JP5354835B2 - 抗ｃｄ３３抗体、及びそれを用いた急性骨髄性白血病の治療方法 - Google Patents

抗ｃｄ３３抗体、及びそれを用いた急性骨髄性白血病の治療方法 Download PDF

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Description

[01] 本出願は、２００２年１１月７日に出願された仮出願番号６０／４２４，３３２の利益を請求し、その開示を、本明細書において参照によって援用する。
発明の属する技術分野
[02] 本発明は、ＣＤ３３に結合する抗体に関するものである。より詳細には、本発明は、抗ＣＤ３３抗体、前記抗体のフラグメント及びホモログ、前記抗体のヒト化型及び表面再構築化型、前記抗体の機能的等価物及び改良型、免疫複合体、及び前記抗体を含む組成物、ならびに、診断、研究及び治療への応用にそれらを用いることに関するものである。
[03] 別の側面において、本発明は、該抗体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、及び該抗体の産生方法に関するものである。
発明の背景
[04] 白血球の分化抗原ＣＤ３３は、ミエリンに関連する糖タンパク質及びＣＤ２２を含むシアロアドヘシンファミリーのメンバー、ならびにシアロアドヘシン自体と配列相同性を有する、３６４アミノ酸の膜貫通型糖タンパク質である（Ｓ．Ｐｅｉｐｅｒ，２００２年、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩＩ，Ｗｈｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，オックスフォード大学プレス、７７７ページ）。
[05] ＣＤ３３の発現は、造血区画に非常に特異的であるようにみえ、骨髄前駆細胞よる強い発現を伴う（Ｓ．Ｐｅｉｐｅｒ，２００２年）。これは、成熟及び分化すると発現は低減するが、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ及びＢＦＵ−Ｅなどの骨髄前駆細胞、単球／マクロファージ、前骨髄球及び骨髄球などの顆粒球前駆体、ならびに、発現レベルは低いが、成熟顆粒球によって、発現される（Ｓ．Ｐｅｉｐｅｒ，２００２年）。
[06] 対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて「芽球コロニー」を生じさせる多能性造血幹細胞（Ｌｅａｒｙ，Ａ．Ｇ．ら、１９８７年、Ｂｌｏｏｄ ６９：９５３）及び造血性長期髄培養物を誘導する多能性造血幹細胞（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｒ．Ｇ．ら、１９８９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７２１；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．ら、１９８９年、Ｂｌｏｏｄ ７４：１５６３）は、ＣＤ３３の発現を欠くようにみえる。
[07] ＣＤ３３の具体的な機能は不明であるが、そのシアロアドヘシンとの相同性は、レクチンファミリーの糖結合特性における役割を示唆し、役割は後に確認された（Ｓ．Ｐｅｉｐｅｒ，２００２年）。
[08] 重要なことには、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体は、クローン原性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞が、ヒト症例の８０％超においてＣＤ３３を発現することを示した（ＬａＲｕｓｓａ，Ｖ．Ｆ．ら、１９９２年、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：４４２−４４８）。
[09] ＣＤ３３を選択的に発現することから、ＡＭＬ細胞の選択的ターゲティングに、細胞毒性薬物を、ＣＤ３３を特異的に認識しそして結合するモノクローナル抗体と組み合わせた免疫複合体を用いることが提案されている。このような治療には、幹細胞及び初期造血前駆体を影響を受けないままにすることが期待される。抗ＣＤ３３抗体を利用する免疫複合体には、ＡＭＬ細胞に非常に致死的であるが（Ｒｏｙ，Ｄ．Ｃ．ら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７７：２４０４；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３２３４）正常な造血及び造血再形成を支持する幹細胞は残す（ＬａＲｕｓｓａ，Ｖ．Ｆ．ら、１９９２年、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：４４２−４４８）ことが示されている、抗ＣＤ３３−リシン免疫複合体が含まれる。
[10] 免疫複合体を用いた追加の試験は、静脈内投与した場合に、放射性標識抗ＣＤ３３抗体の末梢血及び髄の中の白血病芽細胞に対する迅速なターゲティングを示した（Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．ら、１９９１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９：４７８−４９０；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．ら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：２９４−３０３）。標的細胞による抗体の迅速なインターナリゼーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験においても認められた（Ｔａｎｉｍｏｔ，Ｍら、１９８９年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３：３３９−３４８；Ｄｉｖｇｉ，Ｃ．Ｒ．ら、１９８９年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．Ｖｏｌ．３０：４０４ａ）。強力な抗腫瘍抗生物質であるカリケアマイシンと結合したヒト化抗ＣＤ３３抗体（ゲムツズマブ・オゾガマイシン）の前臨床試験における評価は、ＨＬ−６０細胞培養物、マウスにおけるＨＬ−６０腫瘍異種移植片、及びＡＭＬ患者由来の髄試料において、白血病細胞の特異的な死滅を示した（Ｈａｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．ら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：４７−５８）。
[11] これら前臨床試験の正の結果に基づき、ゲムツズマブ・オゾガマイシンを、第Ｉ及びＩＩ相臨床試験において評価した。第Ｉ相試験において、認められた主な毒性は、骨髄前駆細胞上にＣＤ３３が発現することによる骨髄抑制であった（Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．ら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ ９３：３６７８−３６８４；Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｅ．Ｌ．ら、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：３２４４−３２５４）。９ｍｇ／ｍ２の用量を４時間かけて静脈内注射し１４日後に反復した第ＩＩ相試験は、３０％の奏功率をもたらした。ゲムツズマブ・オゾガマイシンの販売承認は、２０００年５月に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認められ、その適応は、６０歳かまたはそれより高齢であってそして細胞毒性化学療法の候補であると思われない、ＣＤ３３陽性ＡＭＬを伴う初回再発患者の治療に対するものであった。市販後報告は、重大な毒性、特に静脈閉塞病（ＶＯＤ）の潜在性を示唆し、添付文書の改訂及び患者のサーベイランスプログラムの開始をもたらした。この毒性の多くは、前臨床モデルにおいて肝毒性を引き起こすことが示された薬物成分カリケアマイシンに関連する可能性があり、それゆえＣＤ３３を標的とすることの直接的な結果でない可能性がある。
[12] 先に論じた結果は、抗ＣＤ３３抗体及び細胞毒性薬物を含む免疫複合体が、ＡＭＬの治療において用いられることに成功する可能性があることを示唆するが、一方で、安全かつ効果的な免疫複合体の要求がある。本発明は、これら及びその他の重要な結果を対象とする。
発明の概要
[13] したがって、特異的にＣＤ３３に結合しそしてＡＭＬの治療に用いられる可能性のある抗体を提供することが、本発明の目的である。
[14] それゆえに、第一の態様において、ＣＤ３３への結合能を有する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが提供される。
[15] 第二の態様において、ネズミ抗体Ｍｙ９−６が提供され、その軽鎖及び重鎖可変領域双方のアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子のｃＤＮＡ配列、そのＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、その表面アミノ酸の同定、及び、組換え型でそれを発現する手段に関して、本明細書において完全に特徴付けられる。
[16] 第三の態様において、Ｍｙ９−６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの表面露出残基を、より厳密に公知のヒト抗体表面に類似するように、軽鎖及び重鎖双方において置換した、ヒト化または表面再構築化型Ｍｙ９−６抗体が提供される。このようなヒト化抗体は、ネズミＭｙ９−６と比較して、治療または診断剤としての有用性が増加する可能性がある。抗体Ｍｙ９−６のヒト化型もまた、軽鎖及び重鎖可変領域双方のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、その表面アミノ酸の同定、及び、組換え型でそれらを発現する手段の開示に関して、本明細書において完全に特徴付けられる。
[17] さらなる態様において、配列番号１〜６：
ＳＹＹＩＨ（配列番号１）、
ＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号２）、ここでＸはＫまたはＱである、
ＥＶＲＬＲＹＦＤＶ（配列番号３）、
ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）、
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）、
ＨＱＹＬＳＳＲＴ（配列番号６）、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含み、そしてＣＤ３３への結合能を有する、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが提供される。
[18] さらなる態様において、少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが提供され、ここで前記重鎖可変領域は、配列番号１〜３：
ＳＹＹＩＨ（配列番号１）、
ＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号２）、ここでＸはＫまたはＱである、
ＥＶＲＬＲＹＦＤＶ（配列番号３）、
によってそれぞれ表されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含み、そして、前記軽鎖可変領域は、配列番号４〜６：
ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）、
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）、
ＨＱＹＬＳＳＲＴ（配列番号６）、
によってそれぞれ表されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含む。
[19] さらなる態様において、配列番号７：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ、
によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を、さらに好ましくは配列番号７と９５％の配列同一性を、最も好ましくは配列番号７と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域を有する抗体が提供される。
[20] 同様に、配列番号８：
ＮＩＭＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＳＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ、
によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を、さらに好ましくは配列番号８と９５％の配列同一性を、最も好ましくは配列番号８と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域を有する抗体が提供される。
[21] さらなる態様において、配列番号９：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、
によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を、さらに好ましくは配列番号９と９５％の配列同一性を、最も好ましくは配列番号９と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構築化された重鎖可変領域を有する抗体が提供される。
[22] 同様に、配列番号１０：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ、
によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を、さらに好ましくは配列番号１０と９５％の配列同一性を、最も好ましくは配列番号１０と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構築化された軽鎖可変領域を有する抗体が提供される。
[23] さらなる態様において、本発明は、直接的に、または切断可能であるかもしくは切断可能でないリンカーを介して、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに共有結合した、薬物またはプロドラッグを含む免疫複合体を提供する。好ましい態様において、薬物またはプロドラッグは、メイタンシノイド、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５アナログ、ドラスタチン及びドラスタチンアナログなどの細胞毒性薬物またはプロドラッグである。
[24] さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、ならびに、薬物またはプロドラッグを含む、組成物を提供する。
[25] さらなる態様において、本発明は、１またはそれより多くの医薬的に許容可能な薬剤の存在下で、本発明の抗体、そのエピトープ結合フラグメントまたは免疫複合体を、単独で、あるいは薬物もしくはプロドラッグまたは他の治療剤と組み合わせて含む、医薬組成物を含む。
[26] さらなる態様において、本発明は、研究または診断への適用のために標識した抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。好ましい態様において、標識は、ビオチン標識、酵素標識、放射性標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤または金属イオンである。
[27] さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、そのエピトープ結合フラグメントまたは免疫複合体を、単独で、あるいは薬物もしくはプロドラッグまたは他の治療剤と組み合わせ、さらには、単独で、あるいは１またはそれより多くの医薬的に許容可能な薬剤の存在下で用いることを介して、ＣＤ３３を発現している細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
[28] さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３３を発現する疾患を有する個体の治療方法を提供し、該方法は、本発明の抗体、そのエピトープ結合フラグメントまたは免疫複合体を、単独で、あるいは別の薬物もしくはプロドラッグまたは別の治療剤と組み合わせ、さらには、単独で、あるいは１またはそれより多くの医薬的に許容可能な薬剤の存在下で投与することを含む。疾患は、例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）、あるいはＣＤ３３を発現することが未だ判定されていない他疾患の、１またはそれより多くであってもよい。
[29] 治療方法は、単独で、あるいは薬物もしくはプロドラッグまたは他の治療剤と組み合わせ、さらには、単独で、あるいは１またはそれより多くの医薬的に許容可能な薬剤の存在下において、本発明の抗体、抗体フラグメント及び免疫複合体をｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにて適用することを含む。
[30] さらなる態様において、生体試料が骨髄性癌細胞を含有するかどうかを判定する方法が提供され、該方法では、生体試料を本発明の標識した抗体またはそのエピトープ結合フラグメントなどの診断試薬と接触させ、そして試料内の試薬の分布を検出する。この方法を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）などの癌を診断するのに用いてもよい。
[31] さらなる態様において、改良された特性を有する、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが提供される。例えば、ＣＤ３３への親和性が改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを、動物免疫化、ハイブリドーマ形成、及び特異的性質を備えた抗体の選択という標準的な技術によって、作製してもよい。
[32] 改良された抗体を、例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異誘発株の使用を介して、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを親和性成熟させることによって、作製してもよい。
[33] さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、組換えベクターで形質転換された宿主細胞、及び、前記抗体及びそのエピトープ結合フラグメントを前記宿主細胞を培養することによって産生する方法を、提供する。
[34] 最終の態様において、本発明は、本発明の抗体及びそのエピトープ結合フラグメントを用いて、ＣＤ３３を生体物質から得る方法を提供する。
発明の詳細な説明
[62] 本発明は、新規ネズミ抗ＣＤ３３抗体及びこの抗体のヒト化型を提供する。さらに、ＣＤ３３を特異的に認識しそして結合するネズミ抗ＣＤ３３抗体またはそのヒト化型のＣＤＲを１またはそれより多く含む抗体を、提供する。
[63] ネズミＭｙ９−６抗体
[64] 本発明のネズミ抗ＣＤ３３抗体を、本明細書では「Ｍｙ９−６］、「ネズミＭｙ９−６」及び「ｍｕＭｙ９−６」と様々に表し、軽鎖及び重鎖可変領域の双方の推定生殖系列アミノ酸配列（図１０）、軽鎖及び重鎖可変領域の双方のアミノ酸配列（図８Ａ及びＢ）、ＣＤＲの同定（図９）、表面アミノ酸の同定（図１３Ａ及びＢ）、及びそれを組換え型で発現する手段に関して、完全に特徴付ける。
[65] Ｍｙ９−６抗体をさらに機能的に特徴付け、そして、ＣＤ３３陽性のＵ−９３７細胞表面のＣＤ３３と高い親和性で結合することを示した（図１）。１２５Ｉ−標識Ｍｙ９−６は、Ｕ−９３７細胞に結合し、そして、非標識Ｍｙ９−６及びすでに特徴付けられた抗ＣＤ３３抗体Ｍｙ９（バイオジェネックス、カタログ番号２６７Ｍ）と、細胞外で競合する。
[66] 「可変領域」の語を、本明細書では、抗体間で配列が異なりそして特定の抗体それぞれのその抗原に対する結合性及び特異性に協調する、抗体重鎖及び軽鎖の特定部分を記載するのに用いる。可変性は、通常は、抗体可変領域全体にわたって均等に分布しない。これは、軽鎖及び重鎖可変領域の双方における、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される可変領域の３つのセグメント内に、典型的には集中する。より高度に保存された可変領域の一部分は、フレームワーク領域と称される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、大部分がβ−シートの立体配置を取る４つのフレームワーク領域を含み、各フレームワーク領域は、β−シート構造と連結するループを形成しそして時にはβ−シート構造の一部を形成する、３つのＣＤＲと連結する。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって非常に近接して保持され、そして、もう一方の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、１９９１年、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ））。
[67] 「定常」領域は、抗体の抗原との結合には直接的に関与しないが、しかし、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与などの様々なエフェクター機能を示す。
[68] ヒト化Ｍｙ９−６抗体
[69] Ｍｙ９−６のヒト化型を、本明細書では「ｈｕＭｙ９−６」及び「ヒト化Ｍｙ９−６」と様々に表し、これもまた調製した。
[70] ヒト化の目的は、ネズミ抗体などの異種抗体の免疫原性を、抗体の抗原結合親和性及び特異性を完全に維持しながら、ヒトへ導入する目的で低減させることである。
[71] ヒト化抗体を、表面再構築化及びＣＤＲグラフトなどのいくつかの技術を用いて作出してもよい。本明細書では、表面再構築化の技術は、標的宿主の公知の抗体の表面に類似するように抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変えるために、分子モデリング、統計解析及び変異誘発の組み合わせを用いる。
[72] 抗体の表面再構築化の戦略及び方法、ならびに異宿主内で抗体の免疫原性を低減させる他の方法は、米国特許第５，６３９，６４１（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら）に開示されており、本明細書ではそのすべてを参照によって援用する。簡潔に言えば、好ましい方法において、（１）抗体の重鎖及び軽鎖可変領域プールの位置アラインメントを、一連の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面に曝露する位置を与えるように行い、ここで、すべての可変領域に対するアラインメント位置は少なくとも約９８％同一である；（２）一連の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を、げっ歯類抗体（またはそのフラグメント）について定め；（３）一連のげっ歯類の表面に露出するアミノ酸残基と極めて同一である、一連の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を同定し；（４）工程（２）において定義した、一連の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を、げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子から５Å以内にある、これらのアミノ酸残基を除いて、工程（３）において定義した、一連の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基で置換し；そして、（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体を作出する。
[73] 抗体を、種々の他の技術を用いてヒト化することが可能であり、該技術には、ＣＤＲグラフト（ＥＰ ０ ２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１；及び５，５８５，０８９）、ベニアリングまたは表面再構築化（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．，１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ．Ｍ．ら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら、１９９４年、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３）、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２）が含まれる。ヒト抗体を、ファージ・ディスプレイ法を含む、当該技術分野において公知の種々の方法によって作製することが可能である。米国特許第４，４４４，８８７、４，７１６，１１１、５，５４５，８０６及び５，８１４，３１８；及び、国際特許出願公開番号ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、及びＷＯ ９１／１０７４１もまた、参照されたい（前記参考文献は、そのすべてを参照によって援用する）。
[74] 本明細書においてさらに記載されるように、Ｍｙ９−６のＣＤＲをモデリングによって同定し、そしてその分子構造を予測した。次いで、ヒト化Ｍｙ９−６抗体を作製し、そして完全に特徴付けた。いくつかのｈｕＭｙ９−６抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を、図１６Ａ及び１６Ｂに示す。ネズミ及びヒト化Ｍｙ９−６抗体の結合値の比較を、図１７に提供する。抗体の結合曲線を、図１８に示す。
[75] Ｍｙ９−６抗体のエピトープ結合フラグメント
[76] ネズミＭｙ９−６抗体及びヒト化Ｍｙ９−６抗体のエピトープ結合フラグメントについて、本明細書では、ネズミＭｙ９−６抗体及びそのヒト化型とは別々に論じるが、本発明の「抗体（単数形）」または「抗体（複数形）」の語は、完全長のｍｕＭｙ９−６及びｈｕＭｙ９−６抗体の双方ならびにこれらの抗体のエピトープ結合フラグメントを含んでもよいことが、理解される。
[77] 本明細書では、「抗体フラグメント」は、一般に「エピトープ結合フラグメント」と称される、ＣＤ３３への結合能を保持する抗体の任意の一部分を含む。抗体フラグメントの例には、好ましくは、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドで連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、及びＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれる。一本鎖抗体を含む、エピトープ結合フラグメントは、可変領域（単数形もしくは複数形）を、単独で、あるいは以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体または一部分と組み合わせて含んでもよい。
[78] このようなフラグメントは、片方もしくは両方のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含有してもよい。３、４または５つのＣＤＲなど、このような領域をすべてよりも少なく含有するフラグメントもまた機能的ではあるが、好ましくは、抗体フラグメントは、抗体全体のすべての６つのＣＤＲを含有する。さらには、機能的等価物は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、及びそのサブクラスのいずれか一つのメンバーであってもよいか、あるいは組み合わせてもよい。
[79] Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを、パパイン（Ｆａｂフラグメント）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）などの酵素を用いて、タンパク質分解性切断によって作出してもよい。
[80] 一本鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのフラグメントと連結した、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つのフラグメントを含有する、エピトープ結合フラグメントである。リンカーは、それらが一本鎖抗体フラグメントの由来する抗体全体の標的分子結合特異性を維持するように連結すると、（ＶＬ）または（ＶＨ）領域の適切な三次元の折り畳み構造が生じることを確実にするように選択された、短くフレキシブルなペプチドであってもよい。（ＶＬ）または（ＶＨ）配列のカルボキシル末端を、相補的な（ＶＬ）または（ＶＨ）配列のアミノ酸末端と、リンカーで共有結合させてもよい。一本鎖抗体フラグメントを、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリーまたは当業者に周知の同様な技術によって、作製してもよい。これらのタンパク質を、例えば、真核細胞、または細菌を含む原核細胞において産生してもよい。
[81] 本発明のエピトープ結合フラグメントもまた、当該技術分野において公知の種々のファージディスプレイ法を用いて作製してよい。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示する。特に、このようなファージを、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはネズミ）から発現させたエピトープ結合ドメインを提示するのに利用することが可能である。目的の抗原と結合するエピトープ結合ドメインを発現しているファージを、抗原を用いて、例えば、標識ＣＤ３３、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されたＣＤ３３を用いて、選択または同定することが可能である。これらの方法において用いるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え技術により融合させた、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドで安定化したＦｖ抗体ドメインとともにファージから発現する、ｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファージである。
[82] 本発明のエピトープ結合フラグメントを作製するのに用いることが可能なファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０；Ａｍｅｓら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７年、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４年、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；及び、米国特許第５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８において開示されたものが含まれ；そのそれぞれは、本明細書においてそのすべてを参照によって援用する。
[83] ファージを選択した後、フラグメントをコードするファージの領域を単離し、そしてエピトープ結合フラグメントを、例えば以下に詳細に記載するような組換えＤＮＡ技術を用いて、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む、選択した宿主における発現を介して作製するのに用いることが可能である。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え技術により作出する技術もまた、ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、１９９２年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉら、１９９５年、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４；及び、Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３において開示されたものなどの、当該技術分野において公知の方法を用いて使用することが可能であり；前記参考文献は、そのすべてを参照によって援用する。一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために用いることができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８および５，２５８，４９８；Ｈｕｓｔｏｎら、１９９１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８；Ｓｈｕら、１９９３年、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９；Ｓｋｅｒｒａら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０；に記載のものが含まれる。
[84] 機能的等価物
[85] Ｍｙ９−６抗体及びヒト化Ｍｙ９−６抗体の機能的等価物もまた、本発明の範囲内に含まれる。「機能的等価物」の語には、例えば各機能的等価物がそのＣＤ３３への結合能によって定義される、相同配列を有する抗体、キメラ抗体、修飾抗体及び人工抗体が含まれる。当業者は、「抗体フラグメント」と称される分子群及び「機能的等価物」と称される群に重複があることを、理解するであろう。
[86] 相同配列を有する抗体とは、本発明のネズミＭｙ９−６及びヒト化Ｍｙ９−６抗体のアミノ酸配列と配列同一性または相同性を有するアミノ酸配列を有する、これらの抗体である。好ましくは、同一性は、本発明のネズミＭｙ９−６及びヒト化Ｍｙ９−６抗体の可変領域のアミノ酸配列とである。本明細書においてアミノ酸配列に適用されるような「配列同一性」及び「配列相同性」を、例えばＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４−２４４８（１９８８年）にしたがったＦＡＳＴＡ検索法によって決定されるように、別のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％または９４％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列として、定義する。
[87] 本明細書では、キメラ抗体とは、抗体の異なる一部分が異なる動物種に由来する抗体である。例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域と組にして、ネズミモノクローナル抗体由来の可変領域を有する抗体である。キメラ抗体を作出する方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２；Ｏｉら、１９８６年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；及び、４，８１６，３９７を参照されたく、そのすべてを本明細書では参照によって援用する。
[88] 人工抗体には、ｓｃＦｖフラグメント、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びｍｒｕが含まれ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，１９９９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１：５４８−５５７による総説を参照されたい）、そのそれぞれは抗原結合能を有する。一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）において、抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、フレキシブルペプチドによって連結される。典型的には、このリンカーペプチドは、約１５アミノ酸残基長である。リンカーが例えば５アミノ酸と、それよりもかなり小さいならば、二価のｓｃＦｖ二量体である二重特異性抗体が形成される。リンカーが、３アミノ酸残基よりも少なく低減されるならば、三重特異性抗体または四重特異性抗体と称される三量体及び四量体構造が形成される。抗体の最小結合単位はＣＤＲであり、典型的には、単独で用いることが可能な、十分な特異的認識及び結合性を有する重鎖のＣＤＲ２である。このようなフラグメントは、分子認識単位またはｍｒｕと称される。いくつかのこのようなｍｒｕを、短いリンカーペプチドで連結して合わせることが可能であり、したがって、１つのｍｒｕよりも高度な結合力を有する人工の結合タンパク質が形成される。
[89] 本出願の機能的等価物には、例えば任意の種類の分子と抗体との共有結合によって修飾される抗体などの、修飾抗体も含まれる。例えば、修飾抗体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾されている抗体が含まれる。共有結合は、抗体が抗イデオタイプ反応を起こすことを妨げない。これらの修飾は、公知の技術によって実行されてもよく、非限定的に、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む。加えて、修飾抗体は、１またはそれより多くの非古典的アミノ酸を含有してもよい。
[90] 機能的等価物を、異なる鎖上の異なるＣＤＲを異なるフレームワーク内で交換することによって、作出してもよい。したがって、例えば、異なる分類の抗体は、所与の一連のＣＤＲについて、異なる重鎖を置換することによって可能であり、それによって、例えばＩｇＧ１〜４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１〜２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体種類及びアイソタイプを作出してもよい。同様に、本発明の範囲内の人工抗体を、所与の一連のＣＤＲを完全合成したフレームワーク内に組込むことによって、作出してもよい。
[91] 機能的等価物を、当該技術分野において公知の多種多様な方法を用いて、特定の一連のＣＤＲに隣接する可変及び／または定常領域配列内で変異、欠失及び／または挿入を行うことによって、容易に作出してもよい。
[92] 本発明の抗体フラグメント及び機能的等価物は、ネズミＭｙ９−６抗体と比較した場合に、検出可能な程度のＣＤ３３との結合性を有するこれらの分子を包含する。検出可能な程度の結合性には、ネズミＭｙ９−６抗体のＣＤ３３への結合能の、少なくとも１０〜１００％の範囲内のすべての値、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が含まれる。
[93] 改良抗体
[94] ＣＤＲは、エピトープ認識及び抗体結合に最も重要である。しかしながら、抗体がその同族のエピトープを認識しそして結合する能力を妨げずに、ＣＤＲを含む残基を変えてもよい。例えば、エピトープ認識には影響を与えないが、エピトープに対する抗体の結合親和性を増加させる変化を行ってもよい。
[95] このように、特異的にＣＤ３３を認識しそして結合し、好ましくは親和性の増加を伴った、ネズミ及びヒト化抗体双方の改良型もまた、本発明の範囲に含まれる。
[96] いくつかの試験によって、抗体の配列中の種々の位置に１またはそれより多くのアミノ酸の変更を導入する影響が、第一抗体配列の知見ならびに結合性及び発現レベルなどのその特性に基づき、調査された（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ら、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ，Ｃ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９）。
[97] これらの試験では、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、変異性ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリングまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異誘発株などの方法を用いて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３またはフレームワーク領域において重鎖及び軽鎖遺伝子配列を変えることによって、第一の抗体の等価物が作製された（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９；Ａｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ら、１９９６年、第１６章、２７７〜２９１ページ、「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」中、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら編集、アカデミック・プレス）。第一の抗体の配列を変えるこれらの方法は、結果として第二の抗体の親和性の改良をもたらした（Ｇｒａｍ，Ｈ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２，１６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８；Ｓｈｏｒｔ，Ｍ．Ｋ．ら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｋ．ら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２７６２２−２７６２８）。
[98] 抗体の１またはそれより多くのアミノ酸残基を変更するという同様な方向性のストラテジーによって、本明細書に記載される抗体配列を、ＣＤ３３に対する改良された親和性を含む、改良された機能を伴う抗ＣＤ３３抗体を開発するのに用いることが可能である。
[99] 改良抗体には、動物の免疫化、ハイブリドーマ形成及び特異的な特徴を有する抗体の選択という標準的な技術によって作製される、改良された特徴を有するこれらの抗体もまた含まれる。
[100] 免疫複合体
[101] 本発明はまた、薬物またはプロドラッグと連結させた、本明細書において開示されるような抗体、抗体フラグメント、機能的等価物、改良抗体及びそのアナログを含む、免疫複合体も対象とする。好ましい薬物またはプロドラッグは細胞毒性剤であり、そして例えば、メイタンシノイド類及びメイタンシノイドアナログ、タキソイド類、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５アナログ、ドラスタチン及びドラスタチンアナログが含まれる。
[102] 該免疫複合体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって作製してもよい。薬物またはプロドラッグを抗体と連結させるために、連結基が用いられる。適当な連結基は、当該技術分野において周知であり、そして、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基及びエステラーゼに不安定な基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基及びチオエーテル基である。例えば、複合体を、ジスルフィド交換反応を用いるか、または抗体と薬剤もしくはプロドラッグとの間にチオエーテル結合を形成することによって、構築することが可能である。
[103] メイタンシノイド類及びメイタンシノイドアナログは、好ましい細胞毒性剤に含まれる。適切なメイタンシノイド類の例には、メイタンシノール及びメイタンシノールアナログが含まれる。適切なメイタンシノイド類は、米国特許第４，４２４，２１９；４，２５６，７４６；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６２，６６３；４，３６４，８６６；４，４５０，２５４；４，３２２，３４８；４，３７１，５３３；６，３３３，４１０；５，４７５，０９２；５，５８５，４９９及び５，８４６，５４５に開示されている。
[104] メイタンシノイド類に関して、連結基は、反応性化学基を含んでもよい。好ましい態様において、反応性化学基は、ジスルフィド結合によって連結した部分を介してメイタンシノイドと共有結合することが可能である。
[105] 特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステル類及びＮ−スルホスクシンイミジルエステル類である。
[106] 反応性化学基を含有する連結基を含む、特に好ましいメイタンシノイド類は、連結部分がジスルフィド結合を含有し、そして化学反応基がＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む、メイタンシノールのＣ−３エステル類及びそのアナログである。
[107] メイタンシノイド類における多くの位は、連結部分と化学的に連結するための位として働くことが可能である。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位は、いずれも有用であることが期待される。しかしながら、Ｃ−３位が好ましく、そしてメイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
[108] 他の化学結合には、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合及びエステラーゼに不安定な結合が含まれる。本明細書において援用する、米国特許第５，２０８，０２０の開示は、このような結合を有するメイタンシノイド類の産生について教示している。
[109] 以下に詳細に記載するように、免疫複合体Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、チオールを含有するメイタンシノイド（ＤＭ１）を利用する。ＤＭ１は、以下の構造式（１）によって表される：
Figure 0005354835
[110] タキサン類もまた、好ましい細胞毒性剤である。本発明において用いるのに適したタキサン類は、米国特許第６，３７２，７３８及び６，３４０，７０１に開示されている。本発明のタキサン類と細胞結合剤との複合体を、現在公知の、または後に開発される任意の技術を用いて、形成することが可能である。複合体形成の多数の方法が、ＵＳＰ ５，４１６，０６４及びＵＳＰ ５，４７５，０９２において教示される。
[111] ＣＣ−１０６５及びそのアナログもまた、本発明において用いるのに好ましい細胞毒性薬物である。ＣＣ−１０６５及びそのアナログは、米国特許第６，３７２，７３８；６，３４０，７０１；５，８４６，５４５；及び、５，５８５，４９９において開示されている。ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養液から単離された、強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンクリスチンなどの一般的に用いられている抗癌剤よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ．Ｂｈｕｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７（１９８２年））。
[112] メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、ドラスタチン及びドラスタチンアナログなどの薬物もまた、本発明の複合体を作製するのに適している。薬物分子はまた、血清アルブミンなどの中間キャリア分子を介して抗体分子と連結することが可能である。
[113] ＣＤ３３を発現する細胞の増殖阻害
[114] ＣＤ３３を発現する細胞の増殖を阻害する方法もまた、本発明に含まれる。これらの方法は、本発明の抗体または免疫複合体、ならびに、１またはそれより多くの追加の治療剤と結合した本発明の抗体または免疫複合体を利用する。適切な治療剤には、ＣＤ３３を発現する細胞の増殖を直接的または間接的に阻害するものが含まれる。
[115] 本明細書では、「阻害する」及び「阻害している」の語は、細胞死を含む、細胞増殖における任意の阻害効果を含むことが理解されるべきである。阻害効果には、一時的な効果、持続的な効果、及び恒久的な効果が含まれる。
[116] 治療への適用
[117] 本発明はまた、本発明の抗体及び免疫複合体の治療への適用を含み、ここで、抗体または免疫複合体を、医薬的に許容可能な剤形で個体に投与してもよい。これらは、ボーラスまたは時間をかけた持続注入によって静脈内に、筋肉内、皮下、動脈内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路で、投与することが可能である。これらは、局所ならびに全身性の治療効果を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病巣周囲経路でも投与してよい。
[118] 医薬的に許容可能な剤形には、一般的には、キャリア、希釈剤及び賦形剤などの医薬的に許容可能な剤が含まれるであろう。これらの剤は周知であり、そして最も適切な剤を、当業者が、臨床状況を根拠に決定することが可能である。適当なキャリア、希釈剤及び／または賦形剤の例には：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有する、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ 〜７．４、（２）０．９％生理食塩液（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、及び、（３）５％（ｗ／ｖ）ブドウ糖が含まれる。
[119] 他の治療への適用においては、本発明の抗体または免疫複合体を、１またはそれより多くの追加の治療剤と同時投与する。治療剤は、宿主に対して最小のダメージでありながら、癌細胞を殺すかまたはその増殖を制限しようとするこれらの剤である。このように、こういった剤は、癌細胞の特性（例えば、代謝、血管新生または細胞表面での抗原提示）における健常宿主細胞との任意の違いを活用してもよい。腫瘍形態学における違いは、介入する可能性のある部位である。例えば、治療剤は、固形腫瘍内部の血管新生を遅らせ、その結果としてその増殖速度を遅くするのに有用な、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体であることが可能である。
[120] 適切な治療剤には、非限定的に、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤が含まれる。タキソールは、細胞毒性剤でもある、好ましい治療剤である。他の治療剤には、非限定的に、グラニセトロンＨＣＬなどの補助剤、酢酸ロイプロリドなどのアンドロゲン阻害剤、ドキソルビシンなどの抗生物質、タモキシフェンなど抗エストロゲン、インターフェロンα−２ａなどの代謝拮抗剤、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤、アルデスロイキンなどの免疫調節物質、及びメルファランＨＣｌなどのナイトロジェンマスタード誘導体等が含まれる。
[121] 抗体は、凍結乾燥された状態でなく水溶性剤形にて存在する場合に、この範囲外の幅広いバリエーションは許容されるが、典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方されるであろう。疾患の治療に関しては、抗体または複合体の適切な用量は、先に定義したような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防または治療のいずれの目的で投与するか、以前の治療経過、患者の既往歴及び抗体への応答、及び主治医の判断によって決まるであろう。抗体を、一度または一連の治療にわたって、患者に適切に投与する。
[122] 疾患の種類及び重症度に応じて、抗体約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ患者体重が、例えば、１またはそれより多くの別々の投与であっても、持続注入であっても、患者へ投与する最初の候補用量である。数日またはそれより長期にわたる反復投与については、状態に応じて、所望の疾患症状の抑制が起こるまで治療を繰り返す。しかしながら、他の投与計画が、有用である可能性もあり、そして除外されない。
[123] 本発明の治療への応用には、疾患を有する個体の治療方法が含まれる。本発明の方法にて治療される疾患は、ＣＤ３３発現によって特徴付けられるものである。このような疾患には、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）などの癌が含まれる。当業者は、本発明の方法を、未だ記載されていないがしかしＣＤ３３の発現によって特徴付けられる、他疾患を治療するのにも用いてよいことを、理解するであろう。
[124] 本発明の治療への適用を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで実行することも可能である。
[125] Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用例には、骨髄系細胞などのＣＤ３３陽性細胞が混入した細胞集団を精製することが含まれる。該方法は、細胞毒性Ｍｙ９−６免疫複合体の存在下で細胞集団を培養し、次いで死滅したＣＤ３３陽性細胞を除去することを含む。非臨床ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用における条件は、周知である（例えば、Ｕｃｋｕｎら、１９８６年、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３，３４７−３６８；Ｕｃｋｕｎら、１９８５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４，３５０４−３５１５；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、１９８５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６１６−３６２２を参照されたい）。
[126] 臨床ｅｘ ｖｉｖｏでの使用例には、異常または悪性の骨髄系細胞を死滅させるために、同じ患者にそれらを注入するのに先立って、自家骨髄の処理をすることが含まれる（Ｒｏｙ Ｄ．Ｃ．ら、１９９５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，５１−５７）。
[127] 診断及び研究への応用
[128] 本明細書において論じる抗体の治療への使用に加えて、本発明の抗体を、多くの公知の診断及び研究への適用において使用することが可能である。本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ双方での診断法に含まれる、例えばＣＤ３３の精製、検出及びターゲティングに用いてもよい。例えば、抗体を、生体試料中の細胞によって発現されるＣＤ３３レベルを定性的及び定量的に測定するためのイムノアッセイに用いてもよい。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー研究所プレス、第二版、１９８８年）を参照されたく、本明細書ではそのすべてを参照によって援用する。
[129] 本発明の抗体を、例えば、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイにおいて用いてもよい（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７〜１５８ページ（ＣＲＣプレスＩｎｃ．、１９８７年））。
[130] 本発明の抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ画像診断にも有用であり、ここで、放射線不透過剤または放射性同位体などの検出が可能な部分で標識した抗体を、個体に、好ましくは血流中に投与し、そして宿主中の標識抗体の存在及び位置をアッセイする。この画像診断技術は、悪性腫瘍の病期分類及び治療に有用である。抗体は、核磁気共鳴、放射線医学または当該技術分野において公知の他の検出手段のいずれによっても、宿主中において検出が可能な任意の部分で標識してもよい。
[131] 標識は、直接的あるいは間接的に検出が可能なシグナルを作り出すことが可能な、検出が可能な任意の部分であることが可能である。例えば、標識は、ビオチン標識、酵素標識（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ及び１２５Ｉ）、蛍光または化学発光化合物などのフルオロフォア（例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン）、造影剤（例えば、Ｔｃ−ｍ９９及びインジウム（１１１Ｉｎ））及び金属イオン（例えば、ガリウム及びユーロピウム）であってもよい。
[132] 当該技術分野において公知の、抗体を標識と結合させる任意の方法を使用してもよく、Ｈｕｎｔｅｒら、１９６２年、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら、１９８１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；Ｎｙｇｒｅｎ，Ｊ．，１９８２年、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７によって記載されたこれらの方法が含まれる。
[133] 本発明の抗体はまた、親和性精製剤としても有用である。この過程では、抗体を、セファデックス樹脂またはろ紙などの適当な担体上に、当該技術分野において周知の方法を用いて固定化する。このように、ＣＤ３３を、生体試料から単離及び精製してもよい。
[134] ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び抗体の作製方法
[135] 本発明は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、さらに提供する。
[136] 本発明はまた、ＣＤ３３と結合が可能なポリペプチドをコードし、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも包含し、ここで、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、以下：６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液及び１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ***ＤＮＡ中で、６０℃にて２時間のプレハイブリダーゼーション；６０℃にて１８時間のハイブリダイゼーション；４ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム中で６０℃にて３０分間の２回洗浄、及び、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて３０分間の２回洗浄、を含む。
[137] 当該技術分野において公知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得て、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知であるならば、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成オリゴヌクレオチドから構築してもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、１９９４年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２において記載されるように）、これは、簡潔に言えば、抗体をコードする配列の一部分を含有する重複したオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いで連結したオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
[138] 抗体のコード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する組換えベクターの構築方法は、当該技術分野において周知である。これらの方法には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。このように、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、または任意のこれらのエピトープ結合フラグメントをコードする、プロモーターに機能可能なように連結されたヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
[139] 組換えベクターを慣用の技術によって宿主細胞へ移行させ、次いでトランスフェクトされた細胞を慣用の技術によって培養し、本発明の抗体を産生する。このように、本発明は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードする、異種プロモーターに機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを含有する、宿主細胞を含む。好ましい態様において、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターを、宿主細胞中で同時発現させてもよい。
[140] 多様な宿主−発現ベクター系を、本発明の抗体分子を発現させるのに利用してもよい。このような宿主−発現系とは、それによって目的のコード配列を産生し、続いて精製してもよい媒体を表すが、しかし、適切なヌクレオチドのコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた場合は、本発明の抗体分子をｉｎ ｓｉｔｕにて発現してもよい細胞もまた表す。これらには、限定されるわけではないが、抗体のコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物体；抗体のコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体のコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；抗体のコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染させた植物細胞系、または、抗体のコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する、組換え発現コンストラクトを保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。
[141] 特に組換え抗体分子全体を発現させるためには、好ましくは大腸菌などの細菌細胞、及びより好ましくは真核細胞を、組換え抗体分子の発現に用いる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主な中間初期遺伝子プロモーターエレメント（intermediate early gene promoter element）などのベクターと連動した、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、抗体に対する効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６年、Ｇｅｎｅ ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。
[142] 長期にわたって組換えタンパク質を高収率に産生するには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を、操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いずに、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されたＤＮＡを用いて形質転換することが可能である。外来ＤＮＡの導入後に、操作した細胞を、強化培地中で１〜２日間増殖させてもよく、次いで、選択培地へと切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして、細胞がその染色体内にプラスミドを安定に組込み、そして、増殖して、今度はクローンニング及び細胞株へと発展させることが可能な巣（foci）を形成することを可能にする。この方法を、有利には、抗体分子を発現する細胞株を操作するのに用いてもよい。このような操作された細胞株は、直接または間接的に抗体分子と相互作用する化合物をスクリーニング及び評価する場合に、特に有用である。
[143] 本発明の抗体分子を組換え技術によって発現させた後、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、特にプロテインＡの後、特異抗原に対する親和性による親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技術などの、当該技術分野において公知の任意の免疫グロブリン分子精製法によってこれを精製してもよい。
[144] （実施例）
[145] これより、本発明を以下の実施例に関して記載するが、該実施例は一例に過ぎず、そして本発明を限定することを意図しない。
[146] 実施例１． ネズミＭｙ９−６抗体
[147] この最初の実施例において、本発明のネズミＭｙ９−６抗体の完全な一次アミノ酸構造及びｃＤＮＡ配列を、その結合特性及び組換え型でそれを発現させる手段とともに、開示する。したがって、免疫学の当業者が、必要以上の実験をすることなく前記抗体を作製することが可能なように、本発明の抗体及びその作製についての十分かつ完全な開示が提供される。
[148] １．１． Ｍｙ９−６抗体の作製、産生及び特徴付け
[149] ＣＤ３３抗原を用いて形質転換された３Ｔ３ネズミ線維芽細胞株を、免疫化に用いた。
[150] ５ヶ月齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、形質転換された３Ｔ３ネズミ線維芽細胞株（０．２ｍＬ ＰＢＳ中に懸濁した、２．５ｘ１０６細胞）で、第０日に腹腔内投与により免疫化した。動物を、０．２ｍＬの細胞懸濁液で以下のように追加免疫した：第１３日に５ｘ１０６細胞；第２１日に５ｘ１０６細胞。第２４日に、マウスを屠殺し、そしてその脾臓を取り出した。
[151] 脾臓を、２つの凍らせたスライドガラス間で粉砕し、単一の細胞懸濁液を得て、ペニシリン及びストレプトマイシン（ＳＦＭ）を含有する無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄した。脾臓細胞ペレットを、赤血球を溶解させるために氷上で１０分間、０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬ中に再懸濁し、次いで、無血清培地（ＳＦＭ）で洗浄した。脾臓細胞（１．６ｘ１０８）を、非分泌型マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州；カタログ番号ＣＲＬ１５８０）由来の骨髄腫細胞（５．４ｘ１０７）とともにチューブ中にプールし、そして無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＦＭ）で洗浄した。上清を除去し、そして細胞ペレットを２ｘ１０７細胞／ｍＬとなるよう希釈した。細胞を、１５ｍｇ／ｍＬコンカナバリンＡでコーティングした組織培養プレート上に、２ｘ１０７細胞／プレートにて播いた。プレートを、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を、穏やかにプレートから除去した。１ｍＬのポリエチレングリコール溶液（４０％ＰＥＧ ｗ／ｖ）を、一滴ずつ緩徐に加えた。プレートを回旋させ、そして３０秒間インキュベートした。ＰＥＧを除去し、そして捨てた。プレートを、５ｍＬのＳＦＭを緩徐に加え、次いで捨てることによって、二度洗浄した。最終洗浄後に、５ｍＬの５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）添加ＳＦＭを加えた。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。インキュベート後に、細胞を、細胞スクレーパーを用いてプレートからこすり落とし、そしてプールした。プレートをすすぎ、そして細胞とともにプールした。細胞を遠心分離によって沈澱させ、そして５％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン及びヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）添加ＲＰＭＩ−１６４０増殖培地中に再懸濁した。細胞を、マクロファージ支持細胞層を含有する９６ウェル平底組織培養プレートに、２ｘ１０５細胞／ウェルにて播いた。免疫化及びハイブリドーマ作出に用いた一般的条件は、Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ及びＨ．Ｖｕｎａｋｉｓ（編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１２１巻、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ」；１９８６年；アカデミックプレス、フロリダ州）及びＥ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；１９８８年；コールドスプリングハーバー研究所プレス、ニューヨーク州）によって記載されたとおりである。他の免疫化及びハイブリドーマ作出技術を、当業者に周知のように用いることも可能である。
[152] ハイブリドーマクローンから得た培養上清を、ＣＤ３３抗原をトランスフェクトされた細胞及びヒト組織球性リンパ腫細胞株Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９５３．２）への結合、ならびにマウス線維芽細胞株への結合の欠如について、スクリーニングした。これらのクローンを、増やしそしてサブクローニングした。サブクローンの培養上清を、前述の結合アッセイによってさらにスクリーニングした。この手順により、サブクローン３Ｅ７−Ｈ２−３Ｄ８（Ｍｙ９−６）を選択し、そして以下に記載するように重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングしそして配列決定した。
[153] ＣＤ３３抗原への特異的結合についてのハイブリドーマ上清のスクリーニングを、この抗原を発現する細胞株及びこの抗原に対して陰性の細胞株において、ＥＬＩＳＡを用いて行った。細胞を組織培養フラスコから別々に回収し、１０％ＦＢＳ含有増殖培地中に懸濁し、遠心分離によって沈澱させ、そしてＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞（約１〜３ｘ１０６細胞／ｍＬ １００μＬ）を、フィトヘマグルチニン（２０μｇ／ｍＬ ＰＨＡ １００μＬ）でコーティングしたイムロン−２ＨＢプレートのウェルに加え、遠心分離し、そして１０分間、ＰＨＡでコーティングしたウェルに接着させた。細胞の付いたプレートを軽く叩いてＰＢＳを除去し、次いで３７℃にて一晩乾燥させた。ウェルを、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３７℃にて１時間ブロッキングし、そしてＰＢＳでやさしく洗浄した。次いで、ハイブリドーマクローンから得た上清のアリコット（１００μＬ；ブロッキングバッファー中に薄めた）を、ＣＤ３３抗原発現細胞及びＣＤ３３を発現していない細胞を含有するウェルに加え、そして外界温度にて１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（１００μＬ；ブロッキングバッファー中）とともに１時間インキュベートし、続いて洗浄し、次いで結合をＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて検出した。ＣＤ３３抗原を過剰発現している細胞とともにインキュベートした場合に３Ｅ７ハイブリドーマサブクローンから得られた典型的な上清は、ＣＤ３３抗原に陰性の細胞とともにインキュベートした場合に得られた０．１０吸光度単位の値とは対照的に、０．５０吸光度単位のシグナルをもたらした。
[154] ハイブリドーマを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水中で増殖させた。凍結ハイブリドーマ細胞のバイアルを解凍し、そして細胞を組織培養フラスコ中で増やし、腹水での産生に必要な細胞数を得た。初回抗原刺激を受けたＢＡＬＢ／ｃマウス（１０〜１４日前に、プリスタン０．５ｍＬをマウスに腹腔内注射しておいた）に、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）０．５ｍＬ中の１ｘ１０６細胞を腹腔内注射した。細胞を注射後第１２〜１８日に、腹水をマウス腹腔からシリンジで回収した。プールした腹水を１０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、次いで上清を、１２，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離にかけた。抗体を、清澄な上清から以下のように精製した：工程１：硫安沈澱。氷上の上清を二倍量の冷ＰＢＳで希釈し、撹拌し、次いで一倍量の冷飽和（１００％）硫安溶液で緩徐に処理した。沈澱物を遠心分離によって回収したとき、溶液は、約５時間氷上に立てたままであった
。ペレットを少量のＰＢＳ中に溶解し、そしてその結果生じた溶液を、プロテインＡを用いた親和性精製工程のため、バッファー中に透析した。工程２：セファロース−プロテインＡでの親和性精製。ネズミＭｙ９−６のアイソタイプは、κ軽鎖を有するＩｇＧ１である。したがって、親和性カラムを、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する０．１ＭトリスＨＣｌバッファー中で平衡化した。同じバッファーの抗体溶液をカラムに通し、カラムを平衡化バッファーでよく洗浄し、次いで０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸で溶出した。画分を、２８０ｎｍにてＵＶ吸光度を測定することによってアッセイした。抗体を含有する画分を混ぜ合わせ、１Ｍトリスで中和し、次いで、使用及び保管のためＰＢＳ中に透析した。
[155] 最初に、精製抗体を、トランスフェクトされたマウス３Ｔ３線維芽細胞株及びヒトＵ−９３７細胞株などのＣＤ３３発現細胞との結合、ならびに、ハイブリドーマ上清のスクリーニングについて先に記載したような、抗原に陰性の細胞株との結合の欠如について、特徴付けた。
[156] ＣＤ３３抗原へのその結合特異性をさらに確かめるために、標識ｍｕＭｙ９−６と商業的に入手可能な抗ＣＤ３３抗体Ｍｙ９との間で、競合的結合実験を行った。結合実験を、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１９８９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１，２２２−２３４）によって記載された方法を用いて行った。ネズミＭｙ９−６抗体を、ヨードジェン（Ｉｏｄｏ−ｇｅｎ）技術（Ｆｒａｋｅｒ，Ｐ．Ｊ．及びＳｐｅｃｋ，Ｊ．Ｃ．，１９７８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０，８４９−８５７）を用いて、１２５Ｉで放射性標識した。１２５Ｉ−標識ｍｕＭｙ９−６の一定量（３ｘ１０−９Ｍ）を、非標識ｍｕＭｙ９−６または非標識Ｍｙ９のいずれかである非放射性標識抗体の濃度増加を伴ったものと混合し、そして、混合物を、４℃にて３０分間、細胞（一試料につき１ｘ１０６細胞）とともにインキュベートした。これらのインキュベーションを、２．５％ヒト血清を添加した、懸濁培養用に改変された最小必須培地（ＳＭＥＭ）からなるバッファー６０μｌ中で行った。次いで、細胞を、１．００９ｇ／ｍｌの密度のシリコーン油（アルドリッチ）及びパラフィン油（ベイカー）の混合物を介した遠心分離によって、非結合物質を含有する培地から分離した。次いで、細胞ペレットを、油の界面にて遠心分離用チューブを切ることによって取り出し、そしてガンマ計数器（ＬＫＢのモデルＲＩＡｇａｍｍａ １２７４）にて細胞に付随した放射活性を測定するのに用いた。測定した細胞に付随した放射活性を、非標識競合抗体の濃度に対してブロットした。結果を、図１に示す：Ｍｙ９及びＭｙ９−６の双方の抗体は、非常に類似した競合結合曲線を与えた。このことは、Ｍｙ９及びＭｙ９−６が同じ抗原に結合し、そしてさらに、双方の抗体が非常に類似した結合力を有することを実証する。Ｍｙ９は公開されそして認容された抗ＣＤ３３標準品であることから、Ｍｙ９−６は抗ＣＤ３３抗体であると結論づけられた。Ｍｙ９抗体は、バイオジェネックス（サンラモン、カリフォルニア州 ９４５８３；カタログ番号ＡＭ２６７−５Ｍ）から商業的に入手可能である。
[157] １．２． Ｍｙ９−６抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子のクローニング
[158] 全ＲＮＡを、Ｍｙ９−６ハイブリドーマ細胞でコンフルエントなＴ１７５フラスコから、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＮＢ１４５５−ｐ１７３）において記載されるように、精製した。ＲＮＡ完全性を、１％ＭＯＰＳゲル上で確認し、そして濃度をＵＶ分光光度法によって測定した。ＲＴ反応を、ギブコ・スーパースクリプトＩＩキット、及びオリゴｄＴまたはランダム六量体プライマーのいずれかを用いて、４〜５μｇのトータルＲＮＡで行った。
[159] ＰＣＲ反応を、Ｃｏら（１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（４）：１１４９−５４）において記載されたＲＡＣＥ法を用いること、及びＷａｎｇら（２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３３：１６７−１７７）において記載された縮重プライマーを用いることの双方によって、行った。ＲＡＣＥ ＰＣＲは、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端にポリｄＧテールを加える中間工程を必要とした。ＲＴ反応物を、Ｑｉａｎｅａｓｙ（キアゲン）カラムで精製し、そして５０μｌの１ｘＮＥＢバッファー４中に溶出した。ｄＧテーリング反応は、１ｘＮＥＢバッファー４中、０．２５ｍＭ ＣｏＣｌ２、１ｍＭ ｄＧＴＰ、および５ユニットのターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）とともにある溶出物で行った。混合物を、３７℃にて３０分間インキュベートし、次いで反応混合物の１／５（１０μｌ）を、鋳型ＤＮＡとして働くようにＰＣＲ反応混合物に直接加えた。
[160] ＲＡＣＥ及び縮重ＰＣＲ反応は、プライマー及び鋳型の違いを除き同一であった。前述のように、末端トランスフェラーゼ反応混合物を、ＲＡＣＥ ＰＣＲの鋳型に対して直接用い、一方で、ＲＴ反応混合物を、縮重ＰＣＲ反応に対して直接用いた。双方の反応セットにおいて、同じ３’軽鎖プライマーＨｉｎｄＫＬ：
ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号１１）
及び、３’重鎖プライマーＢＧｌ２ＩｇＧ１：
ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号１２）
を用いた。
[161] ＲＡＣＥ ＰＣＲでは、１つのポリｄＣ ５’プライマーであるＥｃｏＰｏｌｙｄＣ：ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１３）を、重鎖及び軽鎖の双方について用いたが、一方、縮重５’末端ＰＣＲプライマーは、軽鎖については、Ｓａｃ１ＭＫ：ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号１４）、ならびに重鎖については、ＥｃｏＲ１ＭＨ１：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ（配列番号１５）及びＥｃｏＲ１ＭＨ２：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号１６）の等量混合物であった（混合塩基：Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）。
[162] ＰＣＲ反応を、Ｗａｎｇら（２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３３：１６７−１７７）から改作したプログラム：１）９４℃にて３分間；２）９４℃にて１５秒間；３）４５℃にて１分間；４）７２℃にて２分間；５）工程２に戻って２９回サイクルを行い；６）７２℃にて１０分間の最終伸長工程で終了する、を用いて、ＭＪリサーチの温度サイクラーで行った。ＰＣＲプライマーによって作り出されたＰＣＲ産物を、制限酵素を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン）中にクローニングした。重鎖及び軽鎖のクローンを、ラーク・テクノロジーズまたはＳｅｑｗｒｉｇｈｔのシークエンシングサービスによって、配列決定した。
[163] ＲＡＣＥ ＰＣＲは、Ｍｙ９−６軽鎖については決して成功しなかった。したがって、５’末端ｃＤＮＡ配列を確認するために、追加の縮重ＰＣＲ及びクローニングを行った。縮重ＰＣＲクローンから決定されたＭｙ９−６軽鎖のｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩのブラストサーチウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）に入力し、そして、シグナル配列を有する、提示された上位５つのネズミ抗体配列を、保存した。縮重ＰＣＲプライマーを、コードホップ（Ｃｏｄｅｈｏｐ）ウェブソフトウエア（ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を用いて、これらのシグナルペプチドから設計した。ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を、コードホップ縮重プライマーの３つ（図２）に加え、そしてこれらを、前述のようなＲＴ−ＰＣＲ反応において用いた。
[164] １．３． 重鎖及び軽鎖試料の調製及び配列決定
[165] ｍｕＭｙ９−６抗体の重鎖及び軽鎖を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。還元及び変性させた抗体を、１２％トリス−グリシンゲル（ノベックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）上で電気泳動した。電気泳動後に、ゲルを、ＣＡＰＳ／ＭｅＯＨバッファーを用いてイモビロンｐｓｑ膜上にブロッティングした。転写後に、膜をポンソーＳで染色した。軽鎖及び重鎖に相当するバンドを、タンパク質の配列決定のために切り取った。
[166] 抗体の軽鎖を、自動エドマン分解化学反応によって、ＡＢＩ ４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅシークエンサーで膜から直接的に配列決定した。
[167] 重鎖のＮ−末端を遮断し、そして、タンパク質を、ｉｎ ｓｉｔｕにて、Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉら（１９９６年）にしたがいトリプシンで消化した。次いで、消化混合物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって、Ｋｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ ＳＥＱ装置で解析した。選択されたペプチドは、その配列を決定するためにＭＳ／ＭＳにかけた。
[168] 実施例２． 表面再構築化による抗体可変領域のヒト化
[169] 治療剤または診断剤に適したヒト化型を提供するための、Ｍｙ９−６抗体の表面再構築化を、米国特許第５，６３９，６４１に開示された原理及び方法にしたがい、そして以下のように、一般的には進める。
[170] ２．１． 表面の予測
[171] 構造が解明されている抗体セットの可変領域残基の溶媒露出度を、ネズミＭｙ９−６抗体可変領域の表面残基を予測するのに用いた。１２７の独特の抗体構造ファイルのセット（図３）について、アミノ酸の溶媒露出度を、ＭＣソフトウエアパッケージ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９−９７３）を用いて計算した。この１２７の構造のセットに由来する、最も類似した１０の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を、ＮＣＢＩウェブサイト ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ の配列整列化ソフトウエアを用いて決定した。これらの１０の抗体可変領域の各可変領域残基についての平均溶媒露出度を、エクセル集計表を用いて計算し、そして３０％よりも大きな平均露出度を伴う位置を、表面残基とみなした。２５％〜３５％の平均露出度を伴う位置を、両側に隣接する２つの同一な残基を有するこれらの構造のみについて、個々の残基の露出度を計算することによって、さらにみなした。
[172] ２．２． 分子モデリング
[173] ネズミＭｙ９−６の可変領域の分子モデルを、オックスフォード・モレキュラー・ソフトウエアパッケージＡｂＭを用いて作製した。抗体フレームワークを、最も類似したアミノ酸配列を有する抗体（軽鎖については１ｓｂｓ、及び重鎖については１ｂｂｊ）についての構造ファイルから構築し、そして非正準のＣＤＲを、重複のない解明されている構造を含有するＣ−ａ構造データベースを検索することによって、構築した。モデルを、グラクソ・スミス・クライン・スイス−Ｐｄｂビューアーを用いて視覚化し、そしてＣＤＲから５Å以内に位置する残基を決定した。
[174] ２．３． ヒト抗体の選択
[175] ネズミＭｙ９−６可変領域の表面位置を、Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｕ、２００１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１）：２０５−６）中のヒト抗体の配列において対応する位置と比較した。抗体データベース管理ソフトウエアＳＲ（Ｓｅａｒｌｅ，１９９８年）を用いて、天然の重鎖及び軽鎖ヒト抗体対に由来する表面残基を抽出及び整列化した。ＣＤＲから５Å以内に入る位置を特別に考慮して、最も同一性の表面残基を有するヒト抗体可変領域の表面を、ネズミＭｙ９−６抗体可変領域の表面残基を置換するのに選んだ。
[176] ２．４． ＰＣＲ突然変異誘発によるヒト化抗体遺伝子の構築
[177] ＰＣＲ突然変異誘発を、ネズミＭｙ９−６可変領域のｃＤＮＡクローンについて行い、まず５’末端配列をペプチド配列と一致するように変え、次いで表面再構築化ヒトＭｙ９−６遺伝子を構築した。プライマーセットを、最初の縮重ＰＣＲクローンにおいて元々配列決定されなかったネズミ残基（軽鎖位置Ｎ１、Ｍ３、Ｌ４及びＳ７、ならびに重鎖位置Ｑ３及びＰ７）を作出するように、設計した。
[178] ヒト化のプライマーセットを、ｈｕＭｙ９−６のすべての型に必要とされる６アミノ酸の変更を行うように設計し、そして追加のプライマーを、４つの５Å残基を選択的に変えるように設計した（図４）。ＰＣＲ反応を、以下のプログラムを用いてＭＪリサーチの温度サイクラーで行った：１）９４℃にて１分間；２）９４℃にて１５秒間；３）５５℃にて１分間；４）７２℃にて１分間；５）工程２に戻って２９回サイクルを行い；６）７２℃にて４分間の最終伸長工程で終了する。ＰＣＲ産物を、それらに対応する制限酵素で消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクター中にクローニングした。クローンを配列決定してアミノ酸の変化を確認した。
[179] ２．５． ヒト化抗体の発現ベクター
[180] 軽鎖及び重鎖対の配列を、一つの哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。ヒト可変配列に対するＰＣＲプライマーは、ヒトシグナル配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングベクター中に加えることを可能にする制限酵素認識部位を作出した。次いで、軽鎖または重鎖の可変配列それぞれを、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを有する哺乳動物発現プラスミド中にクローニングすることが可能であった（図５）。軽鎖可変配列を、ヒトＩｇＫａｐｐａ定常領域上にインフレームでクローニングし、そして重鎖可変配列を、ヒトＩｇＧａｍｍａ１定常領域配列中にクローニングした。最終的な発現プラスミドでは、ヒトＣＭＶプロモーターが、軽鎖及び重鎖双方のｃＤＮＡ配列の発現を駆動する。
[181] ２．６． ヒト化抗体の一時的な発現
[182] ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、バイオウィッタカー、１２−６１４Ｆ）、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ハイクローン、ＳＨ３００７１．０３）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（バイオウィッタカー、１７−６０４Ｅ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物（バイオウィッタカー、１７−６０３Ｅ）中で、６％ＣＯ２下で、３７℃インキュベーターにて培養した。細胞を、週に３回、１：１０希釈で分割し、サブコンフルエントな集団を維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞をトリプシン（バイオウィッタカー、１７−１６１Ｅ）処理し；生細胞を、トリパンブルー排除法で計数し、そして１０ｃｍの組織培養処理プレート（コーニング、４３０１６７）上に２ｘ１０６細胞／プレートの密度で播いた。トランスフェクションの直前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩液（バイオウィッタカーの１０ｘＰＢＳ、１７−５１７Ｑから薄めたＰＢＳ）で穏やかに洗浄し、そして細胞を、１％超低ＩｇＧ血清（ギブコＢＲＬ、１６２５０−０７８）を含むハイブリドーマＳＦＭ（インビトロジェン、１２０４５−０７６）７ｍＬで覆った。
[183] 一過性トランスフェクション法を、標準的なキアゲン・ポリフェクトプロトコールから改作した。１枚の１０ｃｍプレートにトランスフェクトするのに、８μｇのＣｓＣｌグレードＤＮＡを、ハイブリドーマＳＦＭ ３００μＬ及びポリフェクトトランスフェクション試薬８０μＬ（キアゲン、３０１１０７）と混合した。トランスフェクション混合物を、低速度で約５秒間ボルテックスし、そして外界温度にて５分間インキュベートした。インキュベーション後に、１ｍＬのハイブリドーマＳＦＭ、１％超低ＩｇＧ血清をトランスフェクション混合物に加え、そしてピペット操作を上下に約５回行うことによって混合した。次いで、トランスフェクション混合物を、細胞を覆っているハイブリドーマＳＦＭ ７ｍＬに加え、そして、均等な分布を保証するために、プレートを穏やかに回旋させた。トランスフェクション反応物を、組織培養インキュベーターにて、一晩、一般的には１６時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を注意深く細胞から取り除き、そして２０ｍＬのハイブリドーマＳＦＭ、１％超低ＩｇＧ血清と取り替えた。次いで、トランスフェクトされた細胞をインキュベーターに７２時間戻した後に、上清を回収し、そして抗体産生をＥＬＳＡで定量した。回収した上清は、精製するまで４℃にて保管した。
[184] ２．７． ヒト化抗体の精製
[185] 上清を、１／１０量の１Ｍトリス／ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０を加えることによって、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ用に調製した。ｐＨを調整した上清を、０．２２μｍフィルター膜を通してろ過し、そして、結合バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したプロテインＡセファロースカラム（ハイトラップ・プロテインＡ ＨＰ、１ｍＬ、アマシャム・バイオサイエンスイズ）に添加した。Ｑ−セファロースプレカラム（１０ｍＬ）を、ＤＮＡなどの細胞物質からの混入を低減するために、試料添加中にプロテインＡカラムの上流に連結した。試料添加後に、プレカラムを除去し、そして、洗浄及び溶出を行うために、プロテインＡカラムの方向を逆にした。カラムを、２８０ｎｍにて吸光度のない安定なベースラインを得るまで、結合バッファーで洗浄した。抗体を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．８を含有する０．１Ｍ酢酸バッファーで、０．５ｍＬ／分の流速を用いて溶出した。およそ０．２５ｍＬの画分を集め、そして１／１０量の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることによって中和した。ピークの画分を、ＰＢＳ、ｐＨ７．３に対して一晩透析した。抗体量を、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量し、そして抗体濃度を、Ｅ２８０ ０．１％＝１．４と想定して計算した。吸光スペクトル分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを、抗体画分について、その純度を確認するために行った。
[186] 実施例３． ヒト化抗体の試験
[187] ３．１． 結合解析用細胞の増殖
[188] ＨＬ−６０細胞を、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得た（ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ−２４０）。これを、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃ウォータージャケット付きインキュベーター（ナプコ・サイエンティフィックＣｏ．、チュアリタン、オレゴン州）中に維持した。細胞を、１０％胎児ウシ血清（ハイクローン、ローガン、ユタ州）に加えて５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含有する、Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ培地（バイオウィッタカー、ウォーカーズビル、メリーランド州）中で増殖させた。
[189] ３．２． ＨＬ−６０細胞における直接的結合アッセイ
[190] ＨＬ−６０細胞をＴ７５フラスコ（ＮＵＮＣＬＯＮＴＭ、カタログ番号１５３７３２）から回収し、そして、４℃にて、約３００ｘｇで５分間、オムニフュージＲＴ卓上遠心分離機（ヘレウス・セパレーションズ、ドイツ）中で遠心分離した。細胞を、３ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で、２％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（シグマケミカルＣｏ．、セントルイス、ミズーリ州）を含むＬ−グルタミン添加ＭＥＭアルファ培地（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）からなるＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。マルチチャンネルピペッターを用いて、３ｘ１０５細胞を、ファルコン９６ウェル丸底プレート（カタログ番号３０７７）のウェルに加え、次いで氷上に置いた。ファルコン９６ウェルフレキシブルアッセイプレート（カタログ番号３５３９１１）を用いて、１１の各試験品または対照品の２倍段階希釈物を、ＦＡＣＳバッファーで、開始濃度２ｘ１０−８Ｍから、二つ組で作製した。次に、試験品又は対象品のいずれかを細胞に混合した。対照ウェルには、ＦＡＣＳバッファーのみを入れた。プレートを氷上で１時間インキュベートし、次いで、冷却遠心分離機中で、３００ｘｇにて５分間遠心分離した。試薬を、１０％漂白剤を含有する廃棄用ビーカー上で速やかに逆さまにすることによって、プレートのウェルから取り除いた。細胞を、穏やかにボルテックスすることによって再懸濁し、冷ＦＡＣＳバッファーで一度洗浄し、遠心分離し、次いで、穏やかにボルテックスしながら再懸濁した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州、カタログ番号１０９−０９６−００３）及びＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州、カタログ番号１０９−０９５−０８８）をＦＡＣＳバッファー中に１：１００希釈し、そして１００μｌをアッセイプレートの適切なウェルに加えた。次いで、プレートをさらに１時間、氷上で遮光してインキュベートした。結合していない二次抗体を、上記と同じ方法で、ウェルから洗浄した。細胞を、穏やかにボルテックスすることによって再懸濁し、次いで１２０μｌ／ウェルの１％ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を加えることによって固定化した。次いで、アッセイプレートを、自動９６ウェルサンプリング装置とインターフェースで接続したＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア州）において、解析した。
[191] ３．３ 形質膜の調製
[192] 形質膜を、Ｖａｔｅｒら（１９９５年）に記載された手順にしたがって調製した。簡潔に言えば、ＨＬ−６０細胞を、１０％胎児ウシ血清及び５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシンを含有する、Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ中で、１ｘ１０６細胞／ｍＬの密度となるまで増殖させた。全部で１ｘ１０９細胞を得たときに、細胞を回収し、オムニフュージＲＴ遠心分離機で約３００ｘｇにて回転させ、ハンクス平衡塩溶液（ライフテクノロジーズ、カタログ番号１４１７５−０９５）で洗浄し、そして１本の５０ｍＬコニカル遠心分離用チューブ中に合わせた。次いで、ペレットを、細胞の溶解及び均質化を促進するため、−８０℃にて少なくとも２４時間凍結した。形質膜を調製するために、ペレットを３７℃にて速やかに解凍し、次いで氷上に保管し；その後のすべての工程を、４℃にて行った。ＨＬ−６０細胞ペレットを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍショ糖及び１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する、８ｍＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０中に再懸濁した。次いで、細胞ペレットを、細胞を破壊する（ぴったりはまるホウケイ酸ガラス乳棒で２０打）ために、１５ｍＬダウンス組織グラインダー（ウィートン、ミリビル、ニュージャージー州）に移した。ホモジネートを、ＳＳ−３４ローター（ウィルミントン、デラウェア州）を用いて、ソーバルＲＣ−５Ｂ冷却超高速遠心分離機で、６０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、そして上清を注意深くペレットから除いた。ペレットを、８ｍＬのバッファーでもう一度洗浄し、そして前述のように処理した。混ぜ合わせた上清を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０の３７％ショ糖クッションバッファー１ｍＬ上に層状に重ね、そしてさらに、ＳＷ５５ｔｉローター（ベックマン・インスツルメンツ、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて、予め冷却しておいたベックマンＬ８−Ｍ超遠心分離機で、３３，０００ｒｐｍにて７０分間処理した。ショ糖クッションのすぐ上にあるオパールのような光彩を放つ膜の層を、各チューブから取り除き、そして４倍量の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．０で希釈した。次いで、この溶液を、超遠心分離機で、１８，０００ｒｐｍにてさらに３０分間遠心分離した。上清を注意深く抜き取り、そして結果として得られたペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．０中に再懸濁した。ＨＬ−６０膜調製物を、１．５ｍＬ無菌スクリューキャップエッペンドルフチューブに等分して入れ、液体窒素中で凍らせ、次いで−８０℃にて、使用のために保管した。最終調製物の総タンパク質濃度を、ピアスＴＭ ＢＣＡアッセイ（ピアス・ケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州、カタログ番号２３２３５）を用いて測定した。
[193] ３．４． ＨＬ−６０膜における直接的結合アッセイ
[194] 前述のように調製したＨＬ−６０膜を、脱イオン水中の開始濃度１０μｇ／ｍＬにて、イムロン２ ９６ウェルアッセイプレート（ダイネックス・ラボラトリーズ、チャンティリー、バージニア州）のポリスチレン表面上で、ラボコンコの吸引デシケーター（ラボコンコ，Ｃｏｒｐ、カンサスシティ、ミズーリ州）を用いて、外界温度にて一晩乾燥させた。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、１％ウシ血清アルブミン画分Ｖ（シグマ−アルドリッチ，Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ａ−３２９４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ−アルドリッチ・Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ｐ−２２８７）溶液を含むトリス緩衝生理食塩液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、ＴＢＳ）で、３００μＬ／ウェルにて、３７℃で１時間ブロッキングした。このブロッキング工程の後に、プレートからブロッキングバッファーを流し出し、そしてペーパータオル上に水分を吸い取った。試験または対照試薬の、２つの３倍段階希釈物を、ブロッキンバッファー中で３．１３ｘ１０−９Ｍから開始して５．２９ｘ１０−１４Ｍに漸減させて、フレキシブル９６ウェルアッセイプレートに四つ組で作製した。陰性対照ウェルは、ブロッキングバッファーのみを含有した。５０μＬの各希釈物を、膜でコーティングしたアッセイプレートの指定したウェルに移し、次いでこのプレートを４℃にて一晩インキュベートした。次いで、ウェルの中身を吸引して１０％（ｖ／ｖ）漂白剤を含有する廃棄用フラスコに入れ、そしてプレートを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄バッファー）を含有するＴＢＳで３回洗浄し、そしてペーパータオル上に水分を吸い取った。結合している抗Ｍｙ９−６抗体量を、適切なウェルにおいて、ブロッキングバッファー中で１：１０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰまたはロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検出した。これらの二次抗体を、アッセイプレートで、遮光、室温にて１時間インキュベートした。前述同様に、プレートを洗浄しそして水分を吸い取った。プレートを、ＴＭＢ（バイオＦＸラボラトリーズ、ランダルズタウン、メリーランド州、カタログ番号ＴＭＢＷ−０１００−０１）を用いて発色し、次いで停止溶液（バイオＦＸラボラトリーズ、ランダルズタウン、メリーランド州、カタログ番号ＳＴＰＲ−０１００−０１）で反応を止めた。アッセイプレートを、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫ ＩＩプレートリーダー（ハンツビル、アラバマ州）を用いて、Ａ４５０ｎｍにて読み取った。
[195] ３．５． ＨＬ−６０膜における競合的結合アッセイ
[196] 前述のように調製したＨＬ−６０膜を、脱イオン水中の開始濃度１０μｇ／ｍＬにて、イムロン２ ９６ウェルアッセイプレート（ダイネックス・ラボラトリーズ、チャンティリー、バージニア州）のポリスチレン表面上で、ラボコンコの吸引デシケーター（ラボコンコ，Ｃｏｒｐ、カンサスシティ、ミズーリ州）を用いて、室温にて一晩乾燥させた。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、１％ウシ血清アルブミン画分Ｖ（シグマ−アルドリッチ，Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ａ−３２９４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ−アルドリッチ・Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ｐ−２２８７）溶液を含むトリス緩衝生理食塩液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、ＴＢＳ）で、３００μＬ／ウェルにて、３７℃で１時間ブロッキングした。このブロッキング工程の後に、プレートからブロッキングバッファーを流し出し、そしてペーパータオル上に水分を吸い取った。試験または対照試薬の、２つの２倍段階希釈物を、ブロッキンバッファー中で１．２５ｘ１０−８Ｍから開始して２．４４ｘ１０−１１Ｍ（２ｘ最終濃度が必要）に漸減させて、フレキシブル９６ウェルアッセイプレートに四つ組で作製した。次いで、これらの非標識競合試薬を、等量の２．５ｘ１０−１０Ｍビオチン化ネズミ抗Ｍｙ９−６（イムノジェン，Ｉｎｃ．、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）と混合した；陽性対照は競合試薬を含有せず、一方、陰性対照はブロッキングバッファーのみを含有した。これらの混合物５０μｌを、膜でコーティングしたアッセイプレートの指定したウェルに移し、次いでそのプレートを４℃にて一晩インキュベートした。次いで、ウェルの中身を吸引して１０％（ｖ／ｖ）漂白剤を含有する廃棄用フラスコに入れ、そしてプレートを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（洗浄バッファー）で３回洗浄した。プレートは、ペーパータオル上で水分を吸い取り、そして、結合しているビオチン化ネズミ抗Ｍｙ９−６量を、ブロッキングバッファー中で１：５，０００希釈した１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州、カタログ番号０１６−０５０−０８４）を用いて検出した。室温及び遮光で１時間インキュベートした後に、結合していない二次抗体試薬をウェルから洗浄し、そしてＴＭＢ（バイオＦＸラボラトリーズ、ランダルズタウン、メリーランド州、カタログ番号ＴＭＢＷ−０１００−０１）を用いて発色し、停止溶液（バイオＦＸラボラトリーズ、ランダルズタウン、メリーランド州、カタログ番号ＳＴＰＲ−０１００−０１）で反応を止めた。アッセイプレートを、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫ ＩＩプレートリーダー（ハンツビル、アラバマ州）を用いて、Ａ４５０ｎｍにて読み取った。
[197] ３．６． ネズミＭｙ９−６抗体可変領域のクローンニング
[198] ネズミＭｙ９−６抗体可変領域を、前述のＲＴ−ＰＣＲ法によってクローニングした。いくつかの個々の軽鎖及び重鎖クローンを、ポリメラーゼによって生じる起こりうる配列エラーを同定しそして回避するために、配列決定した。軽鎖については１つの配列のみを得たが、しかし、重鎖のＲＴ−ＰＣＲクローンからは、２つの別な配列が得られた。
[199] ネズミＭｙ９−６軽鎖可変領域の実際の配列を確かめるために、ペプチド配列を、エドマン分解、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）及びタンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）によって解析した。Ｍｙ９−６軽鎖のアミノ末端における２２残基を、エドマン分解によって配列決定し、そして図６Ａに与える。縮重ＲＴ−ＰＣＲクローンに由来する最初のｃＤＮＡ配列は、縮重プライマーによって生成したと思われる４つの残基を除き、一致した。エドマン分解によって決定したペプチド配列は、後に、５’末端シグナルペプチド配列中の縮重プライマーによって生成したＲＴ−ＰＣＲクローンによって、確認された。トリプシン消化フラグメントをＭＳ−ＭＳ分析することにより、軽鎖ＣＤＲ１及び２の配列もまた確認された（図６Ｂ）。総合すると、これらのペプチド解析は、ＲＴ−ＰＣＲにより生成したｃＤＮＡクローンに由来する、予測されるネズミＭｙ９−６軽鎖アミノ酸配列を確認する。
[200] 重鎖配列に一般的であるように、ｍｕＭｙ９−６重鎖アミノ末端は、ピログルタミン残基によって遮断され、それゆえＮ末端エドマン分解によって配列決定することができなかった。代わりに、内部配列データを、トリプシン消化及び、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）による分析及びタンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）によって作成した。１７８８Ｄａフラグメントを、ｃＤＮＡクローン２の一部分と同一の予測された配列を用いて同定した（図７）。この配列は、ｃＤＮＡクローン２のＣＤＲ３に由来する５残基を含み、それゆえ、ｍｕＭｙ９−６重鎖について確実な同定を行うのに理想的なペプチドである。縮重ＲＴ−ＰＣＲクローン２から元々得られた配列のみを産生する多重ＲＡＣＥ ＰＣＲクローンによっても、このペプチド配列が確認された。
[201] 種々のｃＤＮＡクローン及びペプチド配列解析から得た蓄積データは、図８に示される最終的なネズミＭｙ９−６軽鎖及び重鎖配列を提供した。Ｋａｂａｔ及びＡｂＭ定義を用いて、３つの軽鎖及び重鎖ＣＤＲを同定した（図８及び９）。ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔデータベースの検索により、ｍｕＭｙ９−６抗体軽鎖可変領域は、マウスＩｇＶκ ８−２７生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高く、一方、重鎖可変領域は、ＩｇＶｈ Ｖ１０２生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高いことが、示唆される（図１０）。
[202] ３．７． Ｍｙ９−６抗体の可変領域表面残基の決定
[203] Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５９−９７３）及びＲｏｇｕｓｋａら（１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：８９５−９０４）によって記載された抗体の表面再構築化技術は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を予測することにより始まる。表面残基を、水分子に接近可能なその総表面積の少なくとも３０％を有するアミノ酸として定義する。ｍｕＭｙ９−６の表面残基を見いだすのに解明された構造がないため、１２７の抗体構造のファイルセットの中で最も相同的な配列を有する１０の抗体を、整列化した（図１１Ａ及びＢ）。各Ｋａｂａｔ位置の溶媒露出度を、これらの整列化した配列について平均し、そして各残基の相対的露出度の分布を図１２に示す。
[204] いくつかの表面位置は、２５％〜３５％の平均露出度であった。これらを、両側に隣接する２つの同一な残基を有する抗体のみを平均することによって、より詳細に調べた（図１３Ａ及びＢ）。ｍｕＭｙ９−６重鎖の２５の予測された表面残基は、追加の解析後にも変わらなかったが、しかし、軽鎖におけるＫａｂａｔ位置１５及び７０は、さらなる考察を必要とした。軽鎖の位置１５におけるアラニンは、すべての１０の構造において３４．４％の平均露出度であったが、しかし１つの構造１ｍｃｐのみが、ｍｕＭｙ９−６におけるものと同一の隣接残基を有した。この構造において、Ａｌａ１５は、ほんの１８．２％の相対的露出度であった。この１つの構造において、Ａｌａ１５は、位置１５の平均的な残基よりも極めて露出度が低かったため、隣接残基に１つだけ違いを有する３つの構造（１ａｐ２、１ｆｒｇ、１ｈｉｌ）についても、まとめて平均した。これら３つの構造の平均露出度は、この場合も３３．３％であり、Ａｌａ１５を、予測される表面残基とした。最終的には、表面再構築化された抗Ｂ４、Ｃ２４２、及び表面再構築化の特許自体が、軽鎖位置１５は表面残基であると予測した。総合すると、保存的なアプローチとは、ｍｕＭｙ９−６軽鎖の位置１５が表面残基であると仮定することである。
[205] ｍｕＭｙ９−６軽鎖の位置７０もまた、それが表面残基であるとの保存的な予測を最終的にもたらす、特別な考慮を必要とする。軽鎖に対する表面を予測する最初の作業を、５つの最も相同的な軽鎖構造のみに由来するＭＣデータを用いて行い、そしてこの群において、Ａｓｐ７０が予測された表面残基であった。その後、追加の５つの最も相同的な構造を用いて、位置７０は、図１３Ａに示すように、２９．１％の平均露出度であることが見いだされた。加えて、１０のうち９の構造は同一の隣接残基を有し、そしてこのセットの平均は２９．２％の露出度であった。この残基は、３０％カットオフ点に非常に近いようであり、そして表面再構築化の特許は、位置７０を表面位置と称するため、露出度のデータをさらに精査した。構造１ｌｖｅの位置７０は、２２．５％の相対的露出度であり、これは二番目に低い相対的露出度である２７．５％よりも５％少ない。１ｌｖｅは８番目に最も相同的な構造であり、そしてそれが低い外れ値であったことから、１ｌｖｅを除いた同一の隣接残基を有する８の構造について平均を取り、そしてこのセットは３０．１％の平均露出度であった。最初のｍｕＭｙ９−６軽鎖の解析及び表面再構築化の特許が軽鎖の位置７０を表面位置と称することと併せて、このことは、ｍｕＭｙ９−６軽鎖のＡｓｐ７０が表面残基であるとの保存的な予測をもたらした。
[206] ３．８． どの残基がＣＤＲから５Å以内に入るかを決定するための分子モデリング
[207] ＡｂＭソフトウエアパッケージを用いて作成した分子モデルを、どのｍｕＭｙ９−６表面残基がＣＤＲから５Å以内に入るかを決定するために解析した。抗体の表面を再構築化するには、ＣＤＲの外側のすべての表面残基を、そのヒト対応物に替えなければならないが、しかしＣＤＲ５Å以内に入る残基もまた、抗原の結合及び特異性に寄与する可能性がある。したがって、これらの５Å残基は、ヒト化の過程全般を通じて、同定されそして考慮されなければならない。表面再構築化に用いられるＣＤＲの定義は、重鎖ＣＤＲ２にはＡｂＭの定義を、そして残りの５つのＣＤＲにはＫａｂａｔの定義を組み合わせる（図９）。ネズミモデルを、スイス・ビューアー・ソフトフエアを用いて解析し、そして図１４は、軽鎖または重鎖配列のいずれかにおける任意のＣＤＲ残基から５Å以内である残基を示す。
[208] ３．９． 最も相同的なヒト表面の選択
[209] ｍｕＭｙ９−６の表面を再構築化するためのヒト抗体表面の候補を、ＳＲソフトウエアを用いて、Ｋａｂａｔ抗体配列データベースから得た。このソフトウエアは、抗体データベースから、特定の残基の位置のみを検索するインターフェースを提供する。天然の対を保つため、軽鎖及び重鎖双方の表面残基をまとめて比較した。Ｋａｂａｔデータベースから得た最も相同的なヒト表面を、配列同一性の順位にしたがって整列化した。ＳＲ Ｋａｂａｔデータベースソフトウエアによって整列化させた上位５つの表面を、図１５に与える。次いで、どのヒト表面がＣＤＲから５Å以内で最少の変更を必要とするであろうかを同定するために、表面を比較した。抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体ＬＣ３ｂＰＢ（Ｉｖａｎｏｖｓｋｉ Ｍ．ら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ ９１（７）：２４３３−４２）は、最少数の残基変更（総計１０）を必要とし、そしてこれらの残基のうち４つのみが、ＣＤＲから５Å以内に入った。ｍｕＭｙ９−６の全長可変領域配列もまた、ＳＲを用いたＫａｂａｔヒト抗体データベースに対して整列化させ、そしてＬＣ３ｂＰＢを、１４番目に最も類似したヒト可変領域配列として同定した（データは示さず）。ＬＣ３ｂＰＢ抗体は、最も相同的な表面を提供し、そして最少数の５Å残基の変更を必要とするため、これが、ｍｕＭｙ９−６を表面再構築化するための最良の候補である。
[210] ３．１０． ヒト化Ｍｙ９−６抗体のための、Ｍｙ９−６遺伝子の構築
[211] １０の表面残基の変更を、ｈｕＭｙ９−６のために、前述のようなＰＣＲ突然変異誘発技術を用いて行った。ＬＣ３ｂＰＢの表面残基のうち６つが、ＣＤＲから５Åよりも長く離れていたため、これらの残基を、ヒト化Ｍｙ９−６のすべての型においてマウスからヒトへ変更した（図１６Ａ及びＢ）。ＣＤＲから５Å以内に入る４つの表面残基である、Ｋａｂａｔの軽鎖の位置１、３及び４５ならびに重鎖の位置６４を、Ｍｙ９−６の１６のヒト化型を作製するために、ヒトへ変更するか、あるいはマウスと同じく保持した。これらのうち最もヒトに近いのは、すべての１０のヒト表面残基を有することから、１．０型である。最大の結合親和性を確実にする点で最も保存的な型は、ＣＤＲから５Å以内の４つのマウス表面残基を保持する１．１型である。ヒト化Ｍｙ９−６抗体遺伝子のそれぞれを、一過性でそして安定なトランスフェクションを行うため、抗体発現プラスミド（図５）中にクローニングした。
[212] ３．１１． 結合データ
[213] 表面再構築化によるヒト化の主要な長所は、非表面のネズミフレームワーク残基を保持することによって、ヒト化Ｍｙ９−６が、親和性を変化させずにＣＤ３３と結合し続けるはずであることである。しかしながら、ＣＤＲから５Å以内に入る４つの表面残基は、抗原結合に寄与する可能性があり、それゆえに、これらの残基の変更は、結合に負の効果をもたらす恐れがある。この懸念に対処するために、ヒト化Ｍｙ９−６の１６の型は、４つの５Å残基位置のそれぞれにおいて、ヒトまたはネズミのいずれかの残基のすべての組み合わせを含む。これらは、すべてのＣＤＲでない表面位置にヒト残基を有する、最良または最もヒトに近い１．０型から、４つの５Å表面位置のそれぞれにネズミ残基を保持し、それゆえに野生型の結合性を保持するはずである、最も保存的な１．１型へ及ぶ。Ｍｙ９−６ヒト化型の結合親和性をネズミＭｙ９−６と比較することによって、野生型の結合性を保持する最もヒトに近い型を、表面再構築化されたヒト化Ｍｙ９−６として選択することが可能である。
[214] ネズミＭｙ９−６のヒト化型及びｍｕＭｙ９−６を用いた直接的及び競合的結合実験を、ＣＤ３３を発現しているヒト白血病細胞株ＨＬ−６０上で行った。最も保存的な型（Ｖ１．１）に加えて、３つの最もヒトに近いバージョン（Ｖ１．０、Ｖ１．３、Ｖ１．６）についても、ＨＬ−６０膜または全細胞のいずれかで試験した。図１７は、各条件に対するＫＤ値を与え、そして図１８は、ｍｕＭｙ９−６に対するｈｕＭｙ９−６ Ｖ１．０についての結合曲線の例を示す。最もヒトに近い１．０型を含むヒト化Ｍｙ９−６の型について計算したＫＤ値は、ネズミＭｙ９−６のＫＤ値の実験誤差の範囲内に入る。競合的結合の結果はまた、ｈｕＭｙ９−６抗体が、ＣＤ３３への結合についてｍｕＭｙ９−６自体と十分同等に競合することが可能であることも実証する。これらのデータが、ＨＬ−６０膜及び全細胞において、完全ヒト化Ｍｙ９−６ Ｖ１．０に対する野生型に近い結合親和性を実証したため、１．０型が最適なヒト化Ｍｙ９−６抗体であることから、追加の型について試験する必要はなかった。
[215] ネズミＭｙ９−６抗体を、結合活性を失うことなく完全にヒト化した。これらの表面残基のうちの４つがＣＤＲから５Å以内にあったにもかかわらず、マウスからヒトへの表面残基のいずれの変更も、結合親和性の減少をもたらさなかった。ＣＤＲから５Å以内の残基は、これらのＣＤＲの構造に影響を与える可能性のある、潜在的に重大なファン・デル・ワールス接触を作るものと考えられる。
[216] Ｍｙ９−６をヒト化した結果は、表面再構築化された抗体数が増えるにつれて、実際の結合データに基づいた徹底的な残基位置の解析が、単にＣＤＲから５Å以内にある任意の残基に目を向けるよりも、疑わしい残基を標的とする効果的な方法となる可能性があることを示唆する。
[217] ヒト化Ｍｙ９−６ Ｖ１．０（ｈｕＭｙ９−６）は、本明細書に記載された手順を用いてヒト化された４番目の抗体である。ネズミ抗体の可変領域のフレームワークを表面再構築化することによるヒト化は、ＣＤＲグラフトを含むヒト化の標準的な方法における改良技術として開発されたが、結合活性を維持するのに、広範な開発及び再操作を必要とする可能性もある。このことは、完全にヒト表面を有する十分に活性の抗体を作り出すのに１０のみの表面残基の変更を伴った、表面再構築化されたｈｕＭｙ９−６抗体とは、対照をなす。
[218] 実施例４． Ｍｙ９−６−ＤＭ１免疫複合体
[219] メイタンシノイド薬物であるＤＭ１と結合させたＭｙ９−６抗体を用いて、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を用いた前臨床有効性試験を行った。
[220] 以下に論じるように、Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、修飾されていない抗体のＣＤ３３に対する特異性及び結合親和性を維持し、そして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ３３陽性腫瘍細胞に対して強力な抗原特異的細胞毒性を示した。確立された皮下ＨＬ−６０腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスをＭｙ９−６−ＤＭ１で治療した結果、毒性を示さずそして最大耐用量を十分に下回る用量（２０ｍｇ結合抗体／ｋｇ／日、静脈内投与ｘ５日間）にて、完全に腫瘍が根絶された。対照的に、Ｍｙ９−６抗体のみでの治療は、ビヒクル対照と比較して、ＨＬ−６０腫瘍の増殖に効果がなかった。同様な治療有効性は、皮下ＴＨＰ−１異種移植片を有するマウスの治療において、Ｍｙ９−６−ＤＭ１で認められた。
[221] ４．１． 試薬
[222] 抗体は、上述のヒトＣＤ３３に対するネズミモノクローナルＭｙ９−６抗体であった。
[223] 抗体修飾剤は、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）であった：
Figure 0005354835
[224] 細胞毒性薬物は、微生物の発酵産物であるアンサマイトシンＰ３から合成されるメイタンシンアナログであるＤＭ１であった。ＤＭ１は、チューブリン重合の強力な阻害剤である。
Figure 0005354835
[225] ４．２． Ｍｙ９−６−ＤＭ１の調製
Ｍｙ９−６−ＤＭ１を、抗体一分子につき３〜５のピリジルジチオ基を導入するためにＭｙ９−６抗体をＳＰＰで修飾することによって、作製した。ＤＭ１のチオール置換基と抗体の活性ジスルフィド官能基との間でジスルフィド交換を行うことによって、ＤＭ１を含有する抗体複合体が提供された。
Figure 0005354835
[227] ４．３． フローサイトメトリーによる、抗体及び抗体複合体の結合性の解析
[228] ＨＬ−６０を、様々な濃度のＭｙ９−６抗体またはＭｙ９−６−ＤＭ１とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そしてＦＩＴＣ標識抗ネズミＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。追加の洗浄を行った後に、細胞を２％ホルムアルデヒドで固定化し、そして細胞に付随した蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて定量した。Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、修飾されていない抗体と同程度のＣＤ３３との特異的結合性を維持する（図１９）。
[229] ４．４． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
[230] Ｍｙ９−６−ＤＭ１の細胞毒性を、ＣＤ３３を発現しているＴＨＰ−１細胞及びＣＤ３３陰性細胞株であるＮａｍａｌｗａを用いて測定した。細胞を、９６ウェルプレート中の複合体を含有する培地に播き、そしてコロニーが形成されるまで（２〜３週間）３７℃にてインキュベートした。次いで、コロニーを計数し、そして生存した画分を、演算におけるポアソン分布を用いて判定した。
[231] ４．５． Ｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍異種移植試験
[232] 皮下腫瘍モデル − ＨＬ−６０ヒト前骨髄球性白血病細胞（０．１ｍＬ中に５ｘ１０６細胞）を、雌ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下接種した。マウスを、腫瘍の大きさが１００ｍｍ３（大きな腫瘍モデルでは、４００ｍｍ３）に達したときに、側部尾静脈に静脈内注射することによって治療した。腫瘍の大きさ及びマウス体重を、週に２回測定した。生存モデル − ＨＬ−６０細胞（０．１ｍＬ中に５ｘ１０６細胞）を、雌ＳＣＩＤマウスの側部尾静脈に静脈内注射した。腫瘍細胞を注射後第１１日に、治療を開始した。マウスを、瀕死、腫瘍量または死亡について毎日確認した。体重を、週に２回測定した。
[233] ４．６． Ｍｙ９−６−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性及び有効性
[234] ＣＤ３３発現細胞（ＴＨＰ−１）に対するＭｙ９−６−ＤＭ１の細胞毒性を、治療後に増殖することが可能なコロニー数を定量することによって殺細胞活性を測定する、クローン形成法を用いて、ＣＤ３３陰性細胞株（Ｎａｍａｌｗａ）と比較して試験した。Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ３３陽性ヒト腫瘍細胞に対して強力な殺細胞活性を示す（図２０）。ＣＤ３３陰性細胞に対して有意な毒性は認められず、ＣＤ−３３依存性の細胞毒性が、抗ＣＤ３３抗体であるＭｙ９−６による特異的なターゲティングに起因することが、示唆された。
[235] ４．７． マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片に対するＭｙ９−６−ＤＭ１の有効性
[236] Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭｙ９−６−ＤＭ１の有効性を、ヒトＨＬ−６０腫瘍細胞異種移植片を有するＳＣＩＤマウスを用いて測定した。ＨＬ−６０細胞を皮下注射し、そして腫瘍を平均１００ｍｍ３の大きさに増殖させた。Ｍｙ９−６−ＤＭ１複合体を、図２１に示した用量にて、１日１回５日間静脈内に送達した。用量は、複合体中のｍｇ抗体として表し、抗体１ｍｇにつきＤＭ１およそ１５μｇのＤＭ１用量に相当する。腫瘍体積を、治療有効性の指標として測定し、そしてマウス体重を、治療による毒性の指標とするためにモニターした。Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、ほとんど毒性を引き起こさない用量にて、ヒトＨＬ−６０細胞異種移植片を有するマウスの長期治癒を誘導する（図２１）。試験されたもっとも高い２用量（１９及び２６ｍｇ／ｋｇ）において、腫瘍の完全な退縮が、１０％より少ない最大体重減少とともに認められた（図２１Ａ及びＢ）。試験された最低用量（１３ｍｇ／ｋｇ）においてでさえ、５例中２例のマウスは完全な治癒を示したが、一方、他の３例のマウスは、およそ２０日間遅れての腫瘍の増殖を伴う、腫瘍の緩解を示した。同様な結果は、ＴＨＰ−１白血病細胞株を用いた場合にも認められ、該細胞株において、Ｍｙ９−６−ＤＭ１はヒトＴＨＰ−１腫瘍異種移植片を有するマウスの長期治癒を誘導した（データは示さず）。
[237] これらの結果は、Ｍｙ９−６抗体のみでの治療によって得られたものとは著しっく対照的である。抗体のみでは、５０ｍｇ／ｋｇにおいてでさえ腫瘍細胞の増殖に効果がない（図２１Ｃ）。
[238] Ｍｙ９−６−ＤＭ１の活性を、承認された抗ＣＤ３３抗体−カリケアマイシン複合体であるゲムツズマブ・オゾガマイシンと比較した。ゲムツズマブ・オゾガマイシンを、３用量について４日毎に投与した。予備実験では、ゲムツズマブ・オゾガマイシンは、公表されたヌードマウスにおけるＭＴＤ（０．３ｍｇ／ｋｇ）では、ＳＣＩＤマウスに対して毒性が強すぎることが実証された（データは示さず）。有意な毒性は、この実験において、１００及び２００μｇ／ｋｇの用量でも認められた（図２１Ｆ）。ゲムツズマブ・オゾガマイシンは、最大耐用量（１００μｇ／ｋｇ）にて、このモデルにおいてごく中程度の腫瘍の緩解及び増殖遅延（約２５日）を示した（図２１Ｅ）。
[239] 別の実験において、Ｍｙ９−６−ＤＭ１複合体の抗腫瘍活性を、非結合型の親薬物であるメイタンシンの活性と比較した。ＨＬ−６０腫瘍異種移植片を有するマウスを、複合体 ２３ｍｇ抗体／ｋｇまたは３５０μｇ ＤＭ１／ｋｇ；非結合型薬物 ３５０μｇ／ｋｇ；または非結合型抗体 ２３ｍｇ／ｋｇにて、１日１回５日間治療した。メイタンシンのみで治療された６例中３例のマウスは、治療後第２日に死亡し、この薬物レベルが非常に毒性であることが示された。しかしながら、この薬物は、残りの３例のマウスにおいて、腫瘍の増殖に有意な影響を示し、およそ１０日の増殖遅延を伴った（図２２）。
[240] Ｍｙ９−６抗体のみでは、腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかったが、Ｍｙ９−６−ＤＭ１複合体は、腫瘍の完全な緩解をもたらした。複合体での治療がマウス体重へ及ぼす影響（１２％減少）は、前回の実験よりもわずかに大きく、そして、複合体の合成におけるバッチ間の差異を反映する可能性がある。複合体で治療された６例中２例のマウスにおいて、腫瘍の再増殖が、第７０日より認められた。これらの動物は、初回の治療と同一の、Ｍｙ９−６−ＤＭ１による二度目の治療を受けた。二度目の治療は、結果として、「再発」腫瘍の完全な緩解を、有害毒性を認めることなくもたらし、腫瘍の再増殖が複合体耐性細胞の増殖に起因するものではないことが示唆された。
[241] この異種移植モデルにおけるＭｙ９−６−ＤＭ１の高い有効性は、複合体が、大きなＨＬ−６０腫瘍に対してさえも効果的である可能性があることを示唆した。腫瘍を、治療開始に先立って、腫瘍体積＞４００ｍｍ３に増殖させた。加えて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１活性の標準的な化学療法薬物との比較を行った。Ｍｙ９−６−ＤＭ１は、ＳＣＩＤマウスにおいて大きな腫瘍の完全な緩解をもたらした（図２３Ａ及びＢ）。この場合も、再発腫瘍（マウス６例中２例）は、Ｍｙ９−６−ＤＭ１での二度目の治療に感受性であった。標準的な化学療法剤（Ａｒａ−Ｃ及びイダルビシン）は、腫瘍の増殖にほとんど効果がなかった。より高用量の薬物用量は、マウスに対して極めて毒性であった（示さず）。
[242] ４．８． ＨＬ−６０細胞マウス生存モデルにおけるＭｙ９−６−ＤＭ１の有効性
[243] 腫瘍異種移植モデルにおけるＭｙ９−６−ＤＭ１の有効性は顕著であるが、一方で、ＨＬ−６０細胞を直接マウス尾静脈に注射するマウス生存モデルにおいて、複合体の活性を調べることも重要である。このモデルでは、対照マウスは細胞注射後第３０〜５０日に死亡する。細胞注射後第１１日にＭｙ９−６−ＤＭ１で治療を開始されたマウスは、生存性の劇的な増加を示し、第７０日において８例中７例のマウスが生存した（図２４Ａ）。メイタンシンのみでも、８例中２例のマウスが治療開始後まもなく死亡し、薬物毒性が示唆されたものの、このモデルにおいてマウスの生存性に有意な影響を示した。皮下異種移植モデルと比較した場合の、このモデルにおけるメイタンシンの相対的な有効性は、この場合において、ＨＬ−６０腫瘍が、薬物作用に対してより感受性である可能性があることを示唆する。治療開始がさらに遅れると、標的薬物と非標的薬物との間により著しい差異が実証される可能性がある。しかしながら、このモデルにおいてでさえ、標準的な化学療法は、有意な生存性の増大を提供しなかった（図２４Ｂ）。最も高用量の併用用量は、有意に明らかな薬物毒性を示した。Ｍｙ９−６抗体のみ及びゲムツズマブ・オゾガマイシンの双方は、中程度の生存性増加を示した。
[244] 寄託の陳述
[245] ネズミＭｙ９−６抗体を作るハイブリドーマを、２００２年１１月７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＰＯ Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に、ブダペスト条約の条項にしたがって寄託し、そして寄託番号ＰＴＡ−４７８６を割り当てられた。
[246] 特定の特許及び印刷刊行物を、本開示において参照し、その教示は、そのすべてのそれぞれを、本明細書においてそれぞれ参照によって援用する。
[247] 本発明を詳細かつその特定の態様に関して記載したが、種々の変更及び修正を、その精神及び範囲から逸脱することなくこれに対して行うことが可能であることは、当業者にとって明らかであろう。
[35] 図１は、競合結合実験の結果を示す。125Ｉ−標識Ｍｙ９−６抗体（３ｘ１０-9Ｍ）のＣＤ３３陽性Ｕ−９３７細胞への結合を、濃度を増加させたＭｙ９あるいはＭｙ９−６抗体の存在下で、アッセイした。 [36] 図２は、軽鎖シグナル配列に対するＭｙ９−６縮重プライマーを示す。 [37] 図３は、ｍｕＭｙ９−６可変領域の表面を予測するのに用いたブルックヘブンのデータベースに由来する、１２７の抗体構造のファイル名を示す。 [38] 図４は、１６のＭｙ９−６の表面再構築化型ならびにキメラＭｙ９−６抗体を構築するのに用いたＰＣＲプライマーを示す。 [39] 図５は、ヒト化抗体を構築しそして発現するのに用いたプラスミドを示す。（Ａ）：軽鎖クローニングプラスミド。（Ｂ）：重鎖クローニングプラスミド。（Ｃ）：哺乳動物抗体発現プラスミド。 [40] 図６Ａは、ＲＴ−ＰＣＲにより生成したｍｕＭｙ９−６軽鎖のｃＤＮＡクローンに由来するアミノ酸配列と比較した、エドマン配列決定の結果を示す。 [41] 図６Ｂは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列をそれぞれ含有する、１３１９Ｄａ及び１１２２ＤａのペプチドフラグメントのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果を示す。ＣＤＲ配列は、太字で表す。 [42] 図７は、１７８８ＤａペプチドのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果、及び２つのｃＤＮＡクローンに由来する対応した配列を示す。 [43] 図８Ａは、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列（配列番号９５）を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。 [44] 図８Ｂは、ネズミＭｙ９−６抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列（配列番号９６）を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。 [45] 図９は、Ｋａｂａｔの定義によって決定された軽鎖及び重鎖ＣＤＲを示す。 [46] 図１０は、８−２７及びＶ１０２遺伝子の生殖系列配列とともに整列化させた、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。点（．）は、配列が同一であることを示す。 [47] 図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。 [47] 図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。 [48] 図１２Ａ及びＢは、ｍｕＭｙ９−６抗体軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）の各Ｋａｂａｔ位置の平均露出度を示す。１０の最も相同的な軽鎖及び重鎖配列の各Ｋａｂａｔ位置の相対的な溶媒露出度を、平均しそしてｘ軸上に表す。 [49] 図１３Ａは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な軽鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。位置１５及び７０は、最終列に与えられた最終的な表面予測に到達するのに、さらに計算を要した。 [50] 図１３Ｂは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な重鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。 [51] 図１４は、ＣＤＲ残基から５Å以内に入るＭｙ９−６フレームワークの表面残基を示す。 [52] 図１５は、Ｋａｂａｔデータベースから抽出した上位５つのヒト配列を示す。整列化を、ＳＲ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９９３年）によって行った。ＣＤＲから５Å以内に入るｍｕＭｙ９−６の残基を、下線で示す。 [53] 図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。 [53] 図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。 [54] 図１７は、ＨＬ−６０膜及びＨＬ−６０全細胞における直接的結合アッセイならびにＨＬ−６０膜における競合的結合アッセイによって計算された、Ｍｙ９−６のＫD値を示す。Ｎ＝２である＊を除き、Ｎ＝３。 [55] 図１８は、ｈｕＭｙ９−６ Ｖ１．０に対する結合曲線を示す。（Ａ）：ＨＬ−６０膜における直接的結合。（Ｂ）：ＨＬ−６０全細胞における直接的結合。（Ｃ）：ＨＬ−６０膜における競合的結合。 [56] 図１９は、ＨＬ−６０細胞におけるＭｙ９−６−ＤＭ１及びＭｙ９−６抗体の結合性を比較したものを示す。 [57] 図２０は、ＣＤ３３発現ヒト腫瘍細胞に対するＭｙ９−６−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。 [58] 図２１は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性実験の結果を示す。ＨＬ−６０腫瘍の増殖における、Ｍｙ９−６−ＤＭ１（Ａ）及び修飾されていないＭｙ９−６抗体（Ｃ）の効果を、評価した。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ、Ｄ）。 [59] 図２２は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性を非結合型の薬物であるメイタンシンと比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで治療した。 [60] 図２３Ａ及びＢは、大きなＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性を標準的な化学療法と比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで再治療した。 [61] 図２４Ａ及びＢは、ＨＬ−６０生存モデルにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性をゲムツズマブ・オゾガマイシン及び標準的な化学療法と比較したものを示す。ＨＬ−６０細胞を、ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。示した治療を、細胞注射後第１１日に開始した。治療は、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（１日４回ｘ３）を除き、１日１回ｘ５の静脈内投与であった。
[41] 図６Ｂは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列をそれぞれ含有する、１３１９Ｄａ及び１１２２ＤａのペプチドフラグメントのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果を示す。ＣＤＲ配列は、太字で表す。
[42] 図７は、１７８８ＤａペプチドのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果、及び２つのｃＤＮＡクローンに由来する対応した配列を示す。 [43] 図８Ａは、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。 [44] 図８Ｂは、ネズミＭｙ９−６抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。 [45] 図９は、Ｋａｂａｔの定義によって決定された軽鎖及び重鎖ＣＤＲを示す。 [46] 図１０は、８−２７及びＶ１０２遺伝子の生殖系列配列とともに整列化させた、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。点（．）は、配列が同一であることを示す。 [47] 図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。 [47] 図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。 [48] 図１２Ａ及びＢは、ｍｕＭｙ９−６抗体軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）の各Ｋａｂａｔ位置の平均露出度を示す。１０の最も相同的な軽鎖及び重鎖配列の各Ｋａｂａｔ位置の相対的な溶媒露出度を、平均しそしてｘ軸上に表す。 [49] 図１３Ａは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な軽鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。位置１５及び７０は、最終列に与えられた最終的な表面予測に到達するのに、さらに計算を要した。 [50] 図１３Ｂは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な重鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。 [51] 図１４は、ＣＤＲ残基から５Å以内に入るＭｙ９−６フレームワークの表面残基を示す。 [52] 図１５は、Ｋａｂａｔデータベースから抽出した上位５つのヒト配列を示す。整列化を、ＳＲ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９９３年）によって行った。ＣＤＲから５Å以内に入るｍｕＭｙ９−６の残基を、下線で示す。 [53] 図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。 [53] 図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。 [54] 図１７は、ＨＬ−６０膜及びＨＬ−６０全細胞における直接的結合アッセイならびにＨＬ−６０膜における競合的結合アッセイによって計算された、Ｍｙ９−６のＫＤ値を示す。Ｎ＝２である＊を除き、Ｎ＝３。 [55] 図１８は、ｈｕＭｙ９−６ Ｖ１．０に対する結合曲線を示す。（Ａ）：ＨＬ−６０膜における直接的結合。（Ｂ）：ＨＬ−６０全細胞における直接的結合。（Ｃ）：ＨＬ−６０膜における競合的結合。 [56] 図１９は、ＨＬ−６０細胞におけるＭｙ９−６−ＤＭ１及びＭｙ９−６抗体の結合性を比較したものを示す。 [57] 図２０は、ＣＤ３３発現ヒト腫瘍細胞に対するＭｙ９−６−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。 [58] 図２１は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性実験の結果を示す。ＨＬ−６０腫瘍の増殖における、Ｍｙ９−６−ＤＭ１（Ａ）及び修飾されていないＭｙ９−６抗体（Ｃ）の効果を、評価した。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ、Ｄ）。 [59] 図２２は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性を非結合型の薬物であるメイタンシンと比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで治療した。 [60] 図２３Ａ及びＢは、大きなＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性を標準的な化学療法と比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで再治療した。 [61] 図２４Ａ及びＢは、ＨＬ−６０生存モデルにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性をゲムツズマブ・オゾガマイシン及び標準的な化学療法と比較したものを示す。ＨＬ−６０細胞を、ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。示した治療を、細胞注射後第１１日に開始した。治療は、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（１日４回ｘ３）を除き、１日１回ｘ５の静脈内投与であった。

Claims (36)

  1. ＣＤ３３と特異的に結合する、ヒト化もしくは表面再構築化された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記抗体またはエピトープ結合フラグメントの重鎖可変領域が、配列番号９によって表されるアミノ酸配列を有し、そして前記抗体またはエピトープ結合フラグメントの軽鎖可変領域が、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を有する、前記ヒト化もしくは表面再構築化された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
  2. 薬物またはプロドラッグに連結した、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む、免疫複合体。
  3. 前記薬物またはプロドラッグが、メイタンシノイド、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５アナログ、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、及びその誘導体からなる群より選択される、請求項２に記載の免疫複合体。
  4. 請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、及び、薬物またはプロドラッグを含む、組成物。
  5. 請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む、医薬組成物。
  6. 請求項２ないし４のいずれかに記載の免疫複合体または組成物を含む、医薬組成物。
  7. 前記抗体または抗体フラグメントが標識された、請求項１に記載の抗体を含む、ＣＤ３３を検出するための試薬。
  8. 前記標識が、ビオチン標識、酵素標識、放射性標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤及び金属イオンからなる群より選択される、請求項７に記載の試薬。
  9. 請求項１に記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、請求項２または３に記載の免疫複合体、請求項４に記載の組成物、または請求項５または６に記載の医薬組成物の、ＣＤ３３を発現する細胞の増殖を阻害するｅｘ ｖｉｖｏの方法における使用であって、当該方法はそれらと前記細胞を接触させることを含む、前記使用。
  10. 請求項１に記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、請求項２または３に記載の免疫複合体、請求項４に記載の組成物、または請求項５または６に記載の医薬組成物の、ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の物質を処理するためのｅｘ ｖｉｖｏの方法における使用であって、当該方法はその有効量を投与することを含む、前記使用。
  11. ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の１またはそれより多くの細胞を処理する方法であって、当該対象の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、請求項１に記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、請求項２または３に記載の免疫複合体、請求項４に記載の組成物、または請求項５または６に記載の医薬組成物、の有効量と接触させる工程を含む、前記方法。
  12. 生体試料がＣＤ３３を含有するかどうかを判定する方法であって、以下：
    （ａ）前記生体試料を請求項７または８に記載の試薬と接触させること；
    及び、
    （ｂ）前記試薬の前記試料内での分布を検出すること；
    を含む、前記方法。
  13. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患又は癌である、請求項１０に記載の使用。
  14. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患又は癌である、請求項１１に記載の方法。
  15. 請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  16. 請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの軽鎖または重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  17. 請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  18. 請求項１７に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
  19. ＣＤ３３への結合能を有する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを産生する方法であって、（ａ）請求項１８に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞が抗体またはエピトープ結合フラグメントを発現するような条件下で培養すること；及び、（ｂ）このように発現された抗体またはエピトープ結合フラグメントを回収すること；を含む、前記方法。
  20. 生体材料からＣＤ３３を得る方法であって、以下：
    （ａ）生体材料を、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと接触させること；
    （ｂ）請求項１に記載の抗体またはエピトープ結合フラグメントが、前記生体材料中のＣＤ３３に結合することを可能にすること；及び、
    （ｃ）ＣＤ３３に結合した抗体またはエピトープ結合フラグメントを、生体材料から単離し、それによって生体材料からＣＤ３３を得ること；
    を含む前記方法。
  21. ＣＤ３３を発現している細胞の増殖を阻害するための方法であって、当該細胞を請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと接触させることを含む、但し当該方法はヒトにおいて行われるものではない、前記方法。
  22. ＣＤ３３を発現している細胞の増殖を阻害するための方法であって、当該細胞を請求項２または３に記載の免疫複合体と接触させることを含む、但し当該方法はヒトにおいて行われるものではない、前記方法。
  23. ＣＤ３３を発現している細胞の増殖を阻害するための方法であって、当該細胞を請求項４に記載の組成物と接触させることを含む、但し当該方法はヒトにおいて行われるものではない、前記方法。
  24. ＣＤ３３を発現している細胞の増殖を阻害するための方法であって、当該細胞を請求項５または６に記載の医薬組成物と接触させることを含む、但し当該方法はヒトにおいて行われるものではない、前記方法。
  25. 請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む、ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象を治療するための医薬組成物。
  26. 請求項２または３に記載の免疫複合体を含む、ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象を治療するための医薬組成物。
  27. ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の１またはそれより多くの細胞を処理する方法であって、当該対象の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、請求項１に記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメントの有効量と接触させることを含む、前記方法。
  28. ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の１またはそれより多くの細胞を処理する方法であって、当該対象の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、請求項２または３に記載の、免疫複合体の有効量と接触させることを含む、前記方法。
  29. ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の１またはそれより多くの細胞を処理する方法であって、当該対象の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、請求項４に記載の組成物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
  30. ＣＤ３３を発現している疾患を有する対象由来の１またはそれより多くの細胞を処理する方法であって、当該対象の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、請求項５または６に記載の医薬組成物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
  31. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項２５に記載の医薬組成物。
  32. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  33. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項２７に記載の処理方法。
  34. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項２８に記載の処理方法。
  35. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項２９に記載の処理方法。
  36. 疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）からなる群より選択される疾患である、請求項３０に記載の処理方法。
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