JP4912626B2

JP4912626B2 - 顕微鏡、及び顕微鏡の観察方法

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Publication number: JP4912626B2
Application number: JP2005178995A
Authority: JP
Inventors: 健司川崎
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2005-06-20
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2025-06-20
Also published as: JP2006350182A; US7602556B2; US20060285203A1

Description

本発明は、生体細胞等の試料から発する蛍光等を観察する、油浸系対物レンズを用いた顕微鏡、及び油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法に関する。

現在、最先端のリサーチ分野では、生体の機能解明や蛋白質の挙動解析・相互作用の解明などを目的として、細胞を生きたまま長時間（数日から数週間）観察する方法が種々開発されて来ている。従来、生体細胞内の病変部等を観察する顕微鏡観察の一手法として、蛍光観察が一般的に行われている。蛍光観察は、特定の蛍光タンパク等の蛍光物質を発光標識として生体細胞等の生体試料を染色した後、励起光を照射して蛍光を発させ、これを観察することで生体細胞内における病変等、生体試料内の特定部位の有無及びその位置を検出するというものである。
蛍光顕微鏡観察では、特にＳＮ比の良いことが求められる。微弱な蛍光を検出するためには、高解像で明るい蛍光が得られる油浸系対物レンズを用いる必要がある。
従来の油浸系対物レンズを用いた蛍光顕微鏡としては、例えば次の特許文献１に記載のものがある。また、蛍光顕微鏡用の液浸油としては、例えば次の特許文献２に記載のものがある。
特開２００２−３５０７３４号公報特開平１１−２６９３１７号公報

ところで、油浸系対物レンズを用いた蛍光顕微鏡においては、特許文献２に載のように、試料（より厳密には試料を覆うカバーガラス）と油浸系対物レンズとの間に充填されるイマージョンオイルからの自家蛍光が、ＳＮ比に悪影響を与える。このため、試料と油浸系対物レンズとの間の距離を極力無くすことが、高ＳＮ比を得るためには望まれる。
しかし、特許文献１に記載のような従来の油浸蛍光顕微鏡は、対物レンズ全体を動かして試料との間の距離を変えることによって、焦点位置を調整するように構成されている。このため、試料と油浸系対物レンズとの間を極力無くすように構成すると、試料と油浸系対物レンズとの間の作動距離が極端に短くなってしまい、操作性が悪化して試料の破損や厚い試料等を観察するときに試料の深い部分を観察することができなくなる。
このため、従来の油浸系対物レンズを用いた顕微鏡では、対物レンズの作動距離を確保するために、試料と油浸系対物レンズとの間の距離をある程度離さなければならず、試料と油浸系対物レンズとの間に充填されるイマージョンオイルからの自家蛍光を原因とするＳＮ比への悪影響を低減することができなかった。

本発明は上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、試料（より厳密には試料を覆うカバーガラス）と油浸系対物レンズとの間に充填されるイマージョンオイルからの自家蛍光を極力無くして蛍光像のＳＮ比を高くすることが可能な顕微鏡、及び顕微鏡の観察方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明による油浸系対物レンズを用いた顕微鏡は、試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡において、前記油浸系対物レンズが、試料側から順に、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第１レンズ群と、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第２レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として正の屈折力を持つ第３レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として負の屈折力を持つ第４レンズ群とを有し、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化したときに、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群との間隔が広がり、前記第２レンズと前記第３レンズとの間隔が狭まり、前記第３レンズ群と前記第４レンズ群との間隔が狭まることで、試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されていることを特徴としている。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されているのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記カバーガラスの厚さに対応して、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されているのが好ましい。
さらに、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されているのが好ましい。

また、上記目的を達成するため、本発明による油浸系対物レンズを用いた顕微鏡は、試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡において、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に補正レンズを備え、前記補正レンズが、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備わることにより、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に補正レンズを備えない場合における前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤであるときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えることを特徴としている。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えるのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えるのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えるのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記補正レンズが、前記油浸系対物レンズ側から順に、正の屈折力を持つ第１補正レンズ群と、負の屈折力を持つ第２補正レンズ群と、正の屈折力を持つ第３補正レンズ群を有して構成され、且つ、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に備えられ、前記補正レンズを前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿入することにより、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときに、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとで構成された場合であって前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えると共に、前記第３レンズ群が、像面での結像位置を一定に保つ機能を備えるのが好ましい。
さらに、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡においては、前記油浸系対物レンズの前側焦点位置と試料面とが一致している場合には、倍率が１倍になり、前記作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化したときに、前記油浸系対物レンズと前記第１補正レンズ群との間隔が狭まり、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群との間隔が広がり、前記第２補正レンズ群と前記第３補正レンズ群との間隔が狭まるように構成されているのが好ましい。

また、上記目的を達成するため、本発明による油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法は、結像レンズを備え、試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法において、前記油浸系対物レンズとして、試料側から順に、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第１レンズ群と、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第２レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として正の屈折力を持つ第３レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として負の屈折力を持つ第４レンズ群とを有する油浸系対物レンズを用い、前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにするときに、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群との間隔を広げ、前記第２レンズと前記第３レンズとの間隔を狭め、前記第３レンズ群と前記第４レンズ群との間隔を狭めて、試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴としている。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記カバーガラスの厚さに対応して、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するのが好ましい。
さらに、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するのが好ましい。

さらに、上記目的を達成するため、本発明による油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法は、試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡の観察方法において、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えた場合に、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えない場合における前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤであるときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えた補正レンズを、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えることを特徴としている。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することのが好ましい。
また、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記補正レンズを、前記油浸系対物レンズ側から順に、正の屈折力を持つ第１補正レンズ群と、負の屈折力を持つ第２補正レンズ群と、正の屈折力を持つ第３補正レンズ群を有して構成し、且つ、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に備え、前記補正レンズを前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿入し、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとして、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群を介して、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとで構成された場合であって前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにすると共に、前記第３レンズ群を介して、像面での結像位置を一定に保つのが好ましい。
さらに、この油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法においては、前記油浸系対物レンズの前側焦点位置と試料面とが一致している場合には、倍率が１倍になるようにし、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにするときに、前記油浸系対物レンズと前記第１補正レンズ群との間隔を狭め、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群との間隔を広げ、前記第２補正レンズ群と前記第３補正レンズ群との間隔を狭めるのが好ましい。

本発明によれば、試料（より厳密には試料を覆うカバーガラス）と油浸系対物レンズとの間を極力ゼロに近付けた状態で、焦点距離を調整して試料を観察することができる。このため、試料と油浸系対物レンズとの間に充填されるイマージョンオイルからの自家蛍光を極力無くすことができ、蛍光像のＳＮ比が高い顕微鏡、及び顕微鏡の観察方法が得られる。

本発明の具体的な実施形態の説明に先立ち、本発明の作用効果について補足説明する。
従来のこの種の顕微鏡に用いられる油浸系対物レンズにおけるイマージョンオイルからの自家蛍光量の油浸系対物レンズ全体から発生する自家蛍光量に占める割合は、約３０パーセントある。
本発明の油浸系対物レンズを用いた顕微鏡のように、試料と油浸系対物レンズとの間隔を極力ゼロに近付ければ、イマージョンオイルの厚さもゼロに近づく。このため、本発明の油浸系対物レンズを用いた顕微鏡によれば、従来のこの種の顕微鏡に比べて、全体で約３０パーセントもの自家蛍光を減らすことができ、高ＳＮの蛍光像が得られる。

また、従来の顕微鏡のように、試料と油浸系対物レンズとの間の作動距離を変動させるのでは、試料と油浸系対物レンズとの間の作動距離を短くすると、試料に油浸系対物レンズを衝突させ易く、試料を破損させ易い上、厚みのある試料における深度の深い部分に焦点を合わせることができないなど、焦点距離の調整も限られたものになってしまう。このため、従来のこの種の顕微鏡では、試料と油浸系対物レンズとの間の作動距離、言い換えればイマージョンオイルが充填される間隔を少なくとも０．１ｍｍ程度あける必要がある。しかし、これでは、イマージョンオイルからの自家蛍光をなくすことができない。

これに対し、本発明の油浸系対物レンズを用いた顕微鏡のように、試料と油浸系対物レンズとの間を極力ゼロに近付けた状態で固定し、最も試料側のレンズよりも像側にある一部のレンズで焦点距離を調整するようにすれば、イマージョンオイルからの自家蛍光をなくして高ＳＮの蛍光像を得ることができることに加えて、試料に油浸系対物レンズが衝突して試料が破損するようなことを防止できるとともに、試料における深度の深い部分にも焦点を合わせることができ、従来のこの種の顕微鏡に比べて、操作性が格段に向上する。

第一実施形態
図１は本発明の第一実施形態にかかる顕微鏡に用いる油浸系対物レンズの試料との位置関係を示す説明図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの位置関係、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの位置関係を示している。図２は図１に示した油浸系対物レンズを構成するレンズ群の模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での各レンズ群の位置関係、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での各レンズ群の位置関係を示している。なお、図１，２中、ＣＧはカバーガラス、ＳＧはカバーガラスである。
第一実施形態の顕微鏡は、試料側から順に、油浸系対物レンズ１と、図示省略した結像レンズを有している。

油浸系対物レンズ１は、試料側から順に、第１レンズ群Ｇ１と、第２レンズ群Ｇ２と、第３レンズ群Ｇ３と、第４レンズ群Ｇ４を有して構成されている。
第１レンズ群Ｇ１は、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を有している。第２レンズ群Ｇ２は、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を有している。第３レンズ群Ｇ３は、接合レンズを含んで構成され、全体として正の屈折力を有している。第４レンズ群Ｇ４は、接合レンズを含んで構成され、全体として負の屈折力を有している。

また、油浸系対物レンズ１を構成する各レンズ群Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４は、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときに図２(a)に示すような位置関係でもって、試料における所定深度位置で合焦するように構成されている。そして、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化させたときに、図２(b)に示すように、第１レンズ群Ｇ１と第２レンズ群Ｇ２との間隔が広がり、第２レンズＧ２と第３レンズＧ３との間隔が狭まり、第３レンズ群Ｇ３と第４レンズ群Ｇ４との間隔が狭まることで、図２(a)のときと同様の試料面における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置を図２(a)のときと同様に保つことができるように構成されている。なお、第１レンズ群Ｇ１と第２レンズ群Ｇ２との間隔が広がることで、第１レンズ群Ｇ１で大きく発生する球面収差を低減することができるようになっている。

また、油浸系対物レンズ１は、観察に用いるカバーガラスＣＧの厚さが変わった場合には、カバーガラスＣＧの厚さに対応して、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとなった状態のまま、各レンズ群Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の少なくとも一部を光軸に沿って所定方向に所定量移動することで、図２(a)のときと同様の試料における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置を図２(a)のときと同様に保つことができるように構成されている。

さらに、油浸系対物レンズ１は、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとなった状態のまま、各レンズ群Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の少なくとも一部を光軸に沿って所定方向に所定量移動することで、試料における所望の深度に合焦するとともに、像面での結像位置を図２(a)のときと同様に保つことができるように構成されている。

このように構成された第一実施形態の顕微鏡を用いて試料の自家蛍光を抑えながら観察する場合について説明する。なお、第一実施形態の顕微鏡は、図２(a)に示すように、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときも、自家蛍光量を考慮しなければ試料を観察することができるように構成されている。
カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にする。そして、このとき、第１レンズ群Ｇ１と第２レンズ群Ｇ２との間隔を広げ、第２レンズ群Ｇ２と第３レンズ群Ｇ３との間隔を狭め、第３レンズ群と第４レンズ群Ｇ４との間隔を狭める（図２(b)参照）。これにより、図２(a)のときと同様の試料面における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置が図２(a)のときと同様に保たれる。また、第１レンズ群Ｇ１と第２レンズ群Ｇ２との間隔を広げると、第１レンズ群Ｇ１で大きく発生する球面収差が低減される。

なお、使用するカバーガラスＣＧの厚さが異なる場合であっても、カバーガラスＣＧの厚さに対応して、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にする。そして、各レンズ群Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を光軸に沿って所定方向に移動量を調整して移動させる。これにより、図２(a)のときと同様の試料面における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置が図２(a)のときと同様に保たれる。

さらに、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にする。そして、各レンズ群Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を光軸に沿って所定方向に移動量を調整して移動させる。これにより、試料の所望深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置が図２(a)のときと同様に保たれる。

このように第一実施形態の顕微鏡によれば、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の所定深度位置を観察することができる。このため、イマージョンオイルの厚みがほぼ０になり、イマージョンオイルからの自家蛍光がほぼ０にすることができる。
上述したように、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍ程度離れている場合、そこに充填されるイマージョンオイルから生ずる自家蛍光の占める割合は、全体で生じる自家蛍光の約３０パーセントあった。
従って、第一実施形態の顕微鏡によれば、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にすることで、自家蛍光を約３０パーセント低減することができる。

また、第一実施形態の顕微鏡によれば、カバーガラスＣＧの厚さが変わっても、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の同一深度位置を観察することができる。
従って、第一実施形態の顕微鏡によれば、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にして、カバーガラスＣＧの厚さの誤差の影響を受けることなく良好な画像を観察することができる。

さらに、第一実施形態の顕微鏡によれば、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にしたままで、試料の所望深度位置を観察することができる。
従って、第一実施形態の顕微鏡によれば、観察対象範囲を探す場合には、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを大きく取って（ここでは０．１ｍｍ）観察し、蛍光観察時には、イマージョンオイルからの自家蛍光をなくして高ＳＮの蛍光像を得ることができることに加えて、試料に油浸系対物レンズ１が衝突して試料が破損するようなことを防止できるとともに、試料における深度の深い部分にも焦点を合わせることができ、従来のこの種の顕微鏡に比べて、操作性が格段に向上する。

第二実施形態
図３は本発明の第二実施形態にかかる顕微鏡における光学構成を示す模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での構成、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での構成を示している。なお、図３中、ＣＧはカバーガラス、ＳＧはカバーガラスである。
第二実施形態の顕微鏡は、試料側から順に、油浸系対物レンズ１と、結像レンズ２と、油浸系対物レンズ１と結像レンズ２との間に挿脱可能に設けられた補正レンズ３を有している。

補正レンズ３は、油浸系対物レンズ１側から順に、正の屈折力を有する第１補正レンズ群３Ｇ１と、負の屈折力を有する第２補正レンズ群３Ｇ２と、正の屈折力を有する第３補正レンズ群３Ｇ３を有して構成されている。
そして、図３(a)に示すように、試料を覆うカバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態では、補正レンズ３は光路から外され、図３(b)に示すように、図３(a)のときにおける油浸系対物レンズ１を構成する各レンズ群Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の位置関係を調整しないで、油浸系対物レンズ１全体を試料に近付けて試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズ１との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとしたときには、補正レンズ３を光路に挿入することで、図３(a)と同様の試料における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置を図３(a)のときと同様に保つことができるように構成されている。

図３(a)に示す状態では、油浸系対物レンズ１から結像レンズ２へ平行光束が出射される。油浸系対物レンズ１全体をそのまま、試料を覆うカバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１との間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとなるように近付けると、油浸系対物レンズ１からの光束は発散光束となって出射されることになる。そこで、補正レンズ３は、光路に挿入することによって、各補正レンズ群３Ｇ１，３Ｇ２，３Ｇ３を介して対物レンズ１からの発散光束を平行光束に変換して、結像レンズ２に入射するように、構成されている。
そして、補正レンズ３は、第１補正レンズ群３Ｇ１と第２補正レンズ群３Ｇ２が、主に油浸系対物レンズ１および補正レンズ３の全体の前側焦点距離を、補正レンズ３を光路に挿入しない場合における油浸系対物レンズ１および補正レンズ３の全体の前側焦点距離の値と等しくなるように調整する機能を有し、第３補正レンズ３Ｇ３が主に結像レンズ２を介した像面での結像位置を一定に保つ機能を有している。

このように構成された第二実施形態の顕微鏡を用いて試料の自家蛍光を抑えながら観察する場合について説明する。なお、第二実施形態の顕微鏡は、図３(a)に示すように、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときも、自家蛍光量の低減を考慮しなければ試料を観察することができるように構成されている。
補正レンズ３を油浸系対物レンズ１と結像レンズ２との間に挿入すると共に、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にする。なお、このとき、油浸系対物レンズ１は、各レンズ群Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の相互の位置関係が図３(a)の状態を保ったまま一体で移動させる。このように移動させると、油浸系対物レンズ１からの光束は発散光束となって出射されることになるが、補正レンズ３を光路に挿入すると、各補正レンズ群３Ｇ１，３Ｇ２，３Ｇ３を介して対物レンズ１からの発散光束が平行光束に変換されて、結像レンズ２に入射することになる。また、補正レンズ３の第１補正レンズ群３Ｇ１と第２補正レンズ群３Ｇ２を介して、主に油浸系対物レンズ１および補正レンズ３の全体の前側焦点距離が、補正レンズ３を光路に挿入しない場合における全体の前側焦点距離と等しくなるように調整され、第３補正レンズ３Ｇ３を介して主に結像レンズ２を介した像面での結像位置が一定に保たれる。

このように第二実施形態の顕微鏡によれば、補正レンズ３を介して、第一実施形態の顕微鏡と同様、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の所定深度位置を観察することができる。このため、イマージョンオイルの厚みがほぼ０になり、イマージョンオイルからの自家蛍光がほぼ０にすることができる。このため、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にすることで、自家蛍光を約３０パーセント低減することができる。

また、第二実施形態の顕微鏡によれば、補正レンズ３を介して、油浸対物レンズ1と補正レンズ3の全体の前側焦点位置および前側焦点距離を、補正レンズ３を光路に挿入しない場合における全体の前側焦点位置および前側焦点距離に変換することができる。
このため、第一実施形態の顕微鏡と同様、カバーガラスＣＧの厚さが変わっても、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の同一深度位置を観察することができ、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にして、カバーガラスＣＧの厚さの誤差の影響を受けることなく良好な画像を観察することができる。
また、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にしたままで、試料の所望深度位置を観察することができる。

従って、第二実施形態の顕微鏡によれば、観察対象範囲を探す場合には、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを大きく取って（ここでは０．１ｍｍ）観察し、蛍光観察時には、イマージョンオイルからの自家蛍光をなくして高ＳＮの蛍光像を得ることができることに加えて、試料に油浸系対物レンズ１が衝突して試料が破損するようなことを防止できるとともに、試料における深度の深い部分にも焦点を合わせることができ、従来のこの種の顕微鏡に比べて、操作性が格段に向上する。しかも、従来用いられている油浸系対物レンズ１をそのまま用いることができる。

なお、第二実施形態の顕微鏡において、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にしたままで、試料の所望深度位置を観察するには、補正レンズ３を挿入後、油浸系対物レンズ１を構成するレンズ群のうち、最も試料側のレンズよりも像側に配置された少なくとも一部のレンズを、油浸系対物レンズ１と結像レンズ２とで構成された場合であってカバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときにおいて合焦するときと同じように光軸に沿って所定方向に所定量移動させるようにすればよい。あるいは、油浸系対物レンズ１を構成するレンズ（あるいはレンズ群）は移動させないで、補正レンズ３を構成するいずれかのレンズ（あるいはレンズ群）を光軸に沿って所定方向に移動量を調整して移動させるようにしてもよい。

第三実施形態
図４は本発明の第三実施形態にかかる顕微鏡における光学構成を示す模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での構成、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での構成を示している。なお、図３中、ＣＧはカバーガラス、ＳＧはカバーガラスである。
第三実施形態の顕微鏡は、試料側から順に、油浸系対物レンズ１と、結像レンズ２と、油浸系対物レンズ１と結像レンズ２との間に設けられた補正レンズ３を有している。
なお、第三実施形態の顕微鏡は、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときも、自家蛍光量を考慮しなければ、油浸系対物レンズ１と補正レンズ３とが、図４(a)に示すような位置関係でもって配置された状態で、試料を観察することができるように構成されている。

補正レンズ３は、油浸系対物レンズ１側から順に、正の屈折力を有する第１補正レンズ群３Ｇ１と、負の屈折力を有する第２補正レンズ群３Ｇ２と、正の屈折力を有する第３補正レンズ群３Ｇ３を有して構成されている。
そして、補正レンズ３は、図４(a)のときにおける対物レンズ１を構成する各レンズ群の位置関係を調整しないで、油浸系対物レンズ１全体を試料に近付けて試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズ１との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとしたときに、図４(a)と同様の試料における所定深度位置で合焦するとともに、像面での結像位置を図４(a)のときと同様に保つことができるように構成されている。

図４(a)に示す状態では、油浸系対物レンズ１から結像レンズ２へ平行光束が出射される。油浸系対物レンズ１全体をそのまま、試料を覆うカバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１との間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとなるように近付けると、油浸系対物レンズ１からの光束は発散光束となって出射されることになる。そこで、補正レンズ３は、各補正レンズ群３Ｇ１，３Ｇ２，３Ｇ３を光軸に沿って所定方向に所定量移動することにより、対物レンズ１からの発散光束を平行光束に変換して、結像レンズ２に入射するように、構成されている。
より具体的には、補正レンズ３は、油浸系対物レンズ１の前側焦点位置と試料面とが一致している場合には、全体の倍率を１倍にし、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化したときに、油浸系対物レンズ１と第１補正レンズ群３Ｇ１との間隔が狭まり、第１補正レンズ群３Ｇ１と第２補正レンズ群３Ｇ２との間隔が広がり、第２補正レンズ群３Ｇ２と第３補正レンズ群３Ｇ３との間隔が狭まるように構成されている。
また、補正レンズ３は、第１補正レンズ群３Ｇ１と第２補正レンズ群３Ｇ２が、主に油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離を、補正レンズ３を光路に設けないで構成した場合における油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離と等しくなるように調整する機能を有し、第３補正レンズ３Ｇ３が主に結像レンズ２を介した像面での結像位置を一定に保つ機能を有している。

このように構成された第三実施形態の顕微鏡を用いて試料の自家蛍光を抑えながら観察する場合について説明する。
カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にする。なお、このとき、油浸系対物レンズ１は、各レンズ群Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の相互の位置関係が図４(a)の状態を保ったまま一体で移動させる。このように移動させると、油浸系対物レンズ１からの光束は発散光束となって出射されることになるが、補正レンズ３の各補正レンズ群３Ｇ１，３Ｇ２，３Ｇ３を介して油浸系対物レンズ１からの発散光束が平行光束に変換されて、結像レンズ２に入射することになる。また、補正レンズ３の第１補正レンズ群３Ｇ１と第２補正レンズ群３Ｇ２を介して、主に油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離が、補正レンズ３を光路に設けないで構成した場合における主に油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離と等しくなるように調整され、第３補正レンズ３Ｇ３を介して主に結像レンズ２を介した像面での結像位置が一定に保たれる。

このように第三実施形態の顕微鏡によれば、補正レンズ３を介して、第一実施形態及び第二実施形態の顕微鏡と同様、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の所定深度位置を観察することができる。このため、イマージョンオイルの厚みがほぼ０になり、イマージョンオイルからの自家蛍光がほぼ０にすることができる。このため、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にすることで、自家蛍光を約３０パーセント低減することができる。

また、第三実施形態の顕微鏡によれば、第二実施形態の顕微鏡と同様、補正レンズ３を介して、油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離および前側焦点位置を、補正レンズ３を光路に設けないで構成した場合における油浸対物レンズ１と補正レンズ３の全体の前側焦点距離および前側焦点位置に変換することができる。
このため、第一実施形態及び第二実施形態の顕微鏡と同様、カバーガラスＣＧの厚さが変わっても、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にして、試料の同一深度位置を観察することができ、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態にして、カバーガラスＣＧの厚さの誤差の影響を受けることなく良好な画像を観察することができる。
また、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にしたままで、試料の所望深度位置を観察することができる。

従って、第三実施形態の顕微鏡によれば、観察対象範囲を探す場合には、カバーガラスＣＧと油浸系対物１レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを大きく取って（ここでは０．１ｍｍ）観察し、蛍光観察時には、イマージョンオイルからの自家蛍光をなくして高ＳＮの蛍光像を得ることができることに加えて、試料に油浸系対物レンズ１が衝突して試料が破損するようなことを防止できるとともに、試料における深度の深い部分にも焦点を合わせることができ、従来のこの種の顕微鏡に比べて、操作性が格段に向上する。しかも、従来用いられている油浸系対物レンズをそのまま用いることができる。

なお、第三実施形態の顕微鏡において、カバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤをほぼ０に近い状態（０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍ）にしたままで、試料の所望深度位置を観察するには、油浸系対物レンズを構成するレンズ群のうち、最も試料側のレンズよりも像側に配置された少なくとも一部のレンズを、油浸系対物レンズ１と結像レンズ２とで構成された場合であってカバーガラスＣＧと油浸系対物レンズ１における最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときにおいて合焦するときと同じように光軸に沿って所定方向に所定量移動させるようにすればよい。あるいは、油浸系対物レンズ１を構成するレンズは移動させないで、補正レンズ３を構成するいずれかのレンズを光軸に沿ってさらに所定方向に移動量を調整して移動させるようにしてもよい。

本発明の油浸系対物レンズを用いた顕微鏡、及び油浸系対物レンズを用いた顕微鏡の観察方法は、生体の機能解明や蛋白質の挙動解析・相互作用の解明などを目的として生体細胞等の試料から発する蛍光等を観察するために油浸系対物レンズを使用することが必要とされる分野において有用である。

本発明の第一実施形態にかかる顕微鏡に用いる油浸系対物レンズの試料との位置関係を示す説明図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの位置関係、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの位置関係を示している。図１に示した油浸系対物レンズを構成するレンズ群の模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での各レンズ群の位置関係、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での各レンズ群の位置関係を示している。本発明の第二実施形態にかかる顕微鏡における光学構成を示す模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での構成、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での構成を示している。本発明の第三実施形態にかかる顕微鏡における光学構成を示す模式図であり、(a)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０．１ｍｍのときの合焦状態での構成、(b)は試料を覆うカバーガラスと油浸系対物レンズとの間の作動距離ＷＤが０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍのときの合焦状態での構成を示している。

符号の説明

１油浸系対物レンズ
２結像レンズ
３補正レンズ
Ｇ１第１レンズ群
Ｇ２第２レンズ群
Ｇ３第３レンズ群
Ｇ４第４レンズ群
３Ｇ１第１補正レンズ群
３Ｇ２第２補正レンズ群
３Ｇ３第３補正レンズ群
ＣＧカバーガラス
ＳＧスライドガラス

Claims

試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡において、
前記油浸系対物レンズが、試料側から順に、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第１レンズ群と、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第２レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として正の屈折力を持つ第３レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として負の屈折力を持つ第４レンズ群とを有し、
前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化したときに、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群との間隔が広がり、前記第２レンズと前記第３レンズとの間隔が狭まり、前記第３レンズ群と前記第４レンズ群との間隔が狭まることで、試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されていることを特徴とする顕微鏡。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記カバーガラスの厚さに対応して、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整するように構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の顕微鏡。
試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡において、
前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に補正レンズを備え、
前記補正レンズが、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備わることにより、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に補正レンズを備えない場合における前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤであるときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えることを特徴とする顕微鏡。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えることを特徴とする請求項５又は６に記載の顕微鏡。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整する機能を備えることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の顕微鏡。
前記補正レンズが、前記油浸系対物レンズ側から順に、正の屈折力を持つ第１補正レンズ群と、負の屈折力を持つ第２補正レンズ群と、正の屈折力を持つ第３補正レンズ群を有して構成され、且つ、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に備えられ、
前記補正レンズを前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿入することにより、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときに、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとで構成された場合であって前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えると共に、前記第３レンズ群が、像面での結像位置を一定に保つ機能を備えることを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡。
前記油浸系対物レンズの前側焦点位置と試料面とが一致している場合には、倍率が１倍になり、前記作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍへと変化したときに、前記油浸系対物レンズと前記第１補正レンズ群との間隔が狭まり、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群との間隔が広がり、前記第２補正レンズ群と前記第３補正レンズ群との間隔が狭まるように構成されていることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡の観察方法において、
前記油浸系対物レンズとして、試料側から順に、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第１レンズ群と、最も像側の面が凸面で構成され、全体として正の屈折力を持つ第２レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として正の屈折力を持つ第３レンズ群と、接合レンズを含んで構成され、全体として負の屈折力を持つ第４レンズ群とを有する油浸系対物レンズを用い、
前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにするときに、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群との間隔を広げ、前記第２レンズと前記第３レンズとの間隔を狭め、前記第３レンズ群と前記第４レンズ群との間隔を狭めて、試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする顕微鏡の観察方法。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１１に記載の顕微鏡の観察方法。
前記カバーガラスの厚さに対応して、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１１又は１２に記載の顕微鏡の観察方法。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の顕微鏡の観察方法。
試料を保護するカバーガラスと最も試料側のレンズ面との間に油を充填して観察する、油浸系対物レンズと結像レンズを有する顕微鏡の観察方法において、
前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えた場合に、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置が、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えない場合における前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤが０．０３ｍｍ＜ＷＤであるときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにする機能を備えた補正レンズを、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に備えることを特徴とする顕微鏡の観察方法。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で試料の所定深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡の観察方法。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料上の同一深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１５又は１６に記載の顕微鏡の観察方法。
前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにした状態で像面での結像位置を一定に保ちながら試料内の所望深度位置に合焦するように、前側焦点距離および前側焦点位置を調整することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の顕微鏡の観察方法。
前記補正レンズを、前記油浸系対物レンズ側から順に、正の屈折力を持つ第１補正レンズ群と、負の屈折力を持つ第２補正レンズ群と、正の屈折力を持つ第３補正レンズ群を有して構成し、且つ、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に備え、
前記補正レンズを前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとの間に挿入し、前記作動距離ＷＤを０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍとして、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群を介して、前記油浸系対物レンズと前記結像レンズとで構成された場合であって前記作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤにしたときの前側焦点距離および前側焦点位置と同じとなるようにすると共に、前記第３レンズ群を介して、像面での結像位置を一定に保つことを特徴とする請求項１８に記載の顕微鏡の観察方法。
前記油浸系対物レンズの前側焦点位置と試料面とが一致している場合には、倍率が１倍になるようにし、前記カバーガラスと前記油浸系対物レンズにおける最も試料側のレンズ面との間の作動距離ＷＤを０．０３ｍｍ＜ＷＤから０＜ＷＤ≦０．０３ｍｍにするときに、前記油浸系対物レンズと前記第１補正レンズ群との間隔を狭め、前記第１補正レンズ群と前記第２補正レンズ群との間隔を広げ、前記第２補正レンズ群と前記第３補正レンズ群との間隔を狭めることを特徴とする請求項１９に記載の顕微鏡の観察方法。