の好ましさを評価したところ、本発明品１〜４では、ＴＧによるヨーグルトの硬さ向上効果を保持しつつ、滑らかさはＴＧのみ添加した場合よりも向上するという好ましい評価結果が得られた。すなわち、ＰＧ、ＴＧの併用効果が確認された。
Figure 0005616216
タカナシ低脂肪牛乳（乳蛋白３．３％、乳脂肪１．０％）に乳蛋白を３．６％に調整するため、脱脂粉乳（ローヒートタイプ、乳蛋白３５％含有、よつ葉乳業製）を０．８５％添加して、５５℃で加温しながら溶解し、ヨーグルト用原料乳を調製した。該原料乳を沸騰浴中で加熱し、９５℃達温してから２分保持した後、直ちに氷浴中で冷却した。４７℃になったら、乳酸菌スターター（Yo-Flex，DVS YC-370、クリスチャンハンセン製）を０．００６％添加するとともに、ＴＧ、ＰＧを表５記載の通り、添加してよく攪拌した。プラスチックカップに一定量ずつ分注し、ｐＨが４．５〜４．６に達するまで４４℃のインキュベーター内で発酵させた。発酵開始から終了まではおおよそ４〜５時間要し、発酵終了後は冷蔵庫（５℃）で保存した。翌日、得られたセットタイプヨーグルトの表面離水を観察した。また、ヨーグルトの物性をテクスチャーアナライザー（装置メーカー：Stable Macro System, LTD）により評価した。官能評価は、５名の訓練されたパネルで実施した。ヨーグルトの物性測定条件は、テスト速度１ｍｍ／ｓ、直径１０ｍｍの平板プランジャー、１０％圧縮時の破断応力と付着面積を評価した。破断応力は、ヨーグルトのかたさ、付着面積は、ヨーグルトのクリーミー感と相関が高いことを本発明者らは既に確認している。評価の結果を表６にまとめた。
Figure 0005616216
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表面離水は、対照品と比較品２が多く、また比較品３ではやや多く観察された。比較品１、本発明品１および２では表面離水は見られず表面に艶が合った。一方、物性測定および官能評価結果によれば、比較品１はかたく、もろい寒天様の食感であり、口内に含むと水っぽい感じであった。比較品２、３は対照品よりもかたさが減少し、付着性が増加した。官能評価では、なめらかであるが、やわらかくボディ感に欠けるといったコメントもあった。一方、本発明品１、２はいずれも、かたさと付着性両方が増加し、ボディ感のある、なめらかでクリーミーなヨーグルトであった。以上、外観、物性・食感から総合的に評価すると、本発明品１、２はもっとも好ましいヨーグルトであり、ＴＧとＰＧを適度なバランスで使用することによりセットタイプ低脂肪ヨーグルトの食感改良が可能であることが示された。
タカナシ低脂肪牛乳（乳蛋白３．３％、乳脂肪１．０％）に乳蛋白を３．９４％に調整するため、脱脂粉乳（ローヒートタイプ、乳蛋白３５％含有、よつ葉乳業製）を添加して、５５℃で加温しながら溶解し、ヨーグルト用原料乳を調製した。該原料乳を沸騰浴中で加熱し、９５℃達温してから２分保持した後、直ちに氷浴中で冷却した。４７℃になったら、乳酸菌スターター（Yo-Flex，DVS YC-370、クリスチャンハンセン製）を０．００６％添加するとともに、ＴＧ、ＰＧを表７記載の通り、添加してよく攪拌した。ステンレスカップに一定量ずつ分注し、ｐＨが４．５〜４．６に達するまで４４℃のインキュベーター内で発酵させた。発酵終了後は冷蔵庫（５℃）で冷却した後、メッシュ（２１６μｍ）の篩で濾し取り、スタード化した。出来上がったスタードヨーグルトは５℃で保存し、保存段階において外観および食感の変化を解析することとした。また、ヨーグルトの物性を動的粘弾性測定装置（ＨＡＡＫＥ、レオストレス ＲＳ１）により評価した。官能評価は、３名の訓練されたパネルで実施した。ヨーグルトの物性測定条件は、直径６ｃｍのコーンプレートを使用し、せん断速度０→１００〔１／ｓ〕を３００秒で増加させた後、直ちにせん断速度を１００→０〔１／ｓ〕に同じ時間かけて減少させるプログラムを作成した。測定温度は、１０℃とし、せん断速度１００〔１／ｓ〕のときの粘度を記録した。結果を表８にまとめた。
Figure 0005616216
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スタード化する前の表面離水は、対照品で大量に、また比較品２では少しの量、確認されたが、比較品１、本発明品１〜４ではほとんど見られなかった。スタード化した直後の官能評価の結果、対照品はざらつきがあり、水っぽくやわらかい食感であった。比較品１は、ボディ感が付与されているものの、ざらつく食感であったのに対し、比較品２では、表面の艶がありなめらかであるが、水っぽくやわらかい食感であった。本発明品１〜４はいずれも表面の艶があり、ボディ感とともに、なめらかさも付与されていた。粘度の測定結果も官能評価とよく一致するものであり、本発明品１〜４の粘度は対照品や比較品２に比べると明らかに高く、ボディ感が付与されたことを裏付けるものであった。３週間冷蔵保存後の外観および食感の変化を確認したところ、比較品１はダマが見られ、ざらざらとした砂様の食感が著しかったのに対し、本発明品１ではその傾向が低減、本発明品２〜４ではほぼ改善されていた。以上の結果を総合的に評価すると、対照品および比較品１、２と比べ、本発明品１〜４は明らかに物性、食感（保存中の変化）の点で優れるものであった。
このように、ＴＧのみ使用したヨーグルト（比較品１）では、無添加品に比べてボディ感を付与する効果はあるものの、保存中の品質劣化が問題となるし、また、ＰＧのみ使用したヨーグルト（比較品２）ではなめらかであるものの、ボディ感のない水っぽい食感が問題となる。しかしながら、ＴＧとＰＧをある添加比率で併用したヨーグルト（本発明品１〜４）ではそれらの問題を解決できるだけでなく、表面の艶やなめらかさを付与することで品質向上が可能であることが示された。
市販豆乳（タイシ無調整；最終蛋白質含量４．８％）、０．２Ｍ １５ＮＨ４Ｃｌ、５％Ｄ２Ｏ、実験例１記載のＴＧ又はＰＧをそれぞれ単独で添加しよく混合した。ＴＧは基質／酵素比（Ｓ／Ｅ比）が重量比６０００／１となるように添加した。一方、ＰＧは、ＴＧの０．０１〜１倍添加した。３７℃で１時間１５分インキュベートさせた後の溶液をＮＭＲサンプル管へ移し、実験例１記載のＮＭＲを用い、１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を実施した。実施例１と同様に、それぞれの酵素重量比（ＰＧ／ＴＧ）ならびに活性比（ＰＧ／ＴＧ）について、ＰＧ／ＴＧシグナル強度比を算出した結果を表９に示す。
Figure 0005616216
表１０に記載した添加比にてＴＧとＰＧを併用した豆腐を調製した。寄せ容器に30％ニガリ（赤穂化成製）溶液を１０ｇ（ニガリ３ｇ相当）、ステンレスジョッキに上記市販豆乳を１ｋｇ量りとり、湯煎で５５℃に加温した。豆乳に酵素溶液を添加して撹拌・混合し、すみやかにニガリの入った寄せ容器に勢いよく注ぎこみ、攪拌板を４回上下させた。フタをして、５５℃のインキュベーターに移し、５０分間静置した。水を張ったバットに豆腐を移し、３０分〜１時間放置した後、豆腐を切り分け、豆腐容器に移し、内容重量を測定した。容器にひたひたになるまで水を加え、フィルムを被せて加熱シールした。８５℃の恒温水槽に投入し、４５分間加熱し（２次加熱）、その後、流水で荒熱をとり、氷水中で冷やして冷蔵保存した。翌日、容器内の水を除いて固形物の重量を測定し、物性および官能評価に供した。
Figure 0005616216
物性評価は、レオメーター（不動工業社製）による破断試験を行った。用いたプランジャーは５ｍｍ径円盤、破断速度６ｃｍ／分（１ｍｍ／秒）とした。官能評価は５名のパネラーで酵素無添加品を０点とし、なめらかさとかたさについて±３点の間で７段階評価を行い、平均値を求めた。表１１に結果を示す。ＴＧを添加した、比較品Ｔ１およびＴ２は対照品に比べ破断応力が増加した。一方、ＰＧを添加した比較品Ｐ１およびＰ２は対照品に比べ破断応力が減少した。本発明品１は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ１と破断応力はほぼ同等で、かつ舌ざわりがより滑らかに変化した。本発明品２は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ２と比べ破断応力は若干低下したが、対照品に比べると依然破断応力は大きく、かつ滑らかさも付与されていた。本発明品３は、同量のＴＧを添加した比較品Ｔ２と比べると破断応力は減少したが、同量のＰＧを添加した比較品Ｐ２と比べると破断応力は大きく、ＴＧの添加効果が確認できた。比較品Ｔ-Ｐは、比較品Ｐ１、Ｐ２と同程度にやわらかく、もはやＴＧ反応によるがかたさ付与効果が現れなかった。これは、ＴＧ反応がＰＧによってほとんど停止したことを意味するものである。また、官能評価の結果、本発明品１〜３いずれにおいても、ＴＧによるかたさ付与が保持され、かつ、ＴＧ単独添加よりも舌ざわりが向上しており、総合的に好ましい食感が付与されていた。すなわち、ＰＧ、ＴＧの併用効果が確認された。
Figure 0005616216
表１２に示した配合および試作工程にてうどん及び中華麺を調製した。トランスグルタミナーセおよびプロテイングルタミナーゼは、加水時に水に溶解させた。うどん及び中華麺における各々の酵素添加量を表１３に示した。うどんは、麺１００ｇに対して１５倍量のお湯にて２０分間茹で、その後の食感を訓練されたパネル（ｎ＝５）で評価した。中華麺は、茹で時間は５分間とした以外はうどんと同様に評価を行った。対照品を基準として、硬さ、粘り、なめらかさの項目について評価した（明らかに弱くなる：××、やや弱くなる：×、同等：△、やや強くなる：○、明らかに強くなる：◎）。うどん、中華麺の評価結果はほとんど同じ傾向であったので表１４にまとめて示した。うどん、中華麺いずれにおいてもＰＧ／ＴＧ比が重量比において、０．０１、０．０５、０．２（それぞれ本発明品１、２、３）のときに麺の硬さ、粘り、なめらかさがバランスよく付与された食感となった。すなわち、トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼの両方を作用させて両方の好ましい効果を得る適切な比率であることが麺類の例でも示された。
Figure 0005616216
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本発明によれば、トランスグルタミナーゼ，プロテイングルタミナーゼ各酵素を単独で使用した場合とは異なるタンパク質改質効果を得ることができ、全く新規な特徴を持ったタンパク質食品を製造することができる。また、ＴＧ，ＰＧ両酵素が共に基質に作用する適切な条件を簡便に見出すことができる。従って、本発明は食品分野において極めて有用である。
なお、前述の特許文献等の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。

Claims (5)

  1. プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼをタンパク質に作用させてタンパク質を改質する方法において、プロテイングルタミナーゼのタンパク質への添加時期が、トランスグルタミナーゼの添加時期と実質的に同時である、又はトランスグルタミナーゼが該タンパク質に作用する前であり、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１であるか、または、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１であるか、または、該タンパク質に添加するプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの添加量が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質の改質方法。
  2. タンパク質が乳タンパク質、乳清タンパク質、大豆タンパク質、小麦グルテン、プラズマ、筋肉タンパク質、コラーゲン及びゼラチンより選ばれる１又は２以上のものである請求項１に記載の方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法にて改質されたタンパク質を含有する食品。
  4. トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、活性比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０５〜３：１であるか、または、トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、重量比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．０１〜０．７：１であるか、または、トランスグルタミナーゼ：プロテイングルタミナーゼの配合比率が、ＮＭＲシグナル強度比において、プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ＝０．２〜３．０：１となる条件であることを特徴とするタンパク質改質用酵素製剤。
  5. トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼをそれぞれ別々に同位体標識アンモニウム塩の存在下でタンパク質に作用させ、該タンパク質のグルタミン残基の官能基を同位体標識し、そのＮＭＲシグナル強度を測定することにより、該タンパク質におけるプロテイングルタミナーゼとトランスグルタミナーゼの適正添加量比を見出す方法。
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