JP5543798B2 - 低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法 - Google Patents
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Description
本発明によればさらに、(a)コレステロールエステラーゼ、(b)コレステロールオキシダーゼ、(c)ペルオキシダーゼ、(d)色原体、(e)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および(f)ポリグリセリルエーテルを含む、低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C) 測定用乾式分析要素が提供される。
本発明の方法は、体液中の低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)の測定方法であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルの存在下において、(a)コレステロールエステラーゼ及び(b)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いて低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)を測定する方法である。
より具体的には、酵素としてペルオキシダーゼを挙げることができ、色原体としては、4-アミノアンチピリン(4-AA)、水素供与性カップリングして発色するフェノール性又はアニリン性のトリンダー試薬、及びロイコ色素などを挙げることができる。トリンダー試薬としては、好ましくはアニリン性試薬を用いることがき、例えば、同仁化学研究所製のN-エチル- N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン(ADPS)、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン(ALPS )、N-エチル- N-スルホプロピル-3-メチルアニリン(TOPS)、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(ADOS )、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(TOOS)等が挙げられる。
前記緩衝剤のpHは用いる酵素の至適pHに応じて決定することができるが、好ましくはpH5.0〜8.0の範囲に調整することができ、より好ましくはpH6.0〜7.0の範囲に調整することができる。
(1)コレステロールエステラーゼ
(2)コレステロールオキシダーゼ
(3)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー
(4ポリグリセリルエーテル
(5)ペルオキシダーゼ
(6)色原体(4-AA及びトリンダー試薬)
(7)pH緩衝剤
多孔性層は繊維質又は非繊維質のいずれであってもよく、液体試料の展開層として機能することから、液体計量作用を有する層であることが好ましい。液体計量作用とは、層の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有する成分を実質的に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。展開層には、展開面積や展開速度等を調節するために、特開昭60-222770号公報、特開昭63-219397号公報、特開昭62-182652号公報に記載された親水性高分子又は界面活性剤を配合することができ、界面活性剤として多環ポリグリシドール化合物を配合することもできる。
接着層は、前記水不透過性支持体、及び前記多孔層を接着する機能を有する層であり、ゼラチン及びこれらの誘導体(例、フタル化ゼラチン)、セルロース誘導体(例、ヒドロキシプロピルセルロース)、アガロース、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体等の親水性ポリマーが利用できる。
必要に応じ、安定化剤、pH緩衝剤、架橋剤(硬膜剤又は硬化剤)、界面活性剤、ポリマー等を含有させることができ、これらは接着層又は多孔層に含有させることができる。
試薬組成物は、第1の多孔性層に含まれてもよいが、接着層及び多孔性層の両方の層に含まれてもよい。あるいは全部又は大部分の試薬組成物がいずれかの層に含まれていてもよく、あるいは接着層と多孔性層以外の層に試薬組成物を添加しておいてもよい。
緩衝剤のpHは用いる酵素の至適pHに応じて決定することができ、好ましくはpH5.0〜8.0の範囲に調整することができる。より好ましくは、pH6.0〜7.0の範囲に調整することができる。
本発明の乾式分析素子は、色原体およびペルオキシダーゼを含む層と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および、ポリグリセリルエーテルを含む層、を含むことが好ましい。
本発明と比較例の試料101〜106の作成
試薬1
MOPS (pH緩衝剤、pH 7.0) 50 mM
DAOS(同仁研究所社製) 1 mM
(DAOSは色原体である)
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 2.65%
ポリグリセリルドデシルエーテル(界面活性剤2) 0.21%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、(リポプロテインリパーゼ、東洋紡) 1 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、(recombinant E.Coli, キッコマン) 3 U/ml
試料101と103の比較
試薬1
MOPS (pH緩衝剤、pH 7.0) 50 mM
DAOS(同仁研究所社製) 1 mM
(DAOSは色原体である)
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 2.65%
ポリグリセリルドデシルエーテル(101)または
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル(103)(界面活性剤2) 0.21%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、(リポプロテインリパーゼ、東洋紡) 1 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、(recombinant E.Coli, キッコマン) 3 U/ml
試薬1
MOPS (pH 7.0) 50 mM
DAOS(同仁研究所社製) 1 mM
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 4.0%
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル 0.21%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、(リポプロテインリパーゼ、東洋紡) 4 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、(recombinant E.Coli, キッコマン) 1 U/ml
実施例2において、ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテルをポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(HS210)に置き換えた以外は同様に試料の作成評価を行い、LDL値との相関を求めた。結果は図2に示し、相関係数はR=0.8778である。
実施例2、比較例2の結果から、本発明の構成は、優れた多検体相関性を示すことがわかる。
ゼラチン下塗りされている180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムにゼラチン水溶液を乾燥後の厚さが14μmになるように塗布し、乾燥した。次に、下記組成の水溶液を塗布乾燥した。
4-アミノアンチピリン 0.32 g/m2
TOOS (同仁研究所社製) 0.62g/m2
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 12.75kU/m2
次に上記フィルム上に約30g/m2の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、50デニール相当のポリエステル紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。次に、上記の布地上に下記組成の水溶液を塗布乾燥した。
MOPS (pH 7.0) 1.67 g/m2
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル 5.02g/m2
Pluronic L121 39.75g/m2
コレステロールエステラーゼ、(リポプロテインリパーゼ、東洋紡) 0.65kU/m2
コレステロールオキシダーゼ、(recombinant E.Coli, キッコマン) 0.13 kU/m2
Claims (5)
- コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼにより低密度リポ蛋白コレステロールから生成した過酸化水素にペルオキシダーゼと色原体とを作用させて発色反応を行うことにより低密度リポ蛋白コレステロールを測定する、請求項1に記載の方法。
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